專利名稱：：醋酸桿菌及應(yīng)用其生產(chǎn)對(duì)映體純(r)-有機(jī)硅醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物催化手性化合物不對(duì)稱合成的
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種醋酸桿菌，還涉及該醋酸桿菌的應(yīng)用，即催化有機(jī)硅酮不對(duì)稱還原制備(iO-有機(jī)硅醇。
背景技術(shù)：
：有機(jī)硅化合物是指含有c-si鍵的有機(jī)化合物。目前，在自然界中尚未發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)的存在。有機(jī)硅化合物不但在不對(duì)稱合成及功能材料中具有重要作用，德國(guó)化學(xué)家Tacke等就發(fā)現(xiàn)許多有機(jī)硅化合物具有特定的生物活性。如含硅藥物Zifrosilone、Cisobitan和Silabolin比其碳結(jié)構(gòu)類似物具有更高的藥理活性、更好的選擇性及更小的毒性。合成現(xiàn)有藥物的含硅結(jié)構(gòu)類似物("硅替代")是藥物設(shè)計(jì)、改造的有效途徑。對(duì)映體純手性醇及其衍生物，是許多具有巨大商業(yè)價(jià)值的重要醫(yī)藥和農(nóng)藥產(chǎn)品的中間體。合成對(duì)映體純手性醇的含硅結(jié)構(gòu)類似物，并以含硅手性醇及其衍生物作手性砌塊，可合成大量現(xiàn)有藥物的含硅結(jié)構(gòu)類似物，為利用硅替代設(shè)計(jì)、改造藥物及開(kāi)發(fā)新藥奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。如對(duì)映體純的(5>4~三甲基硅基-3-丁炔-2-醇是一種重要的藥物手性中間體，可用于合成5'-脂氧化酶抑制劑，來(lái)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘等疾病；對(duì)映體純的(/>4~三甲基硅基-3-丁炔-2-醇是許多重要的藥物手性中間體，如可用于合成喜巴辛(himbacine)結(jié)構(gòu)類似物，來(lái)治療老年癡呆癥；也可用來(lái)合成一些抗生素。目前，生產(chǎn)手性硅醇的主要方法有化學(xué)法和生物法兩種。過(guò)去30年里，化學(xué)法催化羰基的立體選擇性還原的研究取得了重大進(jìn)展?；瘜W(xué)法催化的不對(duì)稱還原主要分為手性試劑控制的不對(duì)稱還原和手性催化劑控制的不對(duì)稱還原。常用的手性試劑有手性配體修飾的氫化鋁鋰和手性硼烷試劑。常用的手性催化劑有硼氫化鈉、手性硅烷、手性過(guò)渡金屬絡(luò)合物以及Meerwein-Porndorf-Verley還原試劑等。但是化學(xué)法存在很多缺陷，如手性催化劑制備復(fù)雜，成本高，有時(shí)反應(yīng)的立體選擇性與催化劑的量成正比，甚至需要催化劑與反應(yīng)底物以化學(xué)計(jì)量的比率進(jìn)行，反應(yīng)條件苛刻，許多催化劑有劇毒，造成環(huán)境污染。而采用生物法進(jìn)行潛手性酮的不對(duì)稱還原反應(yīng)，一般來(lái)說(shuō)反應(yīng)活性高，易于控制，比較安全，而且立體選擇性高，底物范圍廣，反應(yīng)條件溫和，同時(shí)對(duì)環(huán)境友好，符合原子經(jīng)濟(jì)、綠色化學(xué)的發(fā)展方向，因此頗受青睞。生物法催化不對(duì)稱還原制備手性硅醇主要有外消旋醇的動(dòng)力學(xué)拆分法和前體硅酮的不對(duì)稱還原法。通常，如果不輔以原位外消旋化，外消旋體拆分法的最高產(chǎn)率僅為50%，而潛手性硅酮不對(duì)稱還原法的最高產(chǎn)率則可高達(dá)100%。因此，目前國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道大多采用這一方法。自然界中微生物的種類異常之多，估計(jì)不少于10萬(wàn)種，是一個(gè)極其豐富的寶庫(kù)。遵循反Prelog規(guī)則催化潛手性酮不對(duì)稱還原的微生物細(xì)胞比較少，已報(bào)道的有乳桿菌屬的丄a"o6flc/〃"51te力r、Zfl"o6aa7/w516rev&、粉狀畢赤氏酵母y""附ac/a2[y附aIFO10896、白地霉GeoWc/w附sp.38、爪哇毛霉il/wcw_/"va"/a*y、假單胞屬尸sew(/o附owaysp.、土曲霉」5perg/〃ws^^rewsCCT3320、構(gòu)巢曲霉五附en'ce〃am'dw/a似CCT3119、酒類酒球菌Oemcoccws0￡"/、木蘭假絲酵母0朋力^附^"0//^、近平滑假絲酵母0^^"/7^"戸//0^(:(:丁0:1^203011等。許多重要的手性醇，如用于合成(i)-苯基-4-羥基-戊酸鹽(治療Alzheimer's病)的中間體(i)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇，用遵循Prelog規(guī)則的微生物細(xì)胞催化其對(duì)應(yīng)的潛手性酮不對(duì)稱還原只能合成其對(duì)映異構(gòu)體，唯有遵循反Prelog規(guī)則的微生物細(xì)胞才能用于這些手性化合物的不對(duì)稱合成。因之，研究遵循反Prelog規(guī)則的微生物細(xì)胞催化手性酮不對(duì)稱還原反應(yīng)具有重要的實(shí)踐意義。