用于快速等溫檢測豬德爾塔冠狀病毒的引物組和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于快速等溫檢測豬德爾塔冠狀病毒的引物組和方法。本發(fā)明公開了一種運用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測豬德爾塔冠狀病毒的方法，用于環(huán)境樣本、醫(yī)學(xué)樣本及衛(wèi)生防疫領(lǐng)域豬德爾塔冠狀病毒的檢測。其技術(shù)方案是以豬德爾塔冠狀病毒基因組中編碼N段區(qū)域基因序列為目的序列，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，進(jìn)行目的基因特異性擴(kuò)增，本發(fā)明只需一個恒溫裝置，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)，而且可以直接觀察結(jié)果，具有低成本、高效率、操作簡單的特點。本發(fā)明建立的豬德爾塔冠狀病毒核酸LAMP檢測方法具有特異性強、靈敏度高、方便快捷等特點，可在基層實驗室和小型實驗基地進(jìn)行，為豬德爾塔冠狀病毒檢測提供了一種新的技術(shù)與方法。
【專利說明】
用于快速等溫檢測豬德爾塔冠狀病毒的引物組和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及病毒檢驗技術(shù)，具體地說是運用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法來檢測豬德爾塔冠 狀病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] 仔豬腹瀉是影響豬群生產(chǎn)的一種常見性多發(fā)性疾病，豬傳染性胃腸炎病毒 (Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，陽DV)、豬輪狀病毒(Porcine rotovirus，PRoV)是我國流行性病毒性仔豬 腹瀉的主要病原，其中TGEV和PEDV均為冠狀病毒。2012年香港大學(xué)學(xué)者檢測到新型豬冠狀 病毒-豬德爾塔冠狀病毒（（porcine del^coronavirus,PDCoV))，基因序列分析表明為S冠 狀病毒。2012年化trick等對169份豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測的結(jié)果表明豬德爾塔冠狀病毒陽性 率為10% ;Madhaler等對美國部分地區(qū)2014年1月至2月的豬場樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果PDCoV 陽性率為30%，表明PDCoV在美國中東部普遍存在。引起仔豬腹瀉的新發(fā)現(xiàn)病原體，PDCoV已 經(jīng)引起了歐盟和世界動物衛(wèi)生組織(OIE)的重視，因此快速、準(zhǔn)確的檢測家畜血清樣品中是 否含有豬德爾塔冠狀病毒將有助于控制病毒的傳播，并為我國的養(yǎng)殖業(yè)動物及其產(chǎn)品的正 常貿(mào)易提供強有力的技術(shù)支持。
[0003] 目前，豬德爾塔冠狀病毒的檢測方法為中和試驗及巧光定量RT-PCR。中和試驗所 需檢測時間過長，費時費力;巧光定量RT-PCR對人員和設(shè)備要求較高，難于在基層實驗室普 及推廣。Notomi等開發(fā)了一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplification ,LAMP)，其特點是在等溫條件（65 °C左右）下作用60min左右即 可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，更為重要的是此方法不需要貴重的儀器和試劑，在水浴鍋中就能完 成反應(yīng)，特別適合在野外現(xiàn)場和基層部口應(yīng)用。近年來，LAMP法已被成功地用于診斷發(fā)生于 人類和動物的病毒性疾病，成為檢測多種致病病毒的有效工具。我們建立了一種運用環(huán)介 導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測豬德爾塔冠狀病毒的方法，用于食品及原料、環(huán)境樣本、進(jìn)境種 豬血清樣品中豬德爾塔冠狀病毒的檢測。其技術(shù)方案是W豬德爾塔冠狀病毒基因組中編碼 N段區(qū)域基因序列為目的序列，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，進(jìn)行目的基因特異性擴(kuò)增， 本發(fā)明只需一個恒溫裝置，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)，而且可W直接觀察結(jié) 果，具有低成本、高效率、操作簡單的特點。
