專利名稱：：用于生產d-乳酸的生物催化劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及高選擇性地高效生產D-乳酸的微生物及使用該微生物生產D-乳酸的方法。詳細而言，涉及高效生產純度高的乳酸的方法，特別涉及丙酮酸的生成蓄積量少的有效的D-乳酸制造方法。本發(fā)明還涉及D-乳酸的生產方法，其特征在于，該方法使用FAD依賴性D-乳酸脫氫酶失活或活性降低的微生物。另外，本發(fā)明還涉及生產D-乳酸的微生物及使用該微生物的D-乳酸生產方法，所述微生物在生產D-乳酸時不產生雜質琥珀酸或富馬酸。
背景技術：
：生物分解性聚合物聚乳酸引發(fā)C02問題、能源問題顯著化的同時，作為可持續(xù)性(sustainability)、LCA(生命周期評估(lifecycleassessment))對應型產品也備受矚目，因此正尋找作為其原料的乳酸的有效且廉價的制造方法。順便提一下，目前工業(yè)生產的聚乳酸是L-乳酸聚合物，乳酸有L-乳酸和D-乳酸，近年來，D-乳酸作為聚合物原料或農藥、醫(yī)藥的中間體而受到關注。但在任一用途中，都要求作為原料的乳酸具有高光學純度。自然界中存在乳酸菌或絲狀菌等有效生產乳酸的微生物，在使用上述菌制造乳酸的方法中，已經有實用化的方法。例如，作為能有效生產L-乳酸的微生物已知有Lactbacillusdelbrueckii等，作為能有效生產D-乳酸的微生物已知有Sporolactobacillus屬的微生物等。任一種情況下乳酸的蓄積量都達到了高水平，但純化培養(yǎng)液中含有的乳酸以外的副產物例如醋酸、乙醇、乙偶姻、丙酮酸等化合物在純化過程中無法完全除去，導致最終產物乳酸的品質下降。另外，由于光學異構體的混入導致光學純度下降也變成嚴重的問題。為了避免如上所述的乳酸純度下降，降低利用微生物生產時的副產物量是有效的方法。如果利用近年來開發(fā)的基因重組技術破壞微生物的特定基因，就可能特異性阻礙副產物的生產。但是目前，基因破壞法并不能容易地適用于任一種微生物，所以在乳酸菌或絲狀菌等原來能高效生產乳酸的微生物中不容易適用。其原因是上述微生物基因組信息不充分，而且作為基因重組的宿主也不能廣泛使用。與此相對，利用基因組信息豐富、作為基因重組宿主的實際成果充分的大腸埃希菌、酵母、人培養(yǎng)細胞等，能比較容易地進行基因破壞。特別是從增殖迅速或培養(yǎng)容易方面考慮，最優(yōu)選大腸埃希菌。由于大腸埃希菌生產的乳酸只有D-型，所以在得到光學純度高的D-乳酸時，是合適的宿主。但是，野生型的大腸埃希菌的D-乳酸生產率低，而且產生D-乳酸以外的各種有機酸副產物。為了解決該問題，曾經嘗試利用基因重組改變大腸埃希菌的代謝途徑，選擇性地高效生產D-乳酸。Chang等人(Chang，D.-E.,et.al.，Appl.Environ.Microbiol"Vol.65(4),ppl384-1389(1999))使用含有5%葡萄糖、及氨基酸的培養(yǎng)基，將大腸埃希菌的磷酸轉乙酰酶(以下簡稱為pta)、及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下簡稱為ppc)2種變異抹先利用通氣培養(yǎng)使菌體增殖，然后進行厭氧培養(yǎng)，同時，追加葡萄糖，使培養(yǎng)基中的葡萄糖不超過5%，進行培養(yǎng)，經60小時產生62.2g/L的D-乳酸。此時，由葡萄糖轉化成D-乳酸的轉化率為76%。Zhou等人(Zhou,S.,et.al.，Appl.Environ.Microbiol"Vol.69(1),pp399-407(2003))制備破壞丙酮酸甲酸裂解酶(以下簡稱為pfl)、富馬酸還原酶(以下簡稱為frd)、醇/醛脫氫酶(以下簡稱為adeE)、以及醋酸激酶(以下簡稱為ackA)4種酶的大腸埃希菌，將其在含有5%葡萄糖的無機鹽培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)168小時，產生48.5g/L的D-乳酸，而不生成曱酸、琥珀酸、乙醇以及醋酸副產物。但是，在該試驗中雖然能成功地高選擇性生產D-乳酸，但生產率低，為0.29g/L/hr,所以不能同時滿足選擇率和生產率兩方面的要求。另外，沒有提及副產物丙酮酸，其減少效果也不清楚。由于丙酮酸是D-乳酸的代謝反應基質，因此與其他副產物有機酸不同，如果過度抑制其生成，則導致D-乳酸本身的生成被抑制。所以，難以將丙酮酸的產生抑制在最低限。通常，在丙酮酸以雜質的形式包含在乳酸單體原料中的情況下，出現(xiàn)聚合物聚合率降低等不希望出現(xiàn)的問題，這是本領域技術人員熟知的事實，由此可知，丙酮酸是必須減少的副產物之一。但過去沒有關于既保持D-乳酸的高效生產率，又能成功抑制丙酮酸副產物生成的報告?？傊?，目前已知的大腸埃希菌的D-乳酸最大蓄積量是62.2g/L,其生產時間為60小時。另一方面，考慮到L-乳酸的工業(yè)化生產中使用的乳酸菌或絲狀菌的L-乳酸生產率為蓄積量大于或等于100g/L，生產時間在24小時以內，則不得不認為大腸埃希菌的D-乳酸蓄積量和生產時間仍然處于低水平。過去沒有關于大腸埃希菌能實現(xiàn)與乳酸菌或絲狀菌同等的乳酸生產率的報告，而且，也沒有暗示使用大腸埃希菌能否使D-乳酸的蓄積量超過100g/L的數(shù)據。使用大腸菌進行D-乳酸發(fā)酵時，通常不優(yōu)選酶的存在。原因是如果存在酶等電子受體，則大腸菌不發(fā)酵而進行呼吸。只有在酶等電子受體不存在的情況下，大腸菌才能僅通過基質水平的磷酸化得到能量(ATP)，利用糖酵解中得到的還原能力(NADH),生產乳酸等還原性有機酸?；谏鲜隼碛桑酝睦么竽c菌的D-乳酸發(fā)酵幾乎都是通過厭氧培養(yǎng)進行。雖然少數(shù)是通過前半段為通氣培養(yǎng)、后半段為厭氧培養(yǎng)的二段式培養(yǎng)進行，但通過上述前半段的通氣培養(yǎng)是為了確保足夠的菌體量，最終的乳酸發(fā)酵仍然是通過厭氧培養(yǎng)進行的。但實際的工業(yè)生產時，在添加到培養(yǎng)基中的廉價的氨基酸源谷物浸提液(以下簡稱為CSL)等中，不僅含有有機酸雜質，而且還含有D-型、L-型兩種乳酸，但如果是厭氧培養(yǎng)，則L-乳酸不被代謝，而殘留在培養(yǎng)基中。由L-型生成丙酮酸的反應的催化酶L-乳酸脫氫酶(以下簡稱為lld)在通氣條件下表達，因此，如果有在通氣條件下也能高效地進行乳酸發(fā)酵的方法，則能通過使用該方法使菌體代謝包含在培養(yǎng)基中的L-型，生成光學純度高的D-型，但是，目前為止，還沒有能夠實現(xiàn)上述目的的技術。關于使用pfl破壞菌抹的乳酸生產，在Zhou等的報告中首先報告了以下內容。即，Contag等人(Contag,P.R.,et.al.，Appl.Environ.Microiol.，Vol.56(12),pp3760-3765(1990))公開了pfl非變異大腸埃希菌抹生成35mM的乳酸，而在pfl變異林中，乳酸的生產率提高，生成45mM的乳酸。即，在大腸埃希菌中，由于pfl失活，D-乳酸的生產率提高，這通過Contag等公開的數(shù)據已經成為公知內容。D-乳酸脫氫酶根據對輔酶的依賴性的不同，分為NADH依賴性和FAD依賴性。NADH依賴性D-乳酸脫氫酶在生物體內催化丙酮酸生成D-乳酸的反應。來源于大腸菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶被特別稱為ldhA。Yang等(Yang,Y.T.,et.al.，Metab.Eng.，Vol.1(2)，ppl41-152(1999))報道了將組裝了ldhA基因的表達載體導入大腸埃希菌，由此使D-乳酸蓄積量提高了8g/L左右，盡管很低。即，由Yang等公開的數(shù)據可知，在大腸埃希菌中，通過強化ldhA活性，能提高D-乳酸的生產率。另外，根據Bunch等[Bunch,PK.，Microbiology,Vol.143(Pt1),187-195(1997)]的報告，導入來源于大腸埃希菌的ldhA基因的表達載體的大腸埃希菌由于表達載體的導入而阻礙其增殖。另外，作為使來源于大腸菌以外的細菌的D-乳酸脫氫酶(以下簡稱為ldh)在大腸菌中過剩表達的例子，可以舉出作為來源于Lactobacillushelveticus的ldh的表達例的Kochhar等[Kochhar,S.，Eur.J.Biochem.,(1992)208，799-805]的報告或作為來源于Lactobacillusbulgaricus的ldh的表達例的Kochhar等[Kochhar,S.，Biochem.Biophys.Res.Commun.,(1992)185，705-712]的報告，任一例都研究了表達的酶的物理化學性質，但都沒有提及D-型或丙酮酸的蓄積量。但是，關于使pfl失活或活性降低，且使ldhA活性加強的微生物的D-乳酸生產率仍然不是很清楚。通常，在使用表達載體的基因強化方法中，會發(fā)生以下不便載體脫落、目的基因的表達量下降、進一步導致目的物質的生產率降低。因此，在應用于D-乳酸工業(yè)生產時，使用表達載體的ldh基因的強化方法中存在幾個應該解決的課題，期待取代利用表達載體的基因強化方法。但是，還沒有與上述相關的報告。作為取代表達載體的基因強化方法，可以舉出Solem等(Solem,C.et.al"Appl.Environ.Microbiol"Vol.68(5),pp2397-2403(2002))報道的通過將基因組上的某一基因的啟動子區(qū)域置換成任意的啟動子來強化該基因的方法。但是，如果在使用上述ldhA基因的D-乳酸制造中應用本技術，則由于利用該方法強化的ldhA基因僅是基因組上的單拷貝基因，與利用表達多拷貝基因的表達載體的強化方法比較，ldhA活性提高幅度小，所以，即使本領域技術人員也難以推測D-乳酸生產率與使用表達栽體時比較能得到提高。另外，通過解析利用大腸菌純化的酶可知，F(xiàn)AD依賴性D-乳酸脫氫酶(以下簡稱為did)主要催化與NADH依賴性D-乳酸脫氫酶所催化的反應的逆反應，即，由D-乳酸生成丙酮酸的反應。雖然Shaw等人得到了dld被破壞的大腸菌抹JS150和JS151,但沒有提及上述菌林中的D-乳酸生產率或丙酮酸生產率(Shaw，L.，et.al.,J.Bacteriol.,Vol.121(3)，ppl047-1055(1975))。另外，Barnes等人報道了dld與各種氨基酸或糖類的攝入有關(Barnes,E.M.,et.al.，J.Biol.Chem.,Vol.246(17),pp5518-5522(1971))，但沒有提及與D-乳酸或丙酮酸的生成的關系。而且，在作為大腸菌^^保藏^L構之一的Yale大學附屬E.coliGeneticStockCenter(CGSC)的數(shù)據庫中，如果檢索did和pfl兩種變異菌抹，則會檢索到Mat-Jan等的論文(Mat-Jan,F.,et.al.，J.Bacteriol.，Vol.171(1),pp342-348(1989))，但實際上仔細閱讀后發(fā)現(xiàn)，該論文中沒有與dld和pfl兩種破壞菌林相關的說明。關于上述D-乳酸，目前沒有在利用微生物的發(fā)酵生產中同時實現(xiàn)符合工業(yè)水平的生產率和選擇性的報告，例如，沒有既能維持D-乳酸的高生產率，又能減少作為主要有機酸副產物的琥珀酸或富馬酸的先例。所以，申請人以不損害D-乳酸的生產率又能抑制琥珀酸產生為目的，進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)通過在厭氧條件下，破壞作為催化草酰乙酸生成蘋果酸的反應的酶蘋果酸脫氫酶(以下簡稱為mdh)的基因，能在不損害D-乳酸生產率的前提下完全抑制琥珀酸的生成。但是，由于仍然生成富馬酸副產物，所以發(fā)現(xiàn)破壞天冬氨酸解氨酶(以下簡稱為aspA)的基因，也能降低富馬酸副產物的量。1970年的Courtright等的論文公開了mdh失活的效果(Courtright，J.B.et.al.，J.Baceriol"Vol.102(3),pp722-728(1970))。其公開內容是在mdh失活的大腸埃希菌中，雖然在厭氧條件下，草酰乙酸生成蘋果酸的反應活性為零，但是天冬氨酸生成富馬酸的反應活性反而提高了。