專(zhuān)利名稱(chēng)：：甘藍(lán)型油菜低亞麻酸分子標(biāo)記及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于油菜分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜低亞麻酸分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記可以作為低亞麻酸甘藍(lán)型油菜育種標(biāo)記輔助選擇，為培育遺傳穩(wěn)定的低亞麻酸油菜新品種提供新的分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
：油菜種子中脂肪酸組成直接決定著菜籽油的品質(zhì)和對(duì)人的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。亞麻酸是高度不飽和脂肪酸中氧化比率最高的脂肪酸，與空氣、光、熱等接觸后極易發(fā)生氧化形成惡臭氧化物，使菜油變質(zhì)而不耐貯藏。更為嚴(yán)重的是亞麻酸的氧化產(chǎn)物對(duì)人體有害，可以弓丨起心血管粥樣硬化(Chang等，Effectsoftheratioofpolyunsaturatedandmonounsaturatedfattyacidonratplasmaandliverlipidconcentration.Lipids,1998，33=481-487)。不飽和脂肪酸的雙鏈斷裂后，比較容易形成自由基，即出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而會(huì)損傷細(xì)胞與細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能(孔祥瑞，必需微量元素的營(yíng)養(yǎng)生理及臨床意義.合肥安徽科學(xué)出版社.1982:3-60)，直接影響細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖和遺傳。菜籽油中α-亞麻酸氧化后還會(huì)使油脂帶有較強(qiáng)的辛辣味。因此，降低菜籽油中亞麻酸含量是育種家在甘藍(lán)型油菜品質(zhì)育種方面的長(zhǎng)期目標(biāo)(RachaelScarth等，Designeroilcanola—areviewofnewfood-gradeBrassicaoilswithfocusonhigholeic，lowlinolenictypes,IOthInt.RapeseedCongress，1999)0目前國(guó)內(nèi)外低亞麻酸遺傳資源還很缺乏，在將低亞麻酸性狀導(dǎo)入到高產(chǎn)的高亞麻酸品種時(shí)主要利用傳統(tǒng)的表型選擇方法。由于甘藍(lán)型油菜中亞麻酸含量受多基因控制，存在育種周期長(zhǎng)、效率低等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代生物技術(shù)中的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，與傳統(tǒng)表型選擇相比有諸多優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記輔助選擇可在任何生長(zhǎng)期進(jìn)行，不受環(huán)境條件影響，可排除非等位基因相互作用而造成的干擾，具有快速、經(jīng)濟(jì)，效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的特點(diǎn)。在甘藍(lán)型油菜低亞麻酸育種過(guò)程中將分子標(biāo)記技術(shù)與回交育種相結(jié)合，可借助分子標(biāo)記對(duì)性狀的基因型進(jìn)行直接而快速進(jìn)行前景選擇，以排除環(huán)境和外界因素的影響。同時(shí)可利用分子標(biāo)記對(duì)背景進(jìn)行選擇，從而加快遺傳背景恢復(fù)速度，縮短育種年限和減輕連鎖累贅。而開(kāi)展這些工作的前提之一是開(kāi)發(fā)高效的分子標(biāo)記。在低亞麻酸目的性狀的定位方面，國(guó)內(nèi)外的研究者已經(jīng)取得很多的研究成果。Somers等(Somers等，IdentificationofMolecularMarkersAssociatedwithLinoleicAcidDesaturationinBrassicanapus，TheoreticalandAppliedGenetics，1998，96.897-903)利用BSA法在由115基因型組成的DH群體中，找到16個(gè)與亞麻酸含量有關(guān)的RAPD標(biāo)記，位于3個(gè)連鎖群，分別解釋32%，14%和5%的表型變異，甘藍(lán)型油菜fad3基因定位于解釋14%變異的這個(gè)連鎖群上。三個(gè)QTLs間表現(xiàn)加性效應(yīng)，共解釋51%的變異。HU等(HuJ等，MappingofagenedetermininglinolenicacidcontentinrapeseedwithDNAbasedmarkers.TheorApplGenetl995，90:258_262)也找到一個(gè)與亞麻酸含量相關(guān)的RAPD顯性標(biāo)記，該標(biāo)記擴(kuò)增片段大小為650bp。他們進(jìn)一步將此片段克隆、測(cè)序，轉(zhuǎn)化為顯性的SCAR標(biāo)記。(HuJ等，SCARandRAPDmarkerassociatedwithl8-carbonfattyacidsinrapeseed,Brassicanapus.PlantBreeding，1999，118:145—150)oCheimg等(CheungMolecularmappingofseedqualitytraitsin(BrassicajunceaL.)czern.andcoss.ActaHorticulturae，1998，459:139-147)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)控制亞麻酸含量的QTLs一個(gè)位于fael位點(diǎn)一個(gè)位于fad3位點(diǎn)。Jourdren等(Jourdren等，Specificmolecularmarkerofthegenescontrollinglinolenicacidcontentinrapeseed.TheorApplGenet，1996b，93:512_518)定位了兩個(gè)與亞麻酸含量有關(guān)的QTLs和fad3基因緊密相關(guān)丄ionneton等(Lionneton等，DevelopmentofanAFLP-basedlinkagemapandlocalizationofQTLsforseedfattyacidcontentincondimentmustard(Brassicajuncea)Genome2002,45:1203-1215)發(fā)現(xiàn)對(duì)于亞麻酸含量位于LG2上的一個(gè)QTL位點(diǎn)可解釋41.2%的表型變異。F.Javidfar等(F.Javidfar等，Identificationofmolecularmarkersassociatedwitholeicandlinolenicacidinspringoilseedrape(Brassicanapus).PlantBreeding,2006,125:65_71)用一個(gè)高油酸，低亞麻酸品種(C18:l>79%,C18:3<2%)T099-5318-20與一個(gè)高油酸，高亞麻酸(C18:l=68%,C18:3>7%)DH系DH12075雜交。得到8個(gè)與油酸和亞麻酸含量關(guān)聯(lián)的RAPD標(biāo)記，其中RAPD標(biāo)記UBC2830對(duì)油酸和亞麻酸含量變異的貢獻(xiàn)率分別為43%和13%。RAPD標(biāo)記UBC153550對(duì)亞麻酸含量變異的貢獻(xiàn)率為19%。標(biāo)記UBC2830被變換成SCAR標(biāo)記。Somers等(DarylSomers，US2003/0150020Al,Aug.7,2003；DarylSomers，US7081564,July25,2006)獲得于低亞麻酸含量的SNP標(biāo)記，Hu等(Hu等，Mappingofthelocicontrollingoleicandlinolenicacidcontentsanddevelopmentoffad2andfad3allele-specificmarkersincanola(BrassicanapusL·)·TheorApplGenet，2006，113:497_507)從DH作圖群體中定位到了與甘藍(lán)型油菜亞麻酸含量有關(guān)的主效QTL，控制低亞麻酸含量的一個(gè)主效QTL(fad3c)位于第14號(hào)染色體，另一個(gè)主效QTL位于第4號(hào)染色體，來(lái)自于A基因組。根據(jù)這些QTL，設(shè)計(jì)得到了兩個(gè)與fad2，fad3相關(guān)的SNP(SingleNucleotidePolymorphisms)標(biāo)記。Zhao(ZhaoJ^.MappingQTLcontrollingfattyacidcompositioninadoubledhaploidrapeseedpopulationsegregatingforoilcontent.MolBreed,2008,21115-125)在甘藍(lán)型油菜N14上也檢測(cè)到一個(gè)關(guān)于亞麻酸的QTL，解釋了28%的遺傳變異率。