通過生產(chǎn)蟻酸(甲酸)儲存氣態(tài)氫的方法
【專利說明】通過生產(chǎn)蟻酸（甲酸）儲存氣態(tài)氨的方法
[0001] 本發(fā)明設(shè)及儲存氣態(tài)氨的方法，其包括W下步驟：在氨依賴二氧化碳還原酶 (皿CR)的存在下，通過使氣態(tài)氨接觸二氧化碳來生產(chǎn)蟻酸（甲酸），由此儲存所述氣態(tài)氨。 皿CR和/或其復(fù)合物優(yōu)選來源于伍氏醋酸桿菌。 陽00引發(fā)明背景
[0003] 氨是一種有前景的化石燃料替代品。通過與氧的反應(yīng)，氨在熱機中爆炸性地釋放 能量或在燃料電池中平穩(wěn)地釋放能量，生成水為唯一的副產(chǎn)物。氨含量豐富且不論國界廣 泛分布于世界各地。W將氨的生產(chǎn)和最終使用靈活地聯(lián)系在一起的高能量密度形式來儲存 氨是氨能經(jīng)濟中的關(guān)鍵要素。
[0004] Boddien等（C〇2-"化utral"Hy化ogen Storage Based on Bicarbonates and F'ormates. Angew. Qiem. Int. Ed. , 201150:6411 - 6414)描述了原位生成的釘催化劑，該催化 劑促進碳酸氨鹽和碳酸鹽W及C〇2和堿的選擇性加氨反應(yīng)，得到甲酸，并且還促進甲酸回到 碳酸氨鹽的選擇性脫氨反應(yīng)。運兩類反應(yīng)可W是偶聯(lián)的，形成可逆的儲氨系統(tǒng)。 陽0化]KR2004/0009875描述了使用二氧化碳制備甲酸的電化學(xué)方法，從而在進行 二氧化碳還原的同時將二氧化碳轉(zhuǎn)化為有用的有機物質(zhì)。該方法包括二氧化碳的電化 學(xué)還原反應(yīng)，所述電化學(xué)還原反應(yīng)使用甲酸脫氨酶或產(chǎn)生甲酸脫氨酶的厭氧菌，W及 在-400至-600mV的電位發(fā)生可逆氧化/還原反應(yīng)的電子載體，其中所述電子載體的濃度 為5至15mM;所述厭氧菌選自熱醋酸梭菌（Clostridiumthermoaceticum)、熱自養(yǎng)梭菌 (Clostridiumthermoauthotro地i州m)、伍氏醋酸桿菌（Acetobacteriumwoodii)、凱伍產(chǎn) 醋菌（Acetogeniumkivui)、醋酸梭菌（Clostridiumaceti州m)、揚氏梭菌（Clostridium ljungd址lii)、產(chǎn)粘真桿菌巧ubacteriumlimosum)或其混合物；所述電子載體選自甲基 紫精、N，N，-二乙基-4, 4-聯(lián)化晚、N，N-二異丙基-4, 4-聯(lián)化晚、4, 4-聯(lián)化晚或其混合物； 還原溫度為20至70°C;且還原抑值為6. 0至7. 0。
[0006] W0 2011/087380描述了在含C0和/或&的氣態(tài)底物的微生物發(fā)酵中提高碳捕獲 效率的方法；所述方法包括在發(fā)酵過程中施加電勢。該方法進一步設(shè)及在含C0和/或&的 氣態(tài)底物的微生物發(fā)酵中提高碳捕獲效率來生產(chǎn)醇和/或酸。
[0007] 可W使用催化過程將主要由C0和/或C0與氨氣化2)組成的氣體轉(zhuǎn)化為各種燃 料和化學(xué)品。也可W使用微生物將運些氣體轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)品。雖然運些生物過程一般 比化學(xué)反應(yīng)慢，但是相比催化過程仍具有多種優(yōu)勢，包括更高的特異性、更高的產(chǎn)率、更低 的能耗和更強的抗中毒性。
