專利名稱：：通過無(wú)方程算法判定實(shí)時(shí)pcr拐點(diǎn)的制作方法通過無(wú)方程算法判定實(shí)時(shí)PCR拐點(diǎn)
背景技術(shù)：
：本發(fā)明總體上涉及處理表示S型曲線或增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)的系統(tǒng)和方法，更具體而言涉及測(cè)定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增曲線中的特征性循環(huán)閾(Ct)值或拐點(diǎn)值或其他增長(zhǎng)曲線中拐點(diǎn)值的系統(tǒng)和方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為酶法合成或擴(kuò)增確定核酸序列的體外方法。該方法通常使用兩個(gè)寡聚核苷酸引物，其可與相反鏈雜交并側(cè)接待擴(kuò)增的模板或靶DNA序列。引物的延伸由熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化。涉及模板變性、引物復(fù)性以及復(fù)性引物在聚合酶作用下的延伸的重復(fù)系列循環(huán)得到特異DNA片段的指數(shù)積累。在該方法中通常使用熒光探針或標(biāo)記物輔助檢測(cè)和定量擴(kuò)增過程。典型的實(shí)時(shí)-PCR曲線顯示于圖l，其中對(duì)典型的PCR過程用熒光強(qiáng)度值對(duì)循環(huán)數(shù)作圖。在這一情況下，在PCR過程的各個(gè)循環(huán)監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的形成。通常在熱循環(huán)儀中測(cè)定擴(kuò)增，該熱循環(huán)儀包括用于測(cè)定擴(kuò)增反應(yīng)中熒光信號(hào)的組件和裝置。該類熱循環(huán)儀的實(shí)例為RocheDiagnosticsLightCycler(目錄編號(hào)20110468)。例如可用熒光標(biāo)記的雜交探針(只有當(dāng)它們與靶核酸結(jié)合時(shí)才會(huì)發(fā)射熒光信號(hào))或在某些情況下使用與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)于典型的PCR曲線，鑒定通常被稱作拐點(diǎn)值或循環(huán)閾(Ct)值的基線區(qū)末端轉(zhuǎn)變點(diǎn)對(duì)于了解PCR擴(kuò)增過程的特性是非常有用的。Ct值可用作PCR方法有效性的量度標(biāo)準(zhǔn)。舉例而言，通常測(cè)定所有待分析反應(yīng)的確定信號(hào)閾值并且測(cè)定靶核酸以及參比核酸例如標(biāo)準(zhǔn)基因或管家基因達(dá)到該閾值需要的循環(huán)數(shù)(Ct)?？苫谒@得靶核酸和參比核酸的Ct值測(cè)定耙核酸的絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)(Gibson等，GenomeResearch6:995-1001;Bieche等，CancerResearch59:2759-2765，1999;WO97/46707;WO97/46712;WO97/46714)。圖1中基線區(qū)15末端的區(qū)20中的拐點(diǎn)值在循環(huán)數(shù)38區(qū)域內(nèi)。可使用若干現(xiàn)有方法測(cè)定PCR曲線的拐點(diǎn)值。舉例而言，許多現(xiàn)有方法將拐點(diǎn)的實(shí)際數(shù)值測(cè)定為熒光達(dá)到被稱作AFL(任意熒光值)的預(yù)定水平的值。其他方法使用基于方程的方法測(cè)定具有典型雙S型曲線的PCR拐點(diǎn)。已證明非常有助于描述S型的方程為雙S型方程。已引入了雙S型方程的許多實(shí)施和處理，例如DSLM(雙S型Levenberg-Marquardt)方程、具有基線減法(BLS)、基線除法(BLD)以及基線減法和除法(BLSD)選項(xiàng)的DSML、曲率方程和下列所述的其他方法美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/316，315，2005年12月20日遞交；美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/349，550,2006年2月6日遞交；美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/458644，2006年7月19日遞交；美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/533，291，2006年9月19日遞交；以及美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/861，188，2007年9月25日遞交。然而，如果PCR曲線的幾何形狀不符合典型的雙S型，那么就不再適用基于雙S型的方法，因此需要更通用的方法獲得拐點(diǎn)或Ct值。因此需要提供可克服上述和其他問題的測(cè)定增長(zhǎng)曲線尤其是PCR曲線中的拐點(diǎn)值的系統(tǒng)和方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供測(cè)定S型或增長(zhǎng)曲線轉(zhuǎn)變值，例如PCR擴(kuò)增曲線的基線區(qū)末端或拐點(diǎn)值或Ct值的系統(tǒng)和方法。為了滿足測(cè)定PCR拐點(diǎn)值例如實(shí)時(shí)PCR拐點(diǎn)值的通用但強(qiáng)效的方法的需要，許多實(shí)施方案利用數(shù)據(jù)的最大值(例如，曲率、相對(duì)曲率、二階導(dǎo)數(shù)或相對(duì)二階導(dǎo)數(shù)的最大值)的位置尋找拐點(diǎn)值。這些數(shù)值的測(cè)定并不需要方程本身，但是使用數(shù)值方法。然而許多實(shí)施方案使用高斯混合模型，其要求方程與數(shù)據(jù)擬合從而測(cè)定分?jǐn)?shù)拐點(diǎn)值。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了計(jì)算機(jī)實(shí)施方法用于測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)的末端的點(diǎn)。該方法通常包括接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集(該數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值)，數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值并測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值。該方法也通常包括計(jì)算能擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件，并輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。在某些方面，該數(shù)據(jù)集表示動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程的增長(zhǎng)曲線并且其中基線區(qū)末端的點(diǎn)表示增長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)或循環(huán)閾(Ct)值。在某些方面，該方法進(jìn)一步包括顯示所述第一參數(shù)值。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，使用第二最大值作為第二參數(shù)的初始條件并且該方法進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)。在某些方面該高斯混合模型包括表達(dá)式gmm!=￡icp(—a)￡bcp、2、x-M,其中h為第一參數(shù)，其中^和h為附加參數(shù)。在某些方面該方法進(jìn)一步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值，其中'max|線性(x,.)-y,.l-如果m22和中值y,.>0.001.5中，W0否則根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了計(jì)算機(jī)實(shí)施方法以測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端的點(diǎn)。