專利名稱：：小鼠心肌祖細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種祖細(xì)胞，特別涉及一種小鼠心肌祖細(xì)胞(cardiacprogenitorcell,CP)，還涉及該心肌祖細(xì)胞的制備方法。
背景技術(shù)：
：對(duì)心臟疾病進(jìn)行有效治療以降低死亡率是當(dāng)今醫(yī)學(xué)的重大難題之一。心肌再生能力有限，一旦受到損傷，就會(huì)不可避免的出現(xiàn)功能性心肌細(xì)胞的死亡或凋亡，影響心臟的正常功能，最終導(dǎo)致慢性心力衰竭(chronicheartfailure,CHF)。使用傳統(tǒng)藥物療法包括β-受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、醛甾酮拮抗劑和利尿劑等，雖然可以從一定程度上保護(hù)心肌，延緩心臟疾病的進(jìn)程，卻無(wú)法使功能性心肌細(xì)胞再生，難以從根本上逆轉(zhuǎn)CHF的發(fā)展進(jìn)程，心梗后心力衰竭患者的死亡率仍在810%之間，再住院率在68%之間。而心臟移植術(shù)也因供體受限，加之免疫排斥等原因，很難在臨床上大規(guī)模推廣。現(xiàn)今讓心臟科醫(yī)生和心力衰竭患者看到曙光的是近年來(lái)興起的有關(guān)利用細(xì)胞移植再生修復(fù)受損心肌的研究，其在理論上具有誘人前景，而它的可行性及效果也已被某些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。近十余年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在篩選細(xì)胞移植的種子細(xì)胞方面做了大量的研究工作，篩選出兩類種子細(xì)胞成體細(xì)胞和干細(xì)胞。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，用骨髓和胚胎來(lái)源的干細(xì)胞移植治療心肌梗死尚存在不足，如直接心肌內(nèi)注射移植干細(xì)胞后，由于移植成分復(fù)雜，在心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)下干細(xì)胞依然表現(xiàn)出向心肌樣細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等分化的多向性，并由此帶來(lái)一系列的移植并發(fā)癥，如微梗死、心律失常、鈣化和腫瘤等，其原因可能在于心肌損傷后的心肌微環(huán)境和胚胎發(fā)育過(guò)程中的心肌微環(huán)境及相關(guān)調(diào)控基因不盡相同，這些原始狀態(tài)的干細(xì)胞在成熟心肌損傷的微環(huán)境中不能被正常調(diào)控；而經(jīng)血管移植干細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞的歸巢現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)只有極少數(shù)的細(xì)胞停留在心臟，對(duì)心功能改善甚微。因此，我們需要?jiǎng)訂T心臟本身存在的心肌祖細(xì)胞來(lái)代償受損心肌功能。但是如何才能有效動(dòng)員呢？其動(dòng)員的機(jī)制是什么呢？為了解決這一問(wèn)題，并最終實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和臨床上的應(yīng)用，我們必須首先得到這些心肌祖細(xì)胞，研究其特性，然后才能進(jìn)一步分析影響其增殖和分化的因素。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種來(lái)源于心臟組織的小鼠心肌祖細(xì)胞，為研究影響心肌祖細(xì)胞在成體心肌細(xì)胞受損情況下增殖和分化的因素提供理想的工具；目的之二在于提供所述小鼠心肌祖細(xì)胞的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案1、小鼠心肌祖細(xì)胞，其表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Tbx50進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物0ct3/4、Nanog和Sox2；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Sca-I和c-kit；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后表達(dá)α-MyHC；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5和Tbx5表達(dá)呈下降趨勢(shì)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白標(biāo)志物α-MyHC,α-actin和cTnT表達(dá)呈上升趨勢(shì)，骨骼肌標(biāo)志物MyoD和平滑肌標(biāo)志物SM-MHC不表達(dá)；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞為可回復(fù)性永生化細(xì)胞；進(jìn)一步，所述心肌祖細(xì)胞來(lái)源于胚胎心臟組織。2、所述小鼠心肌祖細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟a、分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細(xì)胞；b、將步驟a所得心肌細(xì)胞感染永生化質(zhì)粒SSR#69而永生化，通過(guò)抗生素篩選法和無(wú)限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細(xì)胞；C、從步驟b所得永生化的單克隆心肌細(xì)胞中篩選出表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5和Tbx5的心肌細(xì)胞，即得小鼠心肌祖細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于小鼠與人在基因上有高達(dá)90%的同源性且兩者心血管系統(tǒng)極為相似，本發(fā)明選用小鼠心臟及心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，建立了一種來(lái)源于心臟組織的心肌祖細(xì)胞，該心肌祖細(xì)胞為可回復(fù)性永生化細(xì)胞，在敲除永生化基因后可以回復(fù)到永生化前的原代細(xì)胞狀態(tài)，從而使細(xì)胞既能無(wú)限增殖，又無(wú)致瘤和引起病毒感染的危險(xiǎn)，是研究影響心肌祖細(xì)胞在成體心肌細(xì)胞受損情況下增殖和分化因素的理想工具，有著良好的應(yīng)用前景。