目前，關(guān)于利用生物催化劑不對(duì)稱還原4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮來(lái)合成對(duì)映體純的(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的文章，B^adshaw等在水相體系中用X""otoc///w;yfe,醇脫氫酶作為催化劑，得到的(Z)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇e.e.值為94。/。，而產(chǎn)物的產(chǎn)率只有25%(BradshawC.W.HummelW.WongC.H.JournalofOrganicChemistry,1992，57(5):1532-1536}。其主要原因是催化劑的活性不高，且受底物、產(chǎn)物抑制等。迄今，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)微生物細(xì)胞遵循反^108規(guī)則催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不對(duì)稱還原合成(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的研究報(bào)道。與潛在遵循反Prelog規(guī)則微生物相比，新分離得到的醋酸桿菌能遵循反Prelog規(guī)則，高效、高立體選擇性催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮生成(i)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種能高效、高立體選擇性催化潛手性酮新的醋酸桿菌菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供該醋酸桿菌細(xì)胞催化有機(jī)硅酮不對(duì)稱還原制備(及)-型有機(jī)硅醇的方法，其產(chǎn)率大于50%。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是醋酸桿菌菌株XZY003G4ceto^c^sp.XZY003)首次從"中華開(kāi)菲爾粒"分離出來(lái)(中華開(kāi)菲爾粒即為西藏"雪蓮"發(fā)酵乳粒，源自西藏雪原特有珍稀菌種，在西藏生長(zhǎng)的有生命的菌類)，已于2009年3月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCCM，保藏號(hào)為M209061，保藏地址為中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)(郵編為430072)。醋酸桿菌04ceto6""^sp.)XZY003在西紅柿液體培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)24h觀察，細(xì)胞為短小桿狀，革蘭氏染色陰性，不運(yùn)動(dòng)。在西紅柿固體培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)48h后，菌落為乳白色，4光滑，邊緣整齊。醋酸桿菌04"totoc^rsp.)XZY003可用普通的細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，如酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH5.0，無(wú)水酒精至20mL/L,需氧，培養(yǎng)溫度為30'C;可采用斜面、液體石蠟、凍干管法保藏。保藏用的培養(yǎng)基為西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L,葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L。醋酸桿菌04c"o6ac敏sp.)XZY003特性說(shuō)明如下1、分子生物學(xué)鑒定提取50堆醋酸桿菌04ceto6ac欣sp.)XZY003的DNA(提取方法見(jiàn)[美]J薩姆布魯克《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》27頁(yè))，根據(jù)Kurtzman&Robnett的方法，用引物FD1(SEQ.ID.N02)(5'-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3')和FD2(SEQ.ID.N03)(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')PCR擴(kuò)增醋酸桿菌04c"oto"wsp.)XZY003的16SrRNA按下述反應(yīng)條件進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94°C，5min;56°C，20s;68'C，40s。所得PCR產(chǎn)物送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。醋酸桿菌04ceto6acto"sp.)XZY003的DNA序列為SEQ.ID.N01所示。選取酸球狀屬、醋桿菌屬、葡糖桿菌屬、《o加射"屬、Js"紅屬、葡糖醋桿菌屬、酸單胞屬中與XZY003Blast結(jié)果顯示同源性較高的菌株和部分代表種，以g/o^/onm's為外類群，對(duì)選取的35個(gè)菌種作進(jìn)化樹(shù)。從圖1的聚類結(jié)果可以看出，所選取的這幾個(gè)屬的菌株主要分為5類。