該方法通常包括接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集(該數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值)，數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值并測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值。該方法也通常包括計(jì)算能擬合已測(cè)定曲率值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件，并輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。在某些方面，該數(shù)據(jù)集表示動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程的增長(zhǎng)曲線，其中基線區(qū)末端的點(diǎn)表示增長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)或循環(huán)閾(Ct)值。在某些方面，該方法進(jìn)一步包括顯示第一參數(shù)。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，使用第二最大值最作為第二參數(shù)的初始條件并且該方法進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)。在某些方面，該高斯混合模型包括表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中^為第一參數(shù)，其中^和h為附加在某些在另一方面該方法進(jìn)一步包括修飾數(shù)據(jù)集以使所測(cè)定曲率值為比例不變方面，該方法進(jìn)一步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值，射<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>中值如果m22和中值|y,|>0.001<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>0否則另一方面本方法進(jìn)一步包括數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值；測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值；計(jì)算能擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第二參數(shù)的初始條件；并輸出第二參數(shù)，其中所測(cè)定的第二參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的所述基線區(qū)末端。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括用于控制處理器以測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端點(diǎn)的編碼。該編碼通常包括接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集的指令(該數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值)以數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值并測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值。該編碼也通常包括計(jì)算能擬合測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線近似值的指令，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件，并輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。在某些方面，該數(shù)據(jù)集表示動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程的增長(zhǎng)曲線并且基線區(qū)末端的點(diǎn)表示增長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)或循環(huán)閾(Ct)值。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，將第二最大值用作第二參數(shù)的初始條件并且該編碼進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)的指令。在某些方面，該編碼進(jìn)一步包括顯示Ct值的指令。在某些方面坐標(biāo)值對(duì)表示已擴(kuò)增多聚核苷酸的積累和循環(huán)數(shù)。在某些方面，高斯混合模型包括表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>,其中P工為第一參數(shù)，并且其中&和o工為附加參數(shù)。在某些方面該方法進(jìn)一步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>:如果m^2和.f值,y,>0.001<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括用于控制處理器以測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端點(diǎn)的編碼。該編碼通常包括接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集的指令(該數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值)以數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值并測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值。該編碼也通常包括計(jì)算能擬合已測(cè)曲率值的曲線近似值的指令，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件，輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。在某些方面，該數(shù)據(jù)集表示動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程的增長(zhǎng)曲線并且其中基線區(qū)末端的點(diǎn)表示增長(zhǎng)曲線的拐點(diǎn)或循環(huán)閾(Ct)值。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，使用第二最大值作為第二參數(shù)的初始條件并且該編碼進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)的指令。在某些方面該編碼進(jìn)一步包括顯示Ct值的指令。在某些方面坐標(biāo)值對(duì)表示已擴(kuò)增多聚核苷酸的積累和循環(huán)數(shù)。在某些方面，高斯混合模型包括表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>,其中Pi為第一參數(shù)，并且其中&和o工為附加參數(shù)。在某些方面，該方法進(jìn)-DeltaB統(tǒng)計(jì)值，其中-步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>如果mS2和._值，|y,'|>0.001中值|y,.|'■'"'-/'=5..附-10否則根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通常包括動(dòng)態(tài)PCR分析模塊，其可生成表示動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的PCR數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集通常包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值，其中所述數(shù)據(jù)集包括含有循環(huán)閾(Ct)值的所關(guān)注區(qū)域內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。