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖1為體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的形態(tài)(放大200倍)；圖2為永生化心肌細(xì)胞的單克隆生長(zhǎng)情況(放大300倍)；圖3為RT-PCR檢測(cè)心臟特異性基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)時(shí)序(瓊脂糖凝膠電泳圖)；圖4為RT-PCR檢測(cè)心臟特異性基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)時(shí)序(目的基因相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖)；圖5為RT-PCR篩選心肌祖細(xì)胞(瓊脂糖凝膠電泳圖)；15、5A和619分別為永生化心肌細(xì)胞克隆CP15-15、CP15-5A和CP15-619，H9為H9C2，P19為P19CL6；圖6為RT-PCR篩選心肌祖細(xì)胞(目的基因相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖)；15、5A和619分別為永生化心肌細(xì)胞克隆CP15-15、CP15-5A和CP15-619；圖7為全反式維甲酸(ATRA)誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性篩選心肌祖細(xì)胞；*表示P<0.05；圖8為RT-PCR和ATRA誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性篩選心肌祖細(xì)胞(灰階圖)；圖9為免疫熒光檢測(cè)ISLl和c-kit在ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆中的表達(dá)情況(放大200倍)；圖10為WesternBlot檢測(cè)心肌祖細(xì)胞中SV40T的表達(dá)；圖11為心肌祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；圖12為地塞米松(Dex)誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的MyHC-GLuc活性；*表示P<0.05；圖13為心肌祖細(xì)胞的病毒感染情況；圖14為心肌祖細(xì)胞分別感染AdRFP和AdR-cre后在裸鼠體內(nèi)的熒光素酶成像；圖15為心肌祖細(xì)胞分別感染AdRFP和AdR-cre后在裸鼠體內(nèi)的熒光素酶成像(平均信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖)；圖16為Dex誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞分化(放大200倍)；圖17為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的心肌發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)；圖18為免疫熒光檢測(cè)Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的cTnT表達(dá)。具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。優(yōu)選實(shí)施例中使用的主要實(shí)驗(yàn)材料(1)動(dòng)物孕15.5天的健康⑶1小鼠和68周齡的健康免疫缺陷BALB/c裸鼠，SPF級(jí)，由美國(guó)芝加哥大學(xué)動(dòng)物中心提供，喂養(yǎng)于嚴(yán)格消毒的無(wú)菌層流動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度維持在25°C，空氣濕度為60%70%，飼料和水經(jīng)消毒后自由進(jìn)食。(2)細(xì)菌和細(xì)胞株大腸桿菌DHlOB購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司。鼠畸胎瘤細(xì)胞株P(guān)19CL6和鼠心肌細(xì)胞株H9C2購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(ATCC)，鼠成肌細(xì)胞株C2C12、人胚胎腎細(xì)胞株HEK293和人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室提{共。(3)質(zhì)粒永生化質(zhì)粒SSR#69和質(zhì)粒pAmpho由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室提供。攜帶啟動(dòng)子基因a-MyHC(肌球蛋白重鏈α)和報(bào)告基因GLuc(分泌型熒光素酶)的啟動(dòng)子質(zhì)粒MyHC-GLuc由發(fā)明人在前期工作中構(gòu)建(Gao-HuiZhu.Differentiation.2009Jun26.PMID19560855),方法如下根據(jù)基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)上登錄的α-MyHC基因序列(登錄號(hào)為ΝΜ_001091601)設(shè)計(jì)如下引物擴(kuò)增α-MyHC基因第四個(gè)外顯子上游5.5kb的片段，引物序列如下F:aggggatcctgcaaggtcacacaagag(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn))，R:ccgctcgaggtcactcaaactcttatgggggag(下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn))；以含有α-MyHC基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為96°C預(yù)變性45秒，再92°C變性20秒、55°C退火30秒、70°C延伸45秒，共28個(gè)循環(huán)，最后70°C延伸5分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的質(zhì)粒pBGLuc(由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室提供)在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸細(xì)菌DH10B，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用含有卡那霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測(cè)定對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，即得啟動(dòng)子質(zhì)粒MyHC-GLuc。將該質(zhì)粒和肌細(xì)胞分化無(wú)關(guān)對(duì)照質(zhì)粒TOP-Luc分別轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的馬血清的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基或用Dex作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過(guò)GLuc讀數(shù)，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒具有肌肉特異性，且其活性在肌細(xì)胞分化過(guò)程中能夠被有效激活，當(dāng)細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)α-MyHC，它就會(huì)啟動(dòng)報(bào)告基因GLuc的表達(dá)，因此可以通過(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GLuc的表達(dá)量來(lái)衡量細(xì)胞中α-MyHC的表達(dá)情況，進(jìn)一步來(lái)說(shuō)明細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。(4)腺病毒攜帶紅色熒光蛋白(RFP)基因的重組腺病毒AdRFP和攜帶重組酶Cre基因的重組腺病毒AdR-cre由芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤研究室提供。