專利名稱：：一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用。
背景技術(shù)：
：煙酰胺俗名VB3，又名尼克酰胺(Nicotinamide,Niacinamide)，化學名為3_吡啶甲酰胺，吡啶_3-甲酰胺等，分子式C6H6N20，分子量122.13，為白色針狀結(jié)晶或粉末，熔點12913rC，比重1.400。易溶于水、能溶于乙醇和甘油，不溶于醚，無臭、略帶苦味，微毒。煙酸、煙酰胺屬B族維生素，統(tǒng)稱維生素PP，在實際應用中可等量替代，自然界的煙酸存在于肝、腎、酵母和米糠中，是生物體內(nèi)脫氫輔酶I或II的組分，參與碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。它們在醫(yī)藥中可用于治療糙皮病等，還可以添加到食品和面粉中用以補充人體所需的維生素，其最大的應用領(lǐng)域是用作飼料添加劑。工業(yè)上，煙酰胺、煙酸主要是以吡啶類化合物為原料生產(chǎn)的，世界煙酰胺、煙酸的生產(chǎn)主要集中在西歐和美國，日本也有少量生產(chǎn)。全球煙酰胺、煙酸年產(chǎn)能4.2萬t/a，年產(chǎn)量達3.0萬噸，主要生產(chǎn)國有瑞士、比利時、美國、日本及中國等。主要生產(chǎn)廠家有瑞士龍沙(1.5萬t/a)、比利時德固賽(能力為8500t/a)、美國Reilly、日本Yuyigosei公司以及美國內(nèi)貝塔公司等。國內(nèi)生產(chǎn)廠家受原料進口限制，生產(chǎn)規(guī)模普遍較小，主要有廣州龍沙(屬于瑞士龍沙)、江蘇南通醋酸化工、浙江新昌制藥廠等。在生產(chǎn)中主要的工藝就是將3-甲基吡啶(PIC)氨氧化生成3-氰基吡啶(NSN)，再經(jīng)化學水解得到煙酰胺或煙酸。瑞士龍沙公司以2-甲基-l，5-戊二胺(MPDA)為原料合成3-甲基吡啶，再經(jīng)生化水解得煙酰胺，該技術(shù)的應用使龍沙公司的煙酰胺生產(chǎn)技術(shù)在世界上處于領(lǐng)先地位。其中的生化法主要工藝如下使用第三代丙烯酰胺菌種RhodococcusrhodochrousJl的固定化細胞將3-氰基吡啶水解為煙酰胺，采用連續(xù)攪拌釜，沿工藝流程方向?qū)舛葹?020%的3-氰基吡啶連續(xù)進料，并逆流投入生物催化劑。酶水解生產(chǎn)所需要的酰胺的選擇性>99%，轉(zhuǎn)化率為100%。近年來，國內(nèi)不少單位在丙烯腈生物催化合成丙烯酰胺的研究中，對腈水合酶/腈水解酶菌種的篩選和工業(yè)化應用也進行了較深入的研究，研究單位有上海農(nóng)藥所，浙江工業(yè)大學，清華大學和中科院生命有機化學國家重點實驗室等。其中上海農(nóng)藥所先后承擔了國家"七五"，"八五"，"九五"期間丙烯酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)的重大課題，并成功開發(fā)出了煙腈微生物催化為煙酰胺技術(shù)，且申請有專利。在此基礎上，并于2003年7月份在與浙江醫(yī)藥股份有限公司合作，在浙江來益生物技術(shù)有限公司建立了0.2wt/a規(guī)模的煙酰胺生產(chǎn)裝置。如上海市農(nóng)藥研究所的專利CN1424402中報道了采用丙酸棒桿菌產(chǎn)生的腈水合酶將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化成煙酰胺。在轉(zhuǎn)化過程中，當產(chǎn)物濃度>5%時用ultraflow膜過濾系統(tǒng)出產(chǎn)物，同時開始補加3-氰基吡啶和水，等產(chǎn)物的累積濃度^10%以后一次性出罐。瑞士龍沙股份有限公司的專利CN1154364A中報道了采用固定化的紅球菌屬rhodochrous微生物，再多段連續(xù)槽形反應器中進行3-氰基吡啶的催化水合反應。其反應液中3-氰基吡啶的含量在1020%重量之間，因此，反應結(jié)束后產(chǎn)物煙酰胺的濃度也基本不超過20%。浙江愛迪亞營養(yǎng)科技開發(fā)有限公司的專利CN1952114A中報道了一種產(chǎn)腈水合酶的谷氨酸棒桿菌，經(jīng)過固定化處理后在水溶液中轉(zhuǎn)化3_氰基吡啶，最終在反應物總重量中所加入的3-氰基吡啶的重量為1025%。以上專利都是采用生物催化的方法，以3-氰基吡啶為底物，產(chǎn)腈水合酶的微生物作生物催化劑進行水合反應。期間向反應釜中一次性添加生物催化劑，連續(xù)或間隙的補加底物3-氰基吡啶進行水合反應，反應結(jié)束后得到濃度較低的煙酰胺反應液。