專利名稱：傳染性脾腎壞死病毒的lamp-lfd檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染性脾腎壞死病毒的檢測方法，具體涉及傳染性脾腎壞死病毒的 LAMP-LFD檢測方法。
背景技術(shù)：
虹彩病毒是一類對魚類、兩棲類和爬行類水生動物具有廣泛感染性的致病病原，由 其感染所致的疾病己成為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的嚴重問題。根據(jù)國際病毒分類委員會 (International Committee On Taxonomy of Viruses, ICTV)第八個病毒報告，傳染性脾 腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)為虹彩病毒科細胞腫 大病毒屬代表種，是大型二十面體細胞質(zhì)型線性雙鏈DNA病毒，直徑大小約為150nm。 它能引起全身性、系統(tǒng)性地感染，對感病魚的脾臟、腎臟等造血器官和組織造成嚴重破 壞，導致病魚貧血、多器官衰竭而死亡。ISKNV是許多重要養(yǎng)殖魚類如鱖魚、花鱸、大 黃魚及重要的觀賞魚類如藍眼燈和麗麗魚等的爆發(fā)性流行病的病原，這類病毒侵染魚體 流行快，極易引起魚的暴發(fā)性死亡，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。因此快速、 準確、靈敏的檢測ISKNV的新技術(shù)，對控制早期病毒感染、切斷病毒傳播，保障我國 魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
目前公開的ISKNV檢測方法的是采用PCR檢測體系，實現(xiàn)了實驗室條件下對 ISKNV的簡便、快速、敏感、特異檢測。如授權(quán)公告號為CN11864359C，公告日為2005 年1月26日，發(fā)明名稱為鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因診斷試劑盒及檢測方法，就公開 了設(shè)計有二對引物的PCR反應液對樣品模板進行PCR擴增反應檢測。但PCR檢測需要昂 貴的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)(紫外儀)以及分子生物學專業(yè)實驗人員操作，這 只能在實驗室條件下才可以檢測，限制了PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應用。
環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是日本學者 Notomi (2000年)發(fā)明的一種新式恒溫核酸擴增技術(shù)。反應采用能特異識別靶序列上6 個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase),在 恒溫條件下(65 。C左右)高效G0min 1 h)擴增目標DNA。 LAMP產(chǎn)物的檢測一般 采用瓊脂糖凝膠電泳、濁度觀察、熒光染料目測觀察等方法。
橫向流動試紙條(lateral flow dipstick ， LFD)是一種新的檢測方法，反應中FITC 標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳或熒 光染料染色肉眼觀察由非特異性擴增造成的假陽性，進一步提高了反應的特異性和靈敏度。LFD檢測無許特殊的設(shè)備，操作者只需將產(chǎn)物和試紙條浸入緩沖液，并且不需EB 等有毒試劑，操作簡便且更安全。LAMP-LFD結(jié)合技術(shù)的檢測結(jié)果可以直接肉眼觀察。 LFD試紙條上具有控制帶和檢測帶，兩條帶均顯色表示檢測結(jié)果為陽性，只有控制帶 顯色檢測帶不顯色表明檢測結(jié)果為陰性。LAMP-LFD結(jié)合方法安全、快捷、高效、高 靈敏度且無設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)所無法替代的優(yōu)勢。目前，該技術(shù)已被用于 桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV) (Kiatpathomchai et al.， 2008)，對蝦白斑癥病毒 (White spot syndrome virus, WSSV) (Kiatpathomchai et al.， 2008)，傳染性肌肉壞死病 毒(Infectious myonecrosis virus, IMNV) (Puthawibool et al.， 2008)的檢領(lǐng)!l，傳染性脾 腎壞死病毒(ISKNV)的檢測未見報道。