專利名稱：檢測葉螨體內(nèi)共生菌的多重pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究開發(fā)了一種能同時檢測葉螨體內(nèi)共生菌『o/k cWa和Cara fm'MOT的多重PCR方法，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域，可用于檢測葉螨體內(nèi)這兩種共生菌。
二背景技術(shù)：
PTo/6ac/^和CaW/"/wm是兩類呈母性遺傳的共生菌，它們能通過不同的方法調(diào)控寄主的生殖。 ffe/6acWa，屬于ct亞門，能夠引起寄主的以下四種生殖異常行為胞質(zhì)不親和，孤雌生殖，雌性 化，殺雄。CaW/m'"附屬于Bacteroidetes細(xì)菌類群，能引起寄主的三種生殖異常行為胞質(zhì)不親和， 孤雌生殖，雌性化。
隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)在少數(shù)昆蟲和螨的生殖系統(tǒng)內(nèi)，同時含有兩類寄生菌C"W;m'Mw和 『0/Z>wWa。葉螨中，也已發(fā)現(xiàn)了雙重感染現(xiàn)象。對于未知感染狀況的葉螨，為了研究共生菌 CaW"/i/m和恥/tecWa對生殖和發(fā)育的共同調(diào)控作用，以及寄生菌之間的相互作用，檢測葉螨體 內(nèi)共生菌『o/6acWa和CaW/"/"w的感染情況是進(jìn)行研究的前提和重要手段。目前對于這兩種共 生菌，主要用基于PCR的分子方法分別進(jìn)行檢測，即通過兩次PCR來完成對共生菌『o仿acWa 和CaWm't/m的檢測。當(dāng)面臨大量的樣本需要檢測時，分別檢測恥/6acWa和CaW/"/鵬，耗時、 耗材、又耗力。多重PCR (Multiplex PCR)方法則克服了常規(guī)PCR只能檢測一個模板的缺點(diǎn)。 多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，于一個PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對 多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù)。用多重PCR同時擴(kuò)增多個 目的片段，具有節(jié)省時間、降低成本、提高效率、節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣本等優(yōu)勢。
作者已研究多重PCR (Multiplex PCR)方法同時檢測葉螨體內(nèi)的共生菌『o仿ac/n'a和 Ow^fm'M/w的過程，并證實(shí)了該檢測方法具有特異性、靈敏性和可實(shí)用性。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的是通過分別設(shè)計(jì)新的恥/6ac/^和0 W"/Mm的特異性引物，使 這兩對引物在一個PCR反應(yīng)中能正常作用，分別擴(kuò)增兩段不同大小的目的片段。即將原本需要兩 次常規(guī)的PCR擴(kuò)增才能完成對兩種共生菌的檢測，縮減到一次多重PCR檢測同時完成。
技術(shù)方案 同時檢測葉螨體內(nèi)兩種共生菌沃爾巴克氏體(腸/6ac/n'a 'e"to)和
OwJZ"/Mm的多重PCR檢測方法，共分為三步
1) 提取葉螨總DNA
挑單頭雌成螨放入25^1 STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2nl 10mg/ml蛋白酶K， 37'C孵育30min 后，95'C初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，STE緩沖液配制 勵mMNaCl， 10mM Tris-HCl， lmMEDTA， pH 8.0;
2) 多重PCR擴(kuò)增基于沃爾巴克氏體(WWZ)acWa 的wsp基因序列和Carc//w'w/w的16S rDNA基因序
列分別設(shè)計(jì)特異性引物WSP/F236&R446, CLO/F735&R1013: WSP/F236 5'-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3' WSP/R446 5'-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3' CLO/F73 5 5'-CTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGG-3'
CLO/R1013 5'-CCGCTTACACGGGCAGTCTACTT隱3' 以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，多重PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下
反應(yīng)體系
ddH20 14都L
10xBuffer 2.5^L
Mg2Cl 25mM 1.5pL
dNTP 2.5mM 2pL
Primers WSP/F236&R楊 10, 0.5nLx2
Primers CLO/F735&R1013 10一 0.5fiLx2
Taq DNA聚合酶 5U/nm 0.2^L
DNA模板 2.0nL
總體積 25 nL 擴(kuò)增條件
預(yù)變性94°C, 2min;
35個循環(huán)變性94'C, 30s，退火55°C， 45s,延伸72°C， 45s; 延伸72°C， 5min; 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5^1，在質(zhì)量體積比2.0%的瓊脂糖凝膠上100 V電壓電泳檢測，最后在Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)下觀察，如果能擴(kuò)增出211bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌恥化ac/n》；如 果能擴(kuò)增出279bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌CaW/"/"m。
有益效果 本發(fā)明提供的多重PCR檢測技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 多重PCR (Multiplex PCR)方法改變了通過一次PCR擴(kuò)增只能檢測一種共生菌的缺點(diǎn)。與常 規(guī)的PCR分子檢測相比，多重PCR檢測，即在一個反應(yīng)體系中，同時擴(kuò)增共生菌和 CaW"!'"w的特異性目的片段，通過一次瓊脂糖凝膠電泳，能檢測葉螨中兩種共生菌的感染狀態(tài)，
具有節(jié)省時間、降低成本、提高效率、節(jié)省珍貴的實(shí)驗(yàn)樣本等優(yōu)點(diǎn)。
2、 多重PCR檢測具有特異性和較好的靈敏性(圖l，圖2)。
3、 用多重PCR技術(shù)檢測葉螨自然種群中Ow^'m'MW和『o仿acWa的感染情況，得到的結(jié)果與常 規(guī)PCR分子檢測結(jié)果相一致。
四
圖1 用多重PCR檢測朱砂葉螨體內(nèi)QzW/"/mw和『oftac/z/a的特異性 M: Marker (DL 2000); 1， 2:朱砂葉螨『o/6acWa-Cara7"fww雙重感染雌成螨；3, 4:朱砂葉螨 單感染Ow^'"/m附雌成螨；5， 6:朱砂葉螨單感染『o/Z>acWa雌成螨；7， 8:朱砂葉螨不感染雌 成螨；9， 10:清水對照(不加DNA模板)
圖2多重PCR的敏感性測試 M: Marker (DL 2000); A圖.1-6顯示將單頭『0/6acWa-G3re^"&w雙重感染朱砂葉螨DNA稀釋 1， 2， 5， 10， 25， 50倍后作為模板進(jìn)行多重PCR檢測的結(jié)果，7為陰性對照；B圖.1-7顯示將 單頭單感染『o仿ac/ /a及單頭單感染CaWZ"/ww朱砂葉螨的DNA和滅菌水按比例混合(分別為 50:0:0， 25:1:24， 10:2:38， 5:5:40， 2:10:38， 1:25:24， 0:50:0)后作為模板進(jìn)行多重PCR檢測的結(jié) 果
圖3用多重PCR技術(shù)檢測葉螨自然種群中CaW/w'柳和恥/6acWa的感染情況 M: Marker(DL2000); 1， 2:陰性對照；3， 4:陽性對照；5-24:葉螨自然種群；A圖.朱砂葉 螨(江蘇地理種群)；B圖.朱砂葉螨(云南地理種群)；C圖.朱砂葉螨(山西地理種群)；D圖.山 楂葉螨(內(nèi)蒙古地理種群) 五具體實(shí)施例方式
1、適用于多重PCR (Multiplex PCR)特異性引物設(shè)計(jì)
共生菌ffo/tocfeap—'e油'5，簡稱『o/Z>ac/ 'a，公知公用，見參考文獻(xiàn)(Hertig M. The rickettsia, 恥/6ac/z/a /Jij^Zewris (gen.et sp.n.) and associated inclusions of the mosquite Cw/ex pz]p/ews. i^nafs/Zo/ogy, 1936,28:453-486)，中文屬名為沃爾巴克氏體，暫無中文種名。
共生菌CariiZwz'w附，艮卩Cawcfcfafttf Cardinium hertigii， 公失口公用，見參考文獻(xiàn)(Zchori-Fein E, Perlman S J， Kelly S E, Katzir N, Hunter M S. Characterization of a '5acfera/ofetes' symbiont in 五"rars/a wasps (Hymenopera: Aphelinidae): proposal of 'CaWc a,ws Cara /w/柳Z/eW妙，，/"f. / S，. ￡vo/. TW/ctoWo/., 2004, 54: 961-968.)， 2004年首次命名，暫無中文屬名。
『0/toc/n'a的外表皮蛋白基因w^基因常作為一種遺傳標(biāo)記，用于『o仿ac^'a的檢測。而至今僅有 一種遺傳標(biāo)記用于檢測CaWw'鵬，16S rDNA。在基因庫中搜索已有的恥仂flcM 的vi^基因序列以及 CaWim'mw的16S rDNA，并用BioEdit軟件分別進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示了較高的同源性(>80%， >97%)。根據(jù)以上序列比對結(jié)果，基于『o/Zwc/n'a的vwp基因序列(序列號AB096222， NCBI GenBank) 和CaW"&m的16S rDNA基因序列(序列號DQ369965， NCBI GenBank)分別設(shè)計(jì)特異性引物 WSP/F236&R446， CLO/F735&R1013,以擴(kuò)增不同大小的目的片段，分別為2Ilbp和279bp，從而能 通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分出兩種共生菌。多重PCR (MultiplexPCR)檢測的具體步驟如下
1)提取葉螨總DNA
挑單頭雌成螨放入25^1 STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2^1 10mg/ml蛋白酶K， 37'C孵育30min 后，95'C初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，STE緩沖液配制 兩mMNaCl， 10mMTris-HCl， lmMEDTA， pH 8.0;2)多重PCR擴(kuò)增
以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，多重PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下: 反應(yīng)體系
