專利名稱：一株來自汽車排氣管的耐高溫的好氧反硝化細(xì)菌c-2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)微生物領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種優(yōu)良微生物的選育。
背景技術(shù)：
反硝化細(xì)菌是指能夠?qū)03_還原為氣態(tài)氮的細(xì)菌，多為異養(yǎng)、兼性厭氧細(xì)菌，如反 硝化桿菌、斯氏桿菌、螢氣極毛桿菌等。它們廣泛分布于土壤、廄肥和污水中。反硝化機(jī)理適宜的脫氮菌在有外加碳源的情況下，以氮氧化物為氮源，將氮氧化物同化合成 為有機(jī)氮化合物，成為菌體的一部分(合成代謝)，脫氮菌本身獲得生長繁殖；而異化反硝 化作用(分解代謝)則將NOx最終還原成氮?dú)?。NOx中N02和NO溶解于水的能力差別較大，因此凈化機(jī)理也不同。NO不與水反應(yīng)， 溶解度很小，亨利系數(shù)17. 1 31. 4Pa(0 30°C )，其凈化途徑可能有兩條一是NO溶解于 水；二是被反硝化細(xì)菌吸附，然后在其氧化氮還原酶的作用下被還原為N2。N02先溶于水形 成NCV、N02-及N0，化學(xué)反應(yīng)式為2N02+H20 — HN03+HN023HN02 — HN03+2N0+H20N03_在微生物硝酸鹽還原酶的作用下還原為N02_，N02_在亞硝酸鹽還原酶的作用下 再還原為N0，最后N0被吸附在微生物表面后，在氧化氮還原酶的作用下被還原為N2。脫氮微生物的種類很多且差別較大。許多屬都有脫氮種，其類型有異養(yǎng)脫氮菌、專 性自氧菌和兼性自養(yǎng)菌。其中數(shù)量最多的異養(yǎng)脫氮菌，包括無色桿菌屬(Achromobacter)、 產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、桿菌屬(Bacillus)、色桿菌屬(Chromobacterium)、棒桿菌屬 (Corynebacrerium)、鹽桿菌屬(Halobacterium)、生絲桿菌屬(Hyphomicrobium)、微球菌 屬(Micrococcus)、莫拉氏菌屬(Moraxella)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、假單胞菌 屬(Pseudomonas)、螺菌屬(Spirillum)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)。這些異養(yǎng)脫氮菌有些 是專性好氧菌，有些是兼性厭氧菌，它們在好氧、厭氧或缺氧條件下，利用有機(jī)物進(jìn)行脫氮。 此外，還有少量專性和兼性的化能自養(yǎng)菌也能還原NOx。如硫桿菌屬(Thiobacillus)中的 脫氮硫桿菌(T. denitrificans)利用無機(jī)基質(zhì)，如H2、H2S和S、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽等作為 氫受體，能在厭氧條件下利用N03_或N02_作為氫受體，使處于還原價(jià)位的含硫化合物氧化， 而把NO,和NO3-還原成N2。好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)80年代，Robert son等人報(bào)道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶系的存 在，并證實(shí)了泛養(yǎng)硫球菌Thiosphaera pantot ropha(現(xiàn)更名為脫氮副球菌Paracoccus denit rif ications)在生長過程中，02和N03_共同存在時(shí)，其生長速率比兩者單獨(dú)存在時(shí) 都高。目前，越來越多的研究證明細(xì)菌好氧反硝化的存在，并發(fā)現(xiàn)了一些在有氧條件下有較 高反硝化率的細(xì)菌。好氧反硝化細(xì)菌作用機(jī)制的電子理論
早期理論認(rèn)為，O2的得電子能力阻止了電子傳遞給N03_或N02_，從而抑制了反硝化 的進(jìn)行。而最近研究表明，細(xì)菌反硝化酶系和有氧呼吸系統(tǒng)同時(shí)存在。NO3-被還原的同時(shí)， O2被還原，氧不是抑制反硝化酶活性和反硝化酶生成的直接因素。缺少N03_或O2都會降低 細(xì)菌的生長率和反硝化率。Wilson等人提出了細(xì)菌反硝化過程中的電子傳遞模型(