本發(fā)明第一次將LAMP技術(shù)和LFD技術(shù)結(jié) 合并用于傳染性脾腎壞死病毒的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應用環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)結(jié)合色譜橫向流 動試紙條檢測傳染性脾腎壞死病毒的方法，以實現(xiàn)對傳染性脾腎壞死病毒進行快速、安 全、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測，克服已有用PCR檢測傳染性脾腎壞死病毒不能在 生產(chǎn)中應用的問題。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括三個部分1、提供3對用于檢測
傳染性脾腎壞死病毒的LAMP引物序列，即長度分別為45bp、 17bp、 45bp、 18bp、 20bp 和20bp的寡核苷酸序列，依次命名為DpoL-BIPNEW、 Dpol-B3NEW、 Dpol-FIPNEW、 Dpol-F3NEW、 DpolNew-LoopF和DpolNew-LoopB; 2、配制LAMP反應體系，通過 LAMP反應程序?qū)悠纺０暹M行擴增，確定最佳的反應體系和反應條件；3、提供1條 DNA探針序列FITC-Probe，長度為21bp，結(jié)合LFD技術(shù)對LAMP擴增結(jié)果進行分 析。具體包括如下步驟
、 DPOL基因克隆和測序?qū)SKNV的DNA聚合酶(DPOL)基因克隆至 pMD19-T得到重組質(zhì)粒并進行測序分析，測得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列如下<formula>formula see original document page 7</formula>2、 設(shè)計LAMP的引物和探針根據(jù)上述測序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷酸 序列設(shè)計下述LAMP的三對引物序列和一條探針序列-
BIP引物DpoL-BIPNEW:
5 '-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3' 45 FIP引物Dpol-FIPNEW:
B3引物Dpol-B3NEW: 5'-GCTACCCTTTGGGTGGC-3， 17 F3引物Dpol-F3NEW: 5，-GACGCGACAGCGCCATGT-3， 18 LF弓|物DpolNew-LoopF: 5，-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3' 20 LB引物DpolNew-LoopB: 5，-AACCAGGGCTCGTACAAAGT-3， 20 探針FITC-Probe: 5，-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3' 21
其中Dpol-FIPNEW為5，端BIPO生物素標記引物，F(xiàn)ITC-Probe為5，端FITC 標記探針；引物序列和探針序列分別與傳染性脾腎壞死病毒的DNA聚合酶(DPOL) 基因上相應位置核苷酸序列相同或者互補。
3、 配制LAMP反應體系反應體系的終濃度分別為外引物F3和B3各0.2 Hmol/L，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6pmol/L，環(huán)引物LF禾卩LB各0.4nmol/L ， dNTPs 0.96 mmol/ L， Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/ L， KC1 10 mmol/ L， MgS04 6.5 mmol/ L， (NH4)2S04 10 mmol/ L， 0.1% Triton x-100, 8 U 5w DNA聚合酶大片段(New England BIPolabs)和lpL樣品模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25(xL。
4、 LAMP反應體系擴增將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61-65 °C，擴增反應時間為10-60 min。
5、 探針雜交和LFD檢測擴增后將20pmol的FITC-probe探針加入反應體系 中，63°C溫育5min，進行雜交，取8(xL雜交液加入100 buffer中混勻，然后將 LFD試紙條浸入取出的雜交液顯色檢測，判斷橫向流動試紙條檢測LAMP的結(jié)果。