即，在厭氧條件下，生成琥珀酸的途徑包括以下2種途徑由草酰乙酸經由蘋果酸生成富馬酸、琥珀酸的途徑和由草酰乙酸經由天冬氨酸生成富馬酸、琥珀酸的途徑，如果mdh失活，則前一種途徑被中止，后一種途徑被進一步活化。所以，Courtright等的論文沒有公開通過使mdh失活中止琥珀酸的生成。另外一個關于mdh失活的效果的現(xiàn)有技術是關于破壞mdh基因的酵母的技術(特開平11-056361號公報)。本專利是通過破壞酵母的mdh基因，改變生成的蘋果酸量，但沒有提到琥珀酸的生成量受到何種影響。即便是本領域技術人員也難以從現(xiàn)有的知識預見到通過滅活微生物的mdh能完全抑制琥珀酸的生成。另外，關于aspA失活的效果，過去只公開了在鼠疫耶爾森菌的情況(Dreyfus，L.A.，et.al.,J.Bacteriol"Vol.136(2)，pp757-764(1978))。但是，本論文的主旨是由于aspA失活使天冬氨酸或谷氨酰胺在細胞內難以分解，并沒有對富馬酸的生成量進行研究。專利文獻l:特開平ll-056361號公報非專利文獻l:Chang，D.-E.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.,Vol.65(4),ppl384-1389(1999)非專利文獻2:Zhou,S.，et.al"Appl,Environ.Microbiol.，Vol.69(1)pp399-407(2003)非專利文獻3:Contag,P.R.,et.al"Appl.Environ.Microbiol.，Vol.56(12),pp3760-3765(1990)非專利文獻4:Yang,Y.T.,et.al.,Metab.Eng.,Vol.1(2),pp141-152(1999)非專利文獻5:Bunch,P.K.,et.al"Microbiology,Vol.143(pt1),ppl87-195(1997)非專利文獻6:Kochhar,S.,et.al.,Eur.J.Biochem.，Vol.208(3),pp799-805(1992)非專利文獻7:Kochhar,S.，et.al"Biochem.Biophys.Res.Commim.Vol.185(2)，pp705-712(1992)非專矛J文獻8:Solem，C.，et.al.，Appl.Environ.Microbiol.,Vol.68(5),pp2397-2403(2002)非專利文獻9:Shaw，L"et.al"J.Bacteriol.，Vol.121(3)，ppl047-1055(1975)非專利文獻10:Barnes,E.M.,et.al"J.Biol.Chem.，Vol.246(17),pp5518-5522(1971)非專利文獻ll:Mat-Jan，F(xiàn).，et，al.,Bacteriol.,Vol.171(1)，pp342-348(1989)非專利文獻12:Courtright,J.B.et.al.，Bacteriol.，Vol.102(3)，pp722-728(1970)非專利文獻13:Dreyfus，L.A.，et.al"J.Bacteriol.,Vol.136(2),pp757-764(1978)
發(fā)明內容本發(fā)明的課題之一是提供高效生產D-乳酸的方法，本發(fā)明的其他課題是提供光學純度高、有機酸副產物少的高選擇性的D-乳酸生產方法。本發(fā)明的其他課題是提供D-乳酸的生產方法，該方法能減少作為有機酸雜質的不容易從以往利用微生物使乳酸蓄積的培養(yǎng)基中除去的丙酮酸的蓄積量。本發(fā)明的其他課題是提供使用異型乳酸發(fā)酵細菌有效地生產乳酸的乳酸生產方法。本發(fā)明的其他課題是提供使用異型乳酸發(fā)酵細菌有效地生產光學純度高的乳酸的乳酸生產方法。本發(fā)明的其他課題是提供不降低目的物質的生產率、且抑制副產物琥珀酸和/或富馬酸的生成的D-乳酸生產方法。本發(fā)明的其他課題是提供取代使用表達載體的強化方法的穩(wěn)定的D-乳酸脫氫酶基因強化方法，另夕卜，還提供更高效地生產D-乳酸的方法。為解決上述課題，本發(fā)明人等進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氬酶UdhA)的活性被增強的細菌能在比以往短的時間內生產D-乳酸，而且能實現(xiàn)至今未達到的高蓄積量。特別是關于ldhA活性增強的方法，利用在基因組上將編碼ldhA的基因和控制與糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成相關的蛋白質表達的基因的啟動子連接而使其表達的微生物，由此能在比使用表達載體的基因表達強化方法短的時間內生成大量的D-乳酸。D-乳酸脫氫酶的細胞內表達量在使用表達載體的方法中比本發(fā)明的方法多，但沒有任何理由證明高的酶表達量與D-乳酸的高效生產直接相關，而且，令人吃驚的是，在本發(fā)明中，即使細胞內的酶表達量沒有那么高，D-乳酸的生產率也顯著提高。接下來，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)微生物培養(yǎng)液中存在的丙酮酸的一部分實際上是dld催化D-乳酸生成的，而且，通過培養(yǎng)dld基因實質上失活或活性降低的微生物，與宿主比較，該微生物的增殖沒有被抑制，而且得到培養(yǎng)基中的丙酮酸濃度下降的含有高品質D-乳酸的培養(yǎng)液。通過培養(yǎng)Pfl失活或活性降低、且/或ldhA活性增強、且dld基因實質上失活或活性降低的微生物，能得到培養(yǎng)基中的丙酮酸濃度下降的高品質D-乳酸。而且，本發(fā)明人通過使用具有TCA循環(huán)、且蘋果酸脫氫酶(mdh)失活或活性降低、且天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低的上述微生物，不僅能維持高的D-乳酸生產率，還能抑制琥珀酸和富馬酸的副生成，由此實現(xiàn)了本發(fā)明。即，本發(fā)明包括以下內容。一種乳酸的生產方法，其特征在于，在添加了2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的異型乳酸發(fā)酵細菌，從得到的培養(yǎng)物中回收乳酸。[l]所述的乳酸的生產方法，其特征在于，異型乳酸發(fā)酵細菌是大腸埃希菌。[2]所述的乳酸的生產方法，其特征在于，大腸埃希菌是MT-10934(FERMBP-10057)抹。一種D-乳酸的生產方法，其特征在于，培養(yǎng)來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶(ldhA)的活性被增強、且丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的細菌，從得到的培養(yǎng)物中回收D-乳酸。[4]所述的D-乳酸的生產方法，其中，細菌是大腸埃希菌。[4]或[5]所述的D-乳酸的生產方法，其特征在于，在添加了2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。—種微生物，該微生物是其本來具有的FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(dld)失活或活性降低的微生物，其特征在于，丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶(ldhA)的活性被增強。[7]所述的樣i生物，該孩i生物為細菌。[8]所述的微生物，所述細菌是大腸埃希菌?！ND-乳酸的生產方法，其特征在于，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)[7]~[9]任一項所述的微生物，使D-乳酸在培養(yǎng)液中生成并蓄積，從培養(yǎng)液中分離D-乳酸。[IO]所述的D-乳酸的生產方法，其特征在于，在添加了2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)?！ND-乳酸的生產方法，其特征在于，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(did)失活或活性降低的微生物，使D-乳酸在培養(yǎng)液中生成并蓄積，從培養(yǎng)液中分離D-乳酸。[13][12]所述的方法，其中，微生物是細菌。[14][13]所述的方法，其中，細菌是大腸埃希菌。[15]—種微生物，在該微生物的基因組上，編碼來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氬酶(ldhA)的基因通過使用控制與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子來表達該NADH依賴性D-乳酸脫氫酶UdhA)。[16][15]所述的微生物，該微生物是大腸埃希菌。[17][15]或[16]所述的微生物，其特征在于，該微生物本來具有的丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(did)失活或活性降低。—種大腸埃希菌，在大腸埃希菌的基因組中，使用控制來源于大腸埃希菌的與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子取代編碼來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氬酶(ldhA)的基因的啟動子，表達該NADH依賴性D-乳酸脫氬酶(ldhA)。[18]所述的大腸埃希菌，其中，控制與大腸埃希菌的糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子是來源于大腸埃希菌的甘油醛3-磷酸脫氫酶基因的啟動子。[18]或[19]所述的大腸埃希菌，其特征在于，該大腸埃希菌本來具有的丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低、且/或FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(did)失活或活性降低?！N生產方法，該方法是利用培養(yǎng)基培養(yǎng)[15][20]中任一項所述的微生物生產D-乳酸的方法?！N微生物，該微生物具有TCA循環(huán)、且蘋果酸脫氫酶(mdh)失活或活性降低，其特征在于，該微生物的丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且/或FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(did)失活或活性降低。[22]所述的微生物，其中，該微生物本來具有的天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低。[22]或[23]所述的微生物，該微生物是細菌。[24]所述的微生物，其中，細菌是大腸埃希菌。[25]所述的微生物，其中，來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氬酶(ldhA)的活性被增強?！N生產方法，該方法是利用培養(yǎng)基培養(yǎng)[22][26]中任一項所述的微生物，由此生產TCA循環(huán)中產生的有機酸以外的化合物的方法。[27]所述的生產方法，其中，有機酸以外的化合物是D-乳酸。[1][6]、[10]~[14]、[21]、[28]中任一項所述的乳酸的生產方法，其特征在于，該方法是在通氣條件下培養(yǎng)。[29]所述的乳酸的生產方法，其特征在于，所述通氣條件為，在以溫度為30。C的水為對象的情況下，通過供給氧氣使常壓下氧氣體積傳質系數(shù)KLa在大于或等于lh"、小于或等于400h。范圍內的條件。[1]~[6]、[10][14]、[21]、[28][30]中任一項所述的乳酸的生產方法，其特征在于，培養(yǎng)pH為68。利用本發(fā)明能提供具有高D-乳酸生產率和D-乳酸選擇性的微生物。