[0008] 1903年首次發(fā)現(xiàn)微生物WC0作為唯一碳源生長的能力。運在后來被確認為是使 用乙酷輔酶A(乙酷CoA)自養(yǎng)生長的生化途徑（也被稱為Wood-Uungd址1途徑和一氧化 碳脫氨酶/乙酷CoA合酶（C0DH/AC巧途徑）的生物的特性。已表明包括一氧化碳營養(yǎng)生 物、光合生物、產(chǎn)甲燒生物和產(chǎn)醋酸生物的大量厭氧生物能將C0代謝為各種終產(chǎn)物，即C〇2、 &、甲燒、正下醇、醋酸和乙醇。雖然使用CO作為唯一的碳源，所有運類生物產(chǎn)生至少兩種 運些終產(chǎn)物。W氨作為還原劑厭氧固定C〇2的Wood-Uungd址1途徑被認為是世界上首個 維持生命途徑的候選途徑，因為該途徑將二氧化碳的固定與經(jīng)由化學(xué)滲透機理的ATP合成 結(jié)合在一起。
[0009]Schuchmann等(Abacterialelectron-bifurcatinghydrogenase.JBiol Chem. 2012S巧7 :287(37) :31165-71)描述了來自伍氏醋酸桿菌的多聚[FeFe]-氨酶，其包 含催化基于氨的鐵氧化還原蛋白的還原反應(yīng)的四個亞基（HydABCD)。顯然，伍氏醋酸桿菌的 多聚氨酶是可溶的能量轉(zhuǎn)化氨酶，該多聚氨酶利用電子分叉，通過使吸能的鐵氧化還原蛋 白還原與放能的NAD+還原偶聯(lián)來驅(qū)動所述鐵氧化還原蛋白的還原反應(yīng)。
[0010]Schiel-Bengelsdorf和Durre(Pathwayengineeringandsyntheticbiology usingacetogens,陽BSLetters, 2012, 586, 15, 2191)描述了由C〇2或CO合成乙酷CoA的 產(chǎn)醋酸厭氧菌。它們的自養(yǎng)代謝模式為大量可獲得底物與減少溫室氣體的結(jié)合使用在生物 技術(shù)上提供了機會。幾個公司已建設(shè)了將廢氣轉(zhuǎn)化為乙醇的試驗廠和示范廠，乙醇是重要 的生物燃料和多種產(chǎn)醋酸菌的天然產(chǎn)物。DNA重組法現(xiàn)已敞開構(gòu)建產(chǎn)醋酸菌的大口，合成諸 如丙酬和下醇的重要的工業(yè)大宗化學(xué)品和生物燃料。因此，可獲得不再與營養(yǎng)原料競爭的 新型微生物生產(chǎn)平臺。 陽0川 W0 2011/028137描述了將含有C0和任選的&，或者含有C〇2和Η2的氣態(tài)底物發(fā) 酵為一種或多種產(chǎn)物的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，所述產(chǎn)物包括酸和/或醇。
[0012] 118 7,803,589描述了包含基因修飾的大腸桿菌巧3油6'1油1曰〇〇11)微生物，其 中所述基因修飾包括用編碼蛋白的外源細菌核酸分子來轉(zhuǎn)化所述微生物，所述蛋白為鉆胺 酷胺類咕嘟/鐵硫蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶、一氧化碳脫氨酶、乙酷CoA合成酶、乙酷CoA合成酶二 硫化物還原酶和氨化酶，由此，所述蛋白的表達提高了從C〇2、C0、&、或其組合物生產(chǎn)乙酷 CoA的效率。
[0013]Poehlein等（Anancientpathwaycombiningcarbondioxidefixationwith thegenerationandutilizationofasodiumiongradientforATPsynthesis.PLoS One. 2012 ;7 (3) :e3：M39.doi: 10. 1371/journal.pone. 0033439)描述了從二氧化碳和氨分 子合成醋酸，被認為是世界上的首個碳同化途徑。所述合成將二氧化碳在乙酷CoA中的固 定與通過提供細胞膜能量的ATP生產(chǎn)結(jié)合在一起。該途徑如何與凈合成ATP結(jié)合一直是個 謎。厭氧產(chǎn)醋酸的細菌一伍氏醋酸桿菌利用該途徑的古老形式而無需細胞色素和釀類。該 途徑通過鋼驅(qū)動的鐵氧化還原酶：NAD氧化還原酶巧nf)在細胞膜間形成了鋼離子電勢。伍 氏醋酸桿菌的基因組序列解開了運個迷：其掲示了化f作為唯一的離子驅(qū)動酶與所述途徑 結(jié)合，并闡明了設(shè)計為產(chǎn)生還原的鐵氧化還原蛋白且憑借電子分叉的可溶酶克服能壘的代 謝。