[0004] 本發(fā)明建立的豬德爾塔冠狀病毒核酸LAMP檢測方法具有特異性強、靈敏度高、方 便快捷等特點，可在小型實驗基地進(jìn)行，為豬德爾塔冠狀病毒檢測提供了一種新的技術(shù)與 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了提高動物疫病檢測效率，節(jié)約時間，W解決傳統(tǒng)檢測方法無法滿足進(jìn)出口動 物日益增長的現(xiàn)狀，本發(fā)明經(jīng)過實驗檢測，終于探索出一種運用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測豬 德爾塔冠狀病毒的方法，該方法具有檢測快速、便捷、低成本、適合在野外現(xiàn)場和基層部口 應(yīng)用等特點。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供了一種應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測豬德爾塔冠狀病毒的方 法。
[0007] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] -套檢驗豬德爾塔冠狀病毒的引物，其特征在于:通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測 豬德爾塔冠狀病毒的引物組，序列為：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4，上述引物可W檢測到至少10個拷貝的豬德爾塔冠狀病毒。
[0009] 上述引物在制備用于檢驗豬德爾塔冠狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] -種用于檢驗豬德爾塔冠狀病毒的試劑盒，包括：
[0011] (1)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括擴(kuò)增體系中各成分的組成；
[0012] (2)按照比例混合沈Q ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4。
[0013 ] (3)陽性標(biāo)本對照、陰性標(biāo)本對照；
[0014] (4)使用說明書。
[0015] 上述試劑盒中還包括SYBR Green I染料，加入到產(chǎn)物中可W在紫外燈和日光下觀 察反應(yīng)管顏色變化。
[0016] 利用上述試劑盒進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測豬德爾塔冠狀病毒方法，包括：
[0017] (I)RNA的提取及CDNA的制備
[0018] 取樣本，將病毒滅活后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，-2(TC備用；
[0019] (2)豬德爾塔冠狀病毒N段基因區(qū)的檢測
[0020] 化L cDNA樣品、5化Bst DNA聚合酶緩沖液（IOX)、化L Bst DNA聚合酶（8000U/ L)、扣L dNTP(10mmol/L)、3化 Betaine(5mol/L)、6化 MgS04(25mmol/L)、對應(yīng)于N段基因的 引物如權(quán)利要求1所述的沈Q ID N0:1、沈Q ID N0:2各化L、沈Q ID N0:3、SEQ IDN0:4各0.5 化、1祉L肥0,混勻；
[0021] (3)恒溫水浴或熱塊擴(kuò)增或任何保溫材料60°C~65°C，30min~90min;
[0022] (4)擴(kuò)增產(chǎn)物采用巧光染料法同步檢測。
[0023] 上述方法能夠檢測到至少10個拷貝的豬德爾塔冠狀病毒。
[0024] 該方法在檢測食品及原料、環(huán)境樣本、進(jìn)境種豬血清樣品中豬德爾塔冠狀病毒方 面的用途?？蒞在基層或小型實驗基地進(jìn)行，同時也可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評價等方面。
【附圖說明】
[002引圖1 N段基因 LAMP擴(kuò)增電泳結(jié)果（iaoobp Marker;2，N基因；3,陰性對照）；
[0026] 圖2 N段基因 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切圖（iaOObp Marker;2，N基因；3,酶切結(jié)果）；
[0027] 圖3 LAMP擴(kuò)增可見光結(jié)果（1，N基因；2,陰性對照）；
[002引圖4 LAMP擴(kuò)增紫外光結(jié)果（1，N基因；2,陰性對照）；
[0029] 圖5 N基因檢測靈敏度（iaoobp Marker;2，l〇7copiesAiL，；3，l〇6copies/化;4， 10己copies/化;5, l〇4copies/]iL;6, l〇3copies/化;7, l〇2copies/]iL;8, l〇icopies/]iL 9,10°) copies/uL；
[0030] 圖6特異性試驗（I，IOObp Marker; 2，陰性對照;3，N基因；4，豬傳染性胃腸炎病毒； 5，豬流行性腹瀉病毒;6，豬輪狀病毒;7，口蹄疫病毒;8水泡性口炎病毒，）。
【具體實施方式】