步驟4中所述的最適反應溫度為65°C，最適反應時間為20min。 本發(fā)明所提供的傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法具有如下優(yōu)點
一、 靈敏度高，對ISKNV的檢測極限可低至<10拷貝，對ISKNV的檢測靈敏 度比常規(guī)PCR高1 000倍。
二、 特異性強，所用的特異引物根據(jù)ISKNV的DNA聚合酶(DPOL)基因中的 六個不同區(qū)域設(shè)計，又有DNA的特異性探針結(jié)合，特異性比常規(guī)PCR要強。
三、 檢測時間短，lh左右可獲得檢測結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測節(jié)省2-4h。
四、 儀器設(shè)備要求低，不需要普通PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)， 只需要一個水浴鍋就可以完成檢測。 五、 操作簡單、結(jié)果明顯，整個檢測過程不涉及復 儀器和設(shè)備，稍具分子生物學基礎(chǔ)的人員即可完成操作；檢測結(jié)果清晰明顯，直接用眼睛觀察就可以判斷。
六、對人和環(huán)境較安全，檢測過程中不使用EB等有毒試劑，對人和環(huán)境非常安全。 綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有技術(shù)的PCR檢測ISKNV的方法具有更高的特異
性、靈敏度和便捷性，并且可以在于實際生產(chǎn)中現(xiàn)場應用檢測，有利于控制魚類養(yǎng)殖中
傳染性脾腎壞死病毒的傳染和暴發(fā)。


圖1為傳染性脾腎壞死病毒DPOL基因的LAMP引物和探針設(shè)計示意圖； 圖2為擴增反應溫度對LAMP擴增的影響圖；M: lkb DNA標準分子量(Fermentas
公司)；1、 2泳道為6rC恒溫條件下擴增結(jié)果；3、 4泳道為63'C恒溫條件下擴增結(jié)
果；5、 6泳道為65"恒溫條件下擴增結(jié)果；2、 4、 6泳道是以10—3倍稀釋的基因組 DNA做模板；1、 3、 5泳道為無模板；
圖3為反應時間對LAMP擴增的影響圖；M: lkb DNA標準分子量(Fermentas公司)； 2、 3泳道為10min擴增結(jié)果；4、 5泳道為20min擴增結(jié)果；6、 7泳道為30min擴增 結(jié)果；8、 9泳道為40min擴增結(jié)果；1、 10、 11泳道為60min擴增結(jié)果；2、 4、 6、 8、 IO泳道以1(TM咅稀釋的基因組DNA做模板；3、 5、 7、 9、 11泳道以10—3倍稀釋的基因 組DNA做模板；l泳道為無模板；
圖4為LAMP-LFD結(jié)合技術(shù)檢測ISKNV結(jié)果示意圖5為LAMP-AGE(a)、 LAMP-LFD (b)和常規(guī)PCR(c)方法檢測ISKNV的靈敏度 比較電泳圖；其中圖5 (a)為LAMP-AGE電泳圖，圖5 (b)為LAMP-LFD檢測圖， 圖5(c)為PCR電泳圖；(a)lkb DNA標準分子量(Fermentas公司)；(c)PUC19/MSP/23DNA 標準分子量(Fermentas公司)；1:無模板；2~10管模板分別為10—3， 10—4， l(T5， l(T6， 10-7, IO-8， IO-9， l(T10， 10—u倍稀釋的基因組DNA;
圖6為LAMP-LFD的特異性實驗結(jié)果圖；M為lkb DNA標準分子量(Fermentas
公司)；1:無模板；2:傳染性脾腎壞死病毒；3:對蝦白斑綜合癥病毒；4:淋巴囊腫 病病毒；5:鯉魚春季病毒血癥病毒。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。 實施例1
1 、 ISKNV DPOL基因的克隆及序列分析 1.1材料與方法 l丄l材料
患病將死大黃魚采自浙江省象山港海灣水產(chǎn)苗種繁育中心，大腸桿菌菌株TGi由 本室保存，pMD19-TVector、 rr叫DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司，plasmid Mini kit購自O(shè)MEGA公司，QIAquick Gel Extraction試劑盒購自QIAGEN公 司。
l丄2方法
1丄2.1病魚組織基因組DNA提取
取自然患病大黃魚脾組織約100mg于lmL無菌水中冰浴勻漿，1 500Xg 4'C離心 10 min，取上清加入等體積的裂解液(10mM Tris-HCl (pH 8.0)， lOOmM EDTA， 20ng/mLRNase， 0.5% (w/v) SDS)，同時加入蛋白酶K使終濃度為100嗎/mL，然后于 55。C溫育3h后氛氯仿抽提兩次。-20卩乙醇沉淀30 min， 100uL雙蒸水溶解-20°C保 存待用。