以上傳統(tǒng)生物催化工藝的不足之處在于生物催化劑一次性加入，隨著反應時間的延長，細胞受底物和產(chǎn)物的抑制效果逐漸增加，反應速度下降，酶活降低，只能被動的在較低產(chǎn)物濃度時選擇放料，最終難以得到高濃度的產(chǎn)物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株新的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242。本發(fā)明的另一目的是提供該細菌在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用。本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到—株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242，其發(fā)酵產(chǎn)物是產(chǎn)腈水合酶的細胞，腈水合酶能催化3-氰基吡啶進行水合反應生成煙酰胺?？莶菅挎邨U菌KR2(CGMCCNo.3242)具有以下微生物學特征1.形態(tài)學特征在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48小時后出現(xiàn)圓形光滑的單菌落，灰白色，不透明，表面濕潤，邊緣光滑，整個菌落凸起，易挑?。荤R檢成桿狀，大小長為(0.50.8um)X(1.52.5um)，芽孢中生。2.培養(yǎng)學特征本菌株在以下3種培養(yǎng)基中3(TC下培養(yǎng)4896小時后的培養(yǎng)特征見表1。表1枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)在3種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基名稱菌落顏色及形狀營養(yǎng)瓊脂菌落凸起，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，呈乳白色至灰白色，無可溶性色素營養(yǎng)肉湯生長旺盛，灰黃色，渾濁蛋白胨査氏瓊脂菌落平坦而厚，表面濕潤，邊緣光滑，不透明，灰黃色，無可溶性色素3.生理生化特征表2枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)生理生化性質(zhì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(注表中+表示陽性，-表示陰性。)枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)的培養(yǎng)方法如下(1)種子液制備先進行枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)斜面種子制備，將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)接種到滅過菌的斜面培養(yǎng)基上后在2035t:下培養(yǎng)37天，刮取35環(huán)菌種接種到裝有已滅菌的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在溫度為2035t:，轉(zhuǎn)速為100300rpm下振蕩培養(yǎng)30120小時，即可作為枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)的一級種子。同樣培養(yǎng)條件下，將一級種子按310%(%:v/v)的接種量轉(zhuǎn)接第二批裝有同樣培養(yǎng)基的三角瓶中，同樣條件下培養(yǎng)3072小時后作為枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCN0.3242)的二級種子。(2)擴大培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)二級種子以310%(%:v/v)的接種量接種到7300L發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為裝液量6080%(%:v/v)，通氣量0.11(v/v.min)，罐壓0.020.05MPa，溫度2035。C，轉(zhuǎn)速100400rpm，發(fā)酵時間30120小時。所涉及的培養(yǎng)基成分如下斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，瓊脂1030，pH:59，121。C滅菌20min。—級、二級液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1030，酵母膏210，蛋白胨2IO，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，尿素220，己內(nèi)酰胺0.5IO，氯化鈷550ppm，pH:59，121。C滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖1050，酵母膏210，蛋白胨210，氯化鈉15，磷酸二氫鉀0.53，磷酸氫二鉀0.53，硫酸鎂0.22，尿素220，己內(nèi)酰胺0.5IO，氯化鈷550ppm，pH:59，121。C滅菌20min。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用。—種利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242生物催化生產(chǎn)煙酰胺的工藝如下以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242為生物催化劑，采用底物和生物催化劑耦合補加的方式，在溫度為535t:，攪拌轉(zhuǎn)速為100300rpm下進行催化水合反應得到煙酰胺。所述的催化水合反應一般在反應釜中進行，反應釜的裝液體積為5070%(%:v/v)。3-氰基吡啶的起始添加量為110%(%:g/100mL)，生物催化劑的累積添加總量為130%(%:g/100mL)，當?shù)孜餄舛鹊陀?.5g/L時，開始耦合補加底物3-氰基吡啶和生物催化劑，每批的添加量和兩者的起始添加量一致，順序可以互為先后或同時補加，一般連續(xù)補加次數(shù)為520次，最終底物累加濃度可達25%(%:g/100mL)以上。所述的催化水合反應一般進行1596小時，當?shù)孜餄舛戎饾u降低，趨向于零時即可終止。所述的反應結(jié)束后，在25003500rpm下離心1020分鐘后取上清，或者用0.20.5um膜超濾后置于04。C下冷凍11.5小時左右即可直接析出大量煙酰胺晶體，將其混合液25003500rpm轉(zhuǎn)速下冷凍離心1020分鐘得晶體，308(TC下真空干燥即得純度在98%以上的煙酰胺。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242，該菌株產(chǎn)腈水合酶的總酶活力高，為生物催化法生產(chǎn)煙酰胺提供了優(yōu)良的菌種。其他生物催化反應只補加底物，而本發(fā)明首次采用底物和催化劑耦合多次補加。底物分批補加，創(chuàng)造出持續(xù)低濃度底物的催化反應系統(tǒng)，有效的降低了高濃度底物和產(chǎn)物對細胞的毒害作用；同時，雖然每次底物濃度較低，但通過多次補加，底物的累積濃度較之一次性加入并未降低；另外，催化劑分批補加，使生物催化劑受抑制的累積時間相對減少，有利于維持生物催化劑的活性。底物和催化劑耦合多次補加，將二者分批補加的優(yōu)勢結(jié)合在一起，產(chǎn)生了1+1>2的效果，有利于得到高濃度的煙酰胺水合液，其中煙酰胺的濃度不低于25%(%:g/100mL)，有利于反應結(jié)束后的產(chǎn)物分離。本發(fā)明反應結(jié)束后的產(chǎn)物分離部分，含高濃度煙酰胺的水合液勿需經(jīng)過濃縮處理，可直接經(jīng)過冷凍結(jié)晶、干燥處理后得到純度在98%以上的煙酰胺晶體，減少了工藝流程，提高了分離效率。涉及的生物材料樣品的保藏本發(fā)明所要求保護的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。具體實施例方式實施例1枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242的篩選從南京第一農(nóng)藥廠污水池不同角度取污泥樣100余批，分批富集培養(yǎng)后進行篩選和鑒定稱取10克污泥，加無菌水50mL，用玻璃珠搖碎后取5mL懸濁液接種到45mL富集培養(yǎng)基中，放置3(TC搖床上，120rpm振蕩培養(yǎng)3天。之后取該培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取10一6、10—7、10—8的梯度稀釋液涂布到含初篩固體培養(yǎng)基的平板上，置3(TC恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36天。挑取生長出的單菌落接種到新的初篩固體培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。待菌長出后刮取35環(huán)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在3(TC搖床上120rpm下振蕩培養(yǎng)3天，取15mL培養(yǎng)液3000rpm下離心10min，倒去上清液后用等體積的生理鹽水沖洗沉淀菌體，繼續(xù)離心得菌體。