專利名稱：一種利用種間耦合atp再生技術(shù)制備茶氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種茶氨酸的制備方法，具體是一種利用種間耦合ATP制備 茶氨酸的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ATP再生技術(shù)(ATP regeneration technology)是一類把ATP生成過程和需 消耗ATP的酶反應(yīng)緊密聯(lián)系，以促進需消耗ATP的酶反應(yīng)順利進行的技術(shù)。 目前ATP再生技術(shù)處于探索階段和接近實際應(yīng)用階段，正面臨突破，它是中 間產(chǎn)物發(fā)酵法和酶工程的瓶頸技術(shù)，是實現(xiàn)用微生物細(xì)胞(或酶)生產(chǎn)眾多生 物活性物質(zhì)產(chǎn)品的關(guān)鍵技術(shù)，對其深入研究以期在特殊環(huán)境下對ATP再生這 一生物化學(xué)過程實現(xiàn)調(diào)控。按照ATP再生和酶轉(zhuǎn)化底物是否由同一菌種完成， ATP再生技術(shù)分為自耦合ATP再生技術(shù)(ATP再生和酶轉(zhuǎn)化底物由同一菌種 完成)和種間耦合ATP再生技術(shù)(ATP再生和酶轉(zhuǎn)化底物分別由兩個不同菌種 完成)。由于種間耦合ATP再生技術(shù)能夠廣泛地選擇高活性的產(chǎn)物合成酶和高 ATP再生能力的面包酵母或嗜熱脂肪芽孢桿菌相結(jié)合，其應(yīng)用更接近實用階 段。
茶氨酸是茶樹組織合成的特有氨基酸。茶氨酸具有改善食品風(fēng)味、改善睡 眠、益智、靜心安神、改善經(jīng)期綜合癥、產(chǎn)生欣快感、抗疲勞、防止老年性癡 呆、抗高血壓、抗肺瘤、神經(jīng)細(xì)胞保護等等應(yīng)用方面。茶氨酸是一種具有多種 生理效應(yīng)的特殊氨基酸，在食品添加劑方面已有廣泛應(yīng)用，在功能食品方面嶄 露頭角，在醫(yī)藥方面有待開發(fā)，市場潛力巨大。茶氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的主要4種， 分別為提取法、組織培養(yǎng)法、化學(xué)合成法、微生物轉(zhuǎn)化法。國內(nèi)的研究未能形 成大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。微生物轉(zhuǎn)化法是最有發(fā)展前景的茶氨酸工業(yè)化生產(chǎn)方 法，也是目前茶氨酸商業(yè)生產(chǎn)國日本的主要生產(chǎn)方法。
現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于ATP再生技術(shù)及制備茶氨酸的狀況如下 1、日本有采用共培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)茶氨酸的文獻報道，其實質(zhì)采用的是面包 酵母作為ATP再生菌，假單胞菌為產(chǎn)酶菌種，催化茶氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)中Y-谷氨
3酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶是假單胞菌所產(chǎn)的谷氨酰胺合成酶，但文獻報告并沒有明確
提出種間耦合atp再生技術(shù)的概念。
2、 國內(nèi)外有關(guān)種間耦合atp再生技術(shù)生產(chǎn)品的報道，但沒有采用此技術(shù) 生產(chǎn)茶氨酸的報道。
3、 國外有嗜熱脂肪芽孢桿菌是最佳atp再生菌種的報道，但沒有該菌用 于制備茶氨酸的報道。
4、 國內(nèi)外有y -谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶用于茶氨酸制備的報道，但是選擇的是大 腸桿菌生產(chǎn)的y-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶來生產(chǎn)茶氨酸，沒有選擇地衣芽孢桿菌所產(chǎn) 生的y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶來生產(chǎn)茶氨酸的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于彌補已有技術(shù)的不足，提供一種新型的、高效的、生產(chǎn) 過程穩(wěn)定、副產(chǎn)物少的利用種間耦合atp再生技術(shù)制備茶氨酸的方法。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
一種利用種間耦合atp再生技術(shù)制備茶氨酸的方法，包括以下步驟 (1 )以地衣芽孢桿菌制備y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞；以嗜熱脂肪芽 孢桿菌制備l、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液；
(2) 將y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞、1、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液和 底物混合，經(jīng)轉(zhuǎn)化制得茶氨酸轉(zhuǎn)化液；所述底物是谷氨酰胺或谷氨酸和乙胺的 混合物；
(3) 茶氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)提取、精制得到茶氨酸。
上述步驟(1)中所述制備y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞是以地衣芽孢桿 菌作為產(chǎn)酶菌種進行產(chǎn)酶發(fā)酵制得y -谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞。
