專利名稱：：一種矮生型狗牙根新品種的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于草坪草育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種矮生型狗牙根草坪草新品種的培育方法。
背景技術(shù)：
：狗牙根(Cynodondactylon(L.)Pers.)別名絆根草、爬根草、百慕大草等。是禾本科狗牙根屬多年生暖季型草坪草。原產(chǎn)非洲，廣布于熱帶、亞熱帶和溫暖地區(qū)。我國黃河流域以南各地均有野生種。是長江中下游及其以南地區(qū)鋪設(shè)觀賞草坪、運(yùn)動(dòng)草坪和游息草坪的主要草坪草品種。目前用作建植草坪的狗牙根品種，大部分都存在直立莖生長速度快的特點(diǎn)，在草坪養(yǎng)護(hù)中，特別是運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪的養(yǎng)護(hù)中，修剪次數(shù)頻繁，使養(yǎng)護(hù)成本居高不下，同時(shí)由于頻繁修剪而導(dǎo)致剪草機(jī)尾氣排放，造成了環(huán)境污染。誘發(fā)突變是作物改良和基因創(chuàng)新的重要手段。輻射誘發(fā)的突變，多是形態(tài)變異，如花葉、金邊、黃化等，對(duì)大多數(shù)農(nóng)作物來說是劣變，但這對(duì)觀賞植物來說往往是優(yōu)變(吳楚彬等，綠帝王和花葉芋Y射線輻射誘變?cè)囼?yàn)，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997(5):23-24)。國內(nèi)外利用輻射誘變培育狗牙根新品種的方法已有報(bào)道，但主要集中在抗逆品種的培育上，美國育種家用4-8千拉德的6tlCo-Y射線輻射‘Tifway’和‘TifwayII’，誘導(dǎo)出具有精細(xì)質(zhì)地的草^^^^ΙΦ(HannaWW.InducedmutationsinMidironandTifwaybermudagrasses.AgronAbs,AmerSocAgron,Madison,WI.1990175)；JAM^1Um^iTifgreen'的H匐莖上獲得一個(gè)不育的三倍體自然突變體，選育成‘Tifdrawf’品種，之后，用Y射線1181-2132C·kg—1照射該品種的休眠根莖，產(chǎn)生了158種變異，從中選育了許多新品種，如‘TifVayII’，其表現(xiàn)與‘Tifgreen’相似，但具有較強(qiáng)的抗霜凍性和抗蟲性，iTifgreenII，也是利用Y射線輻射育成的(PowellJB.Mutationinducedinvergetativelypropagatedturftypebermudagrassbygammaradiation.CropSci.，1974,14327-330)。國內(nèi)在草坪草誘變育種方面的工作起步較晚，做了一些初步研究。中國科學(xué)院植物研究所通過對(duì)不同種源的國產(chǎn)狗牙根匍匐莖進(jìn)行輻射，認(rèn)為從種的水平上，狗牙根匍匐莖Y射線的半致死劑量為9000radS；高劑量處理對(duì)狗牙根數(shù)量性狀能夠產(chǎn)生較穩(wěn)定的理想的變異；在色澤上，低劑量的處理，可使50%的種源葉色變深。(郭愛桂等，輻射技術(shù)在國產(chǎn)狗牙根中的初步應(yīng)用，草業(yè)科學(xué)，200017(1)45-47)利用6800rads和9000rads兩個(gè)劑量對(duì)普通狗牙根的10份優(yōu)良選系進(jìn)行輻射處理，對(duì)其誘變后代進(jìn)行觀測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)9000radS是狗牙根匍匐莖的半致死劑量，并且該處理使得狗牙根的葉片性狀和匍匐莖性狀能夠產(chǎn)生較穩(wěn)定的理想變異。利用輻射育種手段從輻射后代中選育新品種是簡單而有效的育種方法。現(xiàn)有技術(shù)中尚未有利用6tlCo-Y射線輻射狗牙根干種子結(jié)合田間篩選和實(shí)驗(yàn)室分子標(biāo)記輔助選擇鑒定培育矮生型狗牙根新品種的方法的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，通過物理誘變，田間選擇和分子標(biāo)記輔助選擇，培育一種適用于草坪用的矮生型狗牙根新品種。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種矮生型狗牙根新品種的培育方法，包括如下步驟1)取狗牙根干種子作為實(shí)驗(yàn)材料，用物理方法進(jìn)行誘變處理，所述的物理方法是采用6tlCo-γ射線輻照狗牙根干種子，輻射劑量為200Gy-500Gy，每處理重復(fù)3次，劑量率為1.OGy/min；2)將輻射處理過的狗牙根種子播于田間，通過形態(tài)特征篩選變異植株；3)利用過氧化物同工酶和ISSR標(biāo)記方法對(duì)變異植株進(jìn)行差異性輔助鑒定，篩選獲得矮生型狗牙根植株。