專利名稱：：分選蛋白33在腫瘤治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分選蛋白33(SortingNexin33)的表達(dá)載體的構(gòu)建以及腫瘤治療中的用途，所述分選蛋白33是分選蛋白家族的一員，目前對(duì)于分選蛋白33在細(xì)胞內(nèi)尤其是在腫瘤細(xì)胞中的功能研究的非常少。
背景技術(shù)：
：真核細(xì)胞與原核細(xì)胞的主要區(qū)別之一在于其存在多種膜型細(xì)胞器，例如具有明顯形態(tài)特征的細(xì)胞核、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體及植物中的葉綠體。除此之外，細(xì)胞質(zhì)中還存在著另一類沒(méi)有明顯特征的細(xì)胞器，它們調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)外之間重要物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和交流。內(nèi)涵體就是一類小泡集合體，它由細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)吞進(jìn)來(lái)各種各樣的物質(zhì)所組成，這些內(nèi)吞的物質(zhì)包括細(xì)胞表面受體蛋白及其結(jié)合的配體蛋白、營(yíng)養(yǎng)蛋白(例如低密度脂蛋白LDL受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等)、其他死亡細(xì)胞及侵入的微生物等(GruenbergJ，MaxfieldFR.CurrOpinCellBiol.1995,7:552-563;LemmonSK,TraubLM.CurrOpinCellBiol.2000,12:457-466)。內(nèi)涵體組成了細(xì)胞內(nèi)的分選系統(tǒng)，決定著內(nèi)吞物的命運(yùn)(GruenbergJ,MaxfieldFR.CurrOpinCellBiol.1995,7:552-563;LemmonSK,TraubLM.CurrOpinCellBiol.2000,12:457-466)。同時(shí)研究表明，內(nèi)涵體還參與了從高爾基體合成的蛋白的運(yùn)輸與回收(DahmsNM,LobelP，KomfeldS.JBiolChem.1989,264:12115-12118;KatzmannDJ,OdorizziQEmrSD.NatRevMolCellBiol.2002,3:893-905)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白在分泌及內(nèi)吞中的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，涉及到通過(guò)高度協(xié)調(diào)的膜泡系統(tǒng)的分選和傳送。這些膜泡系統(tǒng)中包括了一類富含特定磷脂(Phospholipids)的內(nèi)膜系統(tǒng)，這些磷脂有固有存在的，也有經(jīng)過(guò)細(xì)胞外信號(hào)刺激而產(chǎn)生的。在真核生物中，蛋白和脂類物質(zhì)的結(jié)合是解釋其他蛋白質(zhì)的激活和膜吸收的一個(gè)重要機(jī)制。這個(gè)過(guò)程由一些可以于磷脂特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，這些結(jié)構(gòu)域包括PH(PleckstrinHomology)、FYVE(Fablp、YOTB、Vaclp和EEA1)、ENTH(epsin氨基端同源域)、ANTH、FERM、PHD、Tubby、C2和PX結(jié)構(gòu)域。在這些結(jié)構(gòu)域中，F(xiàn)YVE和PX結(jié)構(gòu)域更多地選擇性地與Ptdlns4P結(jié)合，并且含有FYVE和PX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)主要定位在內(nèi)涵體膜上。其中，分選蛋白(SortingNexin)家族就是一類含有保守PX結(jié)構(gòu)域的蛋白(SeetLF，HongW.BiochimBiophysActa.2006,1761:878-896)。根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分選蛋白家族可以分為三類。第一類SNXPX，即只具有PX結(jié)構(gòu)域。SNXPX這個(gè)大類包括6個(gè)SNX，即SNX3、SNX10、SNX12、SNX22、SNX23及SNX24。第二類SNXPX-BAR。SNXPX-BAR這個(gè)大類包括SNX家族中已知的SNX1、SNX2、SNX4、SNX5、SNX6-9、SNX18，與新的家族基因SNX30、SNX32、SNX33(分選蛋白33)(SeetLF,HongW.BiochimBiophysActa.2006,1761:878-896)。BAR(Bin/amphiphysin/Rvs)結(jié)構(gòu)域具有形成而二聚體的能力，還可以誘導(dǎo)膜的彎曲化。因此，SNXPX-BAR這一類SNX蛋白可能因?yàn)槠鋮⑴c調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)而成為一類特殊的SNX。第三類SNXPX《'hCT。這類包括17個(gè)SNX基因，既已知的SNXll、SNX13-17、SNX19-21、SNX25-29及新家族基因SNX31(SeetLF,HongW.BiochimBiophysActa.2006，1761:878-896)。分選蛋白主要在蛋白質(zhì)的分選和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能(WorbyCA,DixonJE.NatRevMolCellBiol.2002,3:919-931)。分選蛋白33和SNX9、18在SNX家族中屬于一個(gè)亞類，在結(jié)構(gòu)上都具有保守的PX結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域和BAR結(jié)構(gòu)域。目前對(duì)分選蛋白33的研究比較少。2008年，研究者鑒定出了這個(gè)新的分選蛋白，作為APP(amyloidprecursorprotein)a分泌酶分裂的一個(gè)新的激活因子(SchobelS,NeumannS，HertweckM，etal.JBiolChem.2008,283:14257-14268)。在培養(yǎng)體系中外源表達(dá)分選蛋白33可以增加APPa分泌酶分裂的能力，但是對(duì)p分泌酶分裂的能力沒(méi)有影響，這一表型和Dynaminl抑制型突變體K44A的結(jié)果類似(SchobelS,Neumanns,HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。分選蛋白33結(jié)合到內(nèi)吞的GTPasedynamin并降低dynamin依賴性的APP的內(nèi)吞速度(SchobelS，NeumannS，HertvveckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。