但由于Somers等(DarylSomers，US2003/0150020Al,Aug.7,2003；DarylSomers,US7081564，July25,2006)及Hu等(2006)獲得的SNP標(biāo)記在引物設(shè)計(jì)時(shí)僅僅存在一個(gè)3’端的差異，在甘藍(lán)型油菜亞麻酸輔助選擇育種中的效果受到DNA模板濃度、引物合成質(zhì)量、引物濃度、PCR反映體系及參數(shù)等多種因素等影響，使得其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用存在受到很大限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于發(fā)展一種適用于選育具有低亞麻酸性狀的甘藍(lán)型油菜的分子標(biāo)記，為甘藍(lán)型油菜低亞麻酸育種提供一種簡(jiǎn)單、快速和有效的輔助選育方法。本發(fā)明是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)申請(qǐng)人:通過(guò)試驗(yàn)獲得一種適用于選育具備低亞麻酸性狀的甘藍(lán)型油菜共顯性SNP分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO8所示。制備適用于甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的顯性SNP分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟利用本申請(qǐng)人設(shè)計(jì)的引物HY-fad31、HY-fad32擴(kuò)增低亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A177基因組DNA，分別得到兩個(gè)DNA擴(kuò)增片段，然后對(duì)所述4個(gè)DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，其中從甲A254中擴(kuò)增得到如SEQIDN0:1和SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，從甲A177中擴(kuò)增得到如SEQIDNO:2和SEQIDN0:4所示的核苷酸序列。與序列表SEQIDNO2相比，在序列表SEQIDNO=I的存在5個(gè)單堿基突變以及2個(gè)插入突變(見(jiàn)附圖3)，申請(qǐng)人利用SEQIDNO1和SEQIDNO2中存在的突變位點(diǎn)28T—28C的單核苷酸多態(tài)性(SNP，SingleNucleotidePolymorphisms)，采用引物3，端錯(cuò)配技術(shù)策略(Drenkard等，Asimpleprocedurefortheanalysisofsinglenucleotidepolymorphismsfacilitatesmap-basedcloninginArabidopsis.PlantPhysiol,2000124=1483-1492)設(shè)計(jì)了引物對(duì)YQ-fad31_l及YQ-fad31_2。與序列表SEQIDN0:4相比，在序列表SEQIDNO3的存在1個(gè)1450G—1450A的單堿基突變(見(jiàn)附圖4)，申請(qǐng)人利用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中存在的突變位點(diǎn)1450G—1450A的單核苷酸多態(tài)性，采用引物3’端錯(cuò)配技術(shù)策略設(shè)計(jì)了引物對(duì)YQ-fad32-l及YQ-fad32_2。將引物對(duì)YQ-fad31_l、YQ-fad31-2、YQ-fad32-l和YQ-fad32-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與甘藍(lán)型油菜低亞麻酸基因連鎖的共顯性SNP分子標(biāo)記(即本發(fā)明的目標(biāo)分子標(biāo)記)，其核苷酸序列如序列表SEQIDN05、SEQIDNO:6、SEQIDNO7和SEQIDNO8所示。在上述方法中，所用引物對(duì)的核苷酸序列如下所示引物對(duì)(1)，編號(hào)為HY_fad31正向引物5，-TGGACATGGGAGTTTCTC-3，，反向引物5，-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3，。引物對(duì)(2)編號(hào)為HY_fad32正向引物5，-ACTCCACCCTGAGAACTT-3，，反向引物5，-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3，。引物對(duì)(3)編號(hào)為YQ-fad31_l正向引物5，-GGAGTTTCTCAGACATTCGT-3，，反向引物5，-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3，。引物對(duì)(4)編號(hào)為YQ-fad31_2正向引物5，-GGAGTTTCTCAGACATTCGC-3，，反向引物5，-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3引物對(duì)(5)編號(hào)為YQ-fad32_l正向引物5，-CCTTGGTACAGAGGCAACA-3，，反向引物5，-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3，。引物對(duì)(6)編號(hào)為YQ-fad32_2正向引物5，-CCTTGGTACAGAGGCAATG-3，，反向引物5，-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3，。其中，引物對(duì)HY-fad31用于擴(kuò)增序列表中SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；引物對(duì)HY-fad31用于擴(kuò)增序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；引物對(duì)YQ-fad31-l、YQ-fad31-2分別用于擴(kuò)增序列表中SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；引物對(duì)YQ-fad32-l、YQ-fad32-2分別用于擴(kuò)增序列表中SEQIDNO:7和SEQIDNO8所示的核苷酸序列。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明第一次將引物3’端錯(cuò)配策略應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜SNP多態(tài)性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和檢測(cè)；并第一次利用正向引物和反向引物同時(shí)錯(cuò)配手段在異源多倍體作物甘藍(lán)型油菜中開(kāi)發(fā)出基于PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳SNP標(biāo)記。本發(fā)明成功得到甘藍(lán)型油菜低亞麻酸的共顯性SNP分子標(biāo)記，運(yùn)用該標(biāo)記在低亞麻酸甘藍(lán)型油菜的輔助選擇中可以克服傳統(tǒng)育種中依靠表型進(jìn)行選擇的缺點(diǎn)，減少育種工作量，縮短育種年限，加快了甘藍(lán)型油菜低亞麻酸育種的進(jìn)程。更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《具體實(shí)施方式》。序列表SEQIDNO:1_4是本發(fā)明擴(kuò)增的甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A177基因組DNA的基因組DNA獲得的4個(gè)DNA片段(核苷酸序列)；序列表SEQIDNO:5_8是本發(fā)明制備的甘藍(lán)型油菜亞麻酸含量分子標(biāo)記的核苷酸序列。圖1利用引物對(duì)HY-fad31在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和甲A177以及F1的基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中=P1代表甲A254;P2代表甲A177A代表甲A254X甲A177;M代表DNAmarker(片段大小依次為3000，2600，2050，1650，1000,700，500和278bp)。圖2利用引物對(duì)HY-fad32在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和甲A177以及F1W基因組DNA中的擴(kuò)增結(jié)果。圖中=P1代表甲A254;P2代表甲A177A代表甲A254X甲A177;M代表DNAmarker(片段大小依次為3000，2600，2050，1650，1000,700，500和278bp)。圖3利用引物對(duì)HY-fad31在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和甲A177基因組中的擴(kuò)增的DNA片段序列比對(duì)，圖中:N0_1、N0_2分別代表序列表中SEQIDNO:1禾口SEQIDNO2的序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示序列的第28T—28C的單堿基突變，設(shè)計(jì)的引物位置(即引物對(duì)YQ-fad31-l、YQ-fad31-2的正向引物位置)參見(jiàn)下劃線處，空心三角形“▽”表示引物設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基。