該系統(tǒng)也通常包括適合于處理PCR數(shù)據(jù)集以測(cè)定Ct值的智能模塊，其方式為數(shù)值上測(cè)定沿PCR曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值，測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值并計(jì)算能擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件。該智能模塊也通常適合于輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示Ct值。在某些方面，該動(dòng)態(tài)PCR分析模塊位于動(dòng)態(tài)熱循環(huán)裝置中，并且該智能模塊包括與分析模塊通信偶合的處理器。在某些方面，該智能模塊包括位于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的處理器，其經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接或直接連接之一與分析模塊偶合。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括顯示模塊，例如監(jiān)控器、打印機(jī)或其他可顯示文字和/或圖象數(shù)據(jù)的裝置，其中輸出包括在顯示模塊上顯示Ct值。在某些方面，第二最大值被用作第二參數(shù)的初始條件，并且智能模塊可進(jìn)一步輸出第二在某些方面，高斯混合模型包括表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>,其中P工為第一參數(shù)，并且其中&和o工為附加參數(shù)。在某些方面該方法進(jìn)一步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>中值如果m》2和.f值，y」>0.001<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通常包括動(dòng)態(tài)PCR分析模塊，其可生成表示動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的PCR數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集通常包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值，其中所述數(shù)據(jù)集包括含有循環(huán)閾(Ct)值的所關(guān)注區(qū)域內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。該系統(tǒng)也通常包括適合于處理PCR數(shù)據(jù)集以測(cè)定Ct值的智能模塊，其方式為數(shù)值上測(cè)定沿PCR曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值，測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值并計(jì)算能擬合所測(cè)定曲率值的曲線近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件。該智能模塊也通常適合于輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示Ct值。在某些方面，該動(dòng)態(tài)PCR分析模塊位于動(dòng)態(tài)熱循環(huán)裝置中，并且該智能模塊包括與分析模塊通信偶合的處理器。在某些方面，該智能模塊包括位于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的處理器，其經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接或直接連接之一與分析模塊偶合。在某些方面，該回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。在某些方面，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括顯示模塊，例如監(jiān)控器、打印機(jī)或其他可顯示文字和/或圖象數(shù)據(jù)的裝置，其中輸出包括在顯示模塊上顯示Ct值。在某些方面中，第二最大值被用作第二參數(shù)的初始條件，并且智能模塊可進(jìn)一步輸出第二參數(shù)。在某些方面，高斯混合模型包括表達(dá)式廣./<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>義—A,其中Pi為第一參數(shù)，并且其中&和oi為附加參數(shù)。在某些方面該方法進(jìn)一步包括測(cè)定該曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其方式為計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值，其中maxI線性(x,)—y,如果m22和|y,|>0.001值,W0否則參考本說明書其余部分(包括圖例和權(quán)利要求)將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)以及本發(fā)明許多實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和操作結(jié)合附圖詳細(xì)描述于下文。在附圖中，相似的參考編碼表示相同或功能相似的元件。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了典型PCR增長(zhǎng)曲線的實(shí)例，以熒光強(qiáng)度對(duì)循環(huán)數(shù)作圖。圖2顯示了圖1中實(shí)時(shí)PCR曲線的二階導(dǎo)數(shù)。圖3顯示了圖1中實(shí)時(shí)PCR曲線的曲率。圖4顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案測(cè)定S型曲線轉(zhuǎn)換值，例如動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的拐點(diǎn)值或Ct值的方法。圖5顯示了具有多個(gè)Ct值的實(shí)時(shí)PCR曲線的實(shí)例。圖6顯示了圖5中實(shí)時(shí)PCR曲線的二階導(dǎo)數(shù)。圖7顯示了圖5中實(shí)時(shí)PCR曲線的曲率。圖8顯示了PCR數(shù)據(jù)曲線平臺(tái)區(qū)熒光衰減的實(shí)例。圖9顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的衰減檢測(cè)工作流程圖。圖10顯示了用于區(qū)分曲線的真正增長(zhǎng)與平線的五個(gè)檢測(cè)。圖11顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案測(cè)定增長(zhǎng)曲線Ct值的方法。圖12顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的Ct尋找常規(guī)程序的處理步驟。圖13顯示了在一個(gè)實(shí)施方案中執(zhí)行的專家系統(tǒng)檢查。圖14顯示了具有兩個(gè)拐點(diǎn)的典型實(shí)時(shí)PCR曲線的實(shí)例。圖15為顯示用于實(shí)施本發(fā)明方法和系統(tǒng)的軟件和硬件資源之間關(guān)系的總體塊狀圖的實(shí)例。圖16為顯示熱循環(huán)裝置和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)之間關(guān)系的總體塊狀圖的實(shí)例。發(fā)明詳述本發(fā)明提供測(cè)定S型或增長(zhǎng)曲線的轉(zhuǎn)換值，例如PCR擴(kuò)增曲線的基線區(qū)末端或拐點(diǎn)值或Ct值的系統(tǒng)和方法。在某些方面，進(jìn)行PCR數(shù)據(jù)集的二階導(dǎo)數(shù)和曲率值的數(shù)值測(cè)定。