[0014] 如上文所提到的，氨是討論最多的未來能源之一。生產(chǎn)氨的方法眾所周知，但氨氣 的儲存和運輸卻是尚未解決的問題。因此，本發(fā)明的目的是提供新型有效的方法W便為氨 的儲存提供新的方式，尤其是直接從氣相儲存氨。研究了W下本發(fā)明的描述和實施例，其他 的目的和優(yōu)點對于技術(shù)人員來說將會是顯而易見的。
[0015] 根據(jù)本文的第一個方面，通過提供儲存氣態(tài)氨的方法來實現(xiàn)本發(fā)明的目的，該方 法包括W下步驟：在氨依賴二氧化碳還原酶（皿CR)的存在下，通過使氣態(tài)氨接觸二氧化碳 來生產(chǎn)蟻酸（甲酸），由此儲存所述氣態(tài)氨。
[0016] 本發(fā)明基于意外發(fā)現(xiàn)，即發(fā)現(xiàn)了皿CR酶，且優(yōu)選其各自的酶復(fù)合物，可通過反應(yīng) H2+CO2-肥00H將氣態(tài)Η2+C〇2直接轉(zhuǎn)化為甲酸。該生物系統(tǒng)在正常的壓力和溫度下運行， 例如環(huán)境壓力和環(huán)境溫度，優(yōu)選在標準環(huán)境溫度和環(huán)境壓力下運行，或在約20°C至約40°C的溫度和正常壓力下運行。相比已知的化學(xué)催化劑，所述方法還具有高轉(zhuǎn)化率。另外，優(yōu)選 無需提供額外的能量。
[0017] 因為該反應(yīng)在熱力學(xué)平衡附近發(fā)生，在逆反應(yīng)中，氨易于從甲酸中釋放。
[0018] 與待轉(zhuǎn)化的&相比，C02可氣態(tài)和/或固態(tài)的形式提供于所述方法中。本發(fā) 明的方法中優(yōu)選的是CO2W碳酸氨鹽（肥0 3)的形式提供（見圖3)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法，其中該方法不設(shè)及電化學(xué)還原，尤其是二氧化碳的電化 學(xué)還原。無需提供電能，尤其是絕不對所設(shè)及的生物反應(yīng)器提供電勢。 W20] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法，其中所述皿CR選自細菌酶，例如伍氏醋酸桿菌的 F化F1(登錄號ΥΡ_005268500, SEQ ID No. 1)或F化F2(登錄號ΥΡ_005268502, SEQ ID No. 2)。也可優(yōu)選在氨基酸水平上與F化FI和/或F化F2酶至少65%，更優(yōu)選至少 70%，更優(yōu)選至少80%，最優(yōu)選至少90 %相同的甲酸脫氨酶。優(yōu)選的實例選自艱難梭 菌（Clostridium difficile) 630的甲酸脫氨酶-H(登錄號ΥΡ_001089834. 2)、艱難梭菌 CD196的甲酸脫氨酶h(登錄號ΥΡ_003216147. 1)、梭菌屬種（Clostridium sp.)DL-VIII 的甲酸脫氨酶（登錄號WP_〇〇9172363. 1)、Clostridium arbusti的甲酸脫氨酶（登錄號 WP_010238540. 1)、Clostridium ragsdalei的甲酸脫氨酶（登錄號gb|AEI90724. 1)、多粘 類芽抱桿菌（Paenibacillus polymyxa化681的甲酸脫氨酶H(登錄號ΥΡ_00387103