上述步驟(1)中所述制備1、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液是以嗜熱脂肪芽 孢桿菌作為atp再生菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后經(jīng)過轉(zhuǎn)化培養(yǎng)制得1、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)液；所述以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為atp再生菌種經(jīng)活化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化制得1、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液是以嗜熱脂肪芽孢桿菌利用含有蔗糖、無機磷酸鹽的 營養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)供能體l、 6-二磷酸果糖，制備成l、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液。
本發(fā)明種間耦合atp再生技術(shù)的過程概括為(1)分別建立供能系統(tǒng)和 酶反應(yīng)系統(tǒng)；(2)將兩個系統(tǒng)耦合，實現(xiàn)atp再生和促進酶反應(yīng)。詳述如下
本發(fā)明建立酶合成反應(yīng)系統(tǒng)是采用篩選獲得的高活性的y -谷氨酰基轉(zhuǎn)移
4酶產(chǎn)酶菌種(地衣芽孢桿菌)經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵后，制備成Y-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶固定 化細(xì)胞，該固定化細(xì)胞和酶合成反應(yīng)底物谷氨酰胺(或谷氨酸)和乙胺一起構(gòu) 成酶合成反應(yīng)系統(tǒng)。
本發(fā)明建立ATP供能系統(tǒng)是采用嗜熱脂肪芽孢桿菌利用蔗糖、無機磷酸 鹽等為營養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)供能體1、 6-二磷酸果糖(FDP)，制備成FDP轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液。 其中高活性的乙酸激酶和高含量的能量供體FDP可滿足茶氨酸生產(chǎn)過程中 ATP再生的需要。
本發(fā)明轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸是將上述兩個系統(tǒng)在一定條件下耦合,就能使催化 底物轉(zhuǎn)化生成茶氨酸同時實現(xiàn)被消耗的ATP的再生，使茶氨酸合成反應(yīng)高效 率地進行，獲得高產(chǎn)量的茶氨酸轉(zhuǎn)化液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1 )本成果和日本文獻報道有相似之處，即采用了兩個不同菌種相結(jié)合 來生產(chǎn)茶氨酸，采用了相同的底物谷氨酸(或谷氨酰胺)，將其Y-谷氨酰基轉(zhuǎn) 移到乙胺上生成茶氨酸。但是本專利成果和日本文獻報道有很大的不同，具體 為①ATP再生菌種選用了嗜熱脂肪芽孢桿菌而不是面包酵母，采用嗜熱脂肪 芽孢桿菌作為ATP再生菌種，具有產(chǎn)能水平高、生產(chǎn)過程穩(wěn)定、副產(chǎn)物少等 優(yōu)點；②產(chǎn)酶菌種選用了地衣芽孢桿菌而不是假單胞菌，用地衣芽孢桿菌作為 產(chǎn)酶菌種生產(chǎn)茶氨酸，是本發(fā)明技術(shù)方案的重要特色，目前尚無這方面的公開 報道，為本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)發(fā)展提供了一種新思^s③催化底物轉(zhuǎn)化生成茶氨 酸的酶選用了地衣芽孢桿菌所產(chǎn)的Y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶而不是假單胞菌所產(chǎn)的 谷氨酰胺合成酶，雖然在特定條件下，二者均可以催化谷氨酰胺(或谷氨酸) 和乙胺生成茶氨酸，但反應(yīng)機理不同，副產(chǎn)物不同，y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶可催 化自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，而谷氨酰胺合成酶不能； 種間耦合ATP再生技術(shù)和日本相 關(guān)文獻上所述的共培養(yǎng)技術(shù)相比，反映了不同的理念，而且使用了不同的操作 方法，前者所述的共培養(yǎng)強調(diào)兩種菌在一起培養(yǎng)有利于茶氨酸的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，但 文獻中也認(rèn)識到，產(chǎn)能培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)最適合的pH值差異太大，共培養(yǎng)有效 的同時，也受到兩個培養(yǎng)最適合pH值不配的制約，限制了該項技術(shù)的進一步 發(fā)展，而本發(fā)明采用的種間耦合ATP再生技術(shù)，是對共培養(yǎng)技術(shù)的改進和完 善，將產(chǎn)能培養(yǎng)(FDP轉(zhuǎn)化液生產(chǎn))和茶氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)分開在不同條件下進行， 不是簡單地直接將產(chǎn)能菌種(嗜熱脂肪芽孢桿菌)直接加入到茶氨酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)