使用具有經(jīng)Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程測(cè)定的參數(shù)的高斯混合模型(G匪)函數(shù)尋找二階導(dǎo)數(shù)和曲率曲線的近似值。數(shù)值上測(cè)定的二階導(dǎo)數(shù)值和/或曲率值的最大值用作G匪函數(shù)參數(shù)的初始條件。所測(cè)定的參數(shù)提供分?jǐn)?shù)Ct值。接著報(bào)告Ct值并可將其顯示或用于進(jìn)一步處理。PCR過程背景下的增長(zhǎng)或擴(kuò)增曲線10的實(shí)例顯示于圖1。如圖所示，曲線IO包括延遲期區(qū)15以及指數(shù)期區(qū)25。延遲期區(qū)15通常被稱作基線或基線區(qū)。該曲線10包括連接延遲期和指數(shù)期區(qū)域的所關(guān)注轉(zhuǎn)換區(qū)20。區(qū)20通常稱作拐點(diǎn)或拐點(diǎn)區(qū)。拐點(diǎn)區(qū)通常限定基線的末端和底層過程(underlyingprocess)的增長(zhǎng)或擴(kuò)增速率的轉(zhuǎn)變。鑒定區(qū)20中的特定轉(zhuǎn)變點(diǎn)可用于分析底層過程的行為。在典型的PCR曲線中，鑒定被稱作拐點(diǎn)值或循環(huán)閾(Ct)值的轉(zhuǎn)變點(diǎn)可用于了解PCR過程的定性和定量特點(diǎn)。例如，Ct值可用于提供對(duì)所分析樣品中存在的DNA量的定量。通過繪制Log(DNA量)比Ct值的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。之后的樣品可接著使用Ct值沿著校準(zhǔn)曲線直接獲得樣品中DNA的估計(jì)值。Ct值也可用于提供對(duì)DNA樣品的定性信息。其他可提供相似S型或增長(zhǎng)曲線的過程包括細(xì)菌過程、酶反應(yīng)過程和結(jié)合過程。例如在細(xì)菌生長(zhǎng)曲線中所關(guān)注的轉(zhuǎn)變點(diǎn)被稱作延遲期的時(shí)間，A?？僧a(chǎn)生可根據(jù)本發(fā)明分析的數(shù)據(jù)曲線的其他特定過程包括鏈置換擴(kuò)增(SDA)過程、核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增(NASBA)過程以及轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)過程。SDA和NASBA過程的實(shí)例以及數(shù)據(jù)曲線可分另U參見Wang，Sha-Sha等，〃HomogeneousReal-TimeDetectionofSingle-NucleotidePolymorphismsbyStrandDisplacementAmplificationontheBDProbeTecETSystem,〃ClinChem200349(10):1599，和Weusten，JosJ.A.M.等，〃PrinciplesofQuantitationofViralLoadsUsingNucleicAcidSequence—BasedAmplificationinCombinationWithHomogeneousDetectionUsingMolecularBeacons,〃NucleicAcidsResearch,200230(6):26。因此，盡管本文件的其余部分將就PCR曲線的適用性討論本發(fā)明的實(shí)施方案和各方面，應(yīng)理解的是本發(fā)明可應(yīng)用于和其他過程相關(guān)的數(shù)據(jù)曲線。如圖l所示，典型PCR增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)可以二維坐標(biāo)系統(tǒng)表示，例如，PCR循環(huán)數(shù)定義x-軸，積累的多聚核苷酸增長(zhǎng)的指示物定義y_軸。通常已積累增長(zhǎng)的指示物為熒光強(qiáng)度值，因?yàn)槭褂脽晒鈽?biāo)記可能是最廣泛使用的標(biāo)記方法。然而，應(yīng)理解的是也可使用其他指示物，取決于所使用的具體標(biāo)記和/或檢測(cè)方案。累積信號(hào)增長(zhǎng)的其他可用指示物的實(shí)例包括發(fā)光強(qiáng)度、化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度、生物發(fā)光強(qiáng)度、磷光強(qiáng)度、電荷轉(zhuǎn)移、電壓、電流、功率、能量、溫度、粘度、光散射、放射強(qiáng)度、反射率、透光率和吸光度。循環(huán)的定義也可包括時(shí)間、過程循環(huán)、單位操作循環(huán)和再生循環(huán)?？傮w過程概述考慮如圖1顯示的典型實(shí)時(shí)PCR增長(zhǎng)。需要從圖1中獲得稱作Ct或拐點(diǎn)值的數(shù)值。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，可參考圖4簡(jiǎn)要描述測(cè)定S型曲線轉(zhuǎn)變值(例如動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的拐點(diǎn)值或Ct值)的方法100。在步驟110中，接收或其他方式獲取表示曲線的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集。已作圖的PCR數(shù)據(jù)集的實(shí)例顯示于圖l，其中y-軸和x-軸分別表示熒光強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)。在某些方面，該數(shù)據(jù)集應(yīng)包括沿?cái)?shù)軸的連續(xù)并等間距的數(shù)據(jù)。在用位于PCR數(shù)據(jù)獲取裝置例如熱循環(huán)儀中的智能模塊(例如處理器執(zhí)行指令)實(shí)施方法100的情況下，可在收集數(shù)據(jù)時(shí)實(shí)時(shí)向智能模塊提供數(shù)據(jù)集，或者可將其儲(chǔ)存在存儲(chǔ)單元或緩沖區(qū)中并在試驗(yàn)完成后提供給智能模塊。相似地，數(shù)據(jù)集可提供給分離系統(tǒng)例如臺(tái)式計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或其他計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接(例如LAN、VPN、內(nèi)部網(wǎng)、因特網(wǎng)等)或直接連接(例如USB或其他直接有線或無(wú)線連接)至獲取裝置，或提供于攜帶式介質(zhì)，例如CD、DVD、軟盤等上。在某些方面，該數(shù)據(jù)集包括具有坐標(biāo)數(shù)值對(duì)的數(shù)據(jù)點(diǎn)(或2-維向量)。對(duì)于PCR數(shù)據(jù)，坐標(biāo)數(shù)值對(duì)通常表示循環(huán)數(shù)和熒光強(qiáng)度值。在步驟110中接收或獲取數(shù)據(jù)集后可分析數(shù)據(jù)集以測(cè)定基線區(qū)末端。在步驟120中，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字處理以測(cè)定導(dǎo)數(shù)值和曲率值。通過尋找對(duì)應(yīng)于二階導(dǎo)數(shù)最大值(y_軸)或曲率最大值(y_軸)的(分?jǐn)?shù))循環(huán)數(shù)(x-軸)獲得這些曲線的Ct或"拐點(diǎn)值"。使用圖1顯示的數(shù)據(jù)，二階導(dǎo)數(shù)和曲率的對(duì)應(yīng)圖片顯示于圖2和圖3中。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用Savitzky-Golay(SG)法獲得導(dǎo)數(shù)[參見A.Savitzky禾口MarcelJ.E.Golay(1964).SmoothingandDifferentiationofDatabySimplifiedLeastSquaresProcedures.AnalyticalChemistry,36:1627-1639禾口Press,W.H.等，"NumericalRecipesinC，第2片反.，〃Savitzky-GolaySmoothingFilters,Section14.8,650-655]。使用SG_4_4_2設(shè)置(意指向左4個(gè)點(diǎn)，向右四個(gè)點(diǎn)，以及二次多項(xiàng)式)計(jì)算一階和二階導(dǎo)數(shù)。