圖4利用引物對(duì)HY-fad32在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和甲A177基因組中的擴(kuò)增的DNA片段序列比對(duì)，圖中:N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示序列的第1450G—1450A的單堿基突變，設(shè)計(jì)的引物位置(即引物對(duì)YQ-fad32-l、YQ-fad32-2的正向引物位置)參見(jiàn)下劃線處，空心三角形“▽”表示引物設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基。圖5利用引物對(duì)HY_fad31、HY_fad32在甘藍(lán)型油菜品系甲A254和甲Al77基因組中的擴(kuò)增的DNA片段序列比對(duì)，圖中N0_1、N0_2、N0_3、N0_4分別代表序列表中SEQIDNOSEQIDNO:2、SEQIDNO3禾口SEQIDNO:4的序列，實(shí)心黑三角形“▲”表示引物對(duì)HY-fad31、HY-fad32在同一親本中擴(kuò)增的甘藍(lán)型油菜fad基因的不同拷貝之間的單堿基差異；Pri.1代表引物對(duì)YQ-fad31-l、YQ-fad31-2的反向引物，Pri.2代表引物對(duì)YQ-fad32-l、YQ-fad32-2的反向引物，設(shè)計(jì)的引物位置參見(jiàn)下劃線處，箭頭代表引物方向，空心三角形“▽?zhuān)?，表示引物設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基。圖6本發(fā)明獲得的引物YQ-fad31-l、YQ-fad31_2、YQ-fad32_l和YQ-fad32_2在甘藍(lán)型油菜品系甲A254、甲177、&以及利用(甲A254X甲A177)F1生產(chǎn)的DH群體的部分單株檢測(cè)結(jié)果。圖中=P1代表甲A254;P2代表甲A177A代表甲A254X甲A177;l_18代表DH群體中不同亞麻酸含量單株(圖中正下方數(shù)值為單株亞麻酸含量，單位％)；片段長(zhǎng)度為所述引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。圖7是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、制備F1代雜交種和建立雙單倍體(DH)群體在本實(shí)施例中，以本單位選育的低亞麻酸含量(亞麻酸含量為2.28%)的甘藍(lán)型油菜品系甲A254(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC-P200909)為母本，以普通亞麻酸含量(亞麻酸含量為7.78%)油菜高世代育種選系甲A177(該材料的種子已于2009年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏號(hào)為CCTCC-P200908)為父本進(jìn)行雜交，得到F1種子。將上述步驟得到的F1種子在自然條件下播種，得到F1植株，利用F1植株的花粉經(jīng)小孢子培養(yǎng)得到190個(gè)雙單倍體(簡(jiǎn)稱(chēng)DH)群體。2、提取甘藍(lán)型油菜基因組DNA從上述步驟獲得的DH分離群體以及雙親(即上述步驟所述的甘藍(lán)型油菜甲A177及甲A254)的鮮嫩葉片中提取基因組DNA，具體制備方法參照李佳等(李佳等，一種有效提取油菜葉片總DNA的方法，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，13(5)521-523)報(bào)道的方法進(jìn)行，用的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)(型號(hào)=PharmaciaBiotech,GeneQuantII)檢測(cè)DNA濃度。3、亞麻酸含量的測(cè)定種子按單株收獲后用氣相色譜儀(HP6890，Genmany)，分析脂肪酸含量，親本及后代混合樣隨機(jī)選取30-50粒飽滿種子磨碎后倒入IOml試管，在試管中加入Iml乙醚、石油醚(體積比11)混合液，然后再加入等體積的甲醇(含5%Κ0Η)進(jìn)行酯化反應(yīng)，靜置40分鐘以上使其充分反應(yīng)。最后加蒸餾水定容至IOml萃取，取上部醚層溶液取進(jìn)樣測(cè)定。若進(jìn)行半粒材料分析，乙醚、石油醚(體積比為11)混合液的加入量為IOOul。脂肪酸成份用氣相色譜法測(cè)定，色譜條件如下色譜儀HewlettPackard(HP6890,Genmany)，氫火焰離子化檢測(cè)器，手動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.4ul(半粒分析進(jìn)樣量為0.8ul)，分流比145；色譜柱HP-inowaxl9091N-133,30mX0.25mmX0.25um毛細(xì)管柱；檢側(cè)器和進(jìn)樣室溫度分別為250°C和280°C；載氣N2，30ml/min,尾吹40min/min；空氣流速:300ml/min;H2流速:30min/min；爐溫持續(xù)升溫，180°C保持2分鐘，之后以10°C/min升至220°C保持并保持7min。脂肪酸成份由峰所在位置的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確定，含量則用面積百分比表示。對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和整理時(shí)只考慮7種主要脂肪酸，即棕桐酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)、花生烯酸(C20:l)、芥酸(C22:l)。4、利用引物對(duì)HY_fad31、HY_fad32擴(kuò)增分析雙親和F1的基因組DNA利用本申請(qǐng)人開(kāi)發(fā)的引物對(duì)HY-fad31、HY-fad32(引物對(duì)序列見(jiàn)表2)來(lái)擴(kuò)增分析甘藍(lán)型油菜品種甲A254和甲A177和F1的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系如下IXPCRbuffer,1.35mMMgCl2,0.08mMdNTPs,1.OUTaqDNA聚合酶(均購(gòu)自MBIFermentas，Lithuania公司)，IOOngDNA，正、反向引物各0.45μM，ddH20補(bǔ)充至終體積20μ1。熱循環(huán)參數(shù)為94□C3min；94□C30sec,復(fù)性溫度45□Csec,72□C60sec,29個(gè)循環(huán)；72□CIOmin,1個(gè)循環(huán)；4□C保存，反應(yīng)是在PTC-ALD1244PCR儀上完成。兩個(gè)材料均進(jìn)行兩次重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物在水平電泳槽上1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用IXTAE緩沖液(0.04MTris_acetate，0.OOlMEDTA，pH8.0)，電壓8V/cm，電泳35min。電泳完畢，凝膠成像系統(tǒng)(UVP)拍照保存。本發(fā)明中引物對(duì)HY-fad31在雙親和F1的基因組DNA中擴(kuò)增產(chǎn)物均為2150bp左右的亮帶，該亮帶包括很亮的目的帶及比目的帶稍大一點(diǎn)的非目標(biāo)片段，雙親及F1擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度無(wú)差異；引物對(duì)HY-fad32在雙親和F1的基因組DNA中擴(kuò)增產(chǎn)物均為1950bp左右的單一亮帶，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度無(wú)差異(實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖1和表2)。表2本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)的編號(hào)及其核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注(1)*表中粗體及下劃線堿基(如G)代表該堿基在引物設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行了錯(cuò)配處理。(2)依照描述的順序，在本說(shuō)明書(shū)的末尾及提供的核苷酸序列和/或氨基酸計(jì)算機(jī)可讀形式的副本中，上述表2所述的引物序列分別被處理成序列表SEQIDN0:9-20，其與表2所示的引物序列是一致的。5、回收、克隆、測(cè)序引物對(duì)HY-fad31、HY_fad32在雙親中擴(kuò)增的DNA片段回收上述步驟中獲得的引物對(duì)HY-fad31、HY-fad32在甘藍(lán)型油菜品種甲A254和甲A177中擴(kuò)增的DNA片段。