其中步驟3)所述的ISSR標(biāo)記方法所用的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1-10所示。步驟2)所述播種方法為將步驟2)的種子播于塑料穴盤中，每穴一粒，穴內(nèi)的基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖，其體積比為11，重復(fù)3次，播種后在種子上方再覆蓋基質(zhì)lcm，將所述的穴盆放進(jìn)溫室內(nèi)，定時(shí)、等量和均勻澆水；分蘗期將植株移至塑料營養(yǎng)缽內(nèi)，缽內(nèi)基質(zhì)為泥炭土珍珠巖，其體積比為21，營養(yǎng)缽置室外露地?cái)[放。步驟2)所述的形態(tài)指標(biāo)包括節(jié)間長度、葉片長度、葉片寬度、節(jié)間直徑和植株高度。步驟4)所述的過氧化物同工酶鑒定方法為稱取供試材料的嫩葉，在液氮中快速研磨，轉(zhuǎn)入IOml離心管，加入pH7.O磷酸緩沖液1.5ml，于4°C下，6000r/min離心lOmin，取上清液，置-20°C冰箱備用；采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，pH8.3電極緩沖液為Tris-Gly，點(diǎn)進(jìn)樣量為10μ1，以0.05%甘油溴酚蘭為前沿指示劑，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為100V，進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)為200V，將電泳槽置于4°C冰箱中電泳，穩(wěn)流至電泳完畢，染色至藍(lán)色酶帶充分顯色，流水沖洗約30min，使酶帶變?yōu)樽睾稚?，然后照相，制干膠保存。步驟3)所述的ISSR標(biāo)記方法為先用SDS法提取狗牙根葉片總DNA，以狗牙根(材料編號(hào)為HN018狗牙根品種)基因組DNA為模板，反應(yīng)體系為IOXbuffer2μL；IOmMdNTPO.4μL；MgC121.2μL；ISSR弓|物1μL；Taq酶0.2μL；模板DNA2μL；ddH2013.2μL，反應(yīng)體積為20μL，用序列表SEQIDNO1-10所示的引物對(duì)對(duì)DNA樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min；95°C30s,58°C45s,72°C90s，進(jìn)行復(fù)性梯度降溫，5個(gè)循環(huán)后，固定在95°C30S，53°C45S，72°C90S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸6min，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳3h，電泳液為1XTAE，在凝膠中加0.5μg.ml_l的EB。電泳后在紫外燈下觀察照相。本發(fā)明所述的矮生型狗牙根新品種培育方法，采用物理方法誘變，人工田間篩選和分子標(biāo)記輔助選擇，有利于篩選和穩(wěn)定突變體，由于輻射處理的種子數(shù)量大，輻射后及時(shí)播種，先通過田間實(shí)驗(yàn)從輻射后代中篩選出矮生優(yōu)良形態(tài)變異株，再對(duì)優(yōu)良形態(tài)變異株進(jìn)行過氧化物同工酶和分子標(biāo)記輔助鑒定，因而提高了矮生型狗牙根新品種選育的準(zhǔn)確性和選擇效率。序列表SEQIDNO:1_10是ISSR標(biāo)記引物對(duì)的核苷酸序列；圖1是通過形態(tài)特征篩選的變異植株與其對(duì)照?qǐng)D片；圖2是14個(gè)狗牙根材料的POD同工酶譜模式；圖3是14個(gè)狗牙根材料基于遺傳相似系數(shù)的UPMGA聚類圖；圖4是14個(gè)狗牙根材料的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果(引物N22)；圖5是基于ISSR標(biāo)記所得狗牙根遺傳相似系數(shù)聚類分析圖；圖6是篩選的矮生型狗牙根建植的草坪。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1利用物理輻射誘變培育矮生型狗牙根新品種1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料表1實(shí)驗(yàn)材料編號(hào)和來源<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1.2種子輻射將狗牙根干種子(含水量為13-14%)分別裝入小塑料袋內(nèi)，于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院輻照中心進(jìn)行6ciCo-Y射線輻照。輻射處理設(shè)照射劑量為200Gy、250Gy、300Gy、350Gy、400Gy、450Gy、500Gy，8個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，劑量率為1.OGy/min,各輻射處理的干種子數(shù)為2.5g，保證了足夠的實(shí)驗(yàn)樣本。