而且，培養(yǎng)由本發(fā)明制備的微生物，生產D-乳酸，與現(xiàn)有方法比較能更經濟地生產高純度的D-乳酸。另外，利用本發(fā)明能提供生產丙酮酸生成量少的D-乳酸的細菌。而且，培養(yǎng)由本發(fā)明制備的菌抹，生產D-乳酸，與現(xiàn)有方法比較能更經濟地生產化學純度和光學純度高的D-乳酸。另外，使用本發(fā)明制備的菌抹生產乳酸，能制造與以往的方法比較作為雜質的丙酮酸含量下降、純化操作少的高品質D-乳酸發(fā)酵液。利用本發(fā)明不會導致TCA循環(huán)中產生的有機酸以外的化合物的生產率降低，能抑制琥珀酸和/或富馬酸的副生成。特別是在以工業(yè)生產TCA循環(huán)中產生的有機酸以外的化合物為目的的情況下，通過減少副產物的種類和量，能降低目標產物的純化成本。圖1是表示實施例20的培養(yǎng)液中D-乳酸蓄積量經時變化的曲線圖。圖中，具有三角形的曲線表示MG1655ApflAdld菌林(實施例15)的結果，具有四邊形的曲線表示MG1655ApflAdld/pGAPldhA菌抹(實施例18)的結果，具有圓形的曲線表示MG1655ApflAdld/GAPpldh基因組插入抹(實施例19)的結果。圖2是表示實施例24的培養(yǎng)液中乳酸蓄積濃度經時變化的曲線圖。圖中，具有十字形的曲線表示ApflAdld菌株的結果，具有圓形的曲線表示ApflAdldAmdh菌抹的結果，具有三角形的曲線表示△pflAdldAppc菌抹的結果，具有四邊形的曲線表示ApflAdldAfrd菌株的結果。圖3是表示實施例24的培養(yǎng)液中琥珀酸蓄積濃度經時變化的曲線圖。圖中，具有十字形的曲線表示ApflAdld菌抹的結果，具有圓形的曲線表示ApflAdldAmdh菌抹的結果，具有三角形的曲線表示△pflAdldAppc菌抹的結果，具有四邊形的曲線表示ApflAdldAfrd菌抹的結果。圖4是表示實施例25的培養(yǎng)液中乳酸蓄積濃度經時變化的曲線圖。圖中，具有圓形的曲線表示ApflAdldAmdhAasp菌林的結果，具有三角形的曲線表示ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入林的結果，具有四邊形的曲線表示ApflAdldAmdh菌林的結果。圖5是表示實施例25的培養(yǎng)液中富馬酸蓄積濃度的經時變化的曲線圖。圖中，具有圓形的曲線表示ApflAdldAmdhAasp菌林的結果，具有三角形的曲線表示ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入抹的結果，具有四邊形的曲線表示ApflAdldAmdh菌林的結果。具體實施例方式下面詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明中的丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)是基于國際生物化學聯(lián)合(I.U.B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號2.3.1.54的酶，也稱為曱酸乙?；D移酶。該酶是指可逆催化由丙酮酸生成曱酸的反應的酶的總稱。本發(fā)明中所謂的失活是指利用現(xiàn)有的測定系統(tǒng)測定的該酶的活性在檢測限以下的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂的降低是指由于編碼該酶的基因的突變和/或基因重組，與處理前的狀態(tài)比較，該酶活性明顯下降的狀態(tài)。本發(fā)明中所謂的異型發(fā)酵細菌是指具有發(fā)酵分解糖類、生成乳酸以外的選自甲酸、乙酸、琥珀酸、乙醇中的至少1種或1種以上的能力的細菌。具體而言，作為本發(fā)明中的異型發(fā)酵細菌，優(yōu)選大腸埃希菌，作為丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的異型發(fā)酵細菌，可以舉出能夠利用本發(fā)明實施例所示的方法等制備的任意大腸埃希菌野生抹的pfl基因的破壞抹或大腸埃希菌MT-10934。上述MT-10934是已經確認pfl活性降低的菌抹，能容易地實施本發(fā)明。基于涉及用于專利程序的微生物保藏等國際認證的布達佩斯條約，本菌抹于平成14年11月8日以保藏編號為FERMBP-10057保藏在日本茨城縣筑波市東1丁目1番1號中央6的獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心。關于pfl的單獨變異抹，由于MT-10934具有HfrC的性質，因此只要與任意的具有F-性質的野生抹、例如MG1655、W3110等在LB培養(yǎng)基中混合2小時后，稀釋，得到單菌落，從中選擇希望的變異抹即可。pfl變異抹在厭氧培養(yǎng)中，與野生林比較，曱酸的生成量降低，因此可以將其作為指標進行選擇而得到本發(fā)明中所謂的培養(yǎng)是使用培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明中微生物。作為使用的培養(yǎng)基，只要是包含碳源、氮源、無機離子、和用于生產乳酸的微生物所要求的有機微量元素、核酸、維生素類等的培養(yǎng)基即可，沒有特別限定。本發(fā)明中所謂的添加有2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基是指含有天然存在的各種氨基酸中的至少2種或2種以上的培養(yǎng)基，還包括含有酵母浸膏、酪蛋白水解物、蛋白胨、乳清、廢糖蜜、谷物浸提液等天然物質或天然物質提取物的水解物的培養(yǎng)基。為了得到較優(yōu)選的結果，優(yōu)選含有0.5%20%、更優(yōu)選含有2%~15%的選自酵母浸膏、蛋白胨、乳清、廢糖蜜、谷物浸提液中的至少l種或其混合物的培養(yǎng)基。尤其是谷物浸提液的添加能得到明顯的效果，此時不添加硫酸銨等鹽的培養(yǎng)基反而得到更好的結果。培養(yǎng)基為通常的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件根據制備的菌體、培養(yǎng)裝置的不同而改變，例如，使用pfl活性降低的MT-10934時，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20。C40。C,較優(yōu)選在25。C35。C下進行培養(yǎng)，pH優(yōu)選利用NaOH、NH3等調至6.07.2、更優(yōu)選為6.56.9,進行培養(yǎng)。培養(yǎng)時間沒有特別限定，是菌體充分增殖、且乳酸生成所需要的時間。另夕卜，使用pfl失活的大腸埃希菌野生抹MG1655的pfl基因破壞株時，在中性或比中性稍偏堿性的pH下能得到最大的生產率，培養(yǎng)pH為6.97.4,較優(yōu)選7.1~7.3。培養(yǎng)溫度可以高于MT-10934的溫度，在33。C42。C下培養(yǎng)能得到最大的生產率。培養(yǎng)時通常使用能控制溫度、pH、通氣條件、攪拌速度的培養(yǎng)槽，但本發(fā)明的培養(yǎng)并不限于使用培養(yǎng)槽。使用培養(yǎng)槽培養(yǎng)時，根據需要也可以預先進行作為預培養(yǎng)的種培養(yǎng)，然后接種到預先調制了需要量的培養(yǎng)槽內的培養(yǎng)基中。MT-10934在pH77.5的pH區(qū)域內生成曱酸，而MG1655的pfl基因破壞菌抹利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法并沒有生成曱酸。所以，作為異型發(fā)酵性細菌使用大腸埃希菌的情況下，在接近中性的pH的培養(yǎng)基中使采用的菌體產生乳酸時，如果像MT-10934—樣，能觀察到曱酸的生成，則在實際制造乳酸時，培養(yǎng)基的pH被控制在比中性稍偏酸性側，如果像MG1655的pfl基因破壞抹一樣，沒有觀察到曱酸的生成，則在實際制造乳酸時，培養(yǎng)基的pH被控制在中性或稍偏堿性側，由此能得到最大生產率。本發(fā)明中所謂的培養(yǎng)物是指利用上述方法生產的菌體、培養(yǎng)液、及其處理物。從如上所述得到的培養(yǎng)液等培養(yǎng)物中回收乳酸的方法，例如，如果是從培養(yǎng)液中，則可以利用通常已知的方法，例如，可以采用酸化后直接蒸餾的方法、形成丙交酯后進行蒸餾的方法、加入醇和催化劑進行酯化后進行蒸餾的方法、用有機溶劑萃取的方法、利用離子交換柱分離的方法、利用電透析濃縮分離的方法等或將上述方法組合的方法。另外，利用本發(fā)明的方法制備的菌體由于能產生適合乳酸生產的酶組，所以利用該酶組進一步生產、回收乳酸，被認為是從培養(yǎng)物中回收乳酸的方法的一部分。本發(fā)明中所謂的來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶(ldhA)是利用丙酮酸和NADH生成D-乳酸和NAD的來源于大腸埃希菌的酶，具體而言，可以列舉由Bunch等(Microbiology143(Ptl)，187-195(1997))得到的基因，或具有以大腸埃希菌的基因組DNA為模板、利用序列號3和序列號4進行PCR擴增的DNA片段所包含的序列的基因產生的酶。本發(fā)明中所謂的ldhA活性增強，是指通過編碼ldhA的基因的突變和/或基因重組，使由編碼ldhA的基因生產的酶的活性明顯比進行上述處理前的狀態(tài)增強的狀態(tài)。本發(fā)明中的細菌是通常的原核細胞微生物。在本發(fā)明中，作為ldhA活性被增強、且pfl失活或活性降低的細菌的例子，可以舉出本發(fā)明實施例中所述的MT-10934/pGlyldhA。本菌林可以優(yōu)選用于具有如上述[l]所述的特征的乳酸的生產方法，即，在添加有2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的異型乳酸發(fā)酵細菌，從得到的培養(yǎng)物中回收乳酸。作為增強本發(fā)明中的ldhA活性的方法之一，下面的方法是有效的，即，將編碼ldhA的基因和控制與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子連接，在該狀態(tài)下組裝到表達質粒中，再將質粒導入所希望的細菌。此種情況下的控制與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子是指通常在細菌內、優(yōu)選在大腸埃希菌內發(fā)揮作用的強啟動子，且即使在葡萄糖存在下，其表達也不易受抑制的啟動子，具體而言，可以列舉甘油^-3-磷酸脫氫酶的啟動子或絲氨酸羥曱基轉移酶(glyA)啟動子。如上所述得到的細菌在通氣條件下產生D-乳酸時，與ldhA的表達未被增強時比較，能提高D-乳酸的蓄積量，并降低作為雜質的丙酮酸濃度，同時，提高D-乳酸的光學純度。本發(fā)明中的FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(did)是指在作為輔酶的氧化型黃素腺噤呤二核苷酸的存在下，催化由D-乳酸生成丙酮酸的反應的酶的總稱。本發(fā)明中的微生物只要是具有產生D-乳酸的能力大微生物即可，沒有特別限定，還包括雖然是不具有產生D-乳酸能力的微生物、但是通過施加某種改變能變成具有產生D-乳酸能力的微生物。作為本發(fā)明中的以did失活或活性降低、且/或pfl失活或活性降低、且/或ldhA活性被增強為特征的微生物，可以列舉大腸埃希菌MT-10994(FERMBP-10058)菌抹。本發(fā)明中控制與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子是指通常在微生物內發(fā)揮作用的強啟動子，且即使在葡萄糖存在下，其表達也不易受抑制的啟動子，具體而言，可以列舉甘油醛-3-磷酸脫氫酶(以下有時稱為GAPDH)的啟動子或絲氨酸羥甲基轉移酶啟動子。本發(fā)明中的啟動子是指具有o因子的RNA聚合酶結合并開始轉錄的部位。