圖1)。 從圖1中可以看出N03_、02均可作為電子最終受體。反硝化菌可將電子從被還原的物質(zhì)傳 遞給02，同時(shí)也可通過硝酸還原酶將電子傳遞給N03_。鑒于當(dāng)前關(guān)于好氧反硝化細(xì)菌大多從土壤或活性污泥中分離篩選，而在我國，氮 氧化物的第二大來源來自于汽車廢氣，于是申請人將取樣目標(biāo)定位在汽車排氣管，從中分 離篩選好氧反硝化細(xì)菌。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了證明微生物的分布廣，種類多，在前人的研究基礎(chǔ)上，嘗試從汽車排 氣管中分離篩選出性能優(yōu)良的好氧反硝化細(xì)菌，并且分離得到了該菌株。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基(1)富集培養(yǎng)基 SM(L) 丁 二酸鈉 2.84g、NaNO3 0. 67g, KH2PO4 1. 36g, (NH4)2SO4O. 24g、酵母粉 1. 00g、MgSO4 · 7H20 0. 19g，Iml 微量元素溶液，pH = 7. 2。(2)鑒別培養(yǎng)基 BTB(L) :L-天門冬酰胺酸 l.OOg、KNO3 1. OOg, KH2PO4 1. OOg, FeCl3 · 6H20 0. 05g、CaCl2 · 2H20 0. 20g、MgSO4 · 7H20 1. OOg, ImL 溴百里酚蘭(BTB)儲備液 (1 % 的 BTB 乙醇溶液)，瓊脂 20. 00g, pH = 7. 0-7. 3(3)菌種馴化及細(xì)菌反硝化能力測試培養(yǎng)基DM(L) 丁二酸鈉4. 72g, NaNO3O. 67g、 KH2PO4 1. 50g、Na2HPO4 0. 42g、MgSO4 · 7H20 1. 00g，2ml 微量元素溶液，pH = 7. 2，固體培養(yǎng) 基中時(shí)加入20. OOg瓊脂粉。(4)微量元素溶液(L) =CuSO4 ·5Η20 4. 00g、FeS04 ·7Η20 0. 70g、FeCl3 ·6Η207· 00g、 CoCl2 · 6H20 0. 20g、NaMoO4 · 2H20 3. 40g 和 CaCl2 · 2H20 2. 00g。(1)富集培養(yǎng)從汽車排氣管取樣品0. 5g，加入盛有50mL SM培養(yǎng)基的250mL錐形 瓶中，在30°C、120r/min條件下富集培養(yǎng)3天，將2mL培養(yǎng)物接種到新鮮的SM培養(yǎng)基，以相 同的條件進(jìn)行培養(yǎng)。如此重復(fù)3次。(2)初篩富集培養(yǎng)物在BTB培養(yǎng)基(BTB培養(yǎng)基中加入丁二酸鈉8. 50g/L)上劃 線培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)1 3天。挑取使BTB培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)色的菌落進(jìn)行復(fù)篩。(3)復(fù)篩將初篩菌落在DM培養(yǎng)基上劃線分離3次，以獲得純培養(yǎng)物，并依據(jù)菌種 在DM培養(yǎng)基的生長情況，挑選生長旺盛的菌株，之后通過測定各菌株的反硝化能力進(jìn)行復(fù) 篩，反硝化能力的檢測主要分亞硝酸鹽生成和N2、N2O等氣體生成的檢測。(4)N2, N2O等氣體生成的檢測參照細(xì)菌糖類發(fā)酵試驗(yàn)的方法進(jìn)行，即將具有反硝 化能力的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到盛有IOmL DM培養(yǎng)液、且放置有小倒管的大試管中，37°C連續(xù) 培養(yǎng)，每天觀察產(chǎn)氣情況。(5)好氧反硝化細(xì)菌的生長規(guī)律的測定在容積為250mL的錐形瓶中，加入DM培 養(yǎng)液IOOmL,接種ImL菌懸液(0D = 1)，在30°C、120r/min條件下培養(yǎng)，每隔4h取一次樣在 波長540nm處用722S型可見分光光度計(jì)測其光密度。