操作程序按GenClean柱式DNA膠回收試劑盒(購(gòu)自上海捷瑞生物工程公司)說(shuō)明書(shū)提供的方法用刀片從1.0%的瓊脂糖膠上挖出擴(kuò)增的目的DNA片段，放入1.5ml的離心管，按每IOOmg瓊脂糖凝膠加入300μ1BindingSolutionB,置于55□C水浴中加熱lOmin，每隔2min混勻一次；將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移至套在收集管內(nèi)的GenCleanColumn中，室溫放置2min，3，OOOrpm離心30sec；倒掉收集管中的廢液，加入500μ1WashSolution，8，OOOrpm室溫離心30sec，此步驟重復(fù)一次；倒掉收集管中的廢液，將GenCleanColumn放入同一個(gè)收集管中，10，OOOrpm離心Imin；將GenCleanColumn放入一根新的1.5ml的離心管中，在柱子膜中央加30μ1ElutionBuffer，室溫放置2min；10，OOOrpm離心lmin，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20□C備用。取上述回收的目標(biāo)DNA片段2μ1作模板，用引物對(duì)HY-fad31、HY-fad32按照上述步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1.0%的瓊脂糖膠檢測(cè)擴(kuò)增的DNA片段。如果擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度與上述步驟中擴(kuò)增的結(jié)果不相同，需要重新擴(kuò)增回收；如果擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度與上述步驟中擴(kuò)增的結(jié)果相同，說(shuō)明回收得到的DNA片段即是目標(biāo)DNA片段，可用于下一步的T-A克隆。將回收的目標(biāo)DNA片段連接在pMDT-18載體上(該載體購(gòu)自TaKaRa公司，寶生物工程(大連)有限公司代理)。操作程序按該試劑盒的說(shuō)明書(shū)介紹的方法試劑在使用前先短暫離心將其收集在管底部；在0.5ml的離心管中進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)體系為DNA2.0μ1，pMDT-18載體0.5μ1和SolutionI2.5μ1。用移液管來(lái)回吸幾次混勻，置4°C冰箱進(jìn)行過(guò)夜連接反應(yīng)；準(zhǔn)備LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基(含100mg/ml氨芐青霉素，24mg/ml的異丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；從-70°C冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞放在冰上待它慢慢解凍(約5min)；離心收集連接反應(yīng)液，取2μ1反應(yīng)液加入到一個(gè)已經(jīng)滅菌的1.5ml離心管(放在冰上預(yù)冷)；用手指輕彈裝有感受態(tài)細(xì)胞的管底以混勻，取50μ1感受態(tài)細(xì)胞加入裝有2μ1連接反應(yīng)液的1.5ml離心管，用手指輕彈混勻，放在冰上20min；在42°C水浴中熱激90sec(勿搖動(dòng))，然后在冰上放置5min；加500μ1的LB液體培養(yǎng)基后在37°C振蕩培養(yǎng)Ih(150rmp/min)；吸取振蕩培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化液200μ1涂在無(wú)菌的LB固體培養(yǎng)基上，在37°C放置16_20h；進(jìn)行藍(lán)、白斑篩選，挑選24個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行編號(hào)，并在無(wú)菌的液體LB培養(yǎng)基(含50ug/ml的氨芐青霉素)振蕩培養(yǎng)16_20h；取振蕩培養(yǎng)后的菌液2μ1作PCR模板，用Μ13作引物(正向引物5‘-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3‘；反向引物5‘-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3‘)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)如上述步驟所述。擴(kuò)增結(jié)果在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)。如果所得的DNA片段比目標(biāo)DNA片段大200bp左右，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功，選5份轉(zhuǎn)化成功的菌液各吸取100μ1送華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。剩余400μ1渾濁菌液加400μ150%無(wú)菌的甘油在2ml無(wú)菌的離心管中于_70°C編號(hào)保存。本發(fā)明中，引物HY_fad31、HY_fad32在甲A254和甲Al77中擴(kuò)增的DNA片段各5次重復(fù)測(cè)序，其序列結(jié)果一致。其中引物HY-fad31在甲A254、甲A177中的擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)分別為2148bp、2137bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；引物HY-fad32在甲A254、甲A177中的擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)均為1963bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO3和SEQIDNO4所示。6、制備甘藍(lán)型油菜中與低亞麻酸性狀連鎖的SNP標(biāo)記對(duì)上述步驟得到的引物HY-fad31、HY_fad32在甲A254和甲A177中擴(kuò)增的片段用EBIToolsClustalff(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)Wii^Wifψ列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，與序列表所示的SEQIDNO:2相比，SEQIDNO:1的存在4個(gè)單堿基突變以及2個(gè)插入突變，5個(gè)單堿基突變分別為28T—28C、390A—390T、1692T—1703A、1723G—1734T、1865C—1876T；插入突變分別為在713-714處插入一個(gè)核苷酸T，在第1665-1666bp處插入一個(gè)IObp的核苷酸片段，插入堿基是ATGATTAGTA(見(jiàn)附圖3)。與序列表SEQIDNO:4相比，在序列表SEQIDNO:3的在全長(zhǎng)1963bp中僅存在1個(gè)1450G—1450A的單堿基突變(見(jiàn)附圖4)。同時(shí)，將序列表中SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO3和SEQIDNO:4進(jìn)行多序列比對(duì)結(jié)果顯示，在同一親本中擴(kuò)增出的甘藍(lán)型油菜fad3基因不同拷貝間高度同源，差異部分主要集中在低GC含量區(qū)域，在GC含量適合設(shè)計(jì)引物的區(qū)域(4060%)中，僅存在部分單堿基突變(見(jiàn)附圖5)。根據(jù)引物HY-fad31在甲A254和甲A177中擴(kuò)增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示)，利用報(bào)道的PrimerPremier5.0軟件(http//www.PremierBiosoft.com)，在序列SEQIDNO1中的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條引物，在同一親本來(lái)源的不同甘藍(lán)型油菜fad3基因的不同拷貝間的多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條引物，從而排除甘藍(lán)型油菜基因組中其他fad3拷貝的對(duì)PCR擴(kuò)增的干擾，上述要求的兩條引物配對(duì)組成一對(duì)引物，達(dá)到在特定親本中擴(kuò)增特定拷貝的效果。設(shè)計(jì)時(shí)要求引物長(zhǎng)度為1725bp，復(fù)性溫度5062口C，GC含量為4060%，同時(shí)為有效區(qū)分該位點(diǎn)在雙親間的差異和排除，利用引物3’端錯(cuò)配策略將引物3’端的第2-4位堿基進(jìn)行一個(gè)堿基的錯(cuò)配處理。