(5)試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、抗生素(青霉素、氨芐青霉素、鏈霉素和潮霉素)、RNA提取試劑Trizol、隨機(jī)六聚引物Hexamer、Superscrip逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑RNasin,SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine和WesternBlot相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，胎牛血清(FBS)和超純水購(gòu)自美國(guó)Gibico公司，PCR引物由美國(guó)IDT公司合成，dNTP、TaqDNA聚合酶、二甲基亞砜(DMSO)、RealtimePCR試劑盒、Gluc檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)NEB公司，瓊脂糖、溴化乙啶(EB)和聚凝胺(Polybrene)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，膠回收純化柱購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，細(xì)胞裂解緩沖液和質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，免疫熒光抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，親和素(Avdin)/生物素(Biotin)封閉試劑盒購(gòu)自美國(guó)VECTOR公司。濃度為0.Imol/L、pH為7.27.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)自配稱取NaCl9.Og、Na2HPO4·12H206.Og和NaH2PO4·2H200.4g，用雙蒸水使完全溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.27.4，再用雙蒸水定容至1000ml，分裝，1.05kPa高壓滅菌20min，4°C保存?zhèn)溆谩?6)儀器C02培養(yǎng)箱(ThermoForma3110型)和超凈工作臺(tái)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，倒置顯微鏡和凝膠成像儀購(gòu)自日本奧林巴斯公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，PCR儀(GeneCycler)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光和熒光測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。1、心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)將孕15.5天的健康⑶1小鼠CO2吸入處死后，取出小鼠胚胎心臟，置盛有25ml預(yù)冷至4°C的PBS的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，切碎并反復(fù)吹打，加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液，37°C消化5分鐘，靜置后轉(zhuǎn)移上清液至經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的膠原溶液包被過(guò)夜并盛有15mlDMEM完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，剩余心臟組織再加入2ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液，37°C消化5分鐘，靜置后轉(zhuǎn)移上清液至同一細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)1小時(shí)，再將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至另一經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的膠原溶液包被過(guò)夜的細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，去除懸浮的血細(xì)胞。體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的形態(tài)如圖1所示，心肌細(xì)胞呈成纖維樣形態(tài)，且細(xì)胞不斷增殖，可見細(xì)胞單個(gè)或成團(tuán)搏動(dòng)。2、心肌細(xì)胞永生化將2.OygSSR#69U.ΟμgpAmphoU5y1Lipofectamine和250μ1DMEM空白培養(yǎng)基混勻，室溫下靜置30分鐘，制得轉(zhuǎn)染混合物；將ΗΕΚ293以60%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用DMEM完全培養(yǎng)基在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，用3mlDMEM空白培養(yǎng)基洗滌1次，加入2.5mlDMEM空白培養(yǎng)基，孵育510分鐘，再加入上述轉(zhuǎn)染混合物，孵育4小時(shí)后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，第36小時(shí)吸出培養(yǎng)基，用孔徑為0.2μm的濾器過(guò)濾，濾液再轉(zhuǎn)移至心肌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，12小時(shí)后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，24小時(shí)后加入0.lmg/ml的潮霉素溶液篩選永生化心肌細(xì)胞，篩選時(shí)間為2周。3、永生化心肌細(xì)胞單克隆應(yīng)用無(wú)限稀釋法，將篩選出的永生化心肌細(xì)胞接種到96孔板，至96孔板中1/3的孔每孔只含1個(gè)細(xì)胞時(shí)停止稀釋，用含有0.lmg/ml的潮霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下繼續(xù)篩選培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)基本達(dá)到1/3孔面積時(shí)，用胰蛋白酶消化，依次傳代到24孔板、6孔板、25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和IOOmm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，最后凍存?zhèn)溆茫趦龃媲熬褂煤?.lmg/ml的潮霉素的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，共得到20個(gè)永生化心肌細(xì)胞克隆，分別命名為CP15-15、CP15-5A和CP15-619。永生化心肌細(xì)胞的單克隆生長(zhǎng)情況如圖2所示，接種后第3天可見單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)，第5天可見細(xì)胞分裂形成23個(gè)細(xì)胞，第10天時(shí)出現(xiàn)1個(gè)小的細(xì)胞克隆團(tuán)，第15天時(shí)細(xì)胞克隆團(tuán)基本達(dá)到1/3孔面積。