另外一個(gè)研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞系及非神經(jīng)細(xì)胞系過(guò)表達(dá)分選蛋白33會(huì)增加全長(zhǎng)PrP(Sc)從質(zhì)膜的脫落及緩和PrP(Sc)的內(nèi)吞過(guò)程(HeisekeA，SchobelS，LichtenthalerSF等，Traffic.2008,9:1116-1129)。在此，我們證明了在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或者抑制分選蛋白33都會(huì)使得腫瘤細(xì)胞生L<:停滯而最終死亡，說(shuō)明分選蛋白33對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起著非常重要的作用，并且這些結(jié)果可以為以分選蛋白33作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物奠定理論基礎(chǔ)，提供了腫瘤治療的新手段或新藥物的應(yīng)用方式。
發(fā)明內(nèi)容在本發(fā)明中，發(fā)明人將人的分選蛋白33(SNX33)基因(序列見(jiàn)SEQIDNO:1)的CDS構(gòu)建到帶有Myc和GFP標(biāo)簽的真核表達(dá)載體中，以便驗(yàn)證分選蛋白33(序列見(jiàn)SEQIDNO:2)在腫瘤細(xì)胞中的功能。令人驚訝的，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人分選蛋白33在腫瘤細(xì)胞系Hela或者M(jìn)CF7過(guò)表達(dá)時(shí)，與空載體形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)株相比，腫瘤細(xì)胞系Hela或者M(jìn)CF7因形成類微核的結(jié)構(gòu)而不能正常生長(zhǎng)；同時(shí)，若在腫瘤細(xì)胞系Hela或者M(jìn)CF7利用特異的shRNA載體抑制內(nèi)源性的分選蛋白33，也會(huì)使得腫瘤細(xì)胞系Hela或者M(jìn)CF7停滯在Gl期而不能正常生長(zhǎng)，并且伴隨大量細(xì)胞的調(diào)亡。因此，使用我們所構(gòu)建的分選蛋白33的過(guò)表達(dá)載體或者利用特異的shRNA載體，可以作為新的研究手段和材料應(yīng)用于腫瘤治療。圖1:顯示了SNX33的蛋A表達(dá)水平分析。通過(guò)Western-Blotting分析，我們發(fā)現(xiàn)在A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela這13株細(xì)胞系中，除了Hamp細(xì)胞系表達(dá)較少外，SNX33在大部分的細(xì)胞中均高量表達(dá)。其中GAPDH是內(nèi)參，顯示我們所用的蛋白量基本一致，SNX33蛋白過(guò)夜封閉SNX33抗體后，再檢測(cè)所分析細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，SNX33的特異條帶消失，說(shuō)明SNX33抗體所檢測(cè)到的目的條帶是SNX33蛋白。圖2:顯示了SNX33在Hela細(xì)胞中不能形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)株。將融合有GFP的SNX33和對(duì)照載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，24小時(shí)后分至100mm大盤(pán)中篩選。篩選6天后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照細(xì)胞可以形成形態(tài)正常的克隆，而SNX33卻因?yàn)椴荒苄纬煽寺《饾u死亡。A:形態(tài)觀察分析；B:細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析。圖3:A顯示了過(guò)量表達(dá)SNX33在Hela細(xì)胞中形成微核現(xiàn)象。將融合有GFP的SNX33同對(duì)照載體分別轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中，24小時(shí)后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，GFP-SNX33轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞60%左右的細(xì)胞核異常，形成類似于微核的現(xiàn)象，而這種現(xiàn)象并沒(méi)有伴隨DNA含量的增加；B顯示了激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，GFP-SNX33轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞60n/。左右的細(xì)胞核異常，形成類似于微核的現(xiàn)象圖4:顯示了抑制內(nèi)源性SNX33的細(xì)胞形態(tài)分析。我們?cè)贖da和MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染了對(duì)照載體及抑制載體shRNA,用潮霉素進(jìn)行篩選，7天后觀察發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性SNX33被抑制后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了很大的改變，變成類神經(jīng)樣細(xì)胞，即狹長(zhǎng)而多觸角。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在內(nèi)源性SNX33被抑制后，這種類似神經(jīng)樣的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的60-80%;對(duì)照細(xì)胞中，這種類神經(jīng)樣的細(xì)胞僅占總細(xì)胞數(shù)的5-10%。圖5:顯示了抑制內(nèi)源性SNX33的WesternBlotting分析。我們?cè)贖ela和MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染了對(duì)照載體及抑制載體shRNA，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用潮霉素進(jìn)行篩選，7天后WesternBlotting分析。其中，檢測(cè)一抗為我們自制的多克隆抗體SNX33抗體，并以GAPDH作為內(nèi)參。WesternBlotting結(jié)果顯示，shRNAl都可以很好的抑制Hela和MCF7細(xì)胞中內(nèi)源的SNX33的表達(dá)。