專利名稱：一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
柑桔碎葉病毒(CzYr附to故Wea/v/ms, CTLV)引起的柑桔碎葉病是威脅柑桔生產(chǎn)的重 要病害之一，可以導(dǎo)致以枳作砧木的寬皮柑桔減產(chǎn)25%左右。柑桔碎葉病毒在美國、日本、 南非、澳大利亞和中國等多個國家已有發(fā)生，尤其以日本和中國最為普遍。在浙江、湖南、 福建和廣西等省的局部地區(qū)柑桔碎葉病毒已造成比較嚴(yán)重的為害。柑桔碎葉病毒是RNA 病毒，極易發(fā)生重組、突變， 一旦強致病性的變異株系出現(xiàn)流行，將給柑桔產(chǎn)業(yè)帶來不可 估量的損失。
目前為止，指示植物鑒定是檢測柑桔碎葉病毒株系變異的重要依據(jù)和手段之一。蘇鴻 基根據(jù)柑桔碎葉病在臘斯克枳橙和特洛亞枳'橙上的癥狀，將柑桔碎葉病毒劃分為致病力強 弱不同的株系。何新華等(1996)曾對ll個柑桔碎葉病毒分離株致病力強弱進(jìn)行比較。雖 然用指示植物能夠檢測柑桔碎葉病毒的株系變異，但是費工、費時(30-45天)、成本高， 而且受環(huán)境的影響較大(溫度高于3(TC不表現(xiàn)癥狀)，并且不能明確變異的分子特征。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多科學(xué)工作者開始通過柑桔碎葉病毒全部或部分核苷酸序 列測定來研究其分子變異，目前已測定了來源于蘋果的P-209、百合的L和Li-23等7個 分離株的全基因組核苷酸序列。Magome等(1997)對6個來源于蘋果、日本梨和歐洲梨 的分離物以及2個來源于柑桔的柑桔碎葉病毒分離物的V-區(qū)、CP和ORF2編碼蛋白氨基 酸序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同來源的病毒分離物包含2-4個分子變種，用V-區(qū)、CP和 ORF2編碼蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，這些分離物和分子變種可分為幾個組群。 但是序列測定成本較高，并需要大型儀器設(shè)備，不適合高通量大規(guī)模進(jìn)行。
單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析精確性高，理論上能檢測到只有一個堿基突變的序列 差異。Magome等(1999)根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)柑桔碎葉病毒存在高度可變區(qū)(V-區(qū))，利用SSCP 技術(shù)研究了柑桔碎葉病毒V區(qū)的序列變異。該方法定義變異的類型比較困難，需要單一的 標(biāo)準(zhǔn)分離株，因而重復(fù)性較差，不同實驗室的結(jié)果之間可能存在差異，并且該方法電泳時 間較長，后期的染色程序比較復(fù)雜，結(jié)果判定需要豐富的經(jīng)驗。到目前為止，尚無適合高通量快速檢測柑桔碎葉病毒分子變異的方法報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法。該方法具有速度 快、成本低、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作性強等特點，適合大規(guī)模、高通量的樣品分析， 適用于田間樣品檢測、柑桔碎葉病毒流行監(jiān)控、脫毒苗木鑒定等多種用途。
本發(fā)明的目的通過如下措施來實現(xiàn)
一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法，技術(shù)路線是用特異性引物對柑桔碎葉病
毒基因組特定區(qū)域的核酸序列進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增(RT-PCR)，并應(yīng)用限制性內(nèi)切
酶對其擴增產(chǎn)物進(jìn)行消化，依據(jù)電泳圖譜診斷柑桔碎葉病毒的分子變異。
該方法依次包括下述步驟
(1) 取適量柑桔碎葉病毒寄主植物的葉或皮在液氮中充分研磨，加入核酸提取液按
常規(guī)方法提取樣品總核酸或RNA;
(2) 根據(jù)柑桔碎葉病毒的保守序列設(shè)計特異引物，以所提取的核酸為模版，對柑桔
碎葉病毒基因組特定區(qū)域進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增；
(3) 應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對柑桔碎葉病毒的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化；
(4) 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰氨凝膠電泳、染色、獲取電泳圖譜；
(5) 依據(jù)上述圖譜的條帶特征診斷柑桔碎葉病毒的分子變異類型。
上述方法中
步驟(2)所述的柑桔碎葉病毒基因組特定區(qū)域是指包含或部分包含外殼蛋白基因、
運動蛋白基因或其它基因的核酸序列。
步驟(3)所述的限制性內(nèi)切酶是指TaqI、 Mse I、 Hinf I或其它限制性內(nèi)切酶中的1
種或2種。


圖1是本發(fā)明檢測結(jié)果示意圖
1—7:柑桔碎葉病毒分子變異類型；M: DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點 (O速度快從樣品制備到獲取可用于診斷柑桔碎葉病毒分子變異的酶切圖譜可在