將所得菌體添加到含1%(%:g/100mL)亞氨基二乙腈的PBS緩沖液中轉(zhuǎn)化2小時，反應體系中菌體濃度為0.5g/L。取5mL轉(zhuǎn)化液3000rpm下離心10min得上清液，HPLC法分析上清液。如果轉(zhuǎn)化液含有亞氨基二乙酸則說明該菌對亞氨基二乙腈具有轉(zhuǎn)化能力，選擇其中亞氨基二乙酸轉(zhuǎn)化率最高的一株，按《簡明伯杰細菌鑒定手冊》第八版進行鑒定為枯草芽孢桿菌。將該株枯草芽孢桿菌命名為KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號CGMCCNO.3242，保藏日期為2009年8月19日。篩選方法中的所述的液體富集培養(yǎng)基、固體初篩培養(yǎng)基、液體復篩培養(yǎng)基如下富集培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.l，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，pH:7，121。C滅菌20min。固體初篩培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，亞氨基二乙腈(或丙烯腈、或煙腈、或乳腈、或羥基乙腈)l，氯化鈉0.l，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，瓊脂2，pH:7，121。C滅菌20min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/100mL):葡萄糖3，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，氯化鈉0.1，磷酸二氫鉀0.l，磷酸氫二鉀0.l，硫酸鎂0.05，尿素0.5，pH:7，121。C滅菌20min。實施例2生物催化劑的制備將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中(葡萄糖15，酵母膏5，蛋白胨5，氯化鈉2，磷酸二氫鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，尿素10，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷:10卯m，pH7.O，單位:g/L)。在溫度為25"，轉(zhuǎn)速為150rpm下振蕩培養(yǎng)48小時即可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)—級種子液，將該一級種子液按照10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝有同樣成分已滅菌的培養(yǎng)基中繼續(xù)進行培養(yǎng)，48小時后可得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)二級種子液。將枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNo.3242)二級種子液按照10%的接種量接種到35L已滅菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，(葡萄糖30，酵母膏10，蛋白胨10，氯化鈉2，磷酸二氫鉀l，磷酸氫二鉀l，硫酸鎂0.5，尿素10，己內(nèi)酰胺5，氯化鈷:10卯m，pH:7，單位g/L)，發(fā)酵罐體積為50L，采用通空氣與攪拌聯(lián)用的方式控制溶氧不低于10%，通氣量0.2v/v.min，罐壓0.03MPa，溫度25。C，起始轉(zhuǎn)速100rpm，發(fā)酵過程中根據(jù)發(fā)酵液的溶氧水平有步驟的調(diào)節(jié)，最大轉(zhuǎn)速不超過400rpm，發(fā)酵72小時后即可制得枯草芽孢桿菌KR2(CGMCCNO.3242)細胞發(fā)酵液。將上述所得的發(fā)酵液3000rpm離心15min所得沉淀即為本發(fā)明所需的生物催化劑。實施例3酶活測定本實施例采用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242的發(fā)酵液進行酶活的測定。酶活的定義在25t:下，lmL發(fā)酵液與1微克3-氰基吡啶催化反應1小時后生成的煙酰胺的微克數(shù)，該微克數(shù)即為總酶活力單位數(shù)。煙酰胺采用液相色譜法進行檢測，檢測參數(shù)為色譜柱CLC-ODS柱，150mmX6.OmmI.D;流動相乙腈/水/庚烷磺酸鈉/三乙胺(50/450/0.8g/2mL)(pH3);流速1.2mL/min;柱溫室溫；檢測波長UV268nm。