通過以下方程l所示的公式獲得曲率。在這一公式中，x表示循環(huán)數(shù)，y表示熒光值，并且kappa(k)表示曲率。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>曲率的比例不變量形式(相對(duì)曲率)在一些實(shí)施方案中，可使用其他方法計(jì)算曲率使得結(jié)果為比例不變量。比例不變量意指，如果熒光值乘以一個(gè)常數(shù)，所得Ct值不變。根據(jù)一種方法，在計(jì)算方程(1)顯示的曲率之前用熒光值除以平均熒光值。因此，方程(1)中不使用y，y被yAwn替換，其中少，-士1^根據(jù)另一種方法，在計(jì)算方程(1)顯示的曲率之前用熒光值除以從基線至平臺(tái)的PCR曲線增長(zhǎng)或(最大熒光_最小熒光)。因此，方程(1)中不使用y，y現(xiàn)在被y/AFI替換，其中AFI=中值(最后五個(gè)點(diǎn))-中值(前五個(gè)點(diǎn))，或被y/growth替換，其中g(shù)rowth=(最大熒光_最小熒光)。二階導(dǎo)數(shù)的無(wú)因次形式(相對(duì)二階導(dǎo)數(shù))除了直接測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)^f，可通過尋找函數(shù)i^的最大值使用二階導(dǎo)數(shù)的無(wú)血2少&因次(y中)形式。然而當(dāng)實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)不具有典型的雙S型時(shí)無(wú)方程(Equation-Less)法是最有利的。這樣的實(shí)時(shí)PCR曲線顯示于圖5。具有這一形狀的曲線不易用任何分析表達(dá)式描述。這一特殊的曲線具有多個(gè)拐點(diǎn)和多個(gè)Ct值。對(duì)應(yīng)于圖5的二階導(dǎo)數(shù)和曲率圖顯示于圖6和圖7中。如前文所述，通過測(cè)定對(duì)應(yīng)于二階導(dǎo)數(shù)和曲率最大值(如這兩幅圖所示)的循環(huán)數(shù)獲得Ct值。圖5顯示的曲線產(chǎn)生兩個(gè)Ct值?；氐綀D4，在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟130中測(cè)定分?jǐn)?shù)Ct值。為了尋找曲線的最大值，如圖2和3以及圖6和7所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，將高斯混合模型與該數(shù)據(jù)擬合。高斯混合模型的平均值對(duì)應(yīng)于最大值，因此為Ct值。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過計(jì)算擬合所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值和/或擬合所測(cè)定曲率值的曲線近似值計(jì)算曲線擬合，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。在某些方面，使用Levenberg-Marquardt回歸過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于單峰而言，如方程(2)所示使用一個(gè)峰的高斯混合模型。如果存在兩個(gè)峰，如方程(3)所示使用兩個(gè)峰的高斯混合模型。系數(shù)ii工或(iipii2)的回歸值分別對(duì)應(yīng)于一個(gè)或兩個(gè)峰的Ct值。在一個(gè)實(shí)施方案中使用高斯混合模型，而不采用附加導(dǎo)數(shù)尋找最大值，因?yàn)楦呒?jí)的倒數(shù)(三階或四階)會(huì)變得不穩(wěn)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>應(yīng)理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見可使用其他模型/函數(shù)而不是高斯混合模型。其他模型的實(shí)例包括Bete、Binomial、C塞hy、Chi、ChiSqimre、Exponential、ExtremeValue、FRatio、Gamma、Gumbel、Laplace、Logistic、Maxwell、Pareto、Rayleigh、StudentT和Weibull模型。在一個(gè)實(shí)施方案中使用Levenberg-Marquardt(LM)方法曲線擬合方程(2)或方程(3)。這一方法的細(xì)節(jié)可見參考文獻(xiàn)[Mor6，J.J.，"TheLevenberg-MarquardtAlgorithm,ImplementationandTheory,"NumericalAnalysis編車茸，Watson，G.A丄ectureNotesinMathematics630，Springer-Verlag，1977]。應(yīng)理解的是可使用其他熟知的回歸方法。一般而言，LM回歸法包括需要多種輸入并提供輸出的算法。在一方面，輸入包括待處理的數(shù)據(jù)集、用于擬合數(shù)據(jù)的函數(shù)(例如高斯混合模型)以及函數(shù)的參數(shù)或變量的初始估計(jì)值。輸出包括用于最小化函數(shù)和數(shù)據(jù)集之間距離的一個(gè)或多個(gè)函數(shù)參數(shù)的集合。應(yīng)理解的是可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其他回歸過程。Levenberg-Marquardt方法的一個(gè)特點(diǎn)為其要求在進(jìn)行回歸之前對(duì)參數(shù)值的良好估計(jì)。對(duì)于參數(shù)A(或^，a》和h(或0l，02)，在所有情況下可將初始條件設(shè)置成等于某一常數(shù)(例如1或2)。這些參數(shù)通常是不靈敏的并且一般將會(huì)聚，與所使用的初始條件無(wú)關(guān)。參數(shù)yj或UpP2)要求應(yīng)對(duì)各曲線測(cè)定的更準(zhǔn)確的初始條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用窗口法計(jì)算參數(shù)yj或i^，P2)的初始條件，如下文詳述。在步驟135中，報(bào)告Ct值，例如用于顯示或進(jìn)一步處理。圖形顯示可由顯示裝置實(shí)現(xiàn)，例如監(jiān)視屏或打印機(jī)，與執(zhí)行圖4分析的系統(tǒng)偶聯(lián)或可將數(shù)據(jù)提供給單獨(dú)的系統(tǒng)用于顯示在顯示裝置上。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算GM^和GMM2參數(shù)的R2統(tǒng)計(jì)值和/或置信度(例如，95%置信度)區(qū)間。這些數(shù)值評(píng)價(jià)曲線擬合的質(zhì)量并可用于專家系統(tǒng)(描述于下文)中幫助測(cè)定所計(jì)算的Ct值是否為有效、無(wú)效或零(無(wú)樣品)。這些數(shù)值也顯示于步驟135中。測(cè)定曲線中的最大值在一個(gè)實(shí)施方案中，在數(shù)據(jù)集上使用開窗過程以測(cè)定參數(shù)PpP2的初始條件。為了尋找曲率或二階導(dǎo)數(shù)的最大值，所有負(fù)值均以零代替。在一個(gè)實(shí)施方案中，開窗過程使用以下操作尋找潛在的局部最大值1.從第一個(gè)點(diǎn)開始，檢測(cè)數(shù)據(jù)集前面若干個(gè)(例如五個(gè))點(diǎn)(點(diǎn)1-5)。2.如果中間的y-點(diǎn)不是這五個(gè)點(diǎn)中的最大值，那么這五個(gè)點(diǎn)中沒有潛在最大值。如果中間的y-點(diǎn)是這五個(gè)點(diǎn)的最大值并且其值大于O(以避免將具有精確數(shù)值O的點(diǎn)的更長(zhǎng)序列的中間點(diǎn)加入潛在最大值的集合中)，那么存在潛在最大值。將這一點(diǎn)加入潛在最大S的集合中。3.將滑動(dòng)窗口前進(jìn)一個(gè)點(diǎn)(例如，現(xiàn)在為點(diǎn)2-6)，并且重復(fù)項(xiàng)目2中的過程，再次僅接受這五個(gè)點(diǎn)在指數(shù)3的最大值。在整個(gè)數(shù)據(jù)集中繼續(xù)這一過程。4.如果倒數(shù)第二個(gè)點(diǎn)的y-值比之前兩個(gè)點(diǎn)和最后一個(gè)點(diǎn)的y-值更高或相等，將這一點(diǎn)加入潛在最大值S集合中。