圖6:顯示了抑制內(nèi)源性SNX33的細(xì)胞周期分析。我們?cè)贖ela和MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染了對(duì)照載體及抑制載體shRNA，用潮霉素進(jìn)行篩選，7天后進(jìn)行細(xì)胞周期分析。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，內(nèi)源性SNX33被抑制后，細(xì)胞的G1期明顯增加(Hela細(xì)胞，從51.28%增加到59.05%;MCF7細(xì)胞，從48.68%增加到63.66%)，S期相對(duì)的降低(Hela細(xì)胞，從40.15%增加到34.84%;MCF7細(xì)胞，從37.77%增加到29.73%)。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，內(nèi)源性SNX33被抑制后，細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯了圖7:顯示了抑制內(nèi)源性SNX33的細(xì)胞凋亡分析。我們?cè)贖ela和MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染了對(duì)照載體及抑制載體shRNA，用潮霉素進(jìn)行篩選，7天后進(jìn)行細(xì)胞凋亡那分析。凋亡結(jié)果顯示，內(nèi)源性SNX33降低后，細(xì)胞的凋亡水平顯著增加(Hela細(xì)胞，從27.16%增加到42.33%;MCF7細(xì)胞，從37.38%增加到63.98%)。其中，對(duì)照載體的凋亡率相對(duì)較高的原因，可能是因?yàn)榧?xì)胞處于潮霉素篩選所致。具體實(shí)施方式-如上文所述，本文中使用的分選蛋白33是分選蛋白家族的一員，具有傳統(tǒng)分選蛋白所具有功能，即在蛋白的分選和運(yùn)輸中發(fā)揮著功能(SchobelS,NeumannS，HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268;HeisekeA，SchobelS，LichtenthalerSF等，Traffic.2008,9:1116-1129))。本文中使用的SNX33基因可以來(lái)自包含其的任何動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選來(lái)自人。本文中使用的腫瘤細(xì)胞系可以是現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)分離建立的任何腫瘤細(xì)胞系，優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)自人，最優(yōu)選是Hela或者M(jìn)CF7。本發(fā)明還涉及使用SNX33基因抑制腫瘤細(xì)胞系增殖的方法，所述方法包括(a)調(diào)整腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源SNX33的表達(dá)水平；(b)在適合于腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)步驟(a)中得到的腫瘤細(xì)胞；(c)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)狀況；其中所述檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的狀況包括觀察(b)中腫瘤細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)(b)中的腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)情況、檢測(cè)(b)得到的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期情況；或者檢測(cè)(b)得到的腫瘤細(xì)胞系的調(diào)亡情況。本文所述的調(diào)整腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源SNX33的表達(dá)水平可以通過(guò)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)SNX33基因或者抑制內(nèi)源性SNX33基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在本文中使用時(shí)，可以通過(guò)將外源SNX33編碼基因引入腫瘤細(xì)胞系中來(lái)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)SNX33基因?；蛘?，可以通過(guò)將抑制SNX33基因的內(nèi)源表達(dá)的核苷酸序列引入腫瘤細(xì)胞系來(lái)抑制內(nèi)源性SNX33基因。抑制SNX33基因內(nèi)源表達(dá)的核苷酸序列可以是siRNA或者shRNA?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域己知的任何手段將SNX33的編碼基因或者抑制內(nèi)源性SNX33的shRNA引入腫瘤細(xì)胞系，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、基因槍、病毒(例如腺病毒)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔等。優(yōu)選地使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。本文中使用的shRNA是指能夠抑制內(nèi)源性分選蛋白33的短發(fā)卡狀RNA，它可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)分選蛋白33的核苷酸序列容易地設(shè)計(jì)。本文所使用的一個(gè)實(shí)例是由德國(guó)弗萊堡大學(xué)的StefanF.Lichtenthaler博士贈(zèng)送的shRNA(序列見(jiàn)SEQIDNO:3)。在本文中所提及的觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)可以應(yīng)用顯微鏡鏡下觀察，例如應(yīng)用奧林巴斯顯微鏡鏡下觀察。在本文中提及的檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況是指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代過(guò)程中在顯微鏡鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的過(guò)程。例如，在本文的實(shí)施例中，在1640(GIBCO)中添加10°/。