專利名稱：：一種電泳純莧菜13位氫過氧化物裂解酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—種電泳純莧菜13位氫過氧化物裂解酶的制備方法，具體以莧菜(Amaranthusmangosta皿sL.)為原料，通過該方法得到電泳純的莧菜13-氫過氧化裂解酶。屬于利用鹽析、色譜分離技術(shù)和膜分離技術(shù)純化膜蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：氫過氧化物裂解酶(HPL)是植物脂氧化途徑中脂肪氧合酶(LOX)下游的酶，可將LOX作用下多不飽和脂肪酸形成的氫過氧化脂肪酸裂解形成含氧酸和揮發(fā)性醛類。根據(jù)底物過氧基位置的差異，HPL可分為兩類第一類可裂解13位氫過氧化物生成6C醛類和12C含氧酸，稱為13-HPL;第二類可裂解9位氫過氧化物生成9C醛類和9C含氧酸，稱為9_HPL。由13-L0X和13-HPL共同催化得到的6C醛類(包括己醛，己烯醛)具有清新芳香風(fēng)味，在國外被稱作"GreenNotes"。這些揮發(fā)性醛類被廣泛應(yīng)用于香精、香水制造業(yè)和食品工業(yè)，例如用于長期存儲或殺菌后果蔬新鮮氣味的重塑。HPL廣泛存在于綠色高等植物中，Tressl和Drawert首先于1973年報道了香蕉中HPL的存在，隨后研究者們相繼在西瓜秧苗、黃瓜秧苗、番茄和茶葉中發(fā)現(xiàn)HPL并進行了性質(zhì)研究。最近據(jù)報道，已從青椒果實、番茄葉、紫花苜蓿、番石榴和向日葵中得到基本純的HPL。而國內(nèi)尚無有關(guān)此酶的報道。HPL是一種膜蛋白，色譜行為差，且在植物組織中含量較低易受季節(jié)影響。此外，酶活性中心部位含有巰基，不穩(wěn)定，易受外界條件影響氧化聚集失活。這都是HPL研究較少、進展緩慢的主要原因。建立一種克服季節(jié)影響，有效的氫過氧化物裂解酶分離純化方法，是開發(fā)利用該酶的關(guān)鍵步驟。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種凍干莧菜13位氫過氧化物裂解微粒體酶和其純化工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案一種電泳純莧菜13位氫過氧化物裂解酶，簡稱電泳純莧菜13-HPL，的制備方法，步驟為莧菜13-HPL凍干微粒體酶的制備、初步純化、電泳純純化；(1)制備莧菜13-HPL凍干微粒體酶以莧菜為原料，清洗并除去其中的泥沙及其它雜物，摘除根部和莖，瀝干水分，將莧菜葉切成小片，莧菜葉與在0l(TC預(yù)冷的0.55倍體積/莧菜葉重量(v/V)的緩沖液A混合、且在組織搗碎機中均漿10s-300s，經(jīng)四層紗布過濾；將紗布過濾液在04°C、500050000g離心1060min，取沉淀溶于1050倍體積/沉淀重量(v/w)的緩沖液B，分裝，冷凍干燥36108h得凍干莧菜13-HPL微粒體酶；(2)初步純化凍干莧菜13-HPL微粒體酶經(jīng)洗滌，溶解，硫酸銨沉淀，透析，微濾獲得初步純化莧菜13-HPL;步驟為取凍干莧菜13-HPL微粒體酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的緩沖液C，洗滌去除酶粉中所含蔗糖和色素，于04°C、500050000g離心1060min，取沉淀；沉淀溶于磷酸鈉緩沖液D，于04°C，500050000g離心1060min，取上清；上清液加入硫酸銨，使硫酸銨質(zhì)量濃度達10%50%，于04°C，500050000g離心1060min，取沉淀；沉淀用緩沖液D于04t:透析過夜，并在500050000g離心1060min，取上清；上清液過0.22iim微孔濾膜，透過液即為初步純化莧菜13-HPL;(3)電泳純純化將初步純化13-HPL經(jīng)羥基磷灰石柱，陰離子交換柱，超濾濃縮，得分子量約為55KD電泳純的莧菜13-HPL;步驟為取初步純化莧菜13-HPL上羥基磷灰石柱，用含0.010.4mol/L磷酸根的緩沖液D階段洗脫收集活性組分；經(jīng)超濾管濃縮脫鹽后上DEAE-Toyopearl離子交換柱，后用含00.5mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液E階段洗脫，收集活性組分，經(jīng)超濾管濃縮，得電泳純莧菜13-HPL;緩沖液A:含0.5%聚乙烯吡咯烷酮的0.lmol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液B:含10mmol/LDTT和10%蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液C:0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液D:含10mmol/LDTT和0.5%TritronX-100的pH6.8磷酸鈉緩沖液。緩沖液E:含10mmol/LDTT禾P0.5%TritronX-100的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。所述電泳純莧菜13-HPL的制備方法，所述超濾管為Millipore出產(chǎn)的15mL超濾管，截留分子量為100KD;所述羥基磷灰石柱為40ymI型羥基磷灰石柱，事先用緩沖液D平衡過夜；所述陰離子交換柱為DEAE-Toyopearl柱，事先用緩沖液E平衡過夜。以莧菜為原料，分離純化得到電泳純的13-氫過氧化物裂解酶；該酶的最適pH為6.0，等電點為5.94±0.22，其SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳)顯示為一條分子量約為55KD的帶。采用兩種方法對13-HPL的活力進行測定1.分光光度法xiiL酶液(15-40iiL)、15iiLlOmM底物(13-亞油酸氫過氧化物或13-亞麻酸氫過氧化物)和pH6.0的(2985-x)yL磷酸鈉緩沖液混合，在25°C，以0D234nm下降速率計算酶活?？瞻子刹缓孜锏纳鲜鋈芤航M成。1U酶活定義為每分鐘每裂解lymoL底物所需的酶量(e=25000M—卜m—0。2.氣相色譜法將xiiL酶液(15-40yL)、30yL10mM底物禾口pH6.0的(2970-x)yL磷酸鈉緩沖液混合在llmL頂空瓶中反應(yīng)，在25t:下保溫5分鐘，加入6mol/L的HC1終止反應(yīng)并加入KC1至飽和后做頂空氣相色譜分析。頂空瓶在頂空進樣儀7(TC下加熱30min后用氣相色譜儀進行檢測，工作參數(shù)如下30.0mX0.32mmX0.50iimCP-WAX52CB色譜柱。起始溫度4(TC，保溫5min后以l(TC/min升至180°C，以N2為載氣，載氣流量為30mL/min，分流比為1:1。以Sigma公司購買的己醛和2-反式己烯醛為標(biāo)樣?？瞻诪橹挥忻敢憾鵁o底物的上述溶液。根據(jù)得到的峰面積，可計算其酶活。lU酶活定義為每分鐘催化生成lymol6C醛類所需的酶量。蛋白質(zhì)含量測定采用BCA法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。依照Laemmli的方法進行各個純化階段樣品的十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDSPAGE)。分離膠和濃縮膠的聚丙烯酰胺終濃度分別為12%(w/v)和4%(w/v)。用考馬斯亮藍染色。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白為兔磷酸化酶b(97400Da)，牛血清白蛋白(66200Da)，兔肌動蛋白(43000Da)，牛碳酸酐(31000Da)，胰蛋白酶抑制劑(20100Da)和雞蛋清溶菌(14400Da)。本發(fā)明的有益效果1.緩解原料供應(yīng)壓力。要將13-HPL分離純化工業(yè)化必然需要大量的新鮮果蔬原料，而大部分13-HPL的提取原料都有季節(jié)性。例如高質(zhì)量的新鮮莧菜在中國一年只有八個月可獲得。而按本發(fā)明制備的凍干莧菜13-HPL微粒體酶粉在-2(TC下保存可保持全部酶活數(shù)月之久，一定程度上緩解了原料供應(yīng)的壓力。2.步驟相對簡單。在純化過程中，經(jīng)過硫酸銨沉淀(鹽析)、羥基磷灰石柱層析和陰離子交換柱層析步驟，得到電泳純的13-HPL。