4、RT-PCR篩選心肌祖細(xì)胞由于文獻(xiàn)報(bào)道的心肌祖細(xì)胞的分離鑒定方法與標(biāo)志物各有不同，因此，首先分別提取胚胎13.5天(E13.5)和18.5天(E18.5)，出生后1天(Dl)、3天(D3)、7天(D7)和14天(D14)，以及出生后8周(adult)的健康OTl小鼠心臟組織總RNA，采用RT-PCR檢測(cè)心臟特異性基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)時(shí)序，以鑒定心肌細(xì)胞的早期和晚期標(biāo)志物。具體方法如下取50mg凍存的心臟組織，加入ImlTrizol，充分勻漿后，加入360μ1氯仿，充分震蕩后，HOOOrpm低溫離心20分鐘，取上清液，加入670μ1異丙醇和5μ1糖原(Gly)，充分震蕩后，HOOOrpm低溫離心15分鐘，棄上清液，加入600μ1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，充分震蕩后，HOOOrpm低溫離心5分鐘，棄上清液，晾干，加入50μ1去內(nèi)毒素的雙蒸水使溶解，得心臟組織總RNA溶液，-80°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank上登錄的小鼠心臟特異性基因的序列設(shè)計(jì)PCR引物(引物序列見表1)。RT反應(yīng)方法為將0.5μg/μ1的Hexamer溶液2μ1與心臟組織總RNA溶液10μ1混勻，70°C反應(yīng)5分鐘，制得Hexamer-RNA混合物；在冰上將5X緩沖液2μ1、0.lmol/L的二硫蘇糖醇溶液2μ1、10mmol/L的dNTPs溶液1μl.RNasin0.2μ1和雙蒸水1.6μ1混合，制得RT反應(yīng)混合物；將Hexamer-RNA混合物、RT反應(yīng)混合物和逆轉(zhuǎn)錄酶0.25μ1混合，37°C反應(yīng)60分鐘，95°C反應(yīng)1分鐘，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用雙蒸水稀釋至總體積為100μ1，_20°C保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為將IOX緩沖液2.0μl、10mmol/L的dNTPs溶液2.4μ1、DMS01·2μl，330ng/μ1的引物F/R溶液各0.4μUcDNA模板(RT反應(yīng)產(chǎn)物)10μl、TaqDNA聚合酶0.2μ1禾口雙蒸水3.5μ1混合，總體積為20μ1；反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2分鐘；再92°C變性20秒、68°C退火40秒、72°C延伸30秒，共12個(gè)循環(huán)，每循環(huán)1次退火溫度降低1°C；再92°C變性20秒、56°C退火40秒、72°C延伸30秒，共2132個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像保存，Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各DNA條帶的光密度(OD)值，并將結(jié)果以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行校正，目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因OD值/GAPDH基因OD值。表1小鼠心臟特異性基因的PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>RT-PCR檢測(cè)心臟特異性基因在心臟發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)時(shí)序如圖34所示，可見ISLl特異地表達(dá)在心肌細(xì)胞E13.5的早期階段，E18.5時(shí)已經(jīng)幾乎檢測(cè)不到；c_kit在E13.5到成體心臟的發(fā)育過(guò)程中，表達(dá)量逐漸降低，而Sca-I的表達(dá)趨勢(shì)與c_kit相反，呈逐漸升高的趨勢(shì)；心肌系早期表達(dá)基因Nkx2.5隨心臟的發(fā)育成熟而逐漸降低，間隙連接蛋白Cx43無(wú)明顯變化趨勢(shì)，晚期結(jié)構(gòu)蛋白α-MyHC,α-actin和cTnT則隨心臟發(fā)育成熟而逐漸增加。根據(jù)上述檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選取特異性較高的祖細(xì)胞標(biāo)志物ISL1、心肌細(xì)胞系標(biāo)志物Nkx2.5和Tbx5作為篩選心肌祖細(xì)胞的主要指標(biāo)；干細(xì)胞標(biāo)志物0ct3/4、Nanog和Sox2用于檢測(cè)所分離的細(xì)胞是否具有干細(xì)胞自我更新的標(biāo)志基因；其他的祖細(xì)胞標(biāo)志物和心肌細(xì)胞系標(biāo)志物用于輔助衡量細(xì)胞所處的心肌細(xì)胞發(fā)育階段。根據(jù)上述指標(biāo)，采用RT-PCR從20個(gè)永生化心肌細(xì)胞克隆中篩選心肌祖細(xì)胞，并以文獻(xiàn)報(bào)道常用于研究心肌細(xì)胞發(fā)育的P19CL6和H9C2作為對(duì)照。RT-PCR的具體方法同上，PCR引物序列見表2。表2心臟發(fā)育不同階段的心肌細(xì)胞標(biāo)志物基因的PCR引物引物序列ISLl、Sca-I、c-kit、Nkx2.5、α-MyHC與表1所述引物序列相同Oct3/4FCTGGGCGTTCTCTTTGGA(SEQlDNo.17)RGGCTTCCTCCACCCACTT(SEQIDNo.18)NanogFAAGTACCTCAGCCTCCAGCA(SEQIDNo.19)RGTGCTGAGCCCTTCTGAATC(SEQIDNo.20)Sox2FCCGGGGAGATACATGCTG(SEQIDNo.21)RGAACCCGACTGGGAACCT(SEQIDNo.22)GATA4FTCTCCCAGGAACATCAAACC(SEQIDNo.23)RGTGTGAAGGGGTGAAAAGGA(SEQIDNo.24)Tbx5FCGCTGTGACTTCGTACCAGA(SEQIDNo.25)RACTTTGCATCCGAGACATCCCSEQIDNo.26)Hand2FCTACTTCCACGGCTGGCTTA(SEQIDNo.27)RCCATAATGGGAGTGGTCCAG(SEQIDNo.28)Flk-1FGGCGGTGGTGACAGTATCTT(SEQIDNo.29)RGTCACTGACAGAGGCGATGA(SEQIDNo.30)Actcl(a-actin)FCCCTGGATTTTGAGAACGAG(SEQIDNo.31)RGAGTCTCTGGACAGCGGAAG(SEQIDNo.32)cTnlFCTGCAGGAGATGATTGACGA(SEQIDNo.33)RTGTAGCCATCAGCGTTTTTG(SEQIDNo.34)ANFFGGGGGTAGGATTGACAGGAT(SEQIDNo.35)RGGATCTTTTGCGATCTGCTC(SEQIDNo.36)RT-PCR篩選心肌祖細(xì)胞如圖56和圖8所示，干細(xì)胞標(biāo)志物0ct3/4、Nanog和Sox2在20個(gè)永生化心肌細(xì)胞克隆和P19CL6中基本上都表達(dá)，但在H9C2中不表達(dá)(圖5A)；特異性心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl在CP15-5A、CP15-9,CP15-10、CP15-13、CP15-18和P19CL6中都表達(dá)，特別是在CP15-9中高表達(dá)，非特異性心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Seal和c_kit也在大多數(shù)永生化心肌細(xì)胞克隆中表達(dá)，但I(xiàn)SLl、Seal和c-kit在H9C2中依舊不表達(dá)(圖5B)；心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5、GATA4、Tbx5、Hand2和Flk-I在CP15-5A、CP15-9,CP15-10、CP15-13、CP15-18和P19CL6中均有不同程度的表達(dá)，其中Tbx5表達(dá)量較高且差異較明顯，但H9C2中僅表達(dá)特異性相對(duì)較低的Hand2，其他標(biāo)志物幾乎無(wú)表達(dá)(圖5C)；心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白標(biāo)志物α-MyHC,ActcUcTnI和ANF在20個(gè)永生化心肌細(xì)胞克隆和P19CL6中表達(dá)量相對(duì)較低且無(wú)明顯差異，而cTnl在H9C2中高表達(dá)(圖5D)。