醋桿菌屬的爿cetoto"erg/2a""ew^(EF030713)在與XZY003(FJ869877)比對(duì)的1396bp中，匹配率100%，rDNA差異堿基數(shù)為0;在進(jìn)化樹(shù)中，爿cWo6a"wg/z"""m^與XZY003顯示出較高的同源性(99.95%)，而與最近的Jceto6ac^wwg/z'(AB052712)、Jc"o6flc^"LMG1617(AJ419837)比對(duì)的1396bp中，其同源性分別為99.7%和99.6%。根據(jù)Kurtzman&Robnett的理論"屬于同一種的菌株，其16SrRNA區(qū)堿基差異不超過(guò)1%,并預(yù)測(cè)若此差異超過(guò)1%則可以認(rèn)為是屬于不同種，而如果只有0-3個(gè)堿基替代，就可以認(rèn)為是屬于同一種或是相似種(Kurtzman&Robnett，1998)"，可以認(rèn)為XZY003屬于爿cefo6flcferg/KW7加ra/51，或是其亞禾中。2、生理生化鑒定(1)產(chǎn)醋酸定性實(shí)驗(yàn)將新鮮菌種接種于醋酸桿菌增殖培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)2天后，取培養(yǎng)液5mL于試管內(nèi)，氫氧化鈉溶液中和至pH7.0，加100g/L氯化鐵溶液23滴混勻，觀察液體顏色是否變?yōu)辄S紅色，在火焰上煮沸，觀察有無(wú)紅褐色沉淀生成，清液是否變無(wú)色。增殖培養(yǎng)基酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，pH4.5,12rC滅菌20min后加入30mL/L無(wú)水酒精。(2)乙醇氧化實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種乙醇氧化培養(yǎng)基，培養(yǎng)23天后觀察，若培養(yǎng)基產(chǎn)酸變黃者為陽(yáng)性反應(yīng)。乙醇氧化培養(yǎng)基配方為酵母浸膏10g/L,20mL/L濃度為0.4g/L溴酚藍(lán)水溶液，pH6。8~7.0，121'C滅菌20min后加入40mL/L無(wú)水酒精。(3)乙酸氧化實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種乙酸氧化培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)23天后，觀察菌落四周是否出1L乳白色暈圈，有乳白色暈圈則為陽(yáng)性反應(yīng)。乙酸氧化培養(yǎng)基酵母浸膏10g/L，乙酸鈣10g/L，瓊脂20g/L，pH7.0~7.2，121'C滅菌20min。(4)生酮實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種生酮實(shí)驗(yàn)平板，培養(yǎng)23天之后，用菲林溶液注滿平板，菌落周圍出現(xiàn)明顯的紅色沉淀則為陽(yáng)性。生酮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基酵母浸膏10g/L，甘油30mL/L，瓊脂20g/L，121。C滅菌20min后加入無(wú)水酒精至40mL/L。(5)乳酸利用實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種乳酸氧化培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)23天后，觀察菌落四周是否出現(xiàn)乳白色暈圈，有乳白色暈圏則為陽(yáng)性反應(yīng)。乳酸氧化培養(yǎng)基酵母浸膏10g/L，乳酸鈣10g/L,瓊脂20g/L，pH7.0~7.2，121。C滅菌20min。(6)過(guò)氧化氫酶測(cè)定取一環(huán)生長(zhǎng)于PYG瓊脂斜面的培養(yǎng)物，涂于干凈的載玻片上，然后在其上滴加5滴100mL/L的H202，若有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性反應(yīng)。PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基蛋白胨5g/L,胰酶解酪朊5g/L,酵母浸膏10g/L,鹽溶液40mL/L。PY鹽溶液成分無(wú)水氯化鈣0.2g/L，七水硫酸鎂0.48g/L，磷酸氫二鉀1.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，碳酸氫鈉10.0g/L，氯化鈉2.0g/L。PY鹽溶液制法將氯化鈣和七水硫酸鎂混合溶解于300mL蒸餾水中，再加500inL水，一邊攪拌一邊緩慢加入其他鹽類。繼續(xù)攪拌至全部溶解后加200mL蒸餾水，混合后貯備于4'C備用。PY基礎(chǔ)培養(yǎng)液內(nèi)加入10g/L葡萄糖即為PYG培養(yǎng)基。(7)石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種石慈牛奶培養(yǎng)基，于37'C培養(yǎng)1，3，7天后觀察石蕊牛奶產(chǎn)酸和凝固反應(yīng)。石蕊牛奶培養(yǎng)基在100mL濃度為100g/L脫脂牛奶中加入4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，牛奶高度4-5cm。(8)明膠液化實(shí)驗(yàn)用新鮮菌種接種明膠液化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，置于37'C培養(yǎng)，用兩只未接種的試管培養(yǎng)基做對(duì)照。