按上述要求獲得一對(duì)目標(biāo)引物，正向引物在序列SEQIDNO:1中的第9-28bp之間，反向引物在序列SEQIDNO1中的第788-805bp之間(序列見(jiàn)表2中引物對(duì)YQ-fad31-l，正向引物位置見(jiàn)附圖3中N0_1下劃線所示，反向引物位置見(jiàn)附圖5中N0_1下劃線所示)，設(shè)計(jì)時(shí)將正向引物和反向引物的3’端第2位堿基分別由C錯(cuò)配為G、由A錯(cuò)配為T(mén)，將其命名為YQ-fad31-l，預(yù)期在甘藍(lán)型油菜甲A254的基因組DNA中擴(kuò)增出797bp的片段，而在甲A177的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物；按上述要求利用同樣的方法，在序列SEQIDNO:2中篩選得到一對(duì)目標(biāo)引物，正向引物在序列SEQIDNO2中的第9-28bp之間，反向引物在序列SEQIDNO:2中的第787-804bp之間(序列見(jiàn)表2中引物對(duì)YQ-fad31-2的，正向引物位置見(jiàn)附圖3中N0_2下劃線所示，反向引物位置見(jiàn)附圖5中N0_2下劃線所示)，正向引物和反向引物的3’端第2位堿基分別由C錯(cuò)配為G、由A錯(cuò)配為T(mén)；預(yù)期在親本甲A177的基因組DNA中擴(kuò)增出796bp的片段，而在親本甲A254的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)引物HY-fad32在甲A254和甲A177中擴(kuò)增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQIDNO3和SEQIDNO4所示)及開(kāi)發(fā)引物對(duì)YQ-fad31_l、YQ-fad31_2的要求和方法，在序列SEQIDNO:3中獲得一對(duì)目標(biāo)引物，正向引物在序列SEQIDN0:3中的第1432-1450bp之間，反向引物在序列SEQIDNO:3中的第1840_1859bp之間(序列見(jiàn)表2中引物對(duì)YQ-fad32-l，正向引物位置見(jiàn)附圖4中N0_3下劃線所示，反向引物位置見(jiàn)附圖5中N0_3下劃線所示)，設(shè)計(jì)時(shí)將正向引物和反向引物的3’端第2位堿基分別由G錯(cuò)配為C、由C錯(cuò)配為G，將其命名為YQ-fad32-l，預(yù)期在甘藍(lán)型油菜甲A254的基因組DNA中擴(kuò)增出428bp的片段，而在甲A177的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物；同時(shí)在序列SEQIDNO:4中獲得一對(duì)目標(biāo)引物，正向引物在序列SEQIDNO4中的第1432-1450bp之間，反向引物在序列SEQIDN0:4中的第1840-1859bp之間(序列見(jiàn)表2中引物對(duì)YQ-fad32_l，正向引物位置見(jiàn)附圖4中N0_4下劃線所示，反向引物位置見(jiàn)附圖5中N0_4下劃線所示)，設(shè)計(jì)時(shí)將正向引物和反向引物的3’端第2位堿基分別由G錯(cuò)配為T(mén)、由C錯(cuò)配為G，預(yù)期在親本甲A177的基因組DNA中擴(kuò)增出428bp的片段，而在親本甲A254的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明利用上述步驟設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系同上所述，復(fù)性溫度見(jiàn)表2。擴(kuò)增結(jié)果在1.2%的瓊脂糖膠上檢測(cè)。其中引物YQ-fad31-l在甘藍(lán)型油菜甲A254和F1的基因組DNA中擴(kuò)增出797bp的目標(biāo)片段，而在甘藍(lán)型油菜甲A177的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)附圖6)，因此該擴(kuò)增片段可作為甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的顯性SNP分子標(biāo)記。引物YQ-fad31-2在甘藍(lán)型油菜甲A177和F1的基因組DNA中擴(kuò)增出796bp的目標(biāo)片段，而在甘藍(lán)型油菜甲A254的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)附圖6)，該擴(kuò)增片段與YQ-fad31-l組合可作為甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的共顯性SNP分子標(biāo)記。其中引物YQ-fad32_l在甘藍(lán)型油菜甲A254和F1的基因組DNA中擴(kuò)增出428bp的目標(biāo)片段，而在甘藍(lán)型油菜甲A177的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)附圖6)，因此該擴(kuò)增片段可作為甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的顯性SNP分子標(biāo)記。引物YQ-fad32-2在甘藍(lán)型油菜甲A177和F1的基因組DNA中擴(kuò)增出428bp的目標(biāo)片段，而在甘藍(lán)型油菜甲A254的基因組DNA中無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物(見(jiàn)附圖6)，該擴(kuò)增片段與YQ-fad32-l組合可作為甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的共顯性SNP分子標(biāo)記。7、甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的共顯性SNP標(biāo)記組合的驗(yàn)證利用上述步驟得到的甘藍(lán)型油菜低亞麻酸性狀的SNP標(biāo)記分析本發(fā)明中的DH分離群體，其中33個(gè)單株與親本甲A254中擴(kuò)增片段一樣(即表中的“A/A帶型”)，39個(gè)單株與親本甲A177中擴(kuò)增片段一樣(即表中的“B/B帶型”)，76個(gè)單株檢測(cè)結(jié)果為“A/B帶型”，42個(gè)單株檢測(cè)結(jié)果為“B/A帶型”(見(jiàn)表3)。通過(guò)分析表中數(shù)據(jù)可知，凡是YQ_fad31、YQ-fad32進(jìn)行檢測(cè)檢測(cè)為“A/A帶型”的，其亞麻酸含量均在3.50%以下，其符合RachaelScarth在第10屆國(guó)際油菜大會(huì)中提出的低亞麻酸育種標(biāo)準(zhǔn)(RachaelScarth等，Designeroilcanola—areviewofnewfood-gradeBrassicaoilswithfocusonhigholeic,lowlinolenictypes,IOthInt.RapeseedCongress，1999)。因此，利用YQ-fad31、YQ-fad32可有效鑒定出甘藍(lán)型油菜兩個(gè)位點(diǎn)上均攜帶低亞麻酸基因的個(gè)體，可以把一個(gè)數(shù)量性狀轉(zhuǎn)化成質(zhì)量性狀進(jìn)行選擇，提高選育低亞麻酸含量甘藍(lán)型油菜的準(zhǔn)確性和有效性，從而加快低亞麻酸含量甘藍(lán)型油菜選育。表3本發(fā)明中甘藍(lán)型油菜DH分離群體的亞麻酸含量及標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>72.354.074.913.624.7482.414.094.993.675.1892.524.095.033.695.19102.554.105.053.795.26112.574.145.073.805.37122.674.185.153.805.74132.734.195.183.815.77142.764.195.183.825.87152.824.215.203.885.95162.884.215.204.006.05172.934.215.244.006.25182.934.235.314.076.16192.954.245.334.106.16202.964.265.344.196.19213.014.335.384.206.25223.034.335.394.216.27233.074.425.434.236.34243.084.465.444.286.38253.094.485.524.396.40263.094.485.544.446.54273.124.505.554.466.75283.134.515.564.486.77293.154.555.604.516.89303.304.575.634.546.93313.364.575.644.557.01323.404.585.714.607.12333.494.595.744.667.14344.625.854.737.17354.635.904.797.30364.645.974.937.97374.696.044.948.21384.696.204.958.70395.058.91405.14415.47425.63^FiF33764239190^_平均值，_2.834_4.811_4.174_6.1714.620^M2.00-3.403.41-5.653.41-5.655.66-9.00標(biāo)準(zhǔn)1符合數(shù)目32683828_比例_96.97%_90,48%_90.48%_71.79%_‘MM2.00-3.503.30-5.753.30-5.755.00-9.00標(biāo)準(zhǔn)2符合數(shù)目33703932__YYM__100.00%__92·86%__92.86%__82.05%__序列表〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué)〈120〉甘藍(lán)型油菜低亞麻酸分子標(biāo)記及其制備方法與應(yīng)用〈130〉<141>2009-12-27<160>20<170>PatentInversion3.1<210>1<211>2148<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene<222>(1)..