5、ATRA誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性篩選心肌祖細(xì)胞肌球蛋白(MyHC)是肌肉收縮單位的重要結(jié)構(gòu)組成部分，其中α-MyHC的存在和表達(dá)有組織特異性，因此，α-MyHC的存在對(duì)肌肉細(xì)胞分化過(guò)程有重要提示意義。將2μgMyHC-GLuc,15μ1Lipofactamine和500μ1DMEM空白培養(yǎng)基混勻，室溫下放置1030分鐘，制得轉(zhuǎn)染混合物；分別將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的20個(gè)永生化心肌細(xì)胞克隆以6080%的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用DMEM完全培養(yǎng)基在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，用3.0mlDMEM空白培養(yǎng)基洗滌1次，加入2.5mlDMEM完全培養(yǎng)基，孵育10分鐘，再加入上述轉(zhuǎn)染混合物，孵育4小時(shí)后更換為DMEM完全培養(yǎng)基，12小時(shí)后加入終濃度為0.5μmol/L的ATRA溶液誘導(dǎo)分化，激活MyHC-GLuc活性，分別于誘導(dǎo)后第3、6、12和18天吸取20μ1細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用GLuc檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GLuc的表達(dá)量，按照試劑盒說(shuō)明書操作。ATRA誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性篩選心肌祖細(xì)胞如圖78所示(圖7只列出了經(jīng)RT-PCR檢測(cè)為ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15_13和CP15-18以及3個(gè)ISL1/Tbx5雙陰性克隆CP15-2、CP15-3和CP15-19的數(shù)據(jù))，可見ATRA能夠有效地誘導(dǎo)ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆的MyHC-GLuc活性，特別是在第18天時(shí)(ρ<0.05)。6、免疫熒光檢測(cè)ISLl和c-kit在ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆中的表達(dá)情況為了進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR結(jié)果，采用免疫熒光法檢測(cè)ISLl和c_kit在ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆CP15-5A、CP15-9、CP15-10、CP15-13和CP15-18中的表達(dá)情況，同時(shí)以2個(gè)ISLl/Tbx5雙陰性克隆CP15-12和CP15-17作為對(duì)照。具體方法如下將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的永生化心肌細(xì)胞克隆以6080%的密度接種到培養(yǎng)腔室玻片系統(tǒng)中，用DMEM完全培養(yǎng)基在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，取腔室玻片，用PBS洗滌1次，冷丙酮固定10分鐘，室溫下干燥10分鐘，PBS洗滌1次，用體積分?jǐn)?shù)為5%與二抗同屬源的血清封閉20分鐘，PBS洗滌1次，加入抗ISLl單克隆抗體或抗c-kit單克隆抗體(稀釋度為1200)，同時(shí)設(shè)一抗對(duì)照組(加入同種IgG亞型的單克隆抗體)，室溫下孵育60分鐘或4°C孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，再加入DyLight594(綠色熒光)標(biāo)記的相應(yīng)二抗(稀釋度為1200)，室溫下孵育30分鐘，PBS洗滌3次，封片，置熒光顯微鏡下觀察。免疫熒光檢測(cè)ISLl和c-kit在ISL1/Tbx5雙陽(yáng)性克隆中的表達(dá)情況如圖9所示，ISLl在CP15-9中表達(dá)最強(qiáng)而在CP15-13中表達(dá)較弱，一抗對(duì)照組幾乎沒有表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)較弱(圖9A)；c-kit除了在一抗對(duì)照組中幾乎沒有表達(dá)外，在其余各組中均有表達(dá)，尤其在CP15-9和CP15-13中表達(dá)較強(qiáng)(圖9B)；與RT-PCR結(jié)果一致。綜合上述RT-PCR結(jié)果、ATRA誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性結(jié)果和免疫熒光結(jié)果，篩選出4個(gè)具有心肌祖細(xì)胞特性的克隆CP15-5A、CP15-9,CP15-10和CP15-18。7、WesternBlot檢測(cè)心肌祖細(xì)胞的可復(fù)性SSR#69結(jié)構(gòu)中含有SV40T永生化基因，并且在SV40T基因前后分別加入了重組酶Cre的作用靶點(diǎn)LoxP，當(dāng)有Cre存在時(shí)，SV40T基因可以被Cre作用于2個(gè)LoxP位點(diǎn)而切除，從而使永生化細(xì)胞回復(fù)到正常生長(zhǎng)狀態(tài)。將CP15-9和CP15-10分別感染AdR-Cre，48小時(shí)后收集細(xì)胞裂解總蛋白，用WesternBlot檢測(cè)SV40T的表達(dá)，觀察心肌祖細(xì)胞的可復(fù)性。具體方法如下將總蛋白與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，水浴煮沸10分鐘，上樣進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的脫脂奶粉溶液室溫下封閉12小時(shí)，再加入抗SV40T單克隆抗體(用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的脫脂奶粉的TBST進(jìn)行稀釋，稀釋度為1500)，4°C孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，顯色，凝膠成像儀成像保存，并將結(jié)果以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行校正。