培養(yǎng)23天后，將已接種和對(duì)照管分別置于冰箱中，若對(duì)照管凝面，接種管液化記錄為陽(yáng)性，同時(shí)液化或凝固則為陰性結(jié)果。6明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基蛋白胨10g/L,酵母提取物10g/L，葡萄糖lg/L，鹽溶液40mL/L(與PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基同)，明膠120g/L，pH7.0，12rC滅菌2Omin。(9)產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)乙酸鉛試劑條的制備將普通濾紙條剪成約0.50.6cm寬的紙條，長(zhǎng)度根據(jù)試管和培養(yǎng)基高度而定。用濃度為50100g/L的乙酸鉛將紙條浸透，然后置于烘箱烘干，放入培養(yǎng)皿或試管內(nèi)，滅菌后備用。將新鮮菌種接種產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基試管后，用無(wú)菌鑷子夾取一乙酸鉛紙條懸掛于接種管內(nèi)。下端接近培養(yǎng)基表面而不接觸液面，上端用棉塞塞緊。一支不接種的試管設(shè)為空白對(duì)照，也要懸掛乙酸鉛紙條，置于37"C培養(yǎng)，紙條變黑則為陽(yáng)性反應(yīng)。產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基(半胱氨酸培養(yǎng)基)胰蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉5g/L，半胱氨酸0.4g/L，葡萄糖2g/L，分裝試管，每管培養(yǎng)液高度4-5cm，pH7.2-7.4，12rC滅菌20min。(10)產(chǎn)噴哚實(shí)驗(yàn)將新鮮菌種接種產(chǎn)哼l哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，置于37'C培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3天后，取培養(yǎng)液加入試管，沿管壁加入3-5mm高的試劑于培養(yǎng)液表面，若液層界面出現(xiàn)紅色則為陽(yáng)性反應(yīng)。試劑對(duì)二甲基氨基苯甲醛0.08g，無(wú)水乙醇7.6mL，濃HC11.6mL產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基10g/L胰胨水溶液，調(diào)pH7.27.5，分裝試管，12rC滅菌20min。菌種的生理生化特性如表1所示，能產(chǎn)醋酸和硫化氫，接觸酶陽(yáng)性，生酮實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，能氧化乙醇，不能進(jìn)行明膠液化和利用乳酸，乙酸氧化和牛奶石蕊實(shí)驗(yàn)陰性，不產(chǎn)吲哚。根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特征，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》可鑒定菌種為醋桿菌屬，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定醋酸桿菌04cefo&a"eA"sp.)XZY003為^ceto^"erg/^"aera&，但是已知的XcetoZwc^g/wma柳^不能利用葡萄糖生酮，因此，確定本發(fā)明XZY003菌種為JcWo辦ac敏g/raw"e朋/s的亞種或變禾中。表1醋酸桿菌XZY003生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"+'表示陽(yáng)性，表示陰性。醋酸桿菌(Jc她6ac^g/w"aem')XZY003能催化有機(jī)硅酮不對(duì)稱還原為(i)-有機(jī)硅醇，其對(duì)映體過(guò)量值(e.e.)為99%以上，產(chǎn)率為50~95%。應(yīng)用所述醋酸桿菌催化還原生產(chǎn)對(duì)映體純(/)-有機(jī)硅醇的方法在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中加入有機(jī)硅酮、異丙醇和固定化醋酸桿菌G4c"ok^ersp.)顆粒成混合物，調(diào)節(jié)pH值至4.0-6.0，在溫度為25-35t:，轉(zhuǎn)速為160-200r/min條件下，振蕩反應(yīng)0.5-8h，進(jìn)行微生物細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化，制得對(duì)映體純(及)-有機(jī)硅醇；所述的三乙醇胺、鹽酸、有機(jī)硅酮和異丙醇在混合物中的濃度分別為0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3.0-20mmol/L和43.6~200mmol/L;所述固定化醋酸桿菌04ceto6acto"sp.)顆粒與混合物的重量體積比為0.1-1.0g/mL。所述對(duì)映體純(i)_有機(jī)硅醇為0)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇或0)-三甲基硅乙醇。所述固定化醋酸桿菌細(xì)胞、異丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中濃度分別優(yōu)選為0.50g/mL、130.6mmol/L和10mmol/L。所述pH優(yōu)選為5.0，溫度優(yōu)選為30。