1.3播種及移栽輻射處理后的狗牙根干種子播于128穴(8X16cm)塑料穴盤中，每穴一粒，穴內(nèi)基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖，其體積比為11，重復(fù)3次，播好后在種子的表面覆蓋基質(zhì)lcm。將所述的塑料穴盤移動(dòng)至溫室內(nèi)，該溫室配有自走式澆水機(jī)，可以對(duì)各穴盤定時(shí)、等量、均勻地澆水。在狗牙根的分蘗期將植株移栽至塑料營養(yǎng)缽內(nèi)，營養(yǎng)缽規(guī)格為12XIOcm,營養(yǎng)缽基質(zhì)為東北泥炭土珍珠巖=21(體積比)，將營養(yǎng)缽置于室外露地?cái)[放，按照常規(guī)植物的日常養(yǎng)護(hù)管理，管理水平相同。1.4輻射后代形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)對(duì)輻照處理后的狗牙根后代形態(tài)指標(biāo)觀測(cè)主要包括節(jié)間長度，葉片長度，葉片寬度，節(jié)間直徑和植株高度。節(jié)間長度為從根頸向上記數(shù)的第5個(gè)節(jié)間的長度；葉片長度和葉片度為第5個(gè)節(jié)間上的葉片的測(cè)量數(shù)值；每個(gè)指標(biāo)均選取3個(gè)枝條進(jìn)行測(cè)量。植株高度為從植株根頸起，向上生長的最大自然高度。1.5室內(nèi)差異性檢測(cè)1.5.1過氧化物同工酶(POD)分析采集14個(gè)供試材料的幼嫩葉片作為實(shí)驗(yàn)材料。分別稱取0.5g嫩葉，在液氮中快速研磨，轉(zhuǎn)入IOml離心管，加入1.5ml磷酸緩沖液(lmol/L磷酸二氫鈉390ml和lmol/L磷酸氫二鈉610ml混合，pH7.0)，4°C下，6000r/min離心lOmin，取上清液，置_20°C冰箱備用。采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，參考郭堯君的方法(郭堯君，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京科學(xué)出版社，1999)，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，電極緩沖液為Tris-Gly(pH8.3)，點(diǎn)進(jìn)樣量為10μ1，以0.05%甘油溴酚蘭為前沿指示劑，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為100V，進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至200V。將電泳槽置于4°C冰箱中電泳。穩(wěn)流至電泳完畢(大約lh)。染色主要參考趙小蘭的配方(趙小蘭，桂花品種的同工酶研究，[碩士論文].武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，1998，中國知網(wǎng))，染色至藍(lán)色酶帶充分顯色，流水沖洗約30min，酶帶變?yōu)樽睾稚?。然后照相，制干膠保存。1.5.2ISSR標(biāo)記分析采集供試的狗牙根植株的幼嫩葉片，液氮中浸置后放在-70°C冰箱中備用。狗牙根幼嫩葉片總DNA的提取采用SDS法(王關(guān)林等，植物基因工程(第二版)[M]，北京科學(xué)出版社，2002)的基礎(chǔ)上稍作改動(dòng)。以狗牙根(材料編號(hào)為HN018，品種為Tifway，購自武漢市洪山區(qū)九峰鄉(xiāng)草坪基地的商業(yè)草皮)的基因組DNA為模板，在20μL反應(yīng)體系中(IOXbuffer2μL；IOmMdNTP0.4μL；MgC121.2μL;ISSR引物1μL;Taq酶0.2μL；模板DNA2μL；ddH2013.2μL，反應(yīng)體積為20μL)從NlO等38個(gè)ISSR引物(本課題組設(shè)計(jì)，invitrogen公司合成)中篩選出10條重復(fù)性好、擴(kuò)增性強(qiáng)、多態(tài)性高的穩(wěn)定條帶的ISSR引物(見序列表SEQIDNO1-10所示)，用這10個(gè)引物對(duì)14個(gè)狗牙根DNA樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min；95°C30s，58°C45s,72°C90s，進(jìn)行復(fù)性梯度降溫，5個(gè)循環(huán)后，固定在95°C30S,53°C45S，72°C90S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸6min，在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳3h，電泳液為lXTAE，在凝膠中加0.5μg.ml-l的EB。