5.檢測(cè)所得可能最大值的集合S，其表示在指數(shù)3的可能最大值的集合，并尋找這一可能最大值S集合(Smax)中的最大值數(shù)據(jù)點(diǎn)。6.如果Smax等于或小于MaxNoise輸入?yún)?shù)(使用者可能輸入的或自動(dòng)檢測(cè)到的噪音參數(shù))，則曲率數(shù)據(jù)中沒有峰值。7.保留這一集合S中其余的可能最大數(shù)據(jù)點(diǎn)，前提是它們大于SmaxXRelativeMin輸入?yún)?shù)并大于AbsoluteMin輸入?yún)?shù)。8.如果只剩下一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，那么僅有一個(gè)峰，并且該曲線僅具有一個(gè)最大值。將這一單峰定義為p、。如果剩下兩個(gè)點(diǎn)，那么這表示曲線具有兩個(gè)最大值。如果有多于兩個(gè)峰，取具有數(shù)據(jù)集S的最大值的兩個(gè)峰，將這兩者中具有較低循環(huán)數(shù)的峰報(bào)告為P、，將具有較高循環(huán)數(shù)的峰報(bào)告為plv9.ii!的初始條件則為p、并且(iipii2)的初始條件為(p、，pk2)。衰減檢測(cè)在一些數(shù)據(jù)中，可能存在平臺(tái)區(qū)強(qiáng)度的衰減。在這些情況下常常需要對(duì)這一點(diǎn)做出解釋以去除不利作用。舉例而言，在圖8中可見平臺(tái)區(qū)熒光的衰減。這種平臺(tái)的存在可引起Ct位移。為了提高準(zhǔn)確度，在一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施去除熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)衰減區(qū)段的自動(dòng)方法。在某些方面，在計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)或曲率之前去除衰減平臺(tái)區(qū)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的衰減檢測(cè)工作流程顯示于圖9。在步驟910中，測(cè)定對(duì)應(yīng)于最高熒光強(qiáng)度的循環(huán)數(shù)。在步驟920中，如果最高熒光強(qiáng)度不在最后三個(gè)循環(huán)中，評(píng)價(jià)后續(xù)循環(huán)(最高值之后)的熒光強(qiáng)度。如果最高熒光強(qiáng)度在最后三個(gè)循環(huán)中，不進(jìn)行衰減修正。如果對(duì)應(yīng)于最大熒光的循環(huán)之后的循環(huán)中的最低熒光強(qiáng)度小于最大熒光強(qiáng)度的95%，那么在步驟930中將二階多項(xiàng)式與后續(xù)循環(huán)(最大值之后)中包含的熒光擬合。在步驟940中，測(cè)定數(shù)據(jù)中是否存在顯著衰減。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果最高熒光強(qiáng)度的點(diǎn)高于輸入?yún)?shù)RV(相對(duì)值)的值，將二階多項(xiàng)式的線性項(xiàng)與熒光強(qiáng)度最大值除以數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)量的比值乘以常量閾值(例如，_5)后比較。如果線性項(xiàng)小于這一數(shù)值，表明存在顯著衰減，那么在步驟950中截去對(duì)應(yīng)于最高熒光強(qiáng)度的循環(huán)數(shù)之后循環(huán)的熒光數(shù)據(jù)；否則數(shù)據(jù)中不存在衰減并且無(wú)需任何處理。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用二階多項(xiàng)式擬合以測(cè)定衰減。在某些方面，可使用方程(4)進(jìn)行擬合:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>在方程(4)中，k為對(duì)應(yīng)于最大熒光強(qiáng)度的循環(huán)數(shù)。因此，如果方程(4)中的q值小于上述產(chǎn)物，那么有必要截去對(duì)應(yīng)于最大熒光強(qiáng)度的循環(huán)之后的循環(huán)用于下游的準(zhǔn)確非線性回歸。如果檢測(cè)出衰減并截去數(shù)據(jù)，那么熒光向量y、循環(huán)數(shù)向量x以及熒光向量的長(zhǎng)度m對(duì)應(yīng)于截去形式而不是原始的輸入。忽略最后三個(gè)循環(huán)因?yàn)椴豢赡軘M合少于三個(gè)點(diǎn)的二次函數(shù)。區(qū)分增長(zhǎng)與平線在一些數(shù)據(jù)中可能存在非顯著的增長(zhǎng)。在這些情況下常常需要解釋這一情況以去除不利作用。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用五個(gè)檢測(cè)區(qū)分曲線的真正增長(zhǎng)與平線，如圖io所示。1.在完整或部分RT-PCR曲線上進(jìn)行線性回歸擬合。如果線性回歸的R2>0.99，那么認(rèn)為無(wú)增長(zhǎng)。2.計(jì)算稱作DeltaB(如下所示)的統(tǒng)計(jì)值，如果0<DeltaB<0.04，那么認(rèn)為無(wú)增長(zhǎng)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>3.在任一完整RT-PCR曲線上進(jìn)行二次回歸擬合。如果這一二次回歸的R2〉0.98，那么該RT-PCR曲線被測(cè)定為不具有增長(zhǎng)曲線的足夠曲率。4.如下計(jì)算稱作RFI(相對(duì)熒光增加)的數(shù)值_中銜后5個(gè)點(diǎn)]中值[前5個(gè)點(diǎn)]在某些方面，在通過基線減法將RT-PCR曲線標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算RFI。如果所測(cè)RFI小于輸入RFImin值，那么該曲線被稱為沒有增長(zhǎng)。5.如下計(jì)算稱作AFI(相對(duì)熒光增加)的數(shù)值A(chǔ)FI=中值[后5個(gè)點(diǎn)]-中值[前5個(gè)點(diǎn)]在某些方面，在通過基線減法將RT-PCR曲線標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算AFI。如果所測(cè)AFI小于輸入AFImin值，那么該曲線被稱為沒有增長(zhǎng)。應(yīng)理解的是可使用一個(gè)或多個(gè)上文描述的五個(gè)檢測(cè)和/或使用其他檢測(cè)測(cè)定該曲線是否可被認(rèn)為具有增長(zhǎng)。應(yīng)理解可使用不同的數(shù)值，例如，可不使用前五個(gè)點(diǎn)或后五個(gè)點(diǎn)而使用多于或少于5個(gè)點(diǎn)。算法工作流程圖11顯示了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案測(cè)定增長(zhǎng)曲線中Ct值的方法。在步驟1110中，進(jìn)行衰減檢測(cè)。在這一步驟中，測(cè)定熒光衰減并在需要時(shí)截去熒光數(shù)據(jù)。上述參考圖9討論的操作可用于一個(gè)實(shí)施方案中。在步驟1120中，首先檢測(cè)數(shù)據(jù)是否擬合直線，或是否存在可能的增長(zhǎng)。如果存在可能增長(zhǎng)，那么使用無(wú)方程(Equation-Less)模型，藉此計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)的導(dǎo)數(shù)(或相對(duì)導(dǎo)數(shù))和曲率(或相對(duì)曲率)方程，例如使用Savitzky-Golay方法計(jì)算其數(shù)值。在步驟1130中，測(cè)定CT值。Ct值為PCR熒光模型的二階導(dǎo)數(shù)(相對(duì)導(dǎo)數(shù))或曲率(相對(duì)曲率)具有其最大值時(shí)的分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過如上文所述參考圖4的一元或兩元高斯混合模型的非線性回歸以及方程(2)和(3)尋找分?jǐn)?shù)循環(huán)數(shù)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的Ct尋找常規(guī)程序的處理步驟總結(jié)于圖12。