WesternBlot檢測(cè)心肌祖細(xì)胞中SV40T的表達(dá)如圖10所示，可見Cre能夠有效去除SV40T基因，減少其在心肌祖細(xì)胞中的表達(dá)，從而使心肌祖細(xì)胞恢復(fù)到永生化前的狀態(tài)。8、永生化基因?qū)π募∽婕?xì)胞增殖和分化的影響將CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分別感染AdRFP和AdR-Cre，于感染后第1、2、3、4、5和6天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察SV40T基因的存在對(duì)心肌祖細(xì)胞增殖的影響。心肌祖細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖11所示，可見Ad-RFP組和AdR-Cre組的生長(zhǎng)趨勢(shì)一致，但Ad-Cre組的細(xì)胞增殖較慢，表明SV40T基因的存在可以提高心肌祖細(xì)胞的增殖能力。將CP15-9轉(zhuǎn)染MyHC-GLuc后，再分別感染Ad-RFP和AdR-Cre，用0.5μmol/L的Dex溶液誘導(dǎo)分化，激活MyHC-GLuc活性，于誘導(dǎo)后第3、6、9和12天吸取20μ1細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用GLuc檢測(cè)試劑盒檢測(cè)GLuc的表達(dá)量，按照試劑盒說(shuō)明書操作，觀察SV40T基因的存在對(duì)心肌祖細(xì)胞分化的影響。在MyHC-GLuc活性檢測(cè)時(shí)，為了均衡Ad-RFP組與AdR-Cre組的細(xì)胞量，應(yīng)用細(xì)胞裂解總蛋白量來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化GLuc讀數(shù)。Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的MyHC-GLuc活性如圖12所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，Dex可以有效誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的MyHC-GLuc活性(ρ<0.05)，且空白對(duì)照組和Dex誘導(dǎo)組中AdR-Cre對(duì)MyHC-GLuc活性的影響不大，表明SV40T基因的存在對(duì)心肌祖細(xì)胞分化的影響較小。9、心肌祖細(xì)胞的致瘤性檢測(cè)將質(zhì)粒pSEB-Luc與pAmpho共轉(zhuǎn)染HEK293，在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，36小時(shí)后開始收集病毒液，每12小時(shí)收集1次，共收集3次，每ml病毒液加入6μ12mg/ml的聚凝胺后，分4次感染CP15-9或CP15-10，每次作用48小時(shí)，每次之間用新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)812小時(shí)，最后1次感染后加入2.0μg/ml的滅菌素篩選1周，形成穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株CP15-9*或CP15-10*，再傳代凍存?zhèn)溆茫挥肈MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)CP15-9*或CP15-10*，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%融合時(shí)分別感染Ad-RFP和AdR-Cre,12小時(shí)后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，第48小時(shí)置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞感染率基本在6080%左右(如圖13所示)，用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，IOOOrpm離心5分鐘，棄上清液，細(xì)胞沉淀用含有磷脂酰絲氨酸的PBS洗滌后，重懸于50μ1PBS中，置冰上保存?zhèn)溆茫粚?XIO6個(gè)經(jīng)上述處理的細(xì)胞移植到裸鼠皮下，于移植后第1、3和7天進(jìn)行熒光素酶成像，并進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度分析。心肌祖細(xì)胞分別感染Ad-RFP和AdR-Cre后在裸鼠體內(nèi)的熒光素酶成像如圖1415所示，可見移植后隨時(shí)間延長(zhǎng)，Ad-RFP組和AdR-Cre組的熒光素酶信號(hào)逐漸減弱并最終消失，AdR-Cre組的信號(hào)消失較早，移植的心肌祖細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)未形成腫瘤。10、Dex誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞的分化將CP15-5A、CP15-9、CP15-10和CP15-18分別用0.5umol/L的061溶液誘導(dǎo)分化，第14天時(shí)置明視野顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，如圖16所示，CP15-5A、CP15-9和CP15-10在Dex誘導(dǎo)分化14天后，細(xì)胞形態(tài)變得寬大，細(xì)胞之間排列規(guī)則緊密，而CP15-18細(xì)胞形態(tài)拉長(zhǎng)，成束狀排列。11、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的心肌發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)將CP15-5A、CP15-9,CP15-10和CP15-18分別用0.5μmol/L的Dex溶液誘導(dǎo)分化，第7天和第11天時(shí)提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)RT得到cDNA，再進(jìn)行心肌發(fā)育相關(guān)基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(引物序列見表3)，并將結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正。表3心肌發(fā)育相關(guān)基因的PCR引物基因引物序列ISLKNkx2.5,α-MyHC.a-actin>cTnT~~與表1所述引物序列相同Tbx5與表2所述引物序列相同MyoDF:TGGCAGCGAGCACTACAG(SEQIDNo.37)R:GCGGTGTCGTAGCCATTC(SEQIDNo.38)SM-MHCF:GCAGAAGGCTCAGACCAAAG(SEQIDNo.39)R:TATCCAGAATGCCCAGGAAG(SEQIDNo.40)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的心肌發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)如圖16所示，總體看來(lái)，與空白對(duì)照組(未加入Dex)相比，CP15-9和CP15-10在Dex誘導(dǎo)分化過(guò)程中，早期基因ISLl、Nkx2.5和Tbx5表達(dá)呈下降趨勢(shì)，晚期基因α-MyHC,α-actin和cTnT表達(dá)呈上升趨勢(shì)，骨骼肌標(biāo)志基因MyoD和平滑肌標(biāo)志基因SM-MHC幾乎不表達(dá)；而在CP15-5A和CP15-18中，無(wú)固定變化趨勢(shì)。