例如，來源于大腸埃希菌的GAPDH啟動子在GenBankaccessionnumberX02662的堿基序列信息中，被記為堿基號397-440。編碼本發(fā)明的ldhA的基因通過在基因組上使用控制與糖酵解路徑、核酸生物合成路徑或氨基酸生物合成路徑相關的蛋白質表達的基因的啟動子，表達該ldhA，使pfl失活或活性降低，且/或使did失活或活性降低，以上述為特征的微生物，可以列舉大腸埃希菌MT-10994(FERMBP-10058)菌抹。大腸埃希菌MT-10994菌林通過ldhA基因在基因組上與GAPDH啟動子功能性連接而進行表達，或通過基因破壞使pflB、dld滅活，所以使用該菌林能容易地實施本發(fā)明。本菌抹基于用于專利程序的微生物保藏等國際上承認的布達佩斯條約，于平成16年3月19日以保藏編號為FERMBP-10058保藏在日本茨城縣筑波市東1丁目1番1號中央6的獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心。本發(fā)明中的TCA循環(huán)是指最終完全氧化糖、脂肪酸、多種氨基酸等大型碳骨架的代謝路徑，也稱為三羧酸循環(huán)、克雷布斯循環(huán)。本發(fā)明中的蘋果酸脫氫酶(mdh)是基于國際生物化學聯(lián)合(I.U.B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號1.1.1.37，在作為輔酶的氧化型黃素腺。票呤二核苷酸的存在下，可逆地催化由蘋果酸生成草酰乙酸的反應的酶的總稱。作為本發(fā)明中的mdh失活或活性降低、pfl失活或降低、且/或did失活或活性降低的微生物，可以列舉大腸埃希菌MT-10994菌抹。本菌林可以優(yōu)選用于具有如上述[l]所述的特征的乳酸的生產方法，即，在添加有2種或2種以上氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丙酮酸曱酸裂解酶(pfl)失活或活性降低的異型乳酸發(fā)酵細菌，從得到的培養(yǎng)物中回收乳酸。本發(fā)明中的天冬氨酸解氨酶(aspA)基于國際生物化學聯(lián)合(I.U.B.)酶委員會報告被歸屬于酶編號4.3.1.1,也稱為天冬氨酸酶。該酶是可逆地催化由L-天冬氨酸生成富馬酸的反應的酶的總稱。培養(yǎng)本發(fā)明中得到的微生物生成乳酸時，雖然可以完全不進行通氣，但為了得到較優(yōu)選的結果最好進行通氣。所述通氣條件下并不一定要向培養(yǎng)液中通入空氣，也包括上面通氣，即，根據培養(yǎng)槽的形狀，一邊適度地攪拌培養(yǎng)液，一邊更換培養(yǎng)液上面的空氣層，使包含氧氣的氣體流入培養(yǎng)槽的內部。在向液體中通氣的情況下，通過內壓、攪拌翼位置、攪拌翼形狀、攪拌速度的組合來改變溶解氧濃度，由此能以乳酸的生產率和乳酸以外的有機酸量等作為指標求出下述最適條件。例如，將大腸埃希菌MT-10934菌抹在ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01等比較小型的培養(yǎng)槽中培養(yǎng)時，使用500g培養(yǎng)液時，在通氣條件為常壓下0.01vvmlvvm、攪拌速度50rpm500rpm、較優(yōu)選常壓下0.1vvm0.5vvm、攪拌速度100rpm400rpm時，能得到優(yōu)選結果。其條件為，在以溫度3(TC的水作為對象的情況下，通過供給氧氣使常壓下的氧氣體積傳質系數(shù)KLa在大于或等于lh"、小于或等于400h—1的范圍內。另外，作為最適通氣條件的其他指標還包括，通過調節(jié)通氣量、攪拌速度，從而能夠使利用厭氧培養(yǎng)MT-10934菌林產生的曱酸、乙酸、琥珀酸、乙醇的含量小于或等于5.0g/L、進一步優(yōu)選小于或等于1.0g/L,并且能夠產生乳酸。另外，作為最適通氣條件的其他指標還包括，通過調節(jié)通氣量、攪拌速度，在含有0.3%的光學異構體L-乳酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MT-10934時，在10100小時以內使L-乳酸的濃度降低到小于或等于0.02%。不必從培養(yǎng)初期至結束始終保持上述通氣條件，在部分培養(yǎng)工序中實施即可得到優(yōu)選結果。另外，通過進行上述通氣，能提高乳酸的生產率，并能減少光學異構體o下面，利用實施例表示本發(fā)明的一個例子，但上述實施例對本發(fā)明并無任何限定。[實施例1]利用MT-10364菌^^生產乳酸用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成如下表1所示。表1培養(yǎng)基組成葡萄糖10%谷物浸提物(日本食品化工制)5%硫酸銨0.5%磷酸氫二鈉J2水合物0.3%磷酸二氫鉀0.15%氯化鈉0.15%硫酸鎂，7水合物0.1%AdecanolLG1260.1%在本培養(yǎng)基中，含有來源于谷物浸提物的酸水解后的還原糖0.34%、D-乳酸0.310/0、L-乳酸0.310/0、游離氨基酸0.33%以及微量的各種有機酸。作為預培養(yǎng)是在裝有25mlLBBroth，Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中進行大腸埃希菌MT-10934的植菌，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜，然后在裝有475g上述組成的培養(yǎng)基的1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中，進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為150rpm、培養(yǎng)溫度為31°C、pH為6.7(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)至葡萄糖完全消耗掉。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定得到的培養(yǎng)液中有機酸的含量和光學純度。結果如表2所示。表2MG1655(wild)MT-10934D-乳酸蓄積量54.9g/kg培養(yǎng)液90.5g/kg培養(yǎng)液培養(yǎng)液回收量錫g干燥菌體重量3.5g/L2.2g/LD-乳酸光學純度299,9%ee299.9%ee琥珀酸6.2g/LN.D<0.2g/L曱酸1.8g/LN.D<0.1g/L乙酸2.4g/LN.D<0.1g/L乙醇0.8g/LN.D<0.1g/L培養(yǎng)開始50hr后的D-乳酸蓄積量46.5g/kg58.2g/kgN.D:Notdetected在上述結果中，總乳酸量超過培養(yǎng)開始時加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的還原糖、有機酸、氨基酸，也能達到90%或90%以上的轉換率。另夕卜，即使使用培養(yǎng)基中含有有機酸雜質或乳酸的光學異構體的培養(yǎng)液，也能制造有機酸雜質少、光學純度高的乳酸。需要說明的是，MG1655可以作為ATCC47076從美國模式菌種收集中心(ATCC)購入。ldhA表達載體和乳酸產生菌的構建為得到絲氨酸羥甲基轉移酶(serinehydroxymethyltransferase)(glyA)啟動子，以大腸菌基因組DNA作為模板、以序列號1、及序列號2為探針，利用PCR法進行擴增，并用限制性內切酶EcoRI切割得到的片段，由此得到約850bp的編碼glyA啟動子的片段。而且，為得到ldhA的結構基因，以大腸埃希菌的基因組DNA作為模板，以序列號3、及序列號4為探針，利用PCR法進行擴增，并用限制性內切酶EcoRI和HindIII切割得到的片段，由此得到約l.Okbp的ldhA結構基因片段。將上述2個片段與利用限制性內切酶EcoRI和HindIII切割質粒pUC18得到的片段混合，并利用DNA連接酶連接，然后轉化到大腸菌中，得到質粒pGlyldhA。將得到的質粒pGlyldhA轉化到大腸埃希菌MT-10934菌抹中，得到乳酸產生菌MT-10934/pGlyldhA菌抹。另外，pUC18可以利用常規(guī)方法從購自美國模式菌種收集中心的ATCC37253中提取得到。MT-10934菌抹是于平成14年11月8日以上述保藏編號保藏在日本茨城縣筑波市東1丁目1番1號中央6的獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心。利用乳酸產生菌MT-10934/pGlyldhA菌抹的乳酸生成作為預培養(yǎng)是在裝有25mlLBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中進行實施例2得到的乳酸產生菌MT-10934/pGlyldhA菌抹的植菌，利用與實施例1相同的方法進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定乳酸的含量和光學純度。結果如表3所示。表3D-乳酸蓄積量培養(yǎng)液回收量干燥菌體重量D-乳酸光學純度培養(yǎng)開始50hr后的D-乳酸蓄積量94g/kg培養(yǎng)液570g2.0g299.9%ee65.2g/kg在上述結果中，總乳酸量超過培養(yǎng)開始時加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的還原糖、有機酸、氨基酸，也能達到90%或90%以上的轉換率。大腸埃希菌pfl基因的附近區(qū)域的克隆大腸埃希菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096),編碼大腸埃希菌的丙酮酸曱酸裂解酶(以下也稱為pfl)的基因的石威基序列也尋皮才艮道(GenBankaccessionnumberAE000192)。為了克隆編碼pfl的基因(2283bp)的堿基序列的附近區(qū)域，合成序列號5、6、7和8所示的4種低聚核苷酸引物。序列號6、7的引物在5'末端處具有SphI識別部位。才艮才居CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons)戶斤述的方法制備大腸埃希菌MG1655菌林的基因組DNA，利用得到的基因組DNA1嗎與具有序列號5的堿基序列的引物、具有序列號6的堿基序列的引物、具有序列號7的堿基序列的引物和具有序列號8的堿基序列的引物的組合，使用上述引物DNA各lOOpmol,在通常的條件下進行PCR,擴增約L8kbp(以下也稱為pflB-L片段)、及約1.3kbp(以下也稱為pf!B-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用HindIII和SphI切割pflB-L片段，利用SphI和PstI切割pflB-R。利用T4DNA連接酶使上述2種切割片段與溫度感受性質粒pTH18csl(GenBankaccessionnumberAB019610)(Hashimoto-Gotoh,T.，et,al.，Gene，Vo1.24(1)，ppl85-191(2000))的HindIII和Pstl切割物反應后，轉化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞(competentcell)中，從而得到包含編碼pflB的基因的5，上游附近片段和3'下游附近片段的2個片段的質粒，命名為pTHApfl。大腸埃希菌MG-1655菌抹pfl基因破壞菌抹的制備將實施例4得到的質粒pTHApfl轉化到大腸埃希菌MG1655菌抹中，在細胞能保持溫度感受性質粒的3(TC下，在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜，得轉化體。將得到的轉化體在LB培養(yǎng)基中于30。C培養(yǎng)3小時過夜，然后，用LB液體培養(yǎng)基或生理鹽水適當稀釋，涂布到含有10|ig/ml氯霉素的LB瓊脂平板上。