一天內(nèi)完成。
(2)操作簡便，重復(fù)性好、穩(wěn)定性高同一樣品的不同檢測批次，不同人員操作， 其結(jié)果一致性100%。
4(3)適合大規(guī)模、高通量的樣品分析 一次可輕松處理幾十個樣品。
具體實施例方式
下述實施例是為清楚說明本發(fā)明而進(jìn)行的進(jìn)一步詳細(xì)描述，不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限
定
實施例1:核酸提取
稱取5mg病毒寄主皮或葉裝入一無菌離心管中，在液氮中研磨后依次加入60pL TES
緩沖液和6(VL飽和酚氯仿異戊醇(25: 24: 1),混勻；7(TC水浴5~10分鐘；室溫下
13 000rpm離心5分鐘，吸取40pL上清液加入由Sephadex G-50-80構(gòu)成的微柱中，置于 一新的無菌離心管，5 000rpm離心4分鐘，收集洗脫液。 實施例2:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增
設(shè)計特異引物CTLVR: 5' -AGAGTGGACA AACTCTAGAC-3' ， CTLVF: 5' -CCCTCTCAGC TAGAATTGAA-3 '用于擴增包含柑桔碎葉病毒外殼蛋白基因在內(nèi)的 889bp核酸序列，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增在PCR儀中進(jìn)行，所用反應(yīng)體系總體積10pL，包 括2xPCR緩沖液5 pL， 10nmol4iL引物各1.25 ^L， 50 mmol/LMgS04 0.3 ^L， 5 U/pL RT/Taq酶(Invitrogen公司)0.2pL，按前述方法所提取的核酸混合液lpL，超純水1.5|xL; 反應(yīng)條件為42°C， 30分鐘；94°C， 2分鐘；94。C20s,54.5。C20 s,72。C45s,40個循環(huán);72 °C10分鐘。
實施例3:限制性內(nèi)切酶消化
逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增結(jié)束后，直接加入以下混合液10nL進(jìn)行/Zz'"fl酶切反應(yīng)超 純水6.25pL; buffer B 2.5pL; BSA (10pg4iL) 0.25卩L;倫f I (10U/(xL) lpL;充分混勻 后，37'C水浴1小時。
實施例4:電泳及圖譜獲取
配制3%瓊脂糖凝膠，將上步消化混合液與8 P L染料混勻后點樣，同時點5pL的DNA 標(biāo)準(zhǔn)Marker;電泳條件為初始電壓150V， 10分鐘；后續(xù)電壓IOOV， 60分鐘；電泳完畢 后EB染色15分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)中獲取酶切圖譜。
實施例5:柑桔碎葉病毒分子變異的診斷
檢測結(jié)果如圖l所示，通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker比較可以估計出圖譜中各條帶的大小， 從而判定15個柑桔碎葉病毒樣品中出現(xiàn)7種分子變異類型。
權(quán)利要求
1、一種柑桔碎葉病毒分子變異的快速檢測方法，其特征在于，用特異性引物對柑桔碎葉病毒基因組特定區(qū)域的核酸序列進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U增，并應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對其擴增產(chǎn)物進(jìn)行消化，依據(jù)電泳圖譜診斷柑桔碎葉病毒的分子變異。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的柑桔碎葉病毒基因組 特定區(qū)域是指包含或部分包含外殼蛋白基因、運動蛋白基因或其它基因的核酸序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的限制性內(nèi)切酶是 指Taq I、 Mse I、 Hinf I或其它限制性內(nèi)切酶中的1種或2種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷柑桔碎葉病毒(CTLV)分子變異的快速檢測方法。它包括設(shè)計特異性引物對CTLV基因組特定區(qū)域的核酸序列進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增(RT-PCR)，并用Taq I、Mse I、Hinf I或其它限制性內(nèi)切酶對其RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，然后依據(jù)電泳圖譜診斷CTLV的分子變異。本發(fā)明的方法具有速度快、成本低、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、操作性強等特點，適合大規(guī)模、高通量的樣品分析，適用于田間樣品檢測、CTLV流行監(jiān)控、脫毒苗木鑒定等多種用途。
文檔編號C12Q1/70GK101560577SQ20091010393
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日
發(fā)明者周常勇, 震 宋, 李中安 申請人:西南大學(xué);中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所