ddH2014.8mX
10xBuffer2.5(xL
Mg2Cl 25mM1.5^
dNTP 2.5mM
Primers WSP/F236&R446
Primers CLO/F735&R1013lOjiM
Taq DNA聚合酶 5U/pm
DNA模板
總體積25pL
擴(kuò)增條件
預(yù)變性94°C， 2min;
變性94°C, 30s,退火55°C， 45s，延伸72°C， 45s; 35個循環(huán)； 延伸72°C， 5min; 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5nl，在質(zhì)量體積比2.0%的瓊脂糖凝膠上100 V電壓電泳檢測，最后在Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng)下觀察。如果能擴(kuò)增出211bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌恥/Z^W化如 果能擴(kuò)增出279bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌0 ^"/"附。
2、 多重PCR (MultiplexPCR)檢測的特異性
從朱砂葉螨中，取^b/6<3cWa-Can^>H'Mm雙重感染，只感染『o/6<3cWa，只感染Ozra^m'j/附以 及不感染雌成螨各兩頭，分別提取DNA (均用常規(guī)的PCR方法檢測確保其感染狀態(tài))，用于多重 PCR檢測。結(jié)果顯示在圖l中。結(jié)果顯示，只有在DNA模板中存在相應(yīng)的共生菌時才會擴(kuò)增出 相應(yīng)的PCR產(chǎn)物，而且沒有出現(xiàn)大于100bp的非特異性片段。由于兩對特異性引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大 小不同，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測時，更容易區(qū)別共生菌特異性DNA片段。檢測不感染葉螨以 及空白對照中均沒有出現(xiàn)特異性及非特異性片段。這些結(jié)果顯示了多重PCR檢測時引物以及反應(yīng) 體系的特異性。多重PCR檢測時，新設(shè)計(jì)的引物作用理想，而且能產(chǎn)生適宜的產(chǎn)物量。
用多重PCR檢測雙重感染的朱砂葉螨，擴(kuò)增出的兩個特異性片段經(jīng)過純化，分別進(jìn)行測序。 共生菌的特異性擴(kuò)增片段大小為211bp，共生菌Ca S /"/ 的特異性擴(kuò)增片段大小為 279bp。用BioEdit軟件分別將這兩段序列與己知的『o仿acWa的wsp基因序列，CaW"/鵬的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，均顯示較高的同源性。
3、 多重PCR (Multiplex PCR)檢測的靈敏性
從朱砂葉螨中，提取單頭腸/6ac/^-CaWm'鵬雙重感染的羽化5天的雌成螨總DNA，用常規(guī)的PCR檢測方法分別擴(kuò)增『o/Zwc/ 》和CaW/"/,的目的片段，確保其感染狀態(tài)。用滅菌水對 該DNA進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)依次為2， 5， 10， 25， 50倍。用多重PCR對原DNA模板以及稀釋 后的DNA模板進(jìn)行檢測，并設(shè)空白對照。電泳圖結(jié)果(圖2A)顯示，稀釋50倍后，多重PCR 仍能成功地檢測出CaW/m'ww和『otoac/ /a這兩種共生菌。
從朱砂葉螨中，分別提取單頭只感染ffo/6ac/w'a和只感染CaW/"/MW的羽化5天的雌成螨總 DNA。用常規(guī)的PCR檢測方法分別擴(kuò)增『o/toc/ Vz和CaW/w、w的目的片段，確保其感染狀態(tài)。 將單頭只感染『o仿acA/a雌成螨DNA，單頭只感染CaW/w/"m雌成螨DNA與滅菌水按以下比例 混合50:0:0; 25:1:24; 10:2:38; 5:5:40; 2:10:38; 1:25:24; 0:0:50，然后進(jìn)行多重PCR檢測。電 泳圖結(jié)果(圖2B)顯示，在一種菌量較少而另一種較多時，多重PCR同樣能檢測出菌量較少的 那種菌，進(jìn)一步說明了多重PCR檢測具有較好的靈敏性。 4、用多重PCR技術(shù)檢測葉螨自然種群中Cflr必/f/"/n和附，/6acA/a的感染情況
將多重PCR應(yīng)用于葉螨自然種群的檢測，共檢測了7個種的11個地理種群，各地理種群檢 測40頭雌成螨(表l)。其中有三個地理種群同時感染共生菌『o仍ac/z/a和Ow^力!'ww，五個地 理種群只感染共生菌fFo/toc/n》。這些檢測結(jié)果與用常規(guī)PCR分子檢測得到的結(jié)果相一致。
表1用多重PCR檢測的葉螨自然種群采集記錄及檢測結(jié)果
葉螨物種采集地點(diǎn)寄主采集時間感染共生菌
山西省棉花2008年7月
朱砂葉螨云南省菜豆2008年7月
7fe,ra";yc/iws "'""ato"'w"s (Boisduval)河北省棉花2008年7月
江蘇省菜豆2008年7月
二斑葉螨遼寧省蘋果2008年8月
refrwiyctos Mrti.cae Koch山東省蘋果2008年7月
神澤葉螨 7Wra"yc/zws Aawza而/ Kishida江蘇省菜豆2004年6月/
截形葉螨 7^row_yc/^ ,rwwc她s Ehara新疆自治區(qū)棉花2004年6月
土耳其斯坦葉螨
7Wra/^/iws fw/^5/aw' (Ugarov et新疆自治區(qū)菜豆2008年8月/
Nikolski)
山楂葉螨 reZrawyc/^ v/e朋e肌.s Zacher內(nèi)蒙古自治區(qū)蘋果2008年8月
柑橘全爪螨 Pawo，/zws (McGregor)江蘇沙梨2008年8月/