將上述LB瓊脂板在不能維持溫度感受性質粒的42T:下培養(yǎng)，將形成的轉化體通過基因組外-基因組間相同重組，得到將質粒全長組裝到大腸埃希菌基因組的菌抹。由該菌抹獲得基因組DNA,以其作為模型進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)在基因組上存在pTH18csl所具有的耐氯霉素基因，以及與編碼pflB的基因的5'端附近區(qū)域和3'端附近區(qū)域分別相同的區(qū)域，從而確認該菌株是將質粒全長組裝到大腸埃希菌上的菌抹。將質粒全長組裝到大腸埃希菌上的菌抹植入裝有20ml不含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基的100ml設有緩沖板的燒瓶中，將其在30。C下振搖培養(yǎng)4小時。用不含氯霉素的LB液體培養(yǎng)基適當稀釋上述培養(yǎng)液，然后，涂布到不含氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上。任意挑選96個將其在42。C下培養(yǎng)繁殖的菌落，使其分別在不含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上和含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上繁殖，挑選氯霉素感受性的菌林。從挑選的菌抹中獲得基因組DNA,以其為模型進行PCR擴增，挑選編碼pfl的基因缺損的菌抹，將其命名為MG1655ApflB菌林。利用使用酪蛋白水解物的MG1655Apfl菌抹生產乳酸作為預培養(yǎng)是準備多個裝有250gLBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶，在其中分別植入乳酸生產菌MG1655、MG1655Apfl菌抹、以及將實施例2所述的質粒pGlyldhA按照常規(guī)方法組裝入MG1655Apfl菌林得到的MG1655Apfl/pGlyldhA3種菌林，于30。C下，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，分別在裝有475g表4所示培養(yǎng)基的1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為31°C、pH為6.7(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)50小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定所得培養(yǎng)液中乳酸的含量和光學純度。結果如表5所示。表4培養(yǎng)基組成GlucoselOOg/LNa2HP04-12H206.0g/L(NH4)2S046.0g/LKH2P043.0g/LNaCl3.0g/LMgS04.7aq0.1g/L酵母浸膏0.5g/L酪蛋白水解物5.0g/L表5_MG1655MG1655ApflMG1655Apfl/pGlyldhAD-乳酸蓄積量28g/L58g/L63.7g/L使用谷物浸提物的利用MG1655Apfl菌抹的乳酸的產生作為預培養(yǎng)是分別將MG1655、MG1655Apfl、以及MG1655Apfl/pGlyldhA植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，于30。C下，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，分別在1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中裝入475g表6所示培養(yǎng)基的培養(yǎng)裝置中進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為300rpm、培養(yǎng)溫度為35。C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定所得培養(yǎng)液中的乳酸和丙酮酸。結果如表7所示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在上述結果中，總乳酸量超過培養(yǎng)開始時加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的還原糖、有機酸、氨基酸，也能達到90%或90%以上的轉換率。高葡萄糖濃度下利用MG1655Apfl菌抹的乳酸的高蓄積生產作為預培養(yǎng)是將MG1655Apfl植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，在裝有475g如表8所示的葡萄糖濃度由10%變化至15%的培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為300rpm、培養(yǎng)溫度為35°C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)至葡萄糖被消耗掉。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定乳酸。結果如表9所示。表8培養(yǎng)基組成_葡萄糖10%12%15%谷物浸提物(日本食品化工制)5%AdecanolLG1260.1%表9葡萄糖濃度10%12%15%D-乳酸蓄積量95g/kg培養(yǎng)液112g/kg培養(yǎng)液130g/kg培養(yǎng)液培養(yǎng)液回收量560g567g夠干燥菌體重量2.5g/L2.5g/L2.5g/L總乳酸量超過培養(yǎng)開始時加入的葡萄糖量的原因是利用了谷物浸提物中的碳源。但是，即使全部使用谷物浸提物中的還原糖、有機酸、氨基酸，也能達到90%或90%以上的轉換率，而且達到130g/L這一至今未曾實現(xiàn)的高蓄積量。利用MG1655Apfl菌抹研究谷物浸提物添加量作為預培養(yǎng)是將MG1655Apfl植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，在裝有475g如表10所示的谷物浸提物濃度由1%變化至10%的培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01代培養(yǎng)槽中進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為300rpm、培養(yǎng)溫度為35°C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定乳酸。結果如表ll所示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在1%谷物浸提物添加區(qū)域可觀察到生產速度下降，但在24小時內仍然達到了55g/L這一至今未曾實現(xiàn)的生產速度。另外，相對于使用的葡萄糖，乳酸轉換率維持在大于或等于90%的水平。利用MG1655Apfl菌林研究通氣條件對糖酵解速度的影響作為預培養(yǎng)是將MG1655Apfl植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，在裝有475g表12所示培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-Ol的培養(yǎng)槽中進行全量植菌。在大氣壓下、并以表13所示條件為通氣條件，培養(yǎng)溫度為35。C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)24小時。利用glucoseCII-testwako(和光純藥工業(yè))測定葡萄糖的殘存量。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表13試驗區(qū)域1234通氣量(vvm)00.50.50.5攪拌速度(rpm)200200400600表14試驗區(qū)域1234葡萄糖殘存量(g/L)59.439.421.767.9由該試驗可知，隨著通氣條件的提高，糖酵解速度也提高，如果過度提高通氣條件，則糖分解速度降低。利用MG1655Apfl/pGlyldhA菌林研究谷物浸提物添加量作為預培養(yǎng)是將MG1655ApflB/pGlyldhA植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，在裝有475g如表15所示的谷物浸提物濃度由1%變化至10%的培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中進行全量植菌。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為300rpm、培養(yǎng)溫度為35。C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定D-乳酸。結果如表16所示。表15培養(yǎng)基組成_葡萄糖10%CSL(日本食品化工制)1%2.5%5%10%AdecanolLG1260.1%表16CSL1%2.5%5%10%D-乳酸蓄積量58g/L92g/L96g/L97g/L在1%谷物浸提物添加區(qū)域生產率最低，但在24小時內達到以往沒有的58g/L的生產速度。另外，相對于使用的葡萄糖，乳酸轉換率維持在大于或等于90%的水平。利用MG1655Apfl/pGlyldhA菌抹研究通氣條件對糖酵解速度的影響作為預培養(yǎng)是將MG1655ApflB/pGlyldhA植入裝有25g培養(yǎng)液的三角燒瓶中，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜后，在裝有475g表17所示培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中進行全量植菌。在大氣壓下、并以表18所示條件為通氣條件，培養(yǎng)溫度為35°C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)24小時。利用glucoseCII-testwako(和光純藥工業(yè))測定葡萄糖的殘存量。表17培養(yǎng)基組成_葡萄糖CSL(日本食品化工制)AdecanolLG12612%5%0.1%表18試驗區(qū)域1234通氣量(vvm)00.50.50.5攪拌速度(rpm)200200400600表19試驗區(qū)域_}_^_^_^_葡萄糖殘存量(g/L)59.436.620.154.5由該試驗可知，隨著通氣條件的提高，糖酵解速度也提高，如果過度提高通氣條件，則糖酵解速度降低。大腸埃希菌MG1655林dld基因缺失菌林的制備利用基于來源于MG1655菌抹的基因組DNA的dld基因附近區(qū)域的基因信息制備的CAACACCAAGCTTTCGCG(序列號9)和TTCCACTCCTTGTGGTGGC(序列號10)、AACTGCAGAAATTACGGATGGCAGAG(序列號11)和TGTTCTAGAAAGTTCTTTGAC(序列號12)進行PCR擴增。將得到的片段分別用限制性內切酶HindIII和PstI、PstI和XbaI切割，由此分別得到約1140bp的片段。將該片段與溫度感受性質粒pTH18csl(Hashimoto-Gotoh，T.，et.al.,Gene，Vol.241(1),pp185-191(2000))經HindIII、XbaI切割得到的片段混合，使用連接酶連接后，于3(TC轉化到DH5a菌林中，得到在含有l(wèi)Opg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉化體。將得到的菌落于3(TC在含有10ng/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，從得到的菌體中回收質粒。將該質粒于30。