(2148)<223><220><221>mutation<222>(1665).·(1666)<223><220><221>mutation<222>(1865)..(1865)<223><220><221>mutation<222>(1723).·(1723)<223><220><221>mutation<222>(1692).·(1692)<223><220><221>mutation<222>(713)..(714)<223><220><221>mutation<222>(390)..(390)<223><220><221>primer_bind<222>(2128)..(2148)<223><220><221>primer_bind<222>(788)..(805)<223><220><221>primer_bind〈222〉(9)·.(28)〈223〉〈220〉<221>primer_bind〈222〉⑴··(18)〈223〉〈220〉<221>mutation〈222>(28).·(28)〈223〉<400>1tggacatgggagtttctcagacattccccttctgaatactgcggttggtcatattcttca60ttccttcattctcgttccataccatggttggtaagtcatttattttaacttcttttttca120tgcaaatttattcttgttttcgtatttcttacattttccttgtcattcttggtgcatgtt180agcaaacagtaatctgataactgaaaatatattaatttttcatagtaaaataatgcatgt240gactaaaagcatcaaaatctttagcatcgaagaaaaaagaaccaaacttttatttaatgc300tatgggcctatttatggtccaattagctattatcatatgacatgtccttgaataaattaa360tgtataagtttaatataatatttatatatttttgttttaatggcttattttattgttaaa420tggatacatcagcttgaaatatctacgaacatgcatcattttcctagatacatttgtttg480ttgctcaaaaaatgaataacgtagttaaacgagtgagattcttagcatctgcctcgaaaa540cgatatgttattgacaattccaatttcatttttatgaaaataaaataatagtttatttta600taattgggggtggttgcaggagaataagccatcggacacaccaccagaaccatggccatg660ttgaaaacgacgagtcttgggttccggtaatccccctctcatatttttttttttcttttt720ttgaaactctttcattttaattttcttagaattctatgtatttattttaatcaatccttt780ttccagtgtgaggcttggacgaccacttgtcagatttgtcgtttagctgtagtaaacaac840tgatttaaattgtttatggtactgtagttaactttaacaacgggccacttatattcgagc900cattggcataaaatgattcttctcgaaattcgtttacttttcttagtatttttcagtttt960gtagtttacgtagaactaataaaaagaaaaaaacttataaacacaccacatgcaatgaat1020aaattcgaatatataaccatactgttaaatattaattaacattttaatcttaattttgca1080ttccagttgccagaaaaattatacaagaatttgtcccacagtacacggatgctcagatac1140actgtccctctccccatgctcgcttaccctctctatctggtaaatcctaattcctcattt1200ttcttcctgattataattacaattttgaatttttagattttgagtattaactaaatataa1260attaaatttgtttggggatgactacagtggtacagaagtcctggtaaagaagggtcacat1320tataacccatacagtagtttatttgccccaagcgagagaaagcttattgcaacttcaact1380acttgctggtcgatcatgttggccactcttgtttatctatcattcctcgttggtccagtc1440acagttctaaaagtctatggtgttccttacattgtaagtttcatatatttcattattata1500tcattgctaatataatttgtttttgacataaagttttggaaaaatttcagatctttgtaa1560tgtggttggacgctgtcacgtacttgcatcatcatggtcacgatgataagttgccttggt1620acagaggcaaggtaagtagatcaacattaatttataagaagcaacaatgattagtatttg1680attaatctaaattattgatgttatgtgtacaataataggaatggagttatttatgtggag1740gattaacaactattgatagagattacgggatcttcaacaacattcatcacgatattggaa1800ctcacgtgatccatcatcttttcccacaaatccctcactatcacttggttgatgccgtga1860gtgatctcgctctctttctagtttcatttgattaaaattaaagggtgattaattactaaa1920ttagtgatcttaattaatgatatgcgacagacgaaatcagctaaacatgtgttgggaaga1980tactacagagaaccaaagacgtcaggagcaataccgatccacttggtggaaagtttggtg2040gcaagtattaagaaagatcattacgtcagtgacactggtgatattgtcttctacgagaca2100gatccagatctctacgtttatgcttctgacaaatccaaaatcaactaa2148<210>2<211>2137<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene<222>(1)..(2137)<223><220><221>primer_bind<222>(2117)··(2137)<223><220><221>primer_bind<222>(787)..(804)<223><220><221>primer_bind<222>(9)..(28)<223><220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>2tggacatgggagtttctcagacattcctcttctgaatactgcggttggtcatattcttca60ttccttcattctcgttccataccatggttggtaagtcatttattttaacttcttttttca120tgcaaatttattcttgttttcgtatttcttacattttccttgtcattcttggtgcatgtt180agcaaacagtaatctgataactgaaaatatattaatttttcatagtaaaataatgcatgt240gactaaaagcatcaaaatctttagcatcgaagaaaaaagaaccaaacttttatttaatgc300tatgggcctatttatggtccaattagctattatcatatgacatgtccttgaataaattaa360tgtataagtttaatataatatttatatatatttgttttaatggcttattttattgttaaa420tggatacatcagcttgaaatatctacgaacatgcatcattttcctagatacatttgtttg480ttgctcaaaaaatgaataacgtagttaaacgagtgagattcttagcatctgcctcgaaaa540cgatatgttattgacaattccaatttcatttttatgaaaataaaataatagtttatttta600taattgggggtggttgcaggagaataagccatcggacacaccaccagaaccatggccatg660ttgaaaacgacgagtcttgggttccggtaatccccctctcatattttttttttctttttt720tgaaactctttcattttaattttcttagaattctatgtatttattttaatcaatcctttt780tccagtgtgaggcttggacgaccacttgtcagatttgtcgtttagctgtagtaaacaact840gatttaaattgtttatggtactgtagttaactttaacaacgggccacttatattcgagcc900attggcataaaatgattcttctcgaaattcgtttacttttcttagtatttttcagttttg960tagtttacgtagaactaataaacttataaacacaccacatgcaatgaata1020aattcgaatatataaccatactgttaaatattaattaacattttaatcttaattttgcat1080tccagttgccagaaaaattatacaagaatttgtcccacagtacacggatgctcagataca1140ctgtccctctccccatgctcgcttaccctctctatctggtaaatcctaattcctcatttt1200tcttcctgattataattacaattttgaatttttagattttgagtattaactaaatataaa1260ttaaatttgtttggggatgactacagtggtacagaagtcctggtaaagaagggtcacatt1320ataacccatacagtagtttatttgccccaagcgagagaaagcttattgcaacttcaacta1380cttgctggtcgatcatgttggccactcttgtttatctatcattcctcgttggtccagtca1440cagttctaaaagtctatggtgttccttacattgtaagtttcatatatttcattattatat1500cattgctaatataatttgtttttgacataaagttttggaaaaatttcagatctttgtaat1560gtggttggacgctgtcacgtacttgcatcatcatggtcacgatgataagttgccttggta1620cagaggcaaggtaagtagatcaacattaatttataagaagcaacacttgattaatctaaa1680ttattgatgttttgtgtacaataataggaatggagttatttacgtggaggattaacaact1740attgatagagattacgggatcttcaacaacattcatcacgatattggaactcacgtgatc1800catcatcttttcccacaaatccctcactatcacttggttgatgccgtgagtgatctcgct1860ctctctctagtttcatttgattaaaattaaagggtgattaattactaaattagtgatctt1920aattaatgatatgcgacagacgaaatcagctaaacatgtgttgggaagatactacagaga1980accaaagacgtcaggagcaataccgatccacttggtggaaagtttggtggcaagtattaa2040gaaagatcattacgtcagtgacactggtgatattgtcttctacgagacagatccagatct2100ctacgtttatgcttctgacaaatccaaaatcaactaa2137<210>3〈211>1963<212>DNA〈213〉甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)〈220〉<221>gene〈222〉⑴··(1963)〈223〉〈220〉<221>mutation<222>(1450)..(1450)<223><220><221>primer_bind<222>(1943)··(1963)<223><220><221>primer_bind<222>(1840)..(1859)<223><220><221>primer_bind<222>(1432)··(1450)<223><220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>3actccaccctgagaacttctcaataatcatgctcttagtgctctaagaagggtccttaac60aaaatattaataataagatatagtgtgggcccaaaaaaaaacaaaaaaccggttacaaaa120gtcgcgaaagaaggatcgattttggtcttttacttgtactgtttgtggatcccactggtg180gtggtccgcgattggtttcttttttaatttaatttattttttttaatcggttaagaaaccaaaaaacagttttaatcatggcctcatgttggggttgagttttatattct300gataagaatcccatcttaaaaaccccgttaaacatgctcttaccatctgcttcgaaaatg360atatgttattgacaattccaatttcatttttatgaaaataaaataatagtttattttata420actgagggtggttgcaggagaataagccatcggacacaccaccagaaccatggccatgtt480gaaaacgacgagtcttgggttccggtaatctttccctctctcatatttttttttcttttt540ttttgaaattctttcattttaattttcttaggattctatgtatttattttaatcaatcct600ttttccagtttgaggctaggacgaccacttgtcagatttgtcgtttagctgtagtaaaca660actgatttaaattgtttatagtactgtagttaactttaacaacggaccacttatattcga720gccattggcataaaatgattcttctcgaaattcgtttacttttcttagtatttttcaatt780ttggagtttacgtagaactaataaaaagaaaaacttataatgcaatgaat840aaattcgaatatataaccatactgttaaatattaatttacattttaatcttaattttgca900ttccagttgccagaaaaattatacaagaatttgtcccacagtacacggatgctcagatac960actgtccctctccccatgctcgcttaccctctctatctggtaaatcctaattctaatttt1020cttctgattataattacaattttgaatttttagattttgagtattaactaaatataaatt1080aaatttgtttggggatgactacagtggtacagaagtcctggtaaagaagggtcacattat1140aacccatacagtagtttatttgccccaagcgagagaaagcttattgcaacttcaactact1200tgctggtcgatcgtgttggccactcttgtttatctatcattcctcgttggtccagtcaca1260gttctaaaagtctatggtgttccttacattgtaagtttcatatatttctttattatatca1320ttgctaatataatttgtttttgacataaaagttttggaaaaatttcagatctttgtaatg1380tggttggacgctgtcacgtacttgcatcatcatggtcacgatgataagctgccttggtac1440agaggcaagataagtagatcaacattatttataagaagcaataatgattagtagttgaat1500aatctgaatttttgatgtttttgtacaataataggaatggagttatttacgtggaggatt1560aacaactgttgatagagattacgggatcttcaacaacattcatcacgatattggaactca1620cgtgatccatcatcttttcccacaaatccctcactatcacttggtcgatgccgtgagtga1680tctcgctctctctctagtttcatttgattatattaaagggtgattaattactaaattagt1740gatcttaattaatgacatgcgacagacgaaagcagctaaacatgtgttgggaagatacta1800cagagaaccaaagacgtcaggagcaataccgatccacttagtggaaagtttggtggcaag1860tattaagaaagatcattacgtcagtgacactggtgatattgtcttctacgagacagatcc1920agatctctacgtttatgcttctgacaaatccaaaatcaactaa1963<210>4<211>1963<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)<220><221>gene<222>(1)..(1963)<223><220><221>primer_bind<222>(1943)··(1963)<223><220><221>primer_bind<222>(1840)..(1859)<223><220><221>primer_bind<222>(1432)··(1450)<223><220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>4actccaccctgagaacttctcaataatcatgctcttagtgctctaagaagggtccttaac60aaaatattaataataagatatagtgtgggcccaaaaaaaaacaaaaaaccggttacaaaa120gtcgcgaaagaaggatcgattttggtcttttacttgtactgtttgtggatcccactggtg180gtggtccgcgattggtttcttttttaatttaatttattttttttaatcggttaagaaaccaaaaaacagttttaatcatggcctcatgttggggttgagttttatattct300gataagaatcccatcttaaaaaccccgttaaacatgctcttaccatctgcttcgaaaatg360atatgttattgacaattccaatttcatttttatgaaaataaaataatagtttattttata420actgagggtggttgcaggagaataagccatcggacacaccaccagaaccatggccatgtt480gaaaacgacgagtcttgggttccggtaatctttccctctctcatatttttttttcttttt540ttttgaaattctttcattttaattttcttaggattctatgtatttattttaatcaatcct600ttttccagtttgaggctaggacgaccacttgtcagatttgtcgtttagctgtagtaaaca660actgatttaaattgtttatagtactgtagttaactttaacaacggaccacttatattcga720gccattggcataaaatgattcttctcgaaattcgtttacttttcttagtatttttcaatt780ttggagtttacgtagaactaataaaaagaaaaacttataatgcaatgaat840aaattcgaatatataaccatactgttaaatattaatttacattttaatcttaattttgca900ttccagttgccagaaaaattatacaagaatttgtcccacagtacacggatgctcagatac960actgtccctctccccatgctcgcttaccctctctatctggtaaatcctaattctaatttt1020cttctgattataattacaattttgaatttttagattttgagtattaactaaatataaatt1080aaatttgtttggggatgactacagtggtacagaagtcctggtaaagaagggtcacattat1140aacccataeagtagtttatttgccccaagcgagagaaagcttattgcaacttcaactact1200tgctggtcgatcgtgttggccactcttgtttatctatcattcctcgttggtccagtcaca1260gttctaaaagtctatggtgttccttacattgtaagtttcatatatttctttattatatca1320ttgctaatataatttgtttttgacataaaagttttggaaaaatttcagatctttgtaatg1380tggttggacgctgtcacgtacttgcatcatcatggtcacgatgataagctgccttggtac1440agaggcaaggtaagtagatcaacattatttataagaagcaataatgattagtagttgaat1500aatctgaatttttgatgtttttgtacaataataggaatggagttatttacgtggaggatt1560aacaactgttgatagagattacgggatcttcaacaacattcatcacgatattggaactca1620cgtgatccatcatcttttcccacaaatccctcactatcacttggtcgatgccgtgagtga1680tctcgctctctctctagtttcatttgattatattaaagggtgattaattactaaattagt1740gatcttaattaatgacatgcgacagacgaaagcagctaaacatgtgttgggaagatacta1800cagagaaccaaagacgtcaggagcaataccgatccacttagtggaaagtttggtggcaag1860tattaagaaagatcattacgtcagtgacactggtgatattgtcttctacgagacagatcc1920agatctctacgtttatgcttctgacaaatccaaaatcaactaa1963<210>5<211>797<212>DNA〈213〉甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)〈220〉<221>gene<222>(1)..(797)<223><220><221>mutation<222>(780)..(781)<223><220><221>mutation<222>(19)..(20)<223><220><221>primer_bind<222>(780)..(797)<223><220><221>primer_bind<222>(1)..(20)<223><400>5ggagtttctcagacattcgccttctgaatactgcggttggtcatattcttcattccttca60ttctcgttccataccatggttggtaagtcatttattttaacttcttttttcatgcaaat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編號(hào)為YQ-fad32-2正向引物5‘-CCTTGGTACAGAGGCAATG-3‘，反向引物5‘-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3‘。3.一種甘藍(lán)型油菜低亞麻酸含量的共顯性SNP分子標(biāo)記的制備方法，按照以下步驟(1)用引物對(duì)HY-fad31、HY-fad32分別擴(kuò)增低亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A177基因組DNA，獲得4個(gè)DNA片段；回收測(cè)序，獲得如序列表SEQIDNO:1，SEQIDNO:2，SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的核苷酸序列；(2)分析比較所述SEQIDNO1和SEQIDNO:2與SEQIDNO3和SEQIDNO4所示核苷酸的差異，采用引物3’端錯(cuò)配策略將正向引物和反向引物的3’端的第2位堿基同時(shí)進(jìn)行錯(cuò)配處理，設(shè)計(jì)得到如權(quán)利要求2所示的引物對(duì)YQ-fad31-l、YQ-fad31-2、YQ-fad32-l和YQ-fad32-2；(3)用步驟(2)所述的引物對(duì)在低亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A177中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到甘藍(lán)型油菜亞麻酸含量的共顯性SNP標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO7和SEQIDNO8所示4.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在低亞麻酸甘藍(lán)型油菜的輔助選擇中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)在低亞麻酸甘藍(lán)型油菜的輔助選擇中的應(yīng)用。6.一種引物3’端錯(cuò)配方法在甘藍(lán)型油菜多態(tài)性SNP標(biāo)記的開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用，其特征在于設(shè)計(jì)引物時(shí)將引物3’端的第2-4位堿基進(jìn)行一個(gè)堿基的錯(cuò)配處理。7.一種在多倍體作物(如甘藍(lán)型油菜、棉花等)中開(kāi)發(fā)基于PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳SNP標(biāo)記的方法的應(yīng)用，其特征在于設(shè)計(jì)引物時(shí)將正向引物和反向引物同時(shí)采用3’端錯(cuò)配，將引物3’端的第2-4位堿基進(jìn)行一個(gè)堿基的錯(cuò)配處理。全文摘要本發(fā)明屬于油菜分子育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與甘藍(lán)型油菜亞麻酸含量緊密連鎖的共顯性SNP分子標(biāo)記的制備，及其作為標(biāo)記在輔助選擇低亞麻酸甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用。用引物擴(kuò)增低亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A254和高亞麻酸甘藍(lán)型油菜品系甲A177基因組DNA，分別得到兩個(gè)DNA擴(kuò)增片段，然后對(duì)所述4個(gè)DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序、核苷酸序列比對(duì)；根據(jù)序列的差異，將正向引物和反向引物的3’端的第2個(gè)堿基同時(shí)進(jìn)行錯(cuò)配處理，設(shè)計(jì)了引物對(duì)YQ-fad31-1、YQ-fad31-2、YQ-fad32-1和YQ-fad32-2。將引物對(duì)YQ-fad31-1、YQ-fad31-2、YQ-fad32-1和YQ-fad32-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增和群體檢測(cè)效果分析，進(jìn)而得到與甘藍(lán)型油菜低亞麻酸基因連鎖的共顯性SNP分子標(biāo)記，本發(fā)明為油菜分子育種提供了一種新標(biāo)記。本發(fā)明還第一次將引物3’端錯(cuò)配策略應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜SNP多態(tài)性標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和檢測(cè)，并第一次利用正向引物和反向引物同時(shí)錯(cuò)配手段在異源多倍體作物甘藍(lán)型油菜中開(kāi)發(fā)出基于PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳SNP標(biāo)記。同時(shí)本發(fā)明公開(kāi)了制備所述分子標(biāo)記的方法及應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/11GK101818196SQ20091027343公開(kāi)日2010年9月1日申請(qǐng)日期2009年12月28日優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日發(fā)明者傅廷棟,周永明,楊慶勇申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)