FBS(Hyclone)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)及傳代的過(guò)程，并在奧林巴斯顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)等。'在本文中提及的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期情況是指檢測(cè)細(xì)胞周期的任何方法所能檢測(cè)的細(xì)胞周期。例如，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)。在本文下文所述的一個(gè)實(shí)施例中，在1640(GIBCO)中添加10%FBS(Hyclone)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系，在達(dá)到分析要求時(shí)利用細(xì)胞周期試劑盒(CycletestPlusDNAReagentKit,BD公司)進(jìn)行消化和PI染色，然后利用流式細(xì)胞分析儀(FACScalibur，BD公司)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。在本文中提及的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的凋亡情況是指能夠檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的任何方法。例如，通過(guò)凋亡試劑盒，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的細(xì)胞凋亡情況。在本文中的一個(gè)實(shí)施例中，在1640(GIBCO)中添加10%FBS(Hyclone)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞系，并將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞系，篩選培養(yǎng)后，用調(diào)亡試劑盒(PEAnnexinVApoptosisDetectionKitI，BD公司)進(jìn)行染色，然后在1小時(shí)內(nèi)利用流式細(xì)胞儀(FACScalibur,BD公司)進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況分析。特別地，將SNX33編碼基因或者特異性抑制SNX33的shRNA引入腫瘤細(xì)胞系的方法可以是轉(zhuǎn)染方法，包括構(gòu)建在腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的包含SNX33基因的載體或者特異性抑制載體shRNA;以及將所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞系中。所述轉(zhuǎn)染可以通過(guò)本領(lǐng)域己知的任何方法來(lái)進(jìn)行，例如應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染等?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法構(gòu)建能在腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的包含SNX33基因的載體，優(yōu)選使用本領(lǐng)域熟知的真核細(xì)胞表達(dá)載體pCR3.1(來(lái)自hwi加gen公司)。本文所使用的腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如司徒鎮(zhèn)強(qiáng)編著的《細(xì)胞培養(yǎng)》中所述的那些培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件。本文所使用的檢測(cè)基因的方法包括本領(lǐng)域已知的任何方法，如PCR、WesternBlotting、免疫熒光、細(xì)胞周期分析等，這些方法在Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第3版(2002);CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人編著(1987))等多種參考文獻(xiàn)中均有詳細(xì)的描述。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明所述的SNX33基因或者其shRNA抑制腫瘤增殖的方法。本發(fā)明還涉及SNX33基因抑制腫瘤細(xì)胞系增殖的用途。具體地，對(duì)腫瘤細(xì)胞系增殖的抑制在上調(diào)腫瘤細(xì)胞系中SNX33表達(dá)水平時(shí)表現(xiàn)為可以使得腫瘤細(xì)胞系形成類微核現(xiàn)象而死亡；對(duì)腫瘤細(xì)胞系增殖的抑制在抑制腫瘤細(xì)胞系中SNX33表達(dá)水平時(shí)表現(xiàn)為引起腫瘤細(xì)胞系的形態(tài)變化、細(xì)胞周期停滯及凋亡率增加。在本文中使用時(shí)，類微核現(xiàn)象是指細(xì)胞的一種異常結(jié)構(gòu)。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的染色體異常產(chǎn)生的。當(dāng)子細(xì)胞進(jìn)入下一次分裂間期時(shí)，它們便濃縮成主核之外的小核，即形成了微核。本文中觀察到的細(xì)胞核異常，和微核現(xiàn)象極為類似，故稱為類微核現(xiàn)象，其能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在本文中使用時(shí)，形態(tài)變化是指腫瘤細(xì)胞的形態(tài)由正常情況下的規(guī)則的細(xì)胞形狀和大小，變?yōu)椴灰?guī)則的、多個(gè)觸角的類神經(jīng)樣細(xì)胞。在本文中使用時(shí)，細(xì)胞周期停滯是指轉(zhuǎn)染shRNA后的腫瘤細(xì)胞系的Gl期的明顯增加想象。在本文中使用時(shí)，凋亡率增加是指轉(zhuǎn)染shRNA后的腫瘤細(xì)胞系的調(diào)亡率增加。實(shí)施例下列實(shí)施例舉例了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，用于示例本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。這些實(shí)施例。根據(jù)本文公開(kāi)和本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍水平，技術(shù)人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過(guò)本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變動(dòng)、修飾和改造。其中所涉及的技術(shù)，除非特別說(shuō)明，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。