5培養(yǎng)液中，加入到茶氨酸轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中的是經(jīng)過活化的產(chǎn)能菌體培養(yǎng)物(包括
菌體和能量供體FDP),這樣操作效果更好。
(2)目前現(xiàn)有技術(shù)中沒有提出以1、 6-二磷酸果糖為能量供體進行ATP 再生，也沒有將此方面應(yīng)用于制備茶氨酸的啟示，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一 種全新的技術(shù)方案，是一項能夠促進需消耗ATP的酶反應(yīng)順利進行的技術(shù)， 也是一項適合微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸的技術(shù)。在食品、醫(yī)療或酶工程領(lǐng)域具 有十分廣闊的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。 實施例1
將產(chǎn)酶菌種地衣芽孢桿菌接種斜面3(TC培養(yǎng)48小時，移種種子培養(yǎng) (30ml/瓶)30°C 、 250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時，接種發(fā)酵培養(yǎng)(30ml/瓶)30°C 、 250 轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時獲得產(chǎn)酶發(fā)酵液，發(fā)酵液1000ml—4000轉(zhuǎn)/分、15分鐘，得 到菌體10克(y-谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性9u/ml)。以卡拉膠包埋菌體制備成Y-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞(50克)備用。
② ATP再生菌種(嗜熱脂肪芽孢桿菌)—活化培養(yǎng)—轉(zhuǎn)化生產(chǎn)FDP —FDP 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(56mgFDP/ml、菌體含量為1.5%)備用。
③ 將固定化細(xì)胞50克、FDP轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液10ml、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，調(diào)節(jié)pH值至10.5 —30°C、 180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48 小時轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸—茶氨酸轉(zhuǎn)化液(茶氨酸含量37mg/ml)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)化 成茶氨酸的轉(zhuǎn)化率為60%。
④ 茶氨酸提取精制工藝:茶氨酸轉(zhuǎn)化液預(yù)處理(pH3.0、 80。C加熱、過濾得 到濾液)—732樹脂吸附—氨水洗脫—減壓濃縮洗脫液至(120mg茶氨^/ml) —2倍95%乙醇結(jié)晶(4°C)—真空千燥—茶氨酸成品。提取總收率為62%。 實施例2
① 將產(chǎn)酶菌種地衣芽孢桿菌接種斜面3(TC培養(yǎng)48小時，移種種子培養(yǎng) (30ml/瓶)30°C、 250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時，接種發(fā)酵培養(yǎng)(30ml/瓶)30°C 、 250
轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時獲得產(chǎn)酶發(fā)酵液，發(fā)酵液1000ml—4000轉(zhuǎn)/分、15分鐘，得 到菌體10克(Y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性8u/ml)備用。
② ATP再生菌種(嗜熱脂肪芽孢桿菌)—活化培養(yǎng)—轉(zhuǎn)化生產(chǎn)FDP — FDP轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(53mgFDP/ml、菌體含量為1.5%)備用。
③ 將菌體細(xì)胞10克、FDP轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液lOrnl、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，調(diào)節(jié)pH值至10.5 —30°C、 180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48 小時轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸—茶氨酸轉(zhuǎn)化液(茶氨酸含量39mg/ml)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)化 成茶氨酸的轉(zhuǎn)化率為64%。
④ 茶氨酸提取精制工藝:茶氨酸轉(zhuǎn)化液預(yù)處理(pH3.0、 80。C加熱、過濾得 到濾液)—732樹脂吸附—氨水洗脫—減壓濃縮洗脫液至(125mg茶氨^7ml) —2倍