只需兩次柱層析，比一些已報道的氫過氧化物裂解酶的純化工藝簡單。這主要因為羥基磷灰石柱層析和陰離子柱層析時收集的酶活性峰酶活高而蛋白含量(OD，J低，除去了大量雜蛋白，有很好的分離純化效果。3.成本低。使用少量化學(xué)試劑，純化使用的柱填料可再生重復(fù)使用。4.環(huán)境友好。對環(huán)境無污染，是一種綠色提取工藝。5.有良好的應(yīng)用前景。C6醛類清香型風(fēng)味成分有著廣闊的產(chǎn)品市場，國外估計蔬菜、水果、香水及日用高端化工產(chǎn)品對C6醛類清香型風(fēng)味成分的需求量大約為每年10-30噸，價格約3000美元/千克。目前主要通過化學(xué)合成取得，但隨著人們對綠色健康的要求，天然香料越來越受到人們的青睞。而事實上，在天然植物中己醛、己烯醛等化合物的含量極低，獲取這些成分的成本很高。而模擬植物體內(nèi)的代謝途徑，采用LOX/HPL酶法催化不飽和脂肪酸氧化降解制備己醛、己烯醛等C6醛類就有很強的吸引力。其綠色健康、附加值高，工藝路線無三廢、經(jīng)濟可行。所以此項發(fā)明具有良好的推廣前景。圖1羥基磷灰石層析譜圖。圖2陰離子交換柱層析譜圖。圖3氫過氧化物裂解酶SDSPAGE電泳圖。泳道1為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道2為微粒體酶(32iig)，泳道3為粗酶液(33iig)，泳道4為硫酸銨沉淀組分(10yg)，泳道5為羥基磷灰石組分(7iig)，泳道6為DEAE柱組分(6iig)。具體實施例方式緩沖液A:含0.5%聚乙烯吡咯烷酮的0.lmol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液B:含1Ommol/LDTT(二硫蘇糖醇)和10%蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液C:0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。緩沖液D:含10mmol/LDTT和0.5%TritronX-100的pH6.8磷酸鈉緩沖液。緩沖液E:含10mmol/LDTT禾P0.5%TritronX—100的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。實施例1取濕重100克莧菜葉，切成小塊，加入300mL緩沖液A均漿6次，每次10s，間隔30s。均漿液紗布過濾，濾液于4°C，18000g離心30min，取沉淀溶于50mL緩沖液B，分裝，冷凍干燥80h，即得凍干莧菜13-HPL微粒體酶。凍干莧菜13-HPL微粒體酶復(fù)溶性好，酶活基本可完全回收。在_201:保存50天后復(fù)測酶活基本無變化，可為分離純化和工業(yè)生產(chǎn)C6醛提供穩(wěn)定的酶源。取lOg凍干莧菜13-HPL微粒體酶粉溶于lOOmL緩沖液C。懸濁液于4°C，30000g離心30min，取沉淀溶于緩沖液D。將溶液在相同條件下再離心30min，上清液即為粗酶液。粗酶液加固體硫酸銨至飽和度35%，相同條件下離心30min。收集沉淀用0.OIM磷酸鈉緩沖液D透析過夜。透析液于4t:，30000g離心30min，取上清過0.22iim微孔濾膜。透過液即為初步純化莧菜13-HPL。取透過液上羥基磷灰石柱分離，4t:下用含磷酸根濃度分別為0.OIM，0.25M和0.4M的緩沖液D階段洗脫，收集活性組分。超濾管濃縮后上DEAE-Toyopearl柱，4t:下用含0，0.15M，0.25M和1MNaCl的緩沖液E階段洗脫。收集活性組分，超濾管濃縮，得到的產(chǎn)物經(jīng)檢測為電泳純氫過氧化物裂解酶。純化過程數(shù)據(jù)見表1，電泳結(jié)果見圖3。