在步驟1140中，專家系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)以提供用于降低風(fēng)險(xiǎn)的一系列檢查。專家系統(tǒng)檢查在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖13所示實(shí)施專家系統(tǒng)檢查。在步驟1310中，該系統(tǒng)驗(yàn)證PCR增長(zhǎng)曲線的截距是否在使用者指定的最小值和最大值之間。如果在這一范圍之外，那么該曲線被稱為是無(wú)效的。在一方面，該截距定義為前五個(gè)點(diǎn)的中值。在步驟1320中，該系統(tǒng)驗(yàn)證PCR增長(zhǎng)曲線的斜率是否在使用者指定的最小值和最大值之間。如果在這一范圍之外，那么該曲線被稱為是無(wú)效的。除了斜率也可使用相對(duì)斜率，其中相對(duì)斜率=斜率/截距。以這種方式，斜率比較變成比例不變量。在步驟1330中，該系統(tǒng)驗(yàn)證PCR增長(zhǎng)曲線的Ct值是否在使用者指定的最小值和最大值之間。如果這些條件任何一個(gè)都未被滿足，標(biāo)上旗標(biāo)。之后這些曲線被稱作無(wú)效或陰性。實(shí)施例圖14顯示了具有兩個(gè)拐點(diǎn)的典型實(shí)時(shí)PCR曲線。頂曲線為原始數(shù)據(jù)，而底曲線為基線減法后的數(shù)據(jù)。用算法分析這一數(shù)據(jù)的二階導(dǎo)數(shù)、相對(duì)二階導(dǎo)數(shù)、曲率和相對(duì)曲率。分析結(jié)果顯示于下文的表l。給出兩個(gè)Ct值，對(duì)應(yīng)于兩個(gè)存在的拐點(diǎn)。表1:雙拐點(diǎn)曲線的算法結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>應(yīng)理解的是Ct測(cè)定過程(包括導(dǎo)數(shù)和曲率測(cè)定過程)可在運(yùn)行于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)處理器上的計(jì)算機(jī)編碼中實(shí)施。該編碼包括控制處理器實(shí)施Ct測(cè)定過程各方面和步驟的指令。該編碼通常保存于硬盤、RAM或可攜帶介質(zhì)例如CD、DVD等。相似的，可在PCR裝置例如熱循環(huán)儀中實(shí)施該過程，熱循環(huán)儀包括保存于和處理器偶聯(lián)的存儲(chǔ)單元中的處理器執(zhí)行指令。包括這些指令的編碼可經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接或直接連接至編碼源或使用可攜帶介質(zhì)下載至PCR裝置存儲(chǔ)單元。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明的拐點(diǎn)測(cè)定過程可使用多種程序語(yǔ)言編碼，例如C、C++、C#、F0rtran、ViSualBasiC等，以及應(yīng)用例如提供用于數(shù)據(jù)可視化和分析的預(yù)打包常規(guī)程序、函數(shù)和操作的Mathematics后者的另一個(gè)實(shí)例為MATLAB⑧。在一些實(shí)施方案中根據(jù)本發(fā)明的方法可通過使用常規(guī)個(gè)人電腦系統(tǒng)實(shí)施，其包括但不限于輸入數(shù)據(jù)集的輸入裝置，例如鍵盤、鼠標(biāo)等；顯示曲線區(qū)域所關(guān)注具體點(diǎn)的顯示裝置，例如監(jiān)視器；執(zhí)行方法中各步驟必需的處理裝置，例如CPU;網(wǎng)絡(luò)界面例如調(diào)制解調(diào)器、存儲(chǔ)數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置，在處理器上運(yùn)行的計(jì)算機(jī)編碼等。此外，該方法也可在PCR處理器或PCR系統(tǒng)中實(shí)施。根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的實(shí)例顯示于圖15-16。圖15顯示了解釋可用于實(shí)施本發(fā)明方法和系統(tǒng)的軟件和硬件資源之間關(guān)系的總體塊狀圖。圖16描述的系統(tǒng)包括位于熱循環(huán)裝置中的動(dòng)態(tài)PCR分析模塊和作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)一部分的智能模塊。數(shù)據(jù)集(PCR數(shù)據(jù)集)經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接或直接連接從分析模塊轉(zhuǎn)移至智能模塊或相反。例如可根據(jù)如圖4、9、10、12和13尤其是圖4、12和13描述的流程圖處理數(shù)據(jù)集。這些流程圖便于通過存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的硬件上的軟件實(shí)施，例如根據(jù)圖15中描述的流程圖。就圖15而言，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(200)可包括接收工具(210)，例如用于接收在PCR反應(yīng)中獲得的熒光數(shù)據(jù)；計(jì)算工具(220)，用于根據(jù)本發(fā)明方法處理所述數(shù)據(jù)；應(yīng)用工具(230)，用于根據(jù)計(jì)算工具獲得的結(jié)果替換一部分所述數(shù)據(jù)；以及顯示工具(240)，用于在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示結(jié)果。圖16顯示了熱循環(huán)裝置和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)之間的相互關(guān)系。該系統(tǒng)包括位于熱循環(huán)裝置中的動(dòng)態(tài)PCR分析模塊以及作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)一部分的智能模塊。數(shù)據(jù)集(PCR數(shù)據(jù)集)經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接或直接連接從分析模塊轉(zhuǎn)移至智能模塊或相反?？筛鶕?jù)圖15通過在處理器上運(yùn)行并儲(chǔ)存于智能模塊的存儲(chǔ)裝置中的計(jì)算機(jī)編碼處理該數(shù)據(jù)集并且處理之后轉(zhuǎn)移回分析模塊的存儲(chǔ)裝置中，其中經(jīng)修飾的數(shù)據(jù)顯示于顯示裝置上。如上所述，本發(fā)明系統(tǒng)和方法可用于去除聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)數(shù)據(jù)中的步驟不連續(xù)性。舉例而言，當(dāng)用熒光數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時(shí)，本發(fā)明系統(tǒng)和方法可提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)不僅可用于監(jiān)測(cè)該反應(yīng)也可提供技術(shù)作用例如定量PCR期間被擴(kuò)增的靶核苷酸或根據(jù)所得數(shù)據(jù)調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)條件。盡管以實(shí)施例和具體的實(shí)施方案的方式描述了本發(fā)明，應(yīng)理解的是本發(fā)明不受已公開實(shí)施方案的限制。相反，其意在涵蓋本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的修改和相似排列。因此，附加權(quán)利要求的范圍應(yīng)與最寬泛的解釋一致以涵蓋所有這些修改和相似排列。權(quán)利要求一種測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端的點(diǎn)的計(jì)算機(jī)實(shí)施方法，其包括以下步驟接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各具有一對(duì)坐標(biāo)值；數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值；測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。