L1.2.2 ISKNVDPOL基因的擴增及克隆測序
根據(jù)GenBank中傳染性脾腎壞死病毒病毒基因組序列(登錄號AF371960)設(shè)計 DPOL基因全長的PCR特異擴增引物
ISKNV-DPOL(+): 5，-ATGGATAGTGTGTACATCTATC-3'， ISKNV-DPOL(-): 5'隱TCATACGGCAGGCGTCGTG-3'，
上述PCR特異擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成;PCR擴增反應為25 體系，包含10mmol/LTris-HCL (PH8.3), 50 mmo1/LKCL， 1.5 mmo1/LMgCL2， 0.8 mmo1/ L dNTPs， 0. 2 pmo1/ L引物ISKNV陽DPOL(+)， 0. 2 nmo1/ L引物ISKNV-DPOL(-)， 模板DNA 1.0 pL， 5U&L r7bg DNA聚合酶；反應經(jīng)94"C預變性2 min后，循環(huán)擴增 30次94°C變性30 s， 58°C復性30 s， 72°C反應30 s，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反 應10 min;擴增產(chǎn)物經(jīng)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后，預期大小的擴增條帶用 QIAquick Gel Extraction純化克隆至pMD19-T載體；DPOL基因序列測定由上海英駿 生物技術(shù)有限公司完成。
2、 LAMP技術(shù)檢測傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的方法的建立
2.1材料與方法
2丄1材料
DNA聚合酶大片段(含10X緩沖液)購自New England BIPolabs公司，dNTPs 購自TaKaRa公司，LFD檢測試紙條購自Milenia BIPotec GmbH公司。 2丄2方法
2.1.2.1 LAMP引物的設(shè)計
根據(jù)如圖1所示的ISKNV-DPOL基因測序結(jié)果(登錄號為*****)，設(shè)計和篩 選出下述LAMP的3對引物和一條探針，引物和探針的序列如下所示
B3:5'匿GCTACCCTTTGGGTGGC-3'F3:5 ， -GACGCGACAGCGCCATGT-3'LF: 5'-TCTGCAGATCCCTCAAGGAT-3，LB: 5 ， -AACCAGGGCTCGTACAAAGT-3 ，F(xiàn)ITC-Probe: 5 ， -GATGCACGAC ATGATGATAC C-3'
在引物FIP的5'端標記上生物素BIPO，在FITC-Probe的5'端標記上FITC， ISKNV的DPOL基因的LAMP擴增引物序列位置如圖1所示。按照上述引物序列進行LAMP引物的合成(可由商業(yè)的DNA合成公司合成，如上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司)。2丄2.2 LAMP擴增條件的優(yōu)化
LAMP檢測反應所用的DNA模板可以用常規(guī)的組織核酸提取方法制備，也可以用商品化的組織DNA提取試劑盒制備。首先要配制具有最佳擴增效率和檢測特異性的反應體系，本發(fā)明中的LAMP的反應體系為20mmol/LTris-HCl (pH 8.8)， 10 mmol/LKCl， 6.5 mmol/LMgS04， 10讓o1/L (NH4)2S04， 0.1% Triton X-100， 0.96 mmol/L■Ps， 1. 6 nmol/ L Dpol-FIPNEW， 1. 6 ,ol/ L DpoL國BIPNEW， 0. 2 ,1/ LDpol-F3NEW， 0. 2 pmol/ L Dpol-B3NEW， 0. 4 fxmol/ L DpolNew-LoopF, 0. 4 (xmol/ LDpolNew-LoopB， 8U丑WDNA聚合酶(New England BIPoLabs公司)，基因組DNA模板lpL。按照上述體系要求配制反應混合物，混勻后分裝到無菌Eppendorf管中(規(guī)格為200nL)，反應總體積為25jxL。
在反應程序中，擴增溫度過高或者過低均不利于LAMP反應獲得最佳結(jié)果。本發(fā)明提供的引物和采用本發(fā)明確定的反應體系時，其擴增溫度為61-65°C，擴增效率相當(如圖2)，但由于溫度高反應特異性好，較佳反應溫度選為65°C。另外反應時間對反應產(chǎn)物的量也有較大的影響，在反應lOmin即可檢測到反應產(chǎn)物(見圖3)，但靈敏度較低，為保證LAMP反應的靈敏度，本發(fā)明中的較佳反應時間確定為20min。LAMP檢測時，需將上述含有反應體系的Eppendorf管放入水浴鍋中65°C溫育20min。