12、免疫熒光檢測(cè)Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞的cTnT表達(dá)將CP15-5A、CP15-9,CP15-10和CP15-18分別用0.5μmol/L的Dex溶液誘導(dǎo)分化，第14天時(shí)固定細(xì)胞，采用免疫熒光法檢測(cè)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白cTnT的表達(dá)。結(jié)果如圖18所示，可見與空白對(duì)照組(未加入Dex)相比，cTnT在Dex誘導(dǎo)分化心肌祖細(xì)胞中的表達(dá)較強(qiáng)，其中又以CP15-9和CP15-10的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)，且有形態(tài)改變?？偟膩?lái)說(shuō)，優(yōu)選實(shí)施例是先分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細(xì)胞，使其感染永生化質(zhì)粒SSR#69而永生化，通過(guò)抗生素篩選和無(wú)限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細(xì)胞，再根據(jù)心肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)時(shí)序和ATRA誘導(dǎo)MyHC-GLuc活性，以及免疫熒光法驗(yàn)證，篩選出4個(gè)具有心肌祖細(xì)胞特性的克隆CP15-5A、CP15-9,CP15-10和CP15-18，在進(jìn)一步的實(shí)時(shí)定量PCR和免疫熒光篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)CP15-9和CP15-10在Dex誘導(dǎo)分化過(guò)程中，早期基因ISL1、Nkx2.5和Tbx5表達(dá)逐漸降低，晚期基因α-MyHC,α-actin和cTnT表達(dá)明顯升高，而骨骼肌和平滑肌基因幾乎不表達(dá)，為較優(yōu)克隆。研究結(jié)果還顯示，優(yōu)選實(shí)施例篩選出的4個(gè)心肌祖細(xì)胞單克隆為可回復(fù)性永生化細(xì)胞，在敲除永生化基因后可以回復(fù)到永生化前的原代細(xì)胞狀態(tài)，從而使細(xì)胞既能無(wú)限增殖，又無(wú)致瘤和引起病毒感染的危險(xiǎn)，是研究影響心肌祖細(xì)胞在成體心肌細(xì)胞受損情況下增殖和分化因素的理想工具，有著良好的應(yīng)用前景。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。序列表<110>重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院<120>小鼠心肌祖細(xì)胞及其制備方法<160>40<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>ISL1基因的PCR引物F<400>1aaggacaagaaacgcagcat20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>ISL1基因的PCR引物R<400>2ccatcatgtctctccggact20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sca_l基因的PCR引物F<400>3cctggagccctctagtgatg20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sca_l基因的PCR引物R<400>4gagcagcaatccacaacaaa20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>c_kit基因的PCR引物F<400>5.gggctagccagagacatcag20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>c_kit基因的PCR引物R<400>6aggagaagagctcccagagg20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Nkx2.5基因的PCR引物F<400>7gagcctggtagggaaagagc20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Nkx2.5基因的PCR引物R<400>8ggtgggtgtgaaatctgagg20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Cx43基因的PCR引物F<400>9cctcaacatggcatttcctt20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Cx43基因的PCR引物R<400>10tccacacctagagggtcagg20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>α-MyHC基因的PCR引物F<400>11gaggaccaggccaatgagta20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>α-MyHC基因的PCR引物R<400>12gctgggtgtaggagagcttg20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a-actin基因的PCR引物F<400>13ctgacagaggcaccactgaa20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>a-actin基因的PCR引物R<400>14catctccagagtccagcaca20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>cTnT基因的PCR引物F<400>15ctgagacagaggaggccaac20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>cTnT基因的PCR引物R<400>16accaagttgggcatgaagag20<210>17<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>0ct3/4基因的PCR引物F<400>17ctgggcgttctctttgga18<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>0ct3/4基因的PCR引物R<400>18ggcttcctccacccactt18<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Nanog基因的PCR引物F<400>19aagtacctcagcctccagca20<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Nanog基因的PCR引物R<400>20gtgctgagcccttctgaatc20<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sox2基因的PCR引物F<400>21ccggggagatacatgctg18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>Sox2基因的PCR引物R<400>22gaacccgactgggaacct18<