C，轉(zhuǎn)速優(yōu)選為180r/min。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明具有如下有點(diǎn)和有益效果目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)利用生物催化劑催化有機(jī)硅酮不對(duì)稱還原合成對(duì)映體純手性有機(jī)硅醇，產(chǎn)率或產(chǎn)物的對(duì)映體選擇性低下。本發(fā)明利用遵循反Prelog規(guī)則的醋酸桿菌催化合成(及)-有機(jī)硅醇，與游離酶作為生物催化劑相比，省去了添加昂貴的還原型輔酶如NAD(P)H,降低了其生產(chǎn)成本；與其他細(xì)胞作為催化劑相比，其具有絕對(duì)的立體選擇性和較高的產(chǎn)率，同時(shí)不僅有利于產(chǎn)物的分離，還可回收細(xì)胞重復(fù)使用，大大簡(jiǎn)化生產(chǎn)工序，降低了生產(chǎn)成本。圖1是以iJ/wifop/tog/o^/orw/s為外類群，XZY003對(duì)選取的35個(gè)菌種作的進(jìn)化樹(shù)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，本發(fā)明的實(shí)施例不限如此。實(shí)施例1將2g中華開(kāi)菲爾粒接入裝有100mL西紅柿培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28。C培養(yǎng)24h，以同樣的條件在西紅柿培養(yǎng)基中連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。菌液用十倍稀釋法進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布于固體分離培養(yǎng)基上，28'C培養(yǎng)28h(可以是2436h)，獲得單菌落，純化后西紅柿培養(yǎng)基的斜面進(jìn)行保藏，供鑒定用；2009年3月26日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCCM，保藏號(hào)為M209061，保藏地址為中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)(郵編為430072)。西紅柿培養(yǎng)基的配方具體為西紅柿汁200mL/L，酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH6.0。將鑒定為醋酸桿菌的菌株XZY003從斜面轉(zhuǎn)接入西紅柿培養(yǎng)基中，3CTC，160r/min培養(yǎng)24h，離心(3500r/min，15min，4。C)，洗滌兩次，得到濕菌體。然后將濕菌體分散在等重的蒸餾水中，再加入4倍濕菌體重量濃度為20g/L海藻酸鈉，攪拌均勾，用5"針頭的注射器將上述懸浮液滴入200mL濃度為20g/L的CaCl2溶液中，4。C硬化4h，用蒸鎦水將硬化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2-3mm)洗滌3次，再移入200mL含有CaCl2的葡萄糖溶液中，其終濃度為0.5g/LCaCl2、200g/L葡萄糖，放置于4'C冰箱中保存待用，得到的固定化醋酸桿菌顆粒，其直徑大小為2-3mm，球形，機(jī)械強(qiáng)度較好，其細(xì)胞含量10、8個(gè)/&活性穩(wěn)定。西紅柿培養(yǎng)基的配方具體為西紅柿汁200mL/L,酵母浸膏10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH6.0。實(shí)施例2將鑒定為醋酸桿菌的菌株XZY003從斜面轉(zhuǎn)接入西紅柿培養(yǎng)基中，30°C,160r/min培養(yǎng)24h，離心(8000r/min，10min，4°C)，洗滌兩次，得到濕菌體。然后將濕菌體分散在等重的蒸餾水中，再加入6倍濕菌體重量濃度為10g/L海藻酸鈉，攪拌均勻，用5#針頭的注射器將上述懸浮液滴入200mL濃度為20g/L的CaCl2溶液中，4'C硬化4h，用蒸餾水將硬化后的海藻酸鈣凝膠球(直徑2-3mm)洗滌3次，再移入200mL含有CaCl2的葡萄糖溶液中，其終濃度為0.5g/LCaCl2、200g/L葡萄糖，放置于4'C冰箱中保存待用，得到的固定化醋酸桿菌顆粒，其直徑大小為2-3mm,球形，機(jī)械強(qiáng)度較好，機(jī)械強(qiáng)度一般，其細(xì)胞含量107'8個(gè)&,活性穩(wěn)定。西紅柿培養(yǎng)基的配方具體為西紅柿汁200mL/L、葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，pH6.0。實(shí)施例3將2mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.05mol/L，pH5.0)裝入具塞的10mL的三角瓶中，然后分別加入上述實(shí)施例l制備的固定化醋酸桿菌顆粒、異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物；異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的濃度分別為43.6mmol/L和3.0mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.2g/mL，于30'C,180r/min，條件下反應(yīng)1h，得到(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇對(duì)映體，氣相檢測(cè)(儀器日本島津GC-2010型氣相色譜儀，配備工作站，F(xiàn)ID檢測(cè)器；手性柱HP-Chiral-5(20%Permethylatedy9-cyclodextrin)，柱長(zhǎng)30m，柱徑0.25mm(美國(guó)安捷倫公司)。