2丄2.3 LAMP-LFD結(jié)合技術(shù)檢測ISKNV方法的建立
生物素標記的LAMP擴增在本發(fā)明確定的反應體系和最佳反應條件下進行。反應體系終濃度分別為引物F3禾n B3各0.2pmol/L，內(nèi)引物(5， BIPotin-labeled FIP和BIP)各1.6nmol/L，環(huán)弓l物LF禾Q LB各0.4nmol/L ， dNTPs 0.96 mmol/L， Tris—HCl
(pH8.8) 20 mmol/L， KC110mmol/L， MgS04 6.5 mmol/L， (NH4)2S04 10 mmol/L，0.1% Triton x-100 ， 8 U DNA聚合酶(New England BIPolabs )，基因組DNA模板1 nL ，加雙蒸水使反應體系總體積為25pL。將上述含有反應體系的Eppendorf管放入水浴鍋中65。C溫育20min，不終止反應。2丄2.4探針雜交和LFD檢測
生物素標記的LAMP擴增結(jié)束后，不經(jīng)過終止反應，將20pmol的FITC-probe探針序列加入反應體系中63°C溫育5 min雜交，取8 雜交液加入IOO Buffer混勻，將LFD試紙條浸入其中，觀察檢測帶是否顯色。如果檢測帶顯色表示該樣品的傳
染性脾腎壞死病毒的檢測結(jié)果為陽性，如果不顯色表示該樣品的傳染性脾腎壞死病毒的
檢測結(jié)果為陰性(如圖4所示)。實施例2
用本發(fā)明的LAMP-LFD技術(shù)檢測ISKNV的靈敏度測定
1、 參照1丄2.1的方法提取病魚組織基因組DNA，參照文獻Wang et al.(2005)測定其中病毒ISKNV的量并作10倍梯度稀釋(10—3相當于108 copies/pL)。
2、 用LAMP-AGE方法、LAMP-LFD方法和PCR方法進行ISKNV檢測比較靈
敏度
2. l按照本發(fā)明提供的LAMP的三對引物和條探針結(jié)合LFD技術(shù)將上述梯度稀釋后的基因組DNA (10—3-10—"倍)用作LAMP反應的模板進行擴增，用本發(fā)明提供的LFD方法分析LAMP的反應，結(jié)果見圖5 (b)。
2. 2將上述梯度稀釋的基因組DNA (10入1(T"倍)用作LAMP-AGE的模板進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，結(jié)果見圖5 (a)。
2. 3將上述梯度稀釋的基因組DNA (10-M(TH倍)用作PCR反應的模板，禾,上述DPOL基因的特異引物F3和B3進行擴增；反應體系為25^L: 10 mmo1/ LTris-HCL (PH8.3)， 50mmol/LKCL， 1.5 mmo1/L MgCL2， 0. 8 mmo1/L dNTPs， 上下游引物各0.2pmol/L， 5U/nLr7^DNA聚合酶(Takara公司)lpL模板。94。C預變性2min后，循環(huán)擴增30次94。C變性30 s， 58°C復性30 s， 72°C反應30 s。循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反應10min， 2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖5 (c)。
從圖5(b)與圖5(a)比較可以看出本發(fā)明提供的LAMP-LFD檢測方法對ISKNV的檢測極限可達10—1G，即相當于<10個拷貝的病毒粒子，比LAMP擴增瓊脂糖凝膠電泳(LAMP-AGE)靈敏度高10倍。
從圖5 (b)與圖5 (c)比較可以看出本發(fā)明提供的LAMP-LFD檢測方法對ISKNV的檢測極限可達1(X1()，而PCR方法對ISKNV的檢測極限為10—7;可見本發(fā)明提供的傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法比PCR方法靈敏度高1 000倍。實施例3
用本發(fā)明的LAMP-LFD技術(shù)檢測ISKNV的特異性測定
收集了不同相關(guān)度的DNA病毒4種傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen andkidney necrosis virus)，又寸蟲下白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus)，淋巴囊月中病病毒(Lymphocystis disease virus),鯉魚春季病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus )，提取基因組DNA，用本發(fā)明的LAMP-LFD檢測方法對上述4種病毒進行檢測，其中雙蒸水作為陰性對照。結(jié)果顯示見圖6，說明本發(fā)明提供的ISKNV檢測方法能保證對ISKNV的特異性檢測，并不發(fā)生交叉反應。實施例4