[0031] 現(xiàn)在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明。但是應(yīng)當(dāng)理解， 下面的實施例僅僅是作為例證的，不應(yīng)W任何方式當(dāng)作對上述本發(fā)明總體的限制。除非有 其它說明，本發(fā)明的實施例使用本領(lǐng)域中的分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)。運些技術(shù)是技術(shù)人員熟 知的，并在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。
[0032] 材料和方法
[0033] 1.1 材料
[0034] 總RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、Bst DNA聚合酶、M-M化V反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制 劑、Dpn II內(nèi)切酶購自肥B公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞購自 TIANGEN公司；Be化ine(甜菜堿）、MgS04購自Sigma公司。
[0035] 1.2引物的設(shè)計與合成
[0036] 根據(jù)登錄于GenBank數(shù)據(jù)庫的豬德爾塔冠狀病毒N段基因序列，應(yīng)用生物學(xué)軟件進(jìn) 行序列比對，在N段基因的保守區(qū)設(shè)計了2對引物(外引物和內(nèi)引物），引物的合成修飾由英 俊公司完成，序列見表1。
[0037] 表1引物和探針序列 [00；3 引
[0039] 1.3 RNA的提取及cDNA的制備
[0040] 取經(jīng)DEPC水處理過的EP管，加入ImL TRIzol和200化病毒液，混勻后室溫放置 Smin;加入20化L氯仿，用力搖晃30s，室溫靜置3min，4°C離屯、15min，得到分層液;取上層液 移入干凈的EP管，加入50化L異丙醇，-20°C靜置30min，4 °C離屯、15min;移去上層懸液;加入 1血75%的DEPC乙醇，滿旋振蕩，4°C離屯、IOmin;去上清，空氣中干燥5min;向試管中加入50 化DEPC水。參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶過程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到CDNA，-20°C備用。
[0041 ] 1.4陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0042] 利用針對豬德爾塔冠狀病毒N段基因的特異性引物，將CDNA在50化體系中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物純化后克隆到pGEM-T easy載體中并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì) 胞中，從純化擴(kuò)增的重組菌中提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，選取陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行測序，從而 為檢測提供陽性質(zhì)粒，并利用此陽性質(zhì)粒對LAMP方法進(jìn)行優(yōu)化。
[0043] 1.5豬德爾塔冠狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法檢測
[0044] 經(jīng)過摸索和優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立如下擴(kuò)增反應(yīng)體系：2化cDNA樣品、5化Bst DNA聚合酶緩沖液（10X)、化LBstDNA聚合酶（8000U/L)、扣LdNTP(10mmol/L)、化L Betaine巧mol/L)、6化MgS04(25mmol/L)、對應(yīng)于N段基因的引物FIP和BIP各化L、F3和B3各 0.5化、1祉L肥0。混勻，65 °C，水浴1.化。
[0045] 1.6擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測
[0046] LAMP反應(yīng)結(jié)束后，取化L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳;其余擴(kuò)增產(chǎn)物采用 巧光染料法同步檢測，向擴(kuò)增管中加入化L 50倍稀釋的SYBR Green I染料，在紫外燈和日 光下觀察反應(yīng)管顏色變化?；厥誑段基因的陽性產(chǎn)物，進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系:祉LN基因回 收產(chǎn)物、化L Dpn II內(nèi)切酶、2化內(nèi)切酶緩沖液（10 X )、9化肥0;混勻，37°C，水浴化。同時WN 基因的回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測序。
[0047] 1.7豬德爾塔冠狀病毒N段基因的檢測靈敏度