C轉化到MG1655菌林中，得到在含有10|ig/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖的轉化體。將得到的轉化體涂布在瓊脂平板上，于3(TC培養(yǎng)過夜。然后，將上述培養(yǎng)菌體涂布到含有l(wèi)O^g/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到于42。C繁殖的菌落。再一次進行得到于42。C繁殖的單菌落的操作，通過相同重組挑選質粒整體被組裝到染色體中的克隆體。該克隆體的細胞質中不具有質粒0接下來，將該克隆體涂布在LB瓊脂平板上，于3(TC下培養(yǎng)過夜后，接種到LB液體培養(yǎng)基(3ml/試管)中，于42。C下培養(yǎng)34小時，振搖培養(yǎng)。為得到單菌落，將該培養(yǎng)液適當稀釋(10-210—6左右)，涂布在LB瓊脂平板上，于42。C下培養(yǎng)過夜，得菌落。在出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個菌落，使其分別在LB瓊脂平板上和含有l(wèi)Opg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，挑選只在LB瓊脂平板上繁殖的氯霉素感受性克隆體。再利用PCR擴增上述目的克隆體的染色體DNA中含有dld的約2.0kbp的片段，選擇dld基因區(qū)域缺失的菌抹，以滿足上述條件的克隆體作為did缺失菌林，并將所得的菌林命名為MG1655Adld菌抹。利用MG1655Adld菌抹生產D-乳酸作為預培養(yǎng)是在裝有25mlLBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中植入MG1655菌抹或MG1655Adld菌抹，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜。將各種預培養(yǎng)液整體轉移到裝有475g如表20所示組成的培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中，進行培養(yǎng)。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為31。C、pH為6.7(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)96小時。按照常規(guī)方法，利用HPLC測定48小時后以及培養(yǎng)結束后的乳酸、丙酮酸、甲酸以及乙酸的含量。MG1655菌林、MG1655Adld菌抹分別標記為Wild、Adld，48小時后的結果如表21所示，培養(yǎng)結束時的結果如表22所示。表20培養(yǎng)基組成GlucoselOOg/LNa2HP04,12H206.0g/L(NH4)2S046.0g/LKH2P043.0g/LNaCl3.0g/LMgS04'7aq0.1g/L酵母浸膏0.5g/L酪蛋白水解物5.0g/L表2148小時后的結果wild△didD-乳酸蓄積量26g/L22g/L丙酮酸蓄積量《5g/L1.1g/L曱酸蓄積量5.0g/L1.55g/L乙酸蓄積量"g/L9.5g/L表2296小時后的結果wild△didD-乳酸蓄積量36g/L41g/L丙酮酸蓄積量5.84g/L1.26g/L曱酸蓄積量3.4g/LOg/L乙酸蓄積量12g/L11g/L大腸埃希菌MG1655pfl、dld基因缺失菌林的制備將實施例4中得到的質粒pTHApfl轉化到MG1655Adld菌抹中，在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，得到轉化體。將所得轉化體涂布在瓊脂平板上，于30。C下培養(yǎng)過夜。然后，為得到上述培養(yǎng)菌體，將其涂布在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，得到42°C下繁殖的菌落。通過與實施例5相同地進行操作而從所得菌落得到MG1655dld、pfl基因缺失菌抹，將其命名為MG1655ApflAdld菌抹。ldhA表達載體轉化到MG1655Adld菌林、MG1655ApflAdld菌林中通過將實施例2中得到的質粒pGlyldhA轉化到MG1655Adld菌抹、MG1655ApflAdld菌抹中，得到MG1655Adld/pGlyldhA菌林、MG1655ApflAdld/pGlyldhA菌抹。利用MG1655菌林、MG1655Adld菌林、MG1655Apfl菌抹、MG1655ApflAdld菌抹、MG1655Adld/pGlyldhA菌抹、MG1655ApflAdld/pGlyldhA菌抹生產D-乳酸作為預培養(yǎng)是在裝有25mlLBBroth,Miller培養(yǎng)液的三角燒瓶中植入MG1655菌林、MG1655Adld菌林、MG1655Apfl菌抹、MG1655ApflAdld菌林、MG1655Adld/pGlyldhA菌林、MG1655ApflAdld/pGlyldhA菌林，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜。將各種預培養(yǎng)液整體轉移到裝有475g如表20所示組成的培養(yǎng)基的ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01的培養(yǎng)槽中，進行培養(yǎng)。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為31°C、pH為6.7(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)96小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定乳酸、丙酮酸、曱酸以及乙酸的含量。96小時后的結果如表23所示。菌林名分別表示為A、B、C、D、E、F。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>MG1655ApflAdld/pGAPldhA菌株。大腸埃希菌MG1655ApflAdld菌抹的基因組上ldhA啟動子對GAPDH啟動子的取代大腸埃希菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096)，大腸埃希菌的ldhA基因的堿基序列也被報道(GenBankaccessionnumberU36928)。使用基于來源于大腸埃希菌MG1655菌抹的ldhA基因的5，附近區(qū)域的基因信息制備的AAGGTACCACCAGAGCGTTCTCAAGC(序列號17)和GCTCTAGATTCTCCAGTGATGTTGAATCAC(序列號18)，以大腸埃希菌基因組DNA為模板進行PCR,由此來擴增約1OOObp的DNA片段。另外，利用基于大腸埃希菌MG1655菌抹的甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子的序列信息制備的GGTCTAGAGCAATGATTCACACGATTCG(序列號19)和基于大腸埃希菌MG1655菌株的ldhA基因的序列信息制備的AACTGCAGGTTCGTTCTCATACACGTCC(序列號20),以實施例18中制備的表達載體pGAPldhA為模型，進行PCR擴增，得到由GAPDH啟動子和ldhA基因的起始密碼子附近區(qū)域組成的約850bp的DNA片段。分別利用限制性內切酶KpnI和XbaI、XbaI和PstI切割上述得到的片段，將該片段與利用KpnI和PstI切割溫度感受性質粒pTH18csl得到的片段混合，并利用連接酶連接，然后于3(TC下轉化到DH5a感受態(tài)細胞(TAKARABIO社制)中，在含有10(ig/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，得到轉化體。將得到的菌落于3(TC下在含有l(wèi)(Hig/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，從得到的菌體中回收質粒，并命名為pTH-GAPldhA。將pTH-GAPldhA于30。C下轉化到MG1655Apfl△did菌抹，并于30。C在含有l(wèi)(Hig/ml氯霉素的LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜，得到轉化體。將得到的轉化體接種到含有10(ig/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基上，于30。C培養(yǎng)過夜。接下來，為得到上述培養(yǎng)菌體，將其涂布在含有10iag/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，42。C下繁殖，得到菌落。將所得菌落在不含有藥劑的LB液體培養(yǎng)基中于3(TC培養(yǎng)過夜，然后再涂布到不含藥劑的LB瓊脂平板上，42。C下繁殖，得到菌落。從出現(xiàn)的菌落中任意挑選IOO個菌落，使其分別在不含有藥劑的LB瓊脂平板上和含有10嗎/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，挑選氯霉素感受性的克隆體。然后利用PCR擴增上述目的克隆體的染色體DNA中的包含GAPDH啟動子和ldhA基因的約800bp的片段，挑選ldhA啟動子區(qū)域被GAPDH啟動子取代的菌林，將滿足以上條件的克隆體命名為MG1655ApflAdld/GAPldhA基因組插入林。利用MG1655ApflAdld菌抹、MG1655ApflAdld/pGAPldhA菌抹、MG1655ApflAdld/GAPldhA基因組插入抹生產D-乳酸作為預培養(yǎng)是在裝有25mlLBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中植入MG1655ApflAdld菌抹、MG1655ApflAdld/pGAPldhA菌抹、MG1655ApflAdld&pflB/GAPldhA基因組插入林，以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜。將各種預培養(yǎng)液整體轉移到裝有475g由120g/L葡萄糖、5%谷物浸提物(日本食品化工制)組成的培養(yǎng)基的1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中，進行培養(yǎng)。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為35°C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)至葡萄糖被消耗掉。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定所得培養(yǎng)液中的D-乳酸蓄積量。結果如圖1所示。D-乳酸蓄積生產率分別為MG1655ApflAdld菌林在48小時為109.0g/L、MG1655ApflAdld/pGAPldhA菌林在48小時為115.6g/L、MG1655ApflAdld/GAPldhA基因組插入林在30小時為113.5g/L。大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdh菌林的制備大腸埃希菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096),大腸埃希菌的mdh基因的堿基序列也被報道(GenBankaccessionnumberAE000403)。為了克隆編碼mdh的基因(939bp)的堿基序列附近區(qū)域，合成4種序列號21、序列號22、序列號23及24所示的低聚核苷酸引物。具有序列號21的堿基序列的引物在5'末端處具有KpnI識別部位、具有序列號22、23的堿基序列的引物在5'末端處具有BamHl識別部位、具有序列號24的堿基序列的引物在5'末端處具有XbaI識別部位。