{主上述葉螨物種均屬于公知公用，見于中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志第二十三冊螨目葉螨總科(北京:科學(xué) 出版社，1981)。序列表
<110> 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>檢測葉螨體內(nèi)共生菌的多重PCR檢測方法
<130>說明書
<140> 00
<141> 2009-07-01
<160> 4
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> WSP/F236
<222> (1)..(24) <223>
<400> 1
gacagtttaa cagcattttc agga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> WSP/R446
<222> (1)..(24) <223>
<400> 2
gtttgatttc tggagttaca teat 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220〉
<221> CLO/F735<222>(1)..(23)
<223>
<400>
ctcgcaaggg tgaaactcaa agg<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>CLO/R1013
<222>(1)..(23)
<223>
<400>4
ccgcttacac gggcagtcta ctt
權(quán)利要求
1、對葉螨體內(nèi)兩種共生菌沃爾巴克氏體(Wolbachia pipientis)和Cardinium進(jìn)行同時檢測的方法，其特征在于1)提取葉螨總DNA挑單頭雌成螨放入25μl STE緩沖液中進(jìn)行碾磨，加入2μl10mg/ml蛋白酶K，37℃孵育30min后，95℃初始變性5min并使蛋白酶K失活，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增，STE緩沖液配制100mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0；2)多重PCR擴(kuò)增基于沃爾巴克氏體(Wolbachia pipientis)的wsp基因序列和Cardinium的16S rDNA基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物WSP/F236&R446，CLO/F735&R1013WSP/F2365′-GACAGTTTAACAGCATTTTCAGGA-3′WSP/R4465′-GTTTGATTTCTGGAGTTACATCAT-3′CLO/F7355′-CTCGCAAGGGTGAAACTCAAAGG-3′CLO/R1013 5′-CCGCTTACACGGGCAGTCTACTT-3′以提取的葉螨總DNA作為DNA模板，多重PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件如下反應(yīng)體系ddH2O 14.8μL10×Buffer2.5μLMg2Cl 25mM1.5μLDNTP 2.5mM2μLPrimers WSP/F236&R446 10μM 0.5μL×2Primers CLO/F735&R1013 10μM 0.5μL×2Taq DNA聚合酶5U/μm 0.2μLDNA模板 2.0μL總體積25μL擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃，2min；35個循環(huán)變性94℃，30s，退火55℃，45s，延伸72℃，45s；延伸72℃，5min；3)瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，在質(zhì)量體積比2.0％的瓊脂糖凝膠上100V電壓電泳檢測，最后在GelDocEQ凝膠成像系統(tǒng)下觀察，如果能擴(kuò)增出211bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌Wolbachia；如果能擴(kuò)增出279bp目的片段表示該葉螨感染了共生菌Cardinium。
全文摘要
本發(fā)明同時檢測葉螨體內(nèi)兩種共生菌Wolbachia和Cardinium的多重PCR方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)范疇。多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，于一個PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，針對多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù)。本發(fā)明根據(jù)Wolbachia wsp基因序列和Cardinium 16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)了兩對新的特異性引物，可擴(kuò)增出兩段不同大小的目的片段，分別為211bp和279bp。本發(fā)明所述多重PCR檢測方法具有高度特異性、敏感性、可行性和有效性，即節(jié)約檢測成本，又節(jié)省模板。用多重PCR檢測技術(shù)同時檢測共生菌Wolbachia和Cardinium可廣泛用于葉螨中這兩種共生菌的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK101603081SQ20091003201
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月7日 公開號200910032015.發(fā)明者洪曉月, 謝蓉蓉, 陳小琳 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 被以下專利引用 (1),