在本發(fā)明條件下，每毫升發(fā)酵液中生物量最高可達47mg濕菌體，總酶活最高可達1255U。實施例4煙酰胺的制備在50L攪拌釜中，先添加30L去離子水，調(diào)pH到7.0，溫度為3(TC。向反應釜中添加O.6kg3-氰基吡啶，生物催化劑的起始添加量為0.lkg。每隔2小時檢測一次反應液中的3_氰基吡啶濃度，當?shù)孜餄舛鹊陀?.5g/L后同時開始補加底物和生物催化劑，補加的量與起始量一致，連續(xù)補加14次。反應50小時后檢測反應液中的3-氰基吡啶的濃度，當?shù)孜餄舛融呄蛴诹銜r即可終止反應。將反應液于3000rpm離心10min，取上清液同樣條件下再離心l次，得澄清的上清液。將該上清液4t:下冷凍結(jié)晶，等析出大量晶體后將混合液于3000rpm下冷凍離心10min得晶體，6(TC下真空干燥，最后得純度為98.5%的煙酰胺9.68kg，收率達90.3%。實施例5本實施例僅改變催化反應的溫度，其余反應條件與參數(shù)均與實施例4保持一致。本實施例將攪拌釜中催化反應的溫度調(diào)整為l(TC，其余條件不變。最終得到純度為98.5%的煙酰胺9.76千克，收率達91.1%。實施例6本實施例除對底物和生物催化劑的補加順序進行了調(diào)整外，其他的反應條件和操作方法均與實施例4中的方法保持一致。本實施例的反應參數(shù)、底物和生物催化劑起始添加量、補加次數(shù)也均與實施例4保持一致。本實施例所述的底物和生物催化劑的補加順序指先添加底物，半小時后再補加生物催化劑，以此類推。最終得到純度為98.6%的煙酰胺9.66千克，收率達90.2%。實施例7本實施例中3-氰基吡啶的起始添加濃度量為2kg，生物催化劑的起始添加量為0.4kg，每隔5小時檢測一次反應液中的底物濃度，當?shù)孜餄舛鹊陀?.5g/L后開始補加底物與生物催化劑，補加量與起始添加量一致，連續(xù)補加4次。其余反應條件和操作均與實施例4保持一致。最終得純度為99.1%的煙酰胺10.93千克，收率達92.3%。權(quán)利要求一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KR2，保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.3242。2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242生物催化生產(chǎn)煙酰胺的工藝如下以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CGMCCNO.3242為生物催化劑，采用底物和生物催化劑耦合補加的方式于535°C，100300rpm下進行催化水合反應得到煙酰胺。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的3-氰基吡啶的起始添加量為110%，生物催化劑的起始添加量為15%，當?shù)孜餄舛鹊陀?.5g/L時，開始耦合補加底物3_氰基吡啶和生物催化劑，每批的添加量和兩者的起始添加量一致，順序可以互為先后或同時補加，使得最終底物累加濃度在25%以上，最終生物催化劑累積濃度在130%。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的底物濃度趨向于零時結(jié)束反應。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于所述的反應結(jié)束后，將反應液在25003500rpm下離心或者用0.20.5um膜超濾后于04。C下冷凍結(jié)晶、之后于3080。C下真空干燥得到純度達98%以上的煙酰胺。全文摘要本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，公開了一株枯草芽孢桿菌及其在生物催化生產(chǎn)煙酰胺中的應用?？莶菅挎邨U菌CGMCCNO.3242，其產(chǎn)生的腈水合酶能催化3-氰基吡啶進行水合反應生成煙酰胺。利用枯草芽孢桿菌CGMCCNO.3242生物催化生產(chǎn)煙酰胺的工藝為以3-氰基吡啶為底物，以枯草芽孢桿菌CGMCCNO.3242為生物催化劑，采用底物和生物催化劑耦合補加的方式進行催化水合反應得到煙酰胺。本發(fā)明有效的降低了高濃度底物和產(chǎn)物對細胞的毒害作用，有利于得到高濃度的煙酰胺水合液，其中煙酰胺的濃度不低于25％，有利于產(chǎn)物分離。文檔編號C12R1/125GK101712944SQ20091026430公開日2010年5月26日申請日期2009年12月18日優(yōu)先權(quán)日2009年12月18日發(fā)明者孔國平,楊壽海,趙廣福,陳金福,韋琛鴻申請人:南京第一農(nóng)藥集團有限公司