3.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二最大值用作第二參數(shù)的初始條件，并且其中所述方法進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述高斯混合模型包括下列表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中yi為第一參數(shù)，并且其中ai和o工為附加參數(shù)。5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括通過計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值測(cè)定所述曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>6.—種測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端的點(diǎn)的計(jì)算機(jī)實(shí)施方法，其包括以下步驟接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各具有一對(duì)坐標(biāo)值；數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值；測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定曲率值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述回歸過程包括Levenberg-Marquardt(LM)回歸過程。8.權(quán)利要求6或7中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二最大值用作第二參數(shù)的初始條件，并且其中所述方法進(jìn)一步包括輸出第二參數(shù)。9.權(quán)利要求6至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述高斯混合模型包括下列表達(dá)式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中yi為第一參數(shù)，并且其中ai和o工為附加參數(shù)。10.權(quán)利要求6至9中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括通過計(jì)算DeltaB統(tǒng)計(jì)值測(cè)定所述曲線是否顯示真正的增長(zhǎng)，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>如果m^2和.f值<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>否則11.權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值；測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第二參數(shù)的初始條件；并且輸出第二參數(shù)，其中所測(cè)定的第二參數(shù)表示所述增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。12.—種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括用于控制處理器以測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端點(diǎn)的編碼，所述編碼包括以下指令接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值；數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值；測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。13.—種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包括用于控制處理器以測(cè)定增長(zhǎng)曲線基線區(qū)末端點(diǎn)的編碼，所述編碼包括以下指令接收表示增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)集，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值；數(shù)值上測(cè)定沿增長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值；測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定曲率值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示增長(zhǎng)曲線的基線區(qū)末端。14.一種動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系，其包括可生成表示動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的PCR數(shù)據(jù)集的動(dòng)態(tài)PCR分析模塊，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值，其中所述數(shù)據(jù)集包括含有循環(huán)閾(Ct)值的所關(guān)注區(qū)域中的數(shù)據(jù)點(diǎn)，以及適合于處理PCR數(shù)據(jù)集以測(cè)定Ct值的智能模塊，其方式為數(shù)值上測(cè)定沿PCR曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的二階導(dǎo)數(shù)值；測(cè)定所測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定二階導(dǎo)數(shù)值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示Ct值。15.—種動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系，其包括可生成表示動(dòng)態(tài)PCR擴(kuò)增曲線的PCR數(shù)據(jù)集的動(dòng)態(tài)PCR分析模塊，所述數(shù)據(jù)集包括多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，各自具有一對(duì)坐標(biāo)值，其中所述數(shù)據(jù)集包括含有循環(huán)閾(Ct)值的所關(guān)注區(qū)域中的數(shù)據(jù)點(diǎn)，以及適合于處理PCR數(shù)據(jù)集以測(cè)定Ct值的智能模塊，其方式為數(shù)值上測(cè)定沿PCR曲線的數(shù)據(jù)點(diǎn)的曲率值；測(cè)定所測(cè)定曲率值的最大值；計(jì)算擬合已測(cè)定曲率值的曲線的近似值，其方式為將回歸過程應(yīng)用于高斯混合模型函數(shù)以測(cè)定該函數(shù)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述參數(shù)包括初始條件，并且其中所述最大值用作第一參數(shù)的初始條件；并且輸出第一參數(shù)，其中所測(cè)定的第一參數(shù)表示Ct值。全文摘要本發(fā)明總體上涉及通過無(wú)方程算法判定實(shí)時(shí)PCR拐點(diǎn)，具體而言涉及測(cè)定S型或增長(zhǎng)曲線轉(zhuǎn)換值，例如PCR擴(kuò)增曲線的基線區(qū)末端或拐點(diǎn)值或Ct值的系統(tǒng)和方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101710363SQ20091017593公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年9月11日優(yōu)先權(quán)日2008年9月12日發(fā)明者M(jìn)·蒂茨,R·T·庫(kù)尼克申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司