電泳后在紫外燈下觀察照相。以上反應(yīng)所用的藥品及酶均為Fermentas公司生產(chǎn)。統(tǒng)計(jì)時(shí)將擴(kuò)增條帶的有無轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)“1”和“0”，用EXcel2003計(jì)算兩兩DNA間的相似系數(shù)，相似系數(shù)S=(2Nab/Na+Nb)X100%。公式中Na、Nb、Nab分別代表a種，b種和a、b兩種共有的酶帶數(shù)；對(duì)相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建分子聚類圖，聚類方法應(yīng)用UPMGA法(張俊衛(wèi)等，利用RAPD標(biāo)記鑒定和區(qū)分梅花42個(gè)宮粉型品種，園藝學(xué)報(bào)，2004，31(4):487_490)。用公式多態(tài)性=(總帶數(shù)-共有帶數(shù))/總帶數(shù)X100%，計(jì)算各類群間(或類群內(nèi))的多態(tài)性。2結(jié)果與分析2.1形態(tài)指標(biāo)比較表2:14個(gè)狗牙根輻照材料的形態(tài)指標(biāo)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤，同一列不同英文字母表示數(shù)據(jù)間存在顯著差異(P=0.05)由表2可知14個(gè)狗牙根輻照材料中，葉片最寬的是HN014，寬度為0.30cm,葉片最窄的是HN017，寬度為0.13cm。HN010、HN014和HN016與其對(duì)照HN009之間的差異呈顯著水平，其它形態(tài)變異植株與其對(duì)照間的葉片寬度差異不顯著；葉片長度最長的是HN003，長度為6.27cm，最短的是HN017，長度為1.10cm，各形態(tài)變異植株與其對(duì)照之間的差異都呈顯著水平；從節(jié)間直徑來看，最大的是HN005，直徑為0.26cm，最小的為HN017，直徑為0.Ilcm,除HN016和其對(duì)照HN009差異不明顯外，其它形態(tài)變異植株的節(jié)間直徑和其對(duì)照之間的差異均呈顯著水平；在節(jié)間長度方面，節(jié)間最長的是HN003，長度為3.80cm，最短的是HN017，長度為0.67cm，各形態(tài)變異植株和其對(duì)照之間的節(jié)間長度差異水平顯著；植株的自然高度最高的為HN010，高度為42.52cm,最矮的為HN017，高度為11.25cm。2.2POD分析2.1.1從14個(gè)供試材料總體來分析酶譜分布特征依據(jù)POD酶帶相對(duì)遷移率(Rf值)的大小和酶帶集中程度，所有供試材料的酶譜從負(fù)極到正極都明顯地分為三個(gè)區(qū)(圖2，表3):Rf值在0.018-0.094范圍內(nèi)的酶帶為慢區(qū)，視為A區(qū)；Rf值在0.163-0.325范圍內(nèi)的酶帶為中區(qū)，視為B區(qū)；Rf值在0.445-0.469范圍內(nèi)的酶帶為快區(qū)，視為C區(qū)。在A區(qū)，是14種供試材料酶活性最強(qiáng)、分布最多和最為集中的區(qū)域，共出現(xiàn)了41條酶帶，其中主酶帶為38條，弱帶和痕跡帶為3條。在B區(qū)，共出現(xiàn)了28條酶帶，其中包括5條活性強(qiáng)的主酶帶P4(HN001、HN003、HN007、HN009、HN010)和23條弱帶和痕跡帶。在C區(qū)，共出現(xiàn)了13條酶帶，全部為弱帶和痕跡帶。P2位點(diǎn)上14個(gè)材料均有酶帶出現(xiàn)，說明P2位點(diǎn)是狗牙根不同品系共有的位點(diǎn)。2.1.2從形態(tài)變異植株與其對(duì)照的POD譜帶來分析除變異株系HN010和對(duì)照HN009，變異株系HN012和變異株系HN013的POD酶帶完全相同，變異株系HN015和變異株系HN016的POD酶帶在P8位點(diǎn)上的強(qiáng)弱不同外。形態(tài)變異植株與其對(duì)照之間不僅酶帶總數(shù)不同，而且在各個(gè)區(qū)域分布的位點(diǎn)及帶級(jí)也明顯的不同。表318種狗牙根屬植物材料POD酶譜的Rf值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注“一”表示無酶帶。2.1.314份狗牙根材料的聚類分析14個(gè)材料間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.250-1.000，平均為0.825，遺傳相似性變化較大。從聚類樹狀圖(圖3)可見，以酶譜相似系數(shù)0.83(虛線Li)為閾值時(shí)，可以把供試的14個(gè)材料聚為4類；第I類包括1個(gè)種源HN011；第II類包括6個(gè)種源HN016，HN015，HN013，HN012，HN018，HN007；第III類包括2個(gè)種源HN017，HN003；第IV類包括5個(gè)種源HN010,HN009,HN014,HN005,HN001。