#4居CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons)所述的方法制備大腸埃希菌MG1655菌才朱的基因組DNA,利用得到的基因組DNAlpg與序列號21和序列號22、序列號23和序列號24的組合，且上述引物DNA各使用1OOpmol,在通常的條件下進行PCR，擴增約800bp(以下也稱為mdh-L片段)、及約lOOObp(以下也稱為mdh-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用KpnI和BamHI切割mdh-L片段，利用BamHI和XbaI切割mdh-R片段。利用T4DNA連接酶使上述2種切割片段與溫度感受性質粒pTH18csl(GenBankaccessionnumberAB019610)(Hashimoto畫Gotoh，T.,et.al.,Gene,Vol.241(1)，ppl85-191(2000))經KpnI和XbaI切割的產物反應后，轉化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞(TAKARABIO社制)中，從而得到具有編碼mdh的基因的5，上游附近片段和3'下游附近片段2個片段的質粒，將其命名為pTHAmdh。將質粒pTHAmdh轉化到大腸埃希菌MG1655ApflAdld菌抹中，利用與實施例5相同的方法，獲得mdh基因被破壞的MG1655△pflAdld菌抹。將該菌抹命名為MG1655ApflAdldAmdh菌林。大腸埃希菌MG1655ApflBAdld厶ppc菌林的制備大腸埃希菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096),大腸埃希菌的ppc基因的堿基序列也被報道(GenBankaccessionnumberAE000496)。為了克隆編碼ppc的基因(2652bp)的堿基序列附近區(qū)域，合成4種具有序列號25、26、27和28所示的堿基序列的低聚核苷酸引物。序列號26、27的引物在5'末端處具有Xbal識別部位、序列號28的引物在5'末端處具有SacI識別部位。利用大腸埃希菌MG1655菌抹的基因組DNAl(ag與序列號25和序列號26、序列號27和序列號28的組合，且上述引物DNA各使用100pmol，在通常的條件下進行PCR,擴增約1450bp(以下也稱為ppc-L片段)、及約750bp(以下也稱為ppc-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用HindIII和XbaI切割ppc-L片段，利用XbaI和Sacl切割ppc-R片段。利用T4DNA連接酶使上述2種切割片段與溫度感受性質粒pTH18csl經HindIII和Sacl切割的產物反應后，轉化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞(TAKARABIO社制)中，從而得到含有編碼ppc的基因的5'上游附近片段和3，下游附近片段2個片段的質粒，將其命名為pTHAppc。將質粒pTHAppc轉化到大腸埃希菌MG1655ApflAdld菌林中，最后獲得ppc基因被破壞的MG1655厶pflAdld菌林。將該菌抹命名為MG1655ApflBAdldAppc菌抹。需要說明的是，獲得本菌林的詳細方法基于本發(fā)明的實施例5中所述的方法。大腸埃希菌MG1655ApflAdldAfrd菌林的制備大腸埃希菌的基因組DNA的全部堿基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096)，大腸埃希菌的frd基因的石咸基序列也被報道(GenBankaccessionnumberAE000487)。本實施例中缺失的frd基因是含有編碼frdA的基因(1809bp)、編碼frdB的基因(735bp)、編碼frdC的基因(396bp)、編碼frdD的基因(360bp)4種基因的基因。為了克隆frd基因的堿基序列附近區(qū)域，合成4種具有序列號29、30、31和32所示的堿基序列的低聚核普酸引物。序列號29的引物在5，末端處具有EcoRl識別部位，序列號30、31的引物在5，末端處具有BamHI識別部位，序列號32的引物在其內部具有HindIII識別部位。利用大腸埃希菌MG1655菌抹的基因組DNAlpg與序列號29和序列號30、序列號31和序列號32的組合，且上述引物DNA各lOOpmol,在通常的條件下進行PCR，擴增約600bp(以下也稱為frd-L片段)、及約800bp(以下也稱為frd-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用EcoRl和BamHI切割frd-L片段，利用BamHI和HindIII切割frd-R片段。利用T4DNA連接酶使上述2種切割片段與溫度感受性質粒pTH18csl經EcoRI和HindIII切割的產物反應后，轉化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞(TAKARABIO社制)中，從而得到具有編碼frd的基因的5'上游附近片段和3，下游附近片段2個片段的質粒，將其命名為pTHAfrd。將質粒pTHAfrd轉化到大腸埃希菌MG1655ApflAdld菌株中，最后獲得frd基因組被破壞的MG1655ApflAdld菌林。將該菌抹命名為MG1655ApflAdldAfrd菌抹。獲得本菌林的詳細方法基于本發(fā)明實施例5中所述的方法。大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdhAasp菌抹的制備大腸埃希菌的基因組DNA的全部石咸基序列是公知的(GenBankaccessionnumberU00096),大腸埃希菌的aspA基因的堿基序列也被報道(GenBankaccessionnumberAE000486)。為了克隆編碼aspA的基因(1482bp)的堿基序列附近區(qū)域，合成4種序列號33、34、35和36所示的低聚核苷酸引物。利用大腸埃希菌MG1655菌抹的基因組DNAl嗎與序列號33和序列號34、序列號35和序列號36的組合，且上述引物DNA各使用lOOpmol,在通常的條件下進行PCR,擴增約910bp(以下也稱為aspA-L片段)、及約1lOObp(以下也稱為aspA-R片段)的DNA片段。利用瓊脂糖電泳分離、回收上述DNA片段，利用DNABluntingKit(TAKARABIO社制)將aspA-L片段和aspA-R片段的末端平滑化后，利用T4多核香酸激酶，按照常規(guī)方法磷酸化5'末端。另一方面，溫度感受性質粒pTH18csl經Smal切割后，利用i咸性磷酸酶進行脫磷酸處理。利用T4DNA連接酶使上述磷酸化的2種片段與脫磷酸化的質粒反應后，轉化到大腸埃希菌DH5a感受態(tài)細胞(TAKARABIO社制)中，從而得到含有編碼aspA的基因的5'上游附近片段和3，下游附近片段2個片段的質粒，將其命名為pTHAasp。將質粒pTHAasp轉化到大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdh菌抹中，最后獲得aspA基因組被破壞的MG1655ApflAdldAmdh菌林。將該菌抹命名為MG1655ApflAdldAmdhAasp菌抹。獲得本菌抹的詳細方法基于本發(fā)明實施例5中所述的方法。大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdhAasp菌抹/GAPldhA基因組插入抹的制備將實施例19中得到的質粒pTH-GAPldhA于30。C下轉化到MG1655ApflAdldAmdhAasp菌株中，并在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上于30。C下培養(yǎng)過夜，得轉化體。將得到的轉化體接種到含有10叫/ml氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于3(TC培養(yǎng)過夜。接下來，為了得到上述培養(yǎng)菌體，將其涂布在含有10pg/ml氯霉素的LB瓊脂平板上，42。C下繁殖，得到菌落。將所得菌落于3(TC下在不含藥劑的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后涂布到不含藥劑的LB瓊脂平板上，42。C下繁殖，得到菌落。從出現(xiàn)的菌落中任意挑選100個菌落，分別在不含有藥劑的LB瓊脂平板上和含有10嗎/ml氯霉素的LB瓊脂平板上繁殖，挑選氯霉素感受性的克隆體。然后利用PCR擴增上述目的克隆體的染色體DNA中的包含GAPDH啟動子和ldhA基因的約800bp的片段，挑選ldhA啟動子區(qū)域被GAPDH啟動子取代的菌林，將滿足以上條件的克隆體命名為MG1655Apf!AdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入抹。利用大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdh菌4朱生產D-乳酸、及琥珀酸作為預培養(yǎng)是在4個裝有25mlLBBroth，Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中，分別植入實施例15中得到的大腸埃希菌MG1655ApflAdld菌抹、實施例21中得到的大腸埃希菌MG1655Apf!AdldAmdh菌抹、比較例1中得到的大腸埃希菌MG1655ApflAdldAppc菌抹、比較例2中得到的大腸埃希菌MG1655ApflAdldAfrd菌抹，于30。C下以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜。然后，在4個裝有475g表24所示培養(yǎng)基的1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中分別植入上述燒瓶的全部內容物。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為35°C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)32小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定得到的培養(yǎng)液中的乳酸、及琥珀酸的濃度。乳酸蓄積結果如圖2所示，琥珀酸的蓄積結果如圖3所示。關于乳酸，Apf!AdldAmdh菌抹32小時的蓄積量為89g/L,顯示了與ApflAdld菌林同等的蓄積程度，而在ApflAdld厶ppc菌林、ApflAdWAfrd菌株中，分別為56g/L、71g/L。關于琥珀酸，ApflAdld菌抹32小時的蓄積量為3.8g/L,而其余3種菌抹都未見蓄積。表24培養(yǎng)基組成_葡萄糖12%谷物浸提物(日本食品化工制)5%(剩余部分水)利用大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdhAasp菌林及MG1655ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入林生產D-乳酸、及富馬酸作為預培養(yǎng)是在3個裝有25mlLBBroth,Miller培養(yǎng)液(Difco244620)的三角燒瓶中，分別植入實施例22中得到的大腸埃希菌MG1655ApflAdldAmdhAasp菌林、實施例23中得到的大腸埃希菌MG1655Apf!AdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入抹、及實施例21中得到的ApflAdldAmdh，于30。C下以120rpm的速度攪拌培養(yǎng)過夜。然后，在3個裝有475g表24所示的培養(yǎng)基的1L容積的培養(yǎng)槽(ABLE社制培養(yǎng)裝置BMJ-01)中分別植入上述燒瓶的全部內容物。