用本發(fā)明LAMP-LFD技術(shù)具體檢測魚體內(nèi)的ISKNV
于浙江省象山港海灣水產(chǎn)苗種繁育中心收集大黃魚樣品15份，花鱸樣品15份，根據(jù)以下步驟進行ISKNV病毒的檢測。
1、 制備待檢樣品的LAMP反應模板
取待檢魚的脾臟組織0.5g，采用BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit(BIPoFlux公司)進行組織DNA的提取純化，制備成用于LAMP反應的DNA樣品模板。
2、 配制LAMP反應體系
取上述制備的DNA樣品模板1 pL，加入如下反應體系中引物F3和B3各0. 2pmol/L，內(nèi)引物5'BIPotin-labeledFIP和BIP各1.6 pmol/L，環(huán)引物LF和LB各0.4l^mol/ L ， dNTPs 0.96 mmol/ L， Tris-HCl (pH 8.8) 20 mmol/ L， KCl 10 mmol/ L， MgS046.5 mmol/ L， (NH4)2S04 10 mmol/ L， 0.1 % Triton x-100， 8 U DNA聚合酶大片段，加入雙蒸水使反應總體積達25 pL。其中質(zhì)粒pT-DPOL作為陽性對照，雙蒸水作為陰性對照。
3、 按照反應程序進行LAMP擴增反應，擴增反應溫度為65'C擴增反應溫育時間為20 min。
4、 判斷LAMP檢測結(jié)果
LAMP擴增結(jié)束后，將20pmol的FITC-probe加入反應體系中63°C溫育5 min雜交，取8 nL雜交液加入100 Buffer混勻，將LFD試紙條浸入其中，觀察檢測帶是否顯色。如果檢測帶顯色表示該樣品的傳染性脾腎壞死病毒的檢測結(jié)果為陽性，如果不顯色表示該樣品的傳染性脾腎壞死病毒的檢測結(jié)果為陰性。
同時，上述檢測結(jié)果PCR的檢測結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，經(jīng)ISKNV的PCR檢測方法確定為陽性的樣品，LAMP檢測方法均能檢測到ISKNV的存在。
根據(jù)以上試驗結(jié)果表明，LAMP-LFD結(jié)合技術(shù)能夠為ISKNV提供簡便、快速、靈敏的現(xiàn)場檢測。
權(quán)利要求
1、傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法，其特征在于包括下述步驟(1)DPOL基因純化克隆和測序用母本質(zhì)粒將ISKNV-的DNA聚合酶基因純化克隆至重組質(zhì)粒并進行ISKNV-DPOL基因測序分析，測得的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列如下1ATGGATAGTG TGTACATCTA TCAGTGGCTC TATGCTAACT ATGAGGTGCG51 TGGCTACGGC ATAGCCCCAA ACAACACTGT AGTGTGTGTT CGTGTGCCCA101 ACTTTAAGCA AGTGGTGTAT GTCGAATGCA CCGACCCACA ACAGCATGAC151 CCACGTTCCA CATTCACCCA GCACGGGTTC AGGGTCTATG AGACGCCCCG201 GGCGTGTAGC CTGTATGGCG CAAAGGGGGT GGGCACATAC TTTGCCGCAC251 GCGTGCCCAA CTACAATGCC ATGCGCGATG TACAGGAGAC ACAGGGTGCA301 TTTAAGATAC ATGAGTCGCG TGTTAGCAAG ACGATGGAGT TCACAGCACG351 CGCCGGCCTG CCGACCGTTG GCTGGATACA GGTGTCGCAG CGATGTGTGG401 TGACGCGCAC TGTAACAATG GCAGCCAAAG AGTACATGGT GCCTAACTGG451 CGTACCGATG TCAGGCCGGC CCCGGACATG GAGGGCGTGC CGCCGGCAAA501 GATTGTTTAC TTTGACATTG AGGTCAAGTC CGACCATGAA AACGTGTTCC551 CCAGTGACAG GGACGACGAG GTGATATTTC AGATAGGCCT GGTGCTGTGT601 AGTGGCAACA CGGTGCTGCG