2.3ISSR分析2.3.1篩選的ISSR引物序列從38個(gè)引物中篩選出10個(gè)多態(tài)性好的引物，其中2核苷酸重復(fù)序列9個(gè)，占90%;5核苷酸重復(fù)序列1個(gè)(N46)。2核苷酸重復(fù)序列中(AG)n較多，占60%，產(chǎn)生的多態(tài)性條帶也最多，說明狗牙根基因組中含有豐富的AG/GA重復(fù)序列。所用引物的編號(hào)及序列見表4，其中R=(A，G)，Y=(C，Τ)。表4ISSR分析所用引物序列和擴(kuò)增結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>說明表4中“序列1”即本發(fā)明實(shí)際所述的“SEQIDNO:1”，如此類推；限于表4的位置，表4對(duì)類似的序列編號(hào)進(jìn)行了縮寫。2.3.214個(gè)狗牙根材料間擴(kuò)增結(jié)果分析用篩選出的10個(gè)ISSR引物對(duì)(見表4和序列表SEQIDMO:1_10)對(duì)14個(gè)狗牙根材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出98條帶，不同引物擴(kuò)增條帶數(shù)位7_15條不等，平均每個(gè)引物產(chǎn)生9.8條帶，其中多態(tài)性條帶共94條，多態(tài)性條帶比率平均為95.92%。ISSR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA片段大小一般在250-2000bp之間。以圖4為例來看，引物N22對(duì)14個(gè)狗牙根材料擴(kuò)增的帶數(shù)為10條，其中條帶數(shù)最多的為材料HN009、HN016和HN018，各擴(kuò)增出7條帶，條帶數(shù)最少的是HN001，擴(kuò)增出4條帶。從各變異植株和其對(duì)照的擴(kuò)增條帶數(shù)以及條帶特征來看，均存在差異。2.3.3遺傳相似系數(shù)和聚類分析14個(gè)品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.46-0.82，平均為0.62，遺傳相似性變化較大。基于ISSR標(biāo)記所得遺傳相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析，獲得圖5結(jié)果。由圖5可見，在遺傳相似系數(shù)(GS)為0.654處作切割線Ll時(shí)，14份狗牙根材料可分為3個(gè)類群。A大類包括5個(gè)材料(HN014、HNO16,HN015、HNO10,HN009)；B大類包括5個(gè)材料(HN017、HNO18,HN013、HN012、HN011)；C大類包括4個(gè)材料(HN005、HN007、HN003、HN001)。序列表<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種矮生型狗牙根新品種的培育方法<130><141>2009-12-24<160>10<170>PatentInversion3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220〉<221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>1agagagagagagagagyc18<210>2<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>2agagagagagagagagyg18<210>3<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>3agagagagagagagagyt18<210>4<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>4agagagagagagagagya18<210>5<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>5gagagagagagagagaya18<210>6<211>18<212>DNA<213>狗牙豐艮(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>6gagagagagagagagayt18<210>7<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>7gtgtgtgtgtgtgtgtya18<210>8<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>8gtgtgtgtgtgtgtgtra18<210>9<211>18<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(18)<223><400>9acacacacacacacacya18<210>10<211>15<212>DNA<213>狗牙根(Cynodondactylon(L)Pers.)