表1莧菜氫過氧化物裂解酶的分離純化<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求一種電泳純莧菜13位氫過氧化物裂解酶，簡稱電泳純莧菜13-HPL，的制備方法，其特征在于步驟為莧菜13-HPL凍干微粒體酶的制備、初步純化、電泳純純化；(1)制備莧菜13-HPL凍干微粒體酶以莧菜為原料，清洗并除去其中的泥沙及其它雜物，摘除根部和莖，瀝干水分，將莧菜葉切成小片，莧菜葉與在0～10℃預(yù)冷的0.5～5倍體積/莧菜葉重量(v/w)的緩沖液A混合、且在組織搗碎機中均漿10s-300s，經(jīng)四層紗布過濾；將紗布過濾液在0～4℃、5000～50000g離心10～60min，取沉淀溶于10～50倍體積/沉淀重量(v/w)的緩沖液B，分裝，冷凍干燥36～108h得凍干莧菜13-HPL微粒體酶；(2)初步純化凍干莧菜13-HPL微粒體酶經(jīng)洗滌，溶解，硫酸銨沉淀，透析，微濾獲得初步純化莧菜13-HPL；步驟為取凍干莧菜13-HPL微粒體酶粉加入8-12倍酶粉量(v/w)的緩沖液C，洗滌去除酶粉中所含蔗糖和色素，于0～4℃、5000～50000g離心10～60min，取沉淀；沉淀溶于磷酸鈉緩沖液D，于0～4℃，5000～50000g離心10～60min，取上清；上清液加入硫酸銨，使硫酸銨質(zhì)量濃度達10％～50％，于0～4℃，5000～50000g離心10～60min，取沉淀；沉淀用緩沖液D于0～4℃透析過夜，并在5000～50000g離心10～60min，取上清；上清液過0.22μm微孔濾膜，透過液即為初步純化莧菜13-HPL；(3)電泳純純化將初步純化13-HPL經(jīng)羥基磷灰石柱，陰離子交換柱，超濾濃縮，得分子量為55KD電泳純的莧菜13-HPL；步驟為取初步純化莧菜13-HPL上羥基磷灰石柱，用含0.01～0.4mol/L磷酸根的緩沖液D階段洗脫收集活性組分；經(jīng)超濾管濃縮脫鹽后上DEAE-Toyopearl離子交換柱，后用含0～0.5mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液E階段洗脫，收集活性組分，經(jīng)超濾管濃縮，得電泳純莧菜13-HPL；緩沖液A含0.5％聚乙烯吡咯烷酮的0.1mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液；緩沖液B含10mmol/LDTT和10％蔗糖的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液；緩沖液C0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液；緩沖液D含10mmol/LDTT和0.5％TritronX-100的pH6.8磷酸鈉緩沖液；緩沖液E含10mmol/LDTT和0.5％TritronX-100的0.02mol/L、pH8.5Tris-HCl緩沖液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述電泳純莧菜13-HPL的制備方法，其特征在于所述超濾管為Millipore出產(chǎn)的15mL超濾管，截留分子量為100KD;所述羥基磷灰石柱為40ymI型羥基磷灰石柱，事先用緩沖液D平衡過夜；所述陰離子交換柱為DEAE-Toyopearl柱，事先用緩沖液E平衡過夜。全文摘要一種電泳純莧菜13位氫過氧化物裂解酶(13-HPL)的制備方法，屬于利用鹽析、色譜分離技術(shù)和膜分離技術(shù)純化膜蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明包括莧菜13-HPL凍干微粒體酶的制備、初步純化、電泳純純化；制備莧菜13-HPL凍干微粒體采用新鮮莧菜為原料，經(jīng)均漿、離心后取沉淀和保護劑蔗糖(1-30％)溶液共同冷凍干燥可得凍干微粒體酶。此凍干粉體積小、可在-20℃下長期保存；酶回收率、活力高，解決了原料季節(jié)性依賴。純化工藝步驟主要包括微粒體酶的洗滌，溶解，硫酸銨沉淀，透析，微濾，羥基磷灰石柱層析，陰離子交換柱層析和超濾得到電泳純氫過氧化物裂解酶。莧菜13-HPL在高附加值食品、日化用品生產(chǎn)方面越來越引起重視，這是首次從中國種植莧菜中分離純化得到氫過氧化物裂解酶。文檔編號C12N9/88GK101717764SQ20091023229公開日2010年6月2日申請日期2009年12月11日優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日發(fā)明者華欲飛,孔祥珍,張彩猛,龍禎申請人:江南大學(xué)