實(shí)施例l:細(xì)胞系的培養(yǎng)人細(xì)胞系(A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7禾卩Hela)培養(yǎng)在添加了10%胎牛血清FBS(Hyclone)的培養(yǎng)基在37'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(參見(jiàn)QinB,HeM,ChenX等人，JBiolChem.2006,281:36891-36896)。實(shí)施例2:不同細(xì)胞系中SNX33蛋白(SEQIDNO:2)的表達(dá)情況首先將人不同細(xì)胞系(A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080，Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela)通過(guò)RIPA裂解液裂解得到蛋白裂解液。如圖1所示，通過(guò)Western-Blotting分析，我們發(fā)現(xiàn)在A549、Pro5、PC3、SPCA1、NCIH460、HT1080、Hlamp、HEK293T、HT1080、GLC82、L-78、MCF7和Hela這13株細(xì)胞系中，除了Hlamp細(xì)胞系表達(dá)較少外，SNX33在大部分的細(xì)胞中均高量表達(dá)。其中GAPDH是內(nèi)參，顯示我們所用的蛋白量基本一致，SNX33蛋白過(guò)夜封閉SNX33抗體后，再檢測(cè)所分析細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，SNX33的特異條帶消失，說(shuō)明SNX33抗體所檢測(cè)到的目的條帶是SNX33蛋白。本實(shí)施例說(shuō)明，分選蛋白33是不同細(xì)胞系中都普遍表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞系(例如Hela和MCF7)中普遍表達(dá)。實(shí)施例3:SNX33載體(SEQIDNO:l)的構(gòu)建用終體積為20ul的反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄2ug的總RNA(參見(jiàn)Pan,G等人，(2006)FasebJ20(10)，1730-1732)，得到cDNA文庫(kù)。利用表1的引物擴(kuò)增人SNX33片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收。表l:克隆SNX33片段的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用于真核表達(dá)的質(zhì)粒通過(guò)在融合有綠色熒光蛋白GFP的pCR3.1載體的多克隆位點(diǎn)EcoRV插入PCR片段構(gòu)建的，即在37'C下通過(guò)EcoRV酶切pCR3.1載體4小時(shí)，然后將從人胚腎細(xì)胞HEK293T的cDNA中擴(kuò)增的人SNX33片段，在連接酶的存在下16'C連接4小時(shí)，得到真核表達(dá)載體GFP-SNX33。實(shí)施例4:構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系、形態(tài)觀察及生長(zhǎng)曲線分析我們將融合有綠色熒光蛋白GFP的SNX33真核表達(dá)質(zhì)粒(GFP-SNX33)與對(duì)照質(zhì)粒GFP各2ug，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，之后將細(xì)胞消化并重新種入100mm的培養(yǎng)皿中觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)。圖2A顯示在轉(zhuǎn)染6天后，對(duì)照GFP陽(yáng)性的細(xì)胞可以形成均一的克隆，細(xì)胞形態(tài)和狀態(tài)良好；而轉(zhuǎn)染了SNX33的Hela細(xì)胞卻不能分裂，仍為一個(gè)單一的細(xì)胞直至死亡。同時(shí)我們檢測(cè)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(圖2B)，和從形態(tài)上觀察到結(jié)果一致，對(duì)照轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線正常，細(xì)胞數(shù)在不停的增長(zhǎng)；而SNX33轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞基本處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)隨著陽(yáng)性細(xì)胞的死t不停的減少。此結(jié)果也在MCF7胞中得到了驗(yàn)證(結(jié)果未顯示)。實(shí)施例5:過(guò)表達(dá)SNX33引起腫瘤細(xì)胞系的微核現(xiàn)象為了了解SNX33是如何來(lái)影響細(xì)胞分裂從而影響到細(xì)胞狀態(tài)的，我們仔細(xì)觀察了瞬轉(zhuǎn)后的Hela細(xì)胞。從圖3A屮我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，對(duì)照空載體GFP的Hela細(xì)胞中，表達(dá)熒光的細(xì)胞基本上正常；而轉(zhuǎn)染了融合GFP的SNX33后，帶有GFP陽(yáng)性的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中有很大一部分細(xì)胞產(chǎn)生了類似于微核的現(xiàn)象，即產(chǎn)生了大小不一的兩個(gè)或者多個(gè)的類似于微核的結(jié)構(gòu)(占轉(zhuǎn)染后陽(yáng)性細(xì)胞的60%左右，而對(duì)照細(xì)胞基本上沒(méi)有類似現(xiàn)象)。圖3B的激光共聚焦結(jié)果可以清晰的看到多達(dá)5個(gè)大小不一的類似于微核的結(jié)構(gòu)，并且次結(jié)構(gòu)DAPI染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。為了消除GFP融合后對(duì)SNX33功能的影響，我們還應(yīng)用了Myc標(biāo)記的SNX33進(jìn)行免疫熒光檢湖ij，結(jié)果同融合GFP標(biāo)記的結(jié)果一致，即均產(chǎn)生多個(gè)類似微核的結(jié)構(gòu)。為了搞清楚這種現(xiàn)象是否意味著細(xì)胞核的分裂而細(xì)胞不分裂，我們將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行了流式分析。從流式分析的結(jié)果(圖3A)中可以看出，轉(zhuǎn)染了SNX33的細(xì)胞核同轉(zhuǎn)染了對(duì)照載體的細(xì)胞一樣，其細(xì)胞核的DNA含量并沒(méi)有改變，即說(shuō)明了SNX33過(guò)表達(dá)的細(xì)胞其染色體的含量并沒(méi)有改變，只是細(xì)胞核的分裂受到了影響，產(chǎn)生了類似于微核的現(xiàn)象。