CACTGACCTT CTCTCCTTGC CCGGCCGCGA651 TTACGACGAC TCTGTGTACC AGTACGCCAC AGAAGGCGAG CTGCTGCACG701 CATTCATAGC CTACATCAGG GAACACGAGG TGGTGGCTGT GTGTGGCTAC751 AACATCATGG GCTTTGACAT ACCGTACATT ATCAAGAGGT GCGCACGCAC801 CTCCATGCTG GGCACCCTCA GGCGCATCGG CTTTGATAAC CGCAGGCTGG851 CCATAGAGAA GACGGCCGGT GTCGGCTACG CAAAGATGAC ATACATACAA901 TGGGAAGGCG TCTTGACAAT AGATCTGATG CCCATTATCA TGATGGATCA951 CAAGCTCGAC TCGTACAGCC TGGACTATGT GGCCAACCAC TTTGTCAAGG1001 CGGGCAAGGA CCCCATTCGC CCCAGGGACA TCTTTCACGC CTATAACACG1051 GGCATGATGG CACGCGTGGG GCGCTACTGT GTGAAGGACA CGCAGCTGTG1101 CAAGCAACTG GTCGACTACC TCAATACGTG GGTGGCGCTG TGCGAGATGG1151 CCGGCGTGTG TAACACATCC ATTATGCAAC TGTTTACCCA GGGCCAGCAG1201 GTCCGGGTGT TTGCGCAGAT CTATCGTGAC TGCACGCCAA TGGACGTGGT1251 CGACAAGGTG TATGTCATTC CGGATGGTGG CTGTGACTCG GATGTGGTGT1301 CCCCTTCGTC ATATACGGGC GCATATGTGT ATGAGCCGGT GCCCGGCGTG1351 TACAAGAACG TGATACCCAT GGACTTCCAG AGCCTGTATC CGAGCATCAT1401 CATATCCAAG AACATATGCT ACAGCACCTT GGTGGACCAG GGCGGCGAAG1451 AGTATGCGTG GCAAGAGCAC GAAGGCTGCG AGCACGACCC GCAGTATGCA1501 AAACAACACG CCCTTGGCAT CGAGATTGGT GTCTTGCAAT GCAACATGGC1551 AGCGCTTCCG CGACGCGCCA CCCAAGAGCG GGCCAGGCTG CGTGAGCGCA1601 TAGCAGACAT GAAGATCCAG TATGCTAGCA TGACACCTGC GGCAGTCAAG1651 TGTAACGTCT TCAGCTTCAG GTTCACGCAT GCTCACGAAG GCGTGCTGCC1701 ACGTGTGCTC CGTAACCTGC TGGAGAGCAG GGCCCGCATA CGGGCGCGCA1751 TCAAGACCAC AGACGACCCC GACATTAGGG CAGTTCTGGA CAAGAGGCAG1801 CTGGCGTACA AGATAAGCGC CAACTCGGTG TACGGCACCA TGGGCACGCA1851 GAGGGGCTAC CTGCCGTTTA TGGCGGGGGC AATGACGACG ACGTACTGTG1901 GCCGCAAGCT GATTGAGAAG GCCGCTCATC TCCTTAAGAC GGTGGTGGGC1951 GCTACCATTG TGTACGGCGA CACCGACTCG TGCTACATAC AGCTGGGCCA2001 CGACCGCGCA TCACTCGATG AACTGTGGCA GATGGCCGTG AACGCCAGCG2051 ACACCGTGTC GGCCTTCTTT GAGCGCCCGG TGCGCCTCGA GTTTGAGCAG2101 TGCATCTACA CCAAGTTTAT CATCTTCACC AAGAAACGTT ATGTGTACAG2151 GGCATTCACA CGCGACGGCA AGCAGCGAAC AGGCAGCAAG GGTGTGATGC2201 TGTCCAGACG CGACAGCGCC ATGTGTGCCA GAAACACGTA TGCGGCAATC2251 ATGAACACGA TCCTTGAGGG ATCTGCAGAT GTGCCGTTCA TTGCCGCGTG2301 CATGATGCAC GACATGATGA TACCGGGAGC GCTTCAAGAC GACGACTTTG2351 TGCTGACAAA GAGTGTGCAG GACATTGGCA ATGGGGACGA TAACAACCAG2401 