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GATA4基因的PCR引物F<400>23tctcccaggaacatcaaacc20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>GATA4基因的PCR引物R<400>24gtgtgaaggggtgaaaagga20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tbx5基因的PCR引物F<400>25cgctgtgacttcgtaccaga20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tbx5基因的PCR引物R<400>26actttgcatccgagacatcc20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Hand2基因的PCR引物F<400>27ctacttccacggctggctta20<210>28<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Hand2基因的PCR引物R<400>28ccataatgggagtggtccag20<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Flk_l基因的PCR引物F<400>29ggcggtggtgacagtatctt20<210>30<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Flk_l基因的PCR引物R<400>30gtcactgacagaggcgatga20<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Actcl基因的PCR引物F<400>31ccctggattttgagaacgag20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>Actcl基因的PCR引物R<400>32gagtctctggacagcggaag20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>cTnI基因的PCR引物F<400>33ctgcaggagatgattgacga20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>cTnI基因的PCR引物R<400>34tgtagccatcagcgtttttg20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>ANF基因的PCR引物F<400>35gggggtaggattgacaggat20<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>ANF基因的PCR引物R<400>36ggatcttttgcgatctgctc20<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>MyoD基因的PCR引物F<400>37tggcagcgagcactacag18<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>MyoD基因的PCR引物R<400>38gcggtgtcgtagccattc18<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SM-MHC基因的PCR引物F<400>39gcagaaggctcagaccaaag20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SM-MHC基因的PCR引物R<400>40tatccagaatgcccaggaag20權(quán)利要求小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于其表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISL1及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Tbx5。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞還表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物Sca-I和c-kit。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后表達(dá)α-MyHC。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Nkx2.5和Tbx5表達(dá)呈下降趨勢(shì)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白標(biāo)志物α-MyHC、a-actin和cTnT表達(dá)呈上升趨勢(shì)，骨骼肌標(biāo)志物MyoD和平滑肌標(biāo)志物SM-MHC不表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一權(quán)利要求所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞為可回復(fù)性永生化細(xì)胞。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小鼠心肌祖細(xì)胞，其特征在于所述心肌祖細(xì)胞來(lái)源于胚胎心臟組織。9.權(quán)利要求1所述的小鼠心肌祖細(xì)胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細(xì)胞；b、將步驟a所得心肌細(xì)胞感染永生化質(zhì)粒SSR#69而永生化，通過(guò)抗生素篩選法和無(wú)限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細(xì)胞；c、從步驟b所得永生化的單克隆心肌細(xì)胞中篩選出表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISLl及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Tbx5的心肌細(xì)胞，即得小鼠心肌祖細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種小鼠心肌祖細(xì)胞及其制備方法，該心肌祖細(xì)胞表達(dá)心肌祖細(xì)胞標(biāo)志物ISL1及心肌細(xì)胞系早期標(biāo)志物Tbx5；其制備方法是先分離培養(yǎng)胚胎15.5天的小鼠心肌細(xì)胞，使其感染永生化質(zhì)粒SSR#69而永生化，通過(guò)抗生素篩選法和無(wú)限稀釋法獲得永生化的單克隆心肌細(xì)胞，再?gòu)闹泻Y選出表達(dá)ISL1和Tbx5的心肌細(xì)胞，即得；該心肌祖細(xì)胞為可回復(fù)性永生化細(xì)胞，既能無(wú)限增殖，又無(wú)致瘤和引起病毒感染的危險(xiǎn)，是研究影響心肌祖細(xì)胞在成體心肌細(xì)胞受損情況下增殖和分化因素的理想工具，有著良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/85GK101812429SQ200910191280公開日2010年8月25日申請(qǐng)日期2009年10月30日優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日發(fā)明者何通川,朱高慧,陳沅申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院