此結(jié)果也在MCF7腫瘤細(xì)胞系中得到了同樣的驗(yàn)證(結(jié)果未顯示)。實(shí)施例6:特異地抑制內(nèi)源SNX33的表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)的改變?yōu)榱搜芯縎NX33的功能，我們從StefanF丄ichtenthaler博士(LudwigMaximiliansUniversity,Schillerstr.44,80336Munich,Germany)那里獲得了SNX33的特異性抑制載體(shRNA)及對(duì)照載體(chobelS，NeumannS，HertweckM等，JBiolChem.2008,283:14257-14268)。我們嘗試在腫瘤細(xì)胞系Hela和MCF7中建立特異地抑制了SNX33的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)株。我們將對(duì)照載體及特異性抑制載體shRNA分別轉(zhuǎn)染到Hela和MCF7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用潮霉素進(jìn)行篩選。l周后我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，內(nèi)源性SNX33被特異地抑制后，Hela和MCF7細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的改變，細(xì)胞變得狹長(zhǎng)及具有很多的觸角，類似于神經(jīng)細(xì)胞(圖4)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)源性SNX33被抑制后，這種類似神經(jīng)樣的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的60-80%;而對(duì)照細(xì)胞中，這種類似神經(jīng)樣的細(xì)胞僅占總細(xì)胞數(shù)的5-10%。同時(shí)WesternBlotting檢測(cè)顯示，內(nèi)源性的SNX33被抑制的很充分(圖5)。實(shí)施例7:特異地抑制內(nèi)源SNX33的表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞周期的改變和細(xì)胞凋亡的增加接下來(lái)，我們將所獲得類神經(jīng)樣細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞周期(圖6)和凋亡分析(圖7)。細(xì)胞周期分析(圖6)顯示，與對(duì)照相比，內(nèi)源性SNX33被抑制后，細(xì)胞的Gl期明顯增加(Hela細(xì)胞，從51.28%增加到59.05%;MCF7細(xì)胞，從48.68°/。增加到63.66%)，S期相對(duì)的降低(Hela細(xì)胞，從40.15%增加到34.84%;MCF7細(xì)胞，從37.77%增加到29.73%)。這和我們所觀察到的現(xiàn)象一致，即細(xì)胞的生長(zhǎng)幾乎停滯了。細(xì)胞凋亡的分析(圖7)顯示，內(nèi)源性SNX33降低后，細(xì)胞的凋亡水平顯著增加(Hela細(xì)胞，從27.16%增加到42.33%;MCF7細(xì)胞，從37.38%增加到63.98%)。因此，我們得出結(jié)論，內(nèi)源性SNX33被抑制后，會(huì)引起細(xì)胞周期Gl期的顯著增加、S期的相對(duì)降低及細(xì)胞凋亡率的顯著增加。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以看出，過(guò)表達(dá)分選蛋白33(SNX33)或者特異性地抑制分選蛋白33都會(huì)引起腫瘤細(xì)胞系的不正常生長(zhǎng)現(xiàn)象，因此可以作為一種全新的藥物作用靶點(diǎn)和研究工具來(lái)研究其他可行的腫瘤治療手段及方法。序列表〈110〉中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〈120〉分選蛋白33在腫瘤治療中的應(yīng)用〈130〉參考<160〉33〈170〉Patentln版本3.3<210〉1<211〉1725〈212〉腿〈213>人(Homosapiens)<220〉〈221〉SNX33基因ggaaatcagc60ctggctgcag120gatcgtccgt180tcccggagcc240tgggggcagt300ggatgactgg360caacgggcac420cttccggccc480tgtggtgggc540catcctgggt600ccctcgtggc660cacaaaacag720〈400〉13tggCaCtg3朋ggCCg3gCCCtct3tg3CtttC3C3gtg3g33C33gg3atccagcaggatgaggacctggtcatctttagcgagacctcactggatggggccagaacagccgtggggagacagggctctttcctgcctcttatgtggatctggcatcagcaccaaccatgctgactactccagcagccctgcaggctccaggtgagcttgtac犯cagccccagtgtggccagcccagctaggagtggggcttcctctcaaaccagggtagctttgaggaggatgatgatgatgactggacgacggatgcacagtggtggaggagccacgggctggtgggctgggcaccctcccctcaacctctcctaccctggtgcctaccccagccagcacatggcaagccaccactggagcggcaggacagcctggcatctgccaagcgaggcagcgtaacctcaaccgtttctcatgctttgtgcgttctggagtggaggccttgatgtgcccatgatggcc犯gatcgctgagacatactccattg肌atgggccccagtggaaggccaatccccacccatttgcctgctctgtggaggacccaccaaattcaagggcatcaaaagctacatctcctacaagctcacacccacccatgctgcc780tcacccgtctaccggcgctacaaacactttgactggctctataaccgcctgctacacaag840ttcactgtcatctcggtgccccacctgcctgagaagcaggccactggccgcttcgaggag900gacttcatcgaaaagcggaagcggagactcatcctctggatggaccacatgaccagccac960cctgtgctctcccagtacgaaggcttccagcatttcctcagctgcctggatgacaagcag1020tggaagatgggcaaacgccgggcggag卿gatgagatggtgggtgccagcttcctgctc1080accttccagatccccaccgagcaccaggacttgcaggacgtggaagatcgcgtggacact1140ttcaaggccttcagtaagaagatggacgacagcgtcctgcagctcagcactgtggcatca1200gagctggtgcgtaaacatgtggggggcttccgcaaggaattccag犯gctgggcagtgcc1260ttccaggccatcagtcattccttccagatggacccccccttttgctctgaggccctcaac1320agtgccatttctcacacgggccgtacctatgeiagccatcggggagatgtttgctgagcag1380cccaagaatgacctcttccagatgctggacacactgtctctctaccagggcctgctctcc1440aacttccctgacatcatccatctacaaaaaggcgccttcgccaaggtgaaggagagccaa1500cgcatgagtgacgagggccgcatggtgcaggacgaggcagacggcattcgcaggcgctgc1560cgcgtggtgggtttcgccctgcaggccgagatgaaccacttccaccagcgccgtgagctc1620gacttcaagcacatgatgcagaactacttgcgccagcagatcctcttctaccagcgggtg1680ggccagcagctggagaagaccctgcgcatgtatgacaacctctga1725〈210〉2〈211〉575〈212〉PRT〈213〉人(Homosapiens)〈220〉〈221〉SNX33蛋白質(zhì)〈400〉2MetAlaLeuLysGlyArgAlaLeuTyrAspPheHisSerGluAsnLysGluGlulieSer15101520lieGinGinAspGluAspLeuValliePheSerGluThrSerLeuAspGlyTrpLeuGin25303540GlyGinAsnSerArgGlyGluThrGlyLeuPheProAlaSerTyrValGlulieValArg45505560SerGlylieSerThrAsnHisAlaAspTyrSerSerSerProAlaGlySerProGlyAal65707580GinValSerLeuTyrAsnSerProSerValAlaSerProAlaArgSerGlyGlyGlySer859095100GlyPheLeuSerAsnGinGlySerPheGluGluAspAspAspAspAspTrpAspAspTrp105110115120AspAspGlyCysThrValValGluGluProArgAlaGlyGlyLeuGlyThrAsnGlyHis125130135140ProProLeuAsnLeuSerTyrProGlyAlaTyrProSerGinHisMetAlaPheArgPro145150155160LysProProLeuGluArgGinAspSerLeuAlaSerAlaLysArgGlySerValValGly165170175180ArgAsnLeuAsnArgPheSerCysPheValArgSerGlyValGluAlaPhelieLeuGly185190195200AspValProMetMetAlaLyslieAlaGluThrTyrSerlieGluMetGlyProArgGly205210215220ProGinTipLysAlaAsnProHisProPheAlaCysSerValGluAspProThrLysGin225230235240ThrLysPheLysGlylieLysSerTyrlieSerTyrLysLeuThrProThrHisAlaAla245250255260SerProValTyrArgArgTyrLysHisPheAspTrpLysTyrAsnArgLeuLeuHisLys265270275280PheThrVallieSerValProHisLeuProGluLysGinAlaThrGlyArgPheGluGlu285290295300AspPhelieGluLysArgLysArgArgLeulieLeuTrpMetAspHisMetThrSerHis305310315320ProValLeuSerGinTyrGluGlyPheGinHisPheLeuSerCysLeuAspAspLysGin325330335340TrpLysMetGlyLysArgArgAlaGluLysAspGluMetValGlyAlaSerPheLeuLeu345340355360ThrPheGinlieProThrGluHisGinAspLeuGinAspValGluAspArgValAspThr365370375380PheLysAlaPheSerLysLysMetAspAspSerValLeuGinLeuSerThrValAlaSer385390395400GluLeuValArgLysHisValGlyGlyPheArgLysGluPheGinLysLeuGlySerAla405410415420PheGinAlalieSerHisSerPheGinMetAspProProPheCysSerGluAlaLeuAsn425430435440SerAlalieSerHisThrGlyArgThrTyrGluAlalieGlyGluMetPheAlaGluGin445450455460ProLysAsnAspLeuPheGinMetLeuAspThrLeuSerLeuTyrGinGlyLeuLeuSer465470475480AsnPheProAsplielieHisLeuGinLysGlyAalPheAlaLysValLysGluSerGin485490495500ArgMetSerAspGluGlyArgMetValGinAspGluAalAspGlylieArgArgArgCys505510515520ArgValValGlyPheAlaLeuGinAlaGluMetAsnHisPheHisGinArgArgGluLeu525530535540AspPheLysHisMetMetGinAsnTyrLeuArgGinGinlieLeuPheTyrGinArgVal545550555560GlyGinGinLeuGluLysThrLeuArgMetTyrAspAsnLeu*565570575<210>3<211>19<212>sh艦<213>shRNA<400>3gcacatgatgcagaactac19<210>4<211>31<212>薩<213〉引物<400>4accatggcactgaaaggccgagccctctatg31<210>5<211>28<212>DNA<213>引物<400>5tcagaggttgtca/tacatgcgcagggtc28權(quán)利要求1.使用SNX33基因抑制腫瘤細(xì)胞系增殖的方法，所述方法包括(a)調(diào)整腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源SNX33的表達(dá)水平；(b)在適合于腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)步驟(a)中得到的腫瘤細(xì)胞；(c)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)狀況。2.