95%乙醇結(jié)晶(4°C)—真空干燥—茶氨酸成品。提取總收率為60%。 實施例3
① 將產(chǎn)酶菌種地衣芽孢桿菌接種斜面30。C培養(yǎng)48小時，移種種子培養(yǎng) (30ml/瓶)30°C、 250轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時，接種發(fā)酵培養(yǎng)(30ml/瓶)30°C 、 250
轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)24小時獲得產(chǎn)酶發(fā)酵液(Y -谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性2u/ml)備用。
② ATP再生菌種(嗜熱脂肪芽孢桿菌)—活化培養(yǎng)—轉(zhuǎn)化生產(chǎn)FDP —FDP 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(53mgFDP/ml、菌體含量為1.5°/。)備用。
③ 將產(chǎn)酶發(fā)酵液20ml、 FDP轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液10ml、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，調(diào)節(jié)pH值至10.5 —30°C、 180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)48 小時轉(zhuǎn)化生產(chǎn)茶氨酸—茶氨酸轉(zhuǎn)化液(茶氨酸含量35mg/ml)。谷氨酰胺轉(zhuǎn)化 成茶氨酸的轉(zhuǎn)化率為56%。
④ 茶氨酸提取精制工藝:茶氨酸轉(zhuǎn)化液預(yù)處理(pH3.0、 80。C加熱、過濾得 到濾液)—732樹脂吸附—氨水洗脫—減壓濃縮洗脫液至(123mg茶氨^/ml) —2倍
95%乙醇結(jié)晶(4°C)—真空干燥—茶氨酸成品。拔-又總收率為30%。
權(quán)利要求
1. 一種利用種間耦合ATP再生技術(shù)制備茶氨酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)以地衣芽孢桿菌作為生產(chǎn)γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶的產(chǎn)酶菌種制備γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞；以嗜熱脂肪芽孢桿菌作為ATP再生菌種制備1、6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液；(2)將γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞、1、6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液和底物混合，以1、6-二磷酸果糖為能量供體促進ATP再生經(jīng)轉(zhuǎn)化制得茶氨酸轉(zhuǎn)化液；所述底物是谷氨酰胺或谷氨酸和乙胺的混合物；(3)茶氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)提取、精制得到茶氨酸。
2.如權(quán)利要求1所述的制備茶氨酸的方法，其特征在于步驟(1)所述以 嗜熱脂肪芽孢桿菌作為ATP再生菌種制備1、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液是以嗜 熱脂肪芽孢桿菌利用含有蔗糖、無機磷酸鹽的營養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)供能體1、 6-二磷 酸果糖，制備成l、 6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種種間耦合ATP再生技術(shù)制備茶氨酸的方法，包括以下步驟以地衣芽孢桿菌制備γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞；以嗜熱脂肪芽孢桿菌制備1、6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液；將γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶固定化細(xì)胞、1、6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液、底物混合制備轉(zhuǎn)化制得茶氨酸轉(zhuǎn)化液；所述底物為谷氨酰胺(或谷氨酸)和乙胺；茶氨酸轉(zhuǎn)化液經(jīng)提取、精制得到茶氨酸。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種全新的、以ATP再生技術(shù)和酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)技術(shù)相耦合制備茶氨酸的技術(shù)方案。是一項能夠促進需消耗ATP的酶反應(yīng)順利進行的技術(shù)，也是一項適合微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸的技術(shù)。在食品、醫(yī)療、酶工程領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P13/04GK101457241SQ20091003641
公開日2009年6月17日 申請日期2009年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月4日
發(fā)明者傅錦堅, 劉冬英, 孟佩佩, 張文軍, 胡立勇, 鄧祖軍 申請人:廣東藥學(xué)院