[0048] 取陽性質(zhì)粒DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度，10倍系列稀釋后，進(jìn)行豬德爾塔冠 狀病毒N段基因的靈敏度檢測試驗。具體試驗方案參照LAMP的常規(guī)操作程序進(jìn)行。
[0049] 1.8特異性試驗
[0050] 分別W豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、口蹄疫病毒、水泡 性口炎病毒核酸作為待測樣品，W所提取的豬德爾塔冠狀病毒N段基因質(zhì)粒DNA為陽性對 照，W經(jīng)DEPC處理的水為陰性對照，檢驗方法的特異性。
[0化1]實施例1
[0052] 豬德爾塔冠狀病毒N段基因的擴(kuò)增
[0053] 取樣本，提取病毒基因組后，參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶過程進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到CDNA，利 用特異性引物對豬德爾塔冠狀病毒N段基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)擴(kuò)增后得到S段基因1029bp，與理 論擴(kuò)增值相符。
[0054] 實施例2
[0055] 豬德爾塔冠狀病毒LAMP方法的檢測
[0056] 1.1凝膠電泳結(jié)果觀察
[0057] 經(jīng)過摸索和優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立針對豬德爾塔冠狀病毒N段基因的LAMP檢測方 法，檢測結(jié)果如圖1所示，N段基因區(qū)的擴(kuò)增結(jié)果中核酸電泳條帶呈階梯狀分布，與理論結(jié)果 相符，陰性對照未見特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。
[0化引1.2擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定
[0059] 回收N段基因的陽性擴(kuò)增產(chǎn)物，應(yīng)用化n II內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果如圖2所示， N基因經(jīng)過酶切后電泳結(jié)果為164bp和45bp條帶，與理論結(jié)果相符，未經(jīng)酶切的陽性擴(kuò)增產(chǎn) 物仍為階梯狀條帶。
[0060] 1.3染料法結(jié)果觀察
[0061 ] LAMP方法擴(kuò)增產(chǎn)物中加入化L 50倍稀釋的SYBR Green I染料，在紫外燈和日光下 觀察反應(yīng)管顏色變化。圖3所示，N段基因陽性擴(kuò)增管在可見光下呈黃綠色，陰性對照為橘紅 色。圖4中，N段基因陽性擴(kuò)增管在紫外光下可見巧光產(chǎn)生，陰性對照管內(nèi)無巧光產(chǎn)生?；厥誑 段基因的陽性產(chǎn)物，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增后測序得知，擴(kuò)增序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬德爾 塔冠狀病毒N段基因一致，表明LAMP方法特異性的擴(kuò)增檢測豬德爾塔冠狀病毒N段基因。
[0062] 實施例3
[0063] 豬德爾塔冠狀病毒N段基因的檢測靈敏度
[0064] 取陽性質(zhì)粒DNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度，10倍系列稀釋后，進(jìn)行豬德爾塔冠 狀病毒N段基因的靈敏度檢測試驗。圖5中所示豬德爾塔冠狀病毒N段基因10拷貝W上的稀 釋度均顯示了典型的LAMP擴(kuò)增帶型，說明該檢測方法的靈敏度可達(dá)到10個拷貝的水平。 [00化]實施例4
[0066] 特異性試驗
[0067] 分別W豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒、口蹄疫病毒、水泡 性口炎病毒核酸作為待測樣品，W所提取的豬德爾塔冠狀病毒N段基因質(zhì)粒DNA為陽性對 照，W經(jīng)DEPC處理的水為陰性對照，檢驗方法的特異性。結(jié)果如圖6所示，陽性對照和陰性對 照均成立，W豬德爾塔冠狀病毒所構(gòu)建的質(zhì)粒DNA呈陽性，其他試驗樣品呈陰性，表明試驗 所用引物對豬德爾塔冠狀病毒特異性良好。
[0068] 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是一種新的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)，原理是在目的基因片 段上的多個位點上設(shè)計4條或6條引物，通常只要4條引物即可完成目的基因的擴(kuò)增，如果加 入另外兩條環(huán)引物，可W有效的加速整個反應(yīng)過程，但反應(yīng)體系內(nèi)引物的增多也會增加引 物二聚體的形成。LAMP反應(yīng)結(jié)果判別方法多樣，目前常用的有電泳法、巧光法、濁度法和巧 黃綠素法。濁度法和巧黃綠素法是基于LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的大量焦憐酸鹽副產(chǎn)物進(jìn)行檢測的方 法，因此運巧巾方法均存在一定程度的背景干擾，且干擾強度隨反應(yīng)時間延長而增加；電泳 法和巧光法利用雙鏈嵌合染料直接檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，因此背景更低，其中巧光法的陽性、陰性 可用肉眼區(qū)分，對操作人員的技術(shù)要求低，更適合于現(xiàn)場快速檢測。