權(quán)利要求所述的方法，其中所述檢測(cè)腫瘤細(xì)胞系的狀況包括觀察(b)中腫瘤細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)(b)中的腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)情況、檢測(cè)(b)得到的腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期情況；或者檢測(cè)(b)得到的腫瘤細(xì)胞系的調(diào)亡情況。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中調(diào)整腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源SNX33的表達(dá)水平可以通過(guò)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)SNX33基因或者抑制內(nèi)源性SNX33基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。4.權(quán)利要求3的方法，其中通過(guò)將外源SNX33編碼基因引入腫瘤細(xì)胞系中來(lái)在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)量表達(dá)SNX33基閑。5.權(quán)利要求3的方法，其中通過(guò)將抑制SNX33基因的內(nèi)源表達(dá)的核苷酸序列引入腫瘤細(xì)胞系來(lái)抑制內(nèi)源性SNX33基因。6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述的引入方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、基因槍、病毒(例如腺病毒)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。7.權(quán)利要求4所述的方法，其中將外源SNX33基因引入腫瘤細(xì)胞系包括構(gòu)建在腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)的包含SNX33基因的載體；以及將所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞系中。8.權(quán)利要求5所述的方法，其中將抑制SNX33基因的內(nèi)源表達(dá)的核苷酸序列引入腫瘤細(xì)胞系的方法包括構(gòu)建在腫瘤細(xì)胞系中編碼的包含所述核苷酸序列的載體；以及將所構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入腫瘤細(xì)胞系中。9.權(quán)利耍求7或8所述的方法，其中轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。10.權(quán)利要求5或8所述的方法，其中抑制SNX33基因的內(nèi)源表達(dá)的核苷酸序列包括SNX33基因的shRNA。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞系來(lái)源于哺乳動(dòng)物。12.權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞系來(lái)源于人。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞系為Hela或者M(jìn)CF7。14.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述SNX33基因是來(lái)源于人。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述SNX33基因如SEQIDNO:l所示。16.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述shRNA如SEQIDNO:3所示。17.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)包括對(duì)細(xì)胞的免疫熒光測(cè)定、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析和/或細(xì)胞凋亡測(cè)定。18.SNX33基因用于抑制腫瘤細(xì)胞系增殖的用途。19.權(quán)利要求18所述的方法，其中對(duì)腫瘤細(xì)胞系增殖的抑制在上調(diào)腫瘤細(xì)胞系中SNX33表達(dá)水平時(shí)表現(xiàn)為可以使得腫瘤細(xì)胞系形成類微核現(xiàn)象而死亡。20.權(quán)利要求18所述的方法，其中對(duì)腫瘤細(xì)胞系增殖的抑制在抑制腫瘤細(xì)胞系中SNX33表達(dá)水平時(shí)表現(xiàn)為引起腫瘤細(xì)胞系的形態(tài)變化、細(xì)胞周期停滯及凋亡率增加。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了人分選蛋白33在腫瘤治療中的用途。人分選蛋白33作為分選蛋白家族的一員，在腫瘤細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，區(qū)別于其他的分選蛋白，除了在蛋白內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮功能外，還證實(shí)了在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)或者抑制分選蛋白33都會(huì)使得腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯而最終死亡，說(shuō)明分選蛋白33對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)起著非常重要的作用，并為以分選蛋白33作為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物奠定理論基礎(chǔ)。本發(fā)明中，從機(jī)制上闡述了分選蛋白33過(guò)表達(dá)或者抑制分選蛋白33對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，證實(shí)了分選蛋白33具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，提供了該分選蛋白33基因作為腫瘤治療新手段或新藥物的應(yīng)用方式。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101591706SQ20091003973公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年5月26日優(yōu)先權(quán)日2009年5月26日發(fā)明者娟張,張小飛,裴端卿申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院