GC分析條件汽化室溫度和檢測(cè)室溫度均為250°C;色譜柱初始溫度為85°C,維持13min;載氣為氮?dú)?，流速?.2mL/min，分流比100:1;進(jìn)樣量1^L。在該分析條件下，4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮、內(nèi)標(biāo)正癸垸、4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇的保留時(shí)間分別為5.2，5.7和10.5min。4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇用醋酸酐酯化后其S型和i型酯化產(chǎn)物的保留時(shí)間分別為11.7和12.0min。最大相對(duì)誤差小于1.0%。}，得到(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇對(duì)映體純度為99%以上對(duì)映體過(guò)量值，產(chǎn)率為52.3%。實(shí)施例49將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH4.5)裝入具塞的lOmL三角瓶中，然后分別加入上述實(shí)施例1制備的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的濃度分別為43.6mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.3g/mL，于25"C,160r/min，反應(yīng)2h，氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例3)其產(chǎn)率為59.7%,(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇對(duì)映體純度為99%以上對(duì)映體過(guò)量值。實(shí)施例5將6mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1moI/L，pH5.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入上述實(shí)施例1的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和4-三甲基硅基_3-丁炔-2-酮形成混合物，異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中的濃度分別為130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.1g/mL，于3(TC，180r/min，反應(yīng)lh氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例3)其產(chǎn)率為71.3%，(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇對(duì)映體純度為99%以上e.e.。實(shí)施例6將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.2moI/L,pH6.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入上述實(shí)施例1制備的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和三甲基硅乙酮形成混合物，異丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中濃度分別為200.0mmol/L和10mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為1.0g/mL，于3(TC，200r/min，反應(yīng)2h，氣相檢測(cè)(儀器條件同實(shí)施例3，GC分析條件汽化室溫度和檢測(cè)室溫度均為250°C;色譜柱初始溫度為64。C，維持1min后，以1°C/min的速率升至71°C,維持1min;載氣為氮?dú)?，流速?.5mL/min，分流比100:1;進(jìn)樣量1^L。在該分析條件下，三甲基硅乙酮、內(nèi)標(biāo)正壬烷、(i)-l-三甲基硅乙醇和(Q-l-三甲基硅乙醇的保留時(shí)間分別為3.50min、6.02min、6.72min和7.28min。)其產(chǎn)率為95%，(i)-三甲基硅基-2-醇對(duì)映體純度為99%以上。實(shí)施例7將6mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH5.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實(shí)施例2制備的濕菌體的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中濃度分別為130.6mmol/L和6mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.4g/mL，于30'C，180r/min，反應(yīng)1h，過(guò)濾分離出固定化醋酸桿菌細(xì)胞，用蒸餾水洗滌兩次，再次放入新鮮的反應(yīng)液中進(jìn)行下一次反應(yīng)，依次方法進(jìn)行8批次試驗(yàn)，氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例3)其相對(duì)活性為70%。