[0069] 本文采用LAMP技術(shù)建立了檢測豬德爾塔冠狀病毒核酸的檢測方法，通過與文獻(xiàn)報 道的實時巧光RT-PCR法相比較，兩種方法的檢測靈敏度相當(dāng)，將IO 7復(fù)制的病毒量質(zhì)粒進(jìn)行 10倍系列稀釋后，應(yīng)用本文建立的LAMP方法檢測靈敏度為10個拷貝；從檢測時間上看LAMP 完成1次檢測可在1.化內(nèi)完成，而實時巧光RT-PCR法則需要化。從所需儀器上看實時巧光 RT-PCR需要巧光定量PCR儀，而LAMP只需恒溫水浴鍋。
[0070] 綜上所述，本研究建立的豬德爾塔冠狀病毒核酸LAMP檢測方法具有特異性強、靈 敏度高、方便快捷等特點，可在基層或小型實驗基地進(jìn)行，同時也可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生 評價、臨床診斷等方面，為豬德爾塔冠狀病毒檢測提供了一種新的技術(shù)與方法。
【主權(quán)項】
1. 一套檢驗豬德爾塔冠狀病毒的引物，其特征在于:通過環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測豬 德爾塔冠狀病毒的引物組，序列為：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4,上述引物可以檢測到至少10個拷貝的豬德爾塔冠狀病毒。2. 權(quán)利要求1所述的引物在制備用于檢驗豬德爾塔冠狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。3. -種用于檢驗豬德爾塔冠狀病毒的試劑盒，包括： (1) 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括擴(kuò)增體系中各成分的組成； (2) 按照比例混合的權(quán)利要求1所述的SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4。 (3) 陽性標(biāo)本對照、陰性標(biāo)本對照； (4) 使用說明書。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中還包括SYBR Green I染料，加入到產(chǎn)物中可以在 紫外燈和日光下觀察反應(yīng)管顏色變化。5. 利用權(quán)利要求1的引物或權(quán)利要求3的試劑盒進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測豬德爾塔冠 狀病毒方法，包括： (1) RNA的提取及cDNA的制備 取樣本，將病毒滅活后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，-20°C備用； (2) 豬德爾塔冠狀病毒N基因區(qū)的檢測 2yL cDNA樣品、5yL Bst DNA聚合酶緩沖液（10X)、2yL Bst DNA聚合酶（8000U/L)、5yL dNTP(10mmol/L)、3yL Betaine(5mol/L)、6yL Mg S04(25mmol/L)、對應(yīng)于N段基因的引物如 權(quán)利要求 1 所述的SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2各4yL、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4各0.5yL、18 yL H20,混勻； (3) 恒溫水浴或熱塊擴(kuò)增或任何保溫材料60 °C~65 °C，30min~90min; (4) 擴(kuò)增產(chǎn)物采用熒光染料法同步檢測。6. 如權(quán)利要求5所述方法能夠檢測到至少10個拷貝的豬德爾塔冠狀病毒。7. 如權(quán)利要求5所述方法在檢測食品及原料、環(huán)境樣本、進(jìn)境種豬血清樣品中豬德爾塔 冠狀病毒方面的用途。8. 如權(quán)利要求5所述方法可以在基層或小型實驗基地進(jìn)行，可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測、衛(wèi)生評 價等方面。
【文檔編號】C12Q1/70GK105861744SQ201610188527
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月24日
【發(fā)明人】王乃福, 陳小金, 吳冬雪, 黃晨, 陳本龍, 董志珍, 趙祥平, 王玉玲, 王建華
【申請人】天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心