(6)最佳生長pH值的測定配制不同pH值的DM培養(yǎng)液，各取30mL分裝到容積250mL的錐形瓶中，接種0. 5mL菌懸液，30°C、120r/min條件下培養(yǎng)20h，以DM培養(yǎng)液作空 白，在波長540nm處測定菌懸液的光密度。(7)最佳生長溫度的測定將pH7. 2的DM培養(yǎng)液30ml置于250mL錐形瓶中，接種 0. 5mL 菌懸液，分別在 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、37°C、50°C和 60°C條件下培養(yǎng) 20h，在波 長540nm處測定其光密度值。(8)好氧反硝化細(xì)菌的形態(tài)觀察_革蘭氏染色鏡檢.本發(fā)明具有以下技術(shù)效果1、分離篩選得到好氧反硝化細(xì)菌功能性菌株C-2。2、菌株C-2在培養(yǎng)的12h內(nèi)已經(jīng)進(jìn)入了對數(shù)生長期，其生長速度較快，從20h開始 進(jìn)入穩(wěn)定生長期。3、菌株C-2在pH5. 0-8. 5范圍內(nèi)的生長良好，最適生長pH值為6. 7-7. 5。4、菌株C-2在50°C條件下，0D值最大，生長狀況最佳，屬于耐高溫菌。經(jīng)試驗(yàn)，該 菌株在90°C的環(huán)境下能生長。5、經(jīng)革蘭氏染色可知，菌株C-2為革蘭氏陰性短桿菌，菌體兩端渾圓，單獨(dú)分散排 列。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明詳細(xì)說明。實(shí)施例1 工藝流程取樣一富集一初篩一復(fù)篩一N2、N20等氣體生成的檢測一好氧反硝化細(xì)菌的生長 規(guī)律的測定一最佳生長PH值的測定一最佳生長溫度的測定一好氧反硝化細(xì)菌的形態(tài)觀察 —得到好氧反硝化細(xì)菌C-2。
權(quán)利要求
一株來自汽車排氣管的耐高溫的好氧反硝化細(xì)菌C 2，其特征在于是由汽車排氣管中取樣分離篩選的。
2.針對權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其特征在于菌株C-2在培養(yǎng)的12h內(nèi)已經(jīng)進(jìn)入了對數(shù) 生長期，其生長速度較快，從20h開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期。在pH5. 0 8. 5范圍內(nèi)的生長良好， 最適生長PH值為6. 7 7. 5。在50°C條件下，生長狀況最佳，屬于耐高溫菌。經(jīng)試驗(yàn)，該菌 株在90°C的環(huán)境下能生長。經(jīng)革蘭氏染色可知，菌株C-2為革蘭氏陰性短桿菌，菌體兩端渾 圓，單獨(dú)分散排列。
全文摘要
本發(fā)明為一株來自汽車排氣管的耐高溫的好氧反硝化細(xì)菌C-2。其分離篩選方法是取樣、富集、初篩、復(fù)篩、N2、N2O等氣體生成的檢測、好氧反硝化細(xì)菌的生長規(guī)律的測定、最佳生長pH值的測定、最佳生長溫度的測定以及好氧反硝化細(xì)菌的形態(tài)觀察。其性能是菌株C-2在培養(yǎng)的12h內(nèi)已經(jīng)進(jìn)入了對數(shù)生長期，其生長速度較快，從20h開始進(jìn)入穩(wěn)定生長期。pH值在5.0～8.5范圍內(nèi)的生長良好，最適生長pH值為6.7～7.5。溫度在50℃條件下，生長狀況最佳，屬于耐高溫菌。經(jīng)試驗(yàn)，該菌株在90℃的環(huán)境下能生長。經(jīng)革蘭氏染色可知，為革蘭氏陰性短桿菌，菌體兩端渾圓，單獨(dú)分散排列。通過此菌株的性能檢測，可以看出，將此菌株應(yīng)用于工業(yè)廢棄的處理之上，會獲得巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而從長遠(yuǎn)意義上講，將會對環(huán)境保護(hù)工作起到一定程度的推動(dòng)作用。
文檔編號C12N1/20GK101988042SQ20091007007
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者李建穎, 林翠儀, 池凌鈺 申請人:天津市玄真生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司