<220><221>primer_bind<222>(1)..(15)<223><400>10ggggtggggtggggt1權(quán)利要求一種矮生型狗牙根新品種的培育方法，其特征包括如下步驟1)取狗牙根干種子作為實(shí)驗(yàn)材料，用物理方法進(jìn)行誘變處理，所述的物理方法是采用60Co-γ射線輻照狗牙根干種子，輻射劑量為200Gy-500Gy，每處理重復(fù)3次，劑量率為1.0Gy/min；2)將輻射處理過的狗牙根種子及時(shí)播于田間，通過形態(tài)特征篩選變異植株；3)利用過氧化物同工酶和ISSR標(biāo)記方法對(duì)變異植株進(jìn)行差異性輔助鑒定，篩選獲得矮生型狗牙根植株；其中步驟3)所述的ISSR標(biāo)記方法所用的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1-10所示。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述播種方法為將步驟2)的種子播于塑料穴盤中，每穴一粒，穴內(nèi)的基質(zhì)為泥炭土和珍珠巖，其體積比為11，重復(fù)3次，播種后在種子上方再覆蓋基質(zhì)1cm，將所述的穴盆放進(jìn)溫室內(nèi)，定時(shí)、等量和均勻澆水；分蘗期將植株移至塑料營養(yǎng)缽內(nèi)，缽內(nèi)基質(zhì)為泥炭土珍珠巖，其體積比為21，營養(yǎng)缽置室外露地?cái)[放。3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的形態(tài)指標(biāo)包括節(jié)間長度、葉片長度、葉片寬度、節(jié)間直徑和植株高度。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述的過氧化物同工酶鑒定方法為稱取供試材料的嫩葉，在液氮中快速研磨，轉(zhuǎn)入IOml離心管，加入pH7.O磷酸緩沖液1.5ml，于4°C下，6000r/min離心lOmin，取上清液，置_20°C冰箱備用；采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，pH8.3電極緩沖液為Tris-Gly，點(diǎn)進(jìn)樣量為10μ1，以0.05%甘油溴酚蘭為前沿指示劑，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為100V，進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)為200V，將電泳槽置于4°C冰箱中電泳，穩(wěn)流至電泳完畢，染色至藍(lán)色酶帶充分顯色，流水沖洗約30min，使酶帶變?yōu)樽睾稚?，然后照相，制干膠保存。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述的ISSR標(biāo)記方法為先用SDS法提取狗牙根葉片總DNA，以狗牙根基因組DNA為模板，反應(yīng)體系為IOXbuffer2μL；IOmMdNTP0.4μL；MgC121.2μL;ISSR引物1μL;Taq酶0.2μL；模板DNA2μL；ddH2013.2μL，反應(yīng)體積為20μL，用序列表SEQIDNO:1_10所示的引物對(duì)對(duì)DNA樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性2min；95°C30s,58°C45s,72°C90s，進(jìn)行復(fù)性梯度降溫，5個(gè)循環(huán)后，固定在95°C30S，53°C45S，72°C90S進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸6min，在2.O%瓊脂糖凝膠中電泳3h，電泳液為1XTAE，在凝膠中加0.5μg.ml_l的EB，電泳后在紫外燈下觀察并照相。全文摘要本發(fā)明屬于草坪草育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種矮生型狗牙根新品種的培育方法。本發(fā)明的特征在于，通過輻射誘變狗牙根種子，進(jìn)行田間篩選，結(jié)合分子標(biāo)記和同工酶鑒定等輔助選育，獲得市場(chǎng)上所需要的矮生型狗牙根新品種。本發(fā)明的輻射源為通用的60Co-γ射線，其劑量為200Gy-500Gy，劑量率為1.0Gy/min。本發(fā)明獲得的狗牙根新品種矮生特性明顯，持綠性好，培育的矮生型狗牙根新品種建植的草坪在生長期內(nèi)基本上免修剪。文檔編號(hào)C12Q1/28GK101810138SQ20091027337公開日2010年8月25日申請(qǐng)日期2009年12月25日優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日發(fā)明者劉國鋒,包滿珠,葉要妹,寧國貴,張俊衛(wèi),王文恩,胡惠蓉申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)