GGCTCGTACA AAGTCAGGAA TCCACAGAAG GCGCAGGCGG CGGCCACCCA2451 AAGGGTAGCC CCGGACGATG CCGAAGGGTA CGCCATCGCG CTGCGGCAGG2501 AAATGGTGAA GCAGATGCCT GCGCAGGCAC AATTGGCAGA GCGCATGAGA2551 CTGCAGGGCC GCGCCGTGGT CAGTGGCGCT CGCATCGAGT ATGTCGTTCT2601 TAAGCACCAA TATGGTGTGC CTGAGGGCGC CCTGGGGGCA AGGCTGTTGG2651 ATTTTGAGCG GTGGCGCGAA ATGAAGGTGG CCTATCCACT GGATCGGCTG2701 TACTACATGA AAAGTGTGGT CAACGCATGC GACCAGCTAC TTGTTACGGC2751 CGGCTACGGG CCCGTGTGCA GCAAGGTATA TGCGGCGCAC TTACAGTTGG2801 CGTACGTGCA CAAACAGTTA CTGAGACGCA CGACGCCTGC CGTATGA(2)設(shè)計LAMP的引物和探針根據(jù)上述測序得到的ISKNV-DPOL基因的核苷酸序列進行設(shè)計下述LAMP的三對引物序列和一條探針序列BIP引物5’-CATTGGCAAT GGGGACGATA ACTTTTGCCT TCTGTGGATT CCTGA-3’45FIP引物5’-CACGCGGCAA TGAACGGCAC ATTTTGCCAG AAACACGTAT GCGGC-3’45B3引物5’-GCTACCCTTT GGGTGGC-3’17F3引物5’-GACGCGACAG CGCCATGT-3’18LF引物5’-TCTGCAGATC CCTCAAGGAT-3’20LB引物5’-AACCAGGGCT CGTACAAAGT-3’20FITC-Probe探針5’-GATGCACGAC ATGATGATAC C-3’21其中FIP為5’端BIPO生物素標記引物，F(xiàn)ITC-Probe為5’端FITC標記探針；(3)配制LAMP反應體系反應體系的終濃度分別為外引物F3和B3各0.2μmol/L，內(nèi)引物FIP和BIP各1.6μmol/L，環(huán)引物LF和LB各0.4μmol/L，dNTPs0.96mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO4 6.5mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，0.1％ Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(NeW EnglandBIPolabs)和1μL樣品模板，加雙蒸水使反應體系總體積為25μL；(4)LAMP反應體系擴增將上述反應體系進行擴增反應，擴增反應溫度為61-65℃，擴增反應時間為10-60min。(5)探針雜交和LFD檢測擴增后將20pmol的FITC-probe探針加入反應體系中，63℃溫育5min，進行雜交，取8μL雜交液加入100μL buffer中混勻，然后將LFD試紙條浸入取出的雜交液顯色檢測，判斷橫向流動試紙條檢測LAMP的結(jié)果。
2、如權(quán)利要求1所述的傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法，其特征在于 步驟4中所述的最適反應溫度為65°C，最適反應時間為20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了傳染性脾腎壞死病毒的LAMP-LFD檢測方法，包括DPOL基因純化克隆和測序步驟，設(shè)計三對LAMP的引物BIP、FIP、B3、F3、LF、LB和一條探針FITC-Probe步驟，其中FIP為5’端BIPO生物素標記引物，F(xiàn)ITC-Probe為5’端FITC標記探針，配制含三對引物和樣品模板的LAMP反應體系步驟，對LAMP反應體系擴增步驟，用探針雜交然后用LFD檢測步驟，本發(fā)明具有比現(xiàn)有技術(shù)的PCR檢測ISKNV的方法具有更高的特異性、靈敏度和便捷性，并且可以在于實際生產(chǎn)中現(xiàn)場應用檢測，有利于控制魚類養(yǎng)殖中傳染性脾腎壞死病毒的傳染和暴發(fā)。
文檔編號C12Q1/70GK101624636SQ20091009958
公開日2010年1月13日 申請日期2009年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月12日
發(fā)明者丁文超, 史雨紅, 李明云, 炯 陳 申請人:寧波大學