在大氣壓下、通氣量為0.5vvm、攪拌速度為200rpm、培養(yǎng)溫度為35。C、pH為7.2(利用NaOH調節(jié))的條件下，培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結束后，按照常規(guī)方法，利用HPLC測定得到的培養(yǎng)液中的乳酸、及富馬酸的濃度。乳酸蓄積結果如圖4所示，富馬酸的蓄積結果如圖5所示。關于乳酸，ApflAdldAmdhAasp菌抹48小時的蓄積量為91g/L，ApflAdldAmdh菌抹48小時的蓄積量為90g/L，二者顯示了同等的蓄積程度，而在ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入抹中，24小時的蓄積量為98g/L。關于富馬酸，在ApflAdldAmdh菌林中，48小時的蓄積量為0.037g/L，而在ApflAdldAmdhAasp菌抹和ApflAdldAmdhAasp/GAPldhA基因組插入抹中，48小時的蓄積量為0.01g/L。序列表<110〉三井化學林式會社<120>D-乳酸生產用生物催化劑<130〉F000364<160>36<210>1<211〉34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400〉1ggaattcgtcgaccggctccagttcgaagctggt34<210〉2<211〉32<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>PCR引物<400>2ggaattctgactcagctaacaataaaattttt32<210〉3<211>28<212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400〉3ggaattccggagaaagtcttatgaaact28<210>4<211>29<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>PCR引物<400>4cccaagcttttaaaccagttcgttcgggc29<210>5<211>20<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉PCR引物<400>5gcacgaaagctttgattacg20<210〉6<211〉30<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>6ttattgcatgcttagatttgactgaaatcg30<210〉7<211>30<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>PCR引物<400>7ttattgcatgcttatttactgcgtacttcg30<210〉8<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PCR引物<400〉8aaggcctacgaaaagctgcag21<210>9<211>18<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PCR引物<400〉9caacaccaagctttcgcg18<210〉10<211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400〉10ttccactccttgtggtggc19<210>11<211>26<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PCR引物<400>11aactgcagaaattacggatggcagag26<210〉12<211〉21<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>PCR引物<400〉21tgttctagaaagttctttgac21<210>13<211〉30<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>PCR引物<400〉13aacgaattctcgcaatgattgacacgattc30<210>14<211>32<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>PCR引物<400>14acagaattcgctatttgttagtgaataaaagg32<210>15<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>15ggaattccggagaaagtcttatgaaact28<210>16<211〉30<212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400〉16cccaagcttttaaaccagttcgttcggggc30<210>17<211〉26<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>PCR引物<400〉17aaggtaccaccagagcgttctcaagc26<210〉18<211>30<212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400〉18gctctagattctccagtgatgttgaatcac30<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>PCR引物<400〉19ggtctagagcaatgattcacacgattcg28<210〉20<211>28<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PCR引物<400〉20aactgcaggttcgttctcatacacgtcc28<210〉21<211>30<212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400〉21aaaggtaccagaataccttctgctttgccc30<210〉22<211〉30<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>22aaaggatcccctaaactccttattatattg30<210〉23<211〉30<212>DNA<213>人工序列<220><223〉PCR引物<400〉23aaaggatccaaaccggagcacagactccgg30<210〉24<211><212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>24aaatctagaatcagatcatcgtcgccttac30<210〉25<211〉<212〉DNA<213>人工序列<220><223〉PCR引物<400>25acggagcatgacggcaagc19<210〉26<211〉<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉PCR引物<400>26aatctagacaccccatcttatcgtttg27<210〉27<211><212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>27tttctagatcttcctcttctgcaaaccc28<210>28<211〉<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>28ctttgagctcacgcgaggccaggttatc28<210〉29<211〉<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>29agtgaattctcacagccagtgcgccga27<210>30<211><212〉DNA<213>人工序列<220><223〉PCR引物<400〉30agtggatcccgcatcgccaatgtaaatcc29<210〉31<211〉<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>31agtggatccgacattcctccagattgttttt31<210〉32<211><212>DNA<213〉人工序列<220><223>PCR引物<400〉32ataacgcaagaaagcttgttga22<210〉33<211〉<212〉DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>33ttttgagctcgatcaggattgcgttggtgg30<210>34<211〉<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>34cgaacagtaatcgtacaggg20<210〉35<211〉<212>DNA<213>人工序列<220><223〉PCR引物<400>35tacgattactgttcggcatcgaccgaatacccgag35<210>36<211><212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉PCR引物<400>36tttttctagacctggcacgcctctcttctc30權利要求1、一種大腸埃希菌，該大腸埃希菌具有TCA循環(huán)、且蘋果酸脫氫酶(mdh)失活或活性降低，其特征在于，該大腸埃希菌的丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)失活或活性降低，且/或FAD依賴性D-乳酸脫氫酶(dld)失活或活性降低。2、如權利要求1所述的大腸埃希菌，其中，該大腸埃希菌本來具有的天冬氨酸解氨酶(aspA)失活或活性降低。3、如權利要求1或2所述的大腸埃希菌，其中，來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶(ldhA)的活性被增強。4、一種生產TCA循環(huán)中產生的有機酸以外的化合物的方法，該方法利用培養(yǎng)基培養(yǎng)如權利要求1~3中任一項所述的大腸埃希菌，由此生產TCA循環(huán)中產生的有機酸以外的化合物。5、如權利要求4所述的生產方法，其中，有機酸以外的化合物是D-乳酸。6、如權利要求5所述的乳酸的生產方法，其特征在于，在通氣條件下進行培養(yǎng)。7、如權利要求6所述的乳酸的生產方法，其特征在于，所述通氣條件為，在以溫度為30。C的水為對象的情況下，通過供給氧氣使常壓下氧氣體積傳質系數(shù)KLa在大于或等于lh"、小于或等于400h"的范圍內的條件。8、如權利要求5~7中任一項所述的乳酸的生產方法，其特征在于，培養(yǎng)pH為6~8。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于生產D-乳酸的生物催化劑，提供D-乳酸的高效生產方法，另外，還提供光學純度高、有機酸副產物少的高選擇性D-乳酸生產方法。培養(yǎng)丙酮酸甲酸裂解酶失活或活性降低、且來源于大腸埃希菌的NADH依賴性D-乳酸脫氫酶(ldhA)的活性被增強的微生物、FAD依賴性D-乳酸脫氫酶失活或活性降低的微生物、或除上述微生物所述特征以外、具有TCA循環(huán)、且蘋果酸脫氫酶失活或活性降低、且天冬氨酸解氨酶失活或活性降低的微生物，生產D-乳酸。在基因組上將編碼ldhA的基因與控制涉及糖酵解、核酸生物合成或氨基酸生物合成的蛋白質表達的基因的啟動子連接來增強ldhA活性。文檔編號C12N1/21GK101654666SQ200910175849公開日2010年2月24日申請日期2004年9月17日優(yōu)先權日2003年9月30日發(fā)明者三宅仁基,東庸介,及川利洋,和田光史,安樂城正,川島美由貴,德田淳子,望月大資,森重敬,澤井秀樹,耳塚孝,阿部玲子,高橋均申請人:三井化學株式會社