實(shí)施例8將2mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH6.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實(shí)施例1制備的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮形成混合物，異丙醇和4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮在混合物中濃度分別為163.5mmol/L和3mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.1g/mL，于35'C，180r/min，反應(yīng)2h,氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例6)其產(chǎn)率為65.2%，(i)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇對(duì)映體純度為99%以上e.e.。實(shí)施例9將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.1mol/L，pH6.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入上述實(shí)施例2制備的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和三甲基硅乙酮，異丙醇和三甲基硅乙酮在混合物中濃度分別為163.5mmol/L和20mmol/L，固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.3g/mL，于25'C,160r/min，反應(yīng)2h，氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例6)其產(chǎn)率為96%，(i)-三甲基硅基-2-醇對(duì)映體純度為99%以上e.e.。實(shí)施例10將4mL的三乙醇胺鹽酸緩沖液(三乙醇胺在鹽酸中濃度為0.05mol/L，pH5.0)裝入具塞的三角瓶中，然后分別加入實(shí)施例1制備的固定化醋酸桿菌顆粒以及異丙醇和三甲基硅乙酮形成混合物，異丙醇和三甲基硅乙酮在混合物中濃度分別為200mmol/L和6mmol/L,固定化醋酸桿菌顆粒與混合物的重量體積比為0.3g/mL，于3(TC，180r/min，反應(yīng)8h，氣相檢測(cè)(檢測(cè)條件同實(shí)施例6)其產(chǎn)率為65%，(及)-三甲基硅基-2-醇對(duì)映體純度為99%以上".。序列列表SEQ.ID.N01:SEQUENCELISTING<110>華南理工大學(xué)<120>醋酸桿菌及應(yīng)用其生產(chǎn)對(duì)映體純(R)-有機(jī)硅醇的方法<130><160>3<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>1396<212>DNA<213>醋酸桿菌(Acetobactersp.)<400>1caagtcgcacgaacctttcggggttagtggcggacgggtgagtaacgcgtaggaatctgt60ccatgggtgggggataactctgggaaactggagctaataccgcatgatacctgagggtca120aaggcgcaagtcgcctgtggaggagcctgcgttcgattagctagttggtggggtaaaggc180ctaccaaggcgatgatcgatagctggtttg昭a(bǔ)ggatgatcagccacactgggactgaga240cacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggggcaaccct300gatccagcaatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttcgacgggg360acgatgatgacggtacccgtagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggta420atacgaagggggctagcgttgctcggaatgactgggcgtaaagggcgtgtaggcggtttg480tacagtcagatgtgaaatcccegggcttaacetgggagctgcatttgatacgtgcagact540agagtgtgagagagggttgtggaattcccagtgtagaggtgaaattcgtagatattggga600agaacaccggtggcgaaggcggcaacctggctcattactgacgctgaggcgcgaaagcgt660ggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtgtgctagatg720ttgggtaactttgttattcagtgtcgcagttaacgcgttaagcacaccgcctggggagta780cggccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgt840ggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagggcttgaatgtagaggctgtattca900gagatggatatttcccgcaagggacctctaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc96012gtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctatctttagttgccag1020cacgtttgggtgggcactctagagagactgccggtgacaagccggaggaaggtggggatg1080acgtcaagtccteatggcccttatgtcctgggctacacacgtgctacaatggcggtgaca1140gtgggaagctagatggtgacatcgtgctgatctctaaaagccgtctcagttcggattgca1200ctctgcaactcgagtgcatgaaggtggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcgg1260tgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggtttgacct1320taagccggtgagcgaacccgcaaggggcgcagccgaccacggtcgggtcagcgact路gg1380tgaagtcgtaacaagg1396SEQ.ID.N02:<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>2ccgaattcgtcgacaacagagtttgatcctggctcac37SEQ.ID.N03:<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3agagtttgatcctggctcag20權(quán)利要求1、一種醋酸桿菌，其特征是該醋酸桿菌菌株(AcetobacterspXZY003.)保藏號(hào)為CCTCCM209061。2、應(yīng)用權(quán)利要求1所述醋酸桿菌生產(chǎn)對(duì)映體純(及)-有機(jī)硅醇的方法，其特征在于在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中加入有機(jī)硅酮、異丙醇和固定化醋酸桿菌(A^o^cto"sp.)顆粒成混合物，調(diào)節(jié)pH值至4.0-6.0，在溫度為25-35°C,轉(zhuǎn)速為160-200r/min條件下，振蕩反應(yīng)0.5~8h，進(jìn)行微生物細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化，制得對(duì)映體純(及)-有機(jī)硅醇；所述的三乙醇胺、鹽酸、有機(jī)硅酮和異丙醇在混合物中的濃度分別為0.05-0.2mol/L、1.5-20mmol/L、3.0~20mmol/L和43.6~200mmol/L:所述固定化醋酸桿菌04ce/o6a"ersp.)顆粒與混合物的重量體積比為0.1~1.0g/mL。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用醋酸桿菌生產(chǎn)對(duì)映體純(及)-有機(jī)硅醇的方法，其特征在于所述對(duì)映體純(i)-有機(jī)硅醇為(及)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇或(及)-三甲基硅乙醇。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用醋酸桿菌生產(chǎn)對(duì)映體純(i)-有機(jī)硅醇的方法，其特征在于所述固定化醋酸桿菌細(xì)胞、異丙醇、三甲基硅乙酮在混合物中濃度分別為0.50g/mL、130.6mmol/L禾fl10mmol/L。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用醋酸桿菌生產(chǎn)對(duì)映體純(及)-有機(jī)硅醇的方法，其特征在于所述pH為5.0，溫度為30。C,轉(zhuǎn)速為180r/min。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)醋酸桿菌及應(yīng)用其生產(chǎn)對(duì)映體純(R)-有機(jī)硅醇的方法，該醋酸桿菌(Acetobactersp.)XZY003保藏號(hào)為CCTCCM209061。應(yīng)用醋酸桿菌生產(chǎn)對(duì)映體純(R)-有機(jī)硅醇的方法是在三乙醇胺的鹽酸緩沖液中加入有機(jī)硅酮、異丙醇和固定化醋酸桿菌(Acetobactersp.)顆粒成混合物，調(diào)節(jié)pH值至4.0-6.0，在溫度為25-35℃，轉(zhuǎn)速為160-200r/min條件下，振蕩反應(yīng)0.5-8.0h，制得對(duì)映體純(R)-有機(jī)硅醇，本發(fā)明利用遵循反Prelog規(guī)則的醋酸桿菌催化合成(R)-有機(jī)硅醇，省去添加昂貴的還原型輔酶，降低了其生產(chǎn)成本，具有絕對(duì)的立體選擇性和較高的產(chǎn)率。文檔編號(hào)C12N1/20GK101586091SQ20091014626公開(kāi)日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年6月19日優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日發(fā)明者婁文勇,宗敏華,肖仔君申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)