專利名稱：水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)條病菌的padlock探針及多重檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測水稻白葉枯病菌(^b"^wwwas. o^zaepv. oo;zae)和水稻細(xì)菌 性條斑病菌(義a"Ao附oway.w7加e pv.oo^'co/e)的padlock探針以及能夠同時檢測這 兩種植物病原菌的多重檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。適用于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)、植物保護(hù)等部門使用。
(二)
背景技術(shù)：
水稻白葉枯病是一個世界性病害，每年給水稻生產(chǎn)造成的損失輕則10%，重 則30%，甚至可達(dá)50%以上。自1884年在日本發(fā)生以來，相繼在亞洲、歐洲、 大洋洲、非洲和北美洲均有發(fā)現(xiàn)(MewT.1989)，目前其發(fā)生范圍已遍及全球水稻 栽培地區(qū)(OuSH. 1985;MewTW 1987;SwingJM. 1990)。水稻細(xì)菌性條斑病亦 是危害水稻的重要細(xì)菌病害，其危害僅次于水稻白葉枯病，屬國內(nèi)植物檢疫性病 害。在國外，俄羅斯、韓國、澳大利亞、美國等均把它列為檢疫性有害生物。在 熱帶亞洲各國均有發(fā)現(xiàn)，在非洲中部亦有發(fā)生。中國主要分布在華南稻區(qū)，近年 來在長江流域雜交稻上亦有發(fā)現(xiàn)。水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌均借種子調(diào) 運(yùn)做遠(yuǎn)距離傳播。因此，在國內(nèi)調(diào)種引種前，盡量到產(chǎn)地實(shí)地考察進(jìn)行產(chǎn)地檢驗(yàn)， 十分有效且完全必要。檢測技術(shù)先進(jìn)、可靠，外來有害生物傳入的風(fēng)險就可以降 低。
目前己有很多不同的PCR檢測技術(shù)應(yīng)用于水稻白葉枯和細(xì)菌性條斑病菌的 檢測和鑒定。Sakthivel等(2001 )利用IS1113序列設(shè)計了一對引物TXT和TXT4R， 通過PCR對水稻白葉枯病菌進(jìn)行擴(kuò)增，得到片段大小為964bp的擴(kuò)增引物。該方 法可以快速簡便的從受侵染的稻種和稻株上檢測到白葉枯病菌，但是引物的轉(zhuǎn)化 性不夠強(qiáng)，不能很好的區(qū)分出條斑病菌。廖曉蘭等(2003)成功建立了水稻白葉 枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌快速檢測鑒定的實(shí)時熒光PCR方法。結(jié)果表明，兩個特 異性探針能分別特異性檢測到病原菌產(chǎn)生的熒光信號而其他參試菌不產(chǎn)生熒光信 號，檢測靈敏度為103cfWml-105cfWml，該方法可以有效地避免傳統(tǒng)PCR方法無 法避免的非特異性擴(kuò)增和假陽性現(xiàn)象。近年來的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，水稻白葉枯病和條斑病在同一稻田可以同時發(fā)生， 甚至在同一葉片上出現(xiàn)兩種病害的癥狀(黃瑞榮等，1996)。已有許多研究者通 過設(shè)計專化性引物來檢測白葉枯病菌和條斑病菌，但是由于這兩種病菌是水稻黃 單胞菌的不同致病變種，在生理生化等方面比較類似，還存在不同程度的交互抑 制作用(王長方等，1999)，通過PCR擴(kuò)增往往產(chǎn)生交叉反應(yīng)，因而很難把白葉 枯病菌和條斑病菌完全區(qū)分開來。雖然，在實(shí)時定量PCR應(yīng)用到植物病原菌檢測 以后，通過在實(shí)時定量PCR的反應(yīng)體系中加入不同的熒光染料，根據(jù)不同染料發(fā) 出熒光顏色的差異來區(qū)分不同的病原物(Heide/a/，1996)。但是，這種方法仍存在 缺陷，由于受到引物設(shè)計問題、熒光染料的種類和熒光定量PCR儀光源是單一光 源問題(Martin^a/，2000)，因此不能同時檢測非常多的病原物。所以我們極有必 要建立能夠同時檢測這兩種病原菌的多重檢測方法。
Padlock探針(PLPs)的發(fā)明為植物病原菌的高通量分子檢測提供了一條新的 思路。Padlock探針是一條長度為100bp左右的單核苷酸探針(

圖1),包括磷酸化 的5'端和羥基化的3'端，這兩端能夠識別特定目標(biāo)物的DNA序列(Nilsson " a/, 1994),我們通常稱之為T1端和T2端。在T1端和T2之間，存在著一段通用序 列和一段特異序列，我們稱之為P1、 P2端和ZipCode。在進(jìn)行反應(yīng)時，首先將 padlock探針和要檢測的目標(biāo)DNA進(jìn)行連接，在TaqDNA連接酶的作用下，探針 的Tl端和T2端通過和特定的檢測靶標(biāo)物的DNA序列互補(bǔ)而相結(jié)合，探針的5' 端和3'端連成環(huán)狀。由于ra《DNA連接酶的特性，只有DNA序列和探針的T1 端和T2端完全互補(bǔ)時，探針才能形成環(huán)狀，否則，探針以線性存在。采用核酸 外切酶去除沒有形成環(huán)狀的探針和錯配的探針，然后采用所有探針的通用端Tl 端和T2端的引物對切除后的產(chǎn)物進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。然后將擴(kuò)增后的產(chǎn)物與固定在 膜上或者M(jìn)icroarray上的與ZipCode序列互補(bǔ)的核酸序列進(jìn)行雜交(Shoemaker W fl/， 1996)。通過膜上的地高辛標(biāo)記信號或者M(jìn)icroarray上的熒光來判斷檢測樣品 中是否有特定的病原物。由于padlock探針可與Macroarray或者M(jìn)icroarray技術(shù) 相結(jié)合，因此能夠在檢測的過程中實(shí)現(xiàn)高通量(HardenbolWa/,2003)。目前， padlock探針獨(dú)特的設(shè)計多與基因芯片相結(jié)合應(yīng)用于病毒性疾病分子的檢測 (Baner J W fl/，2007)和單核苷酸突變檢測當(dāng)中(Baner J e, "/，2003)。目前尚未有將 padlock探針應(yīng)用于植物病原菌實(shí)際檢測的實(shí)例。參考文獻(xiàn)
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發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中對水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌 的分子檢測方法難以實(shí)現(xiàn)多重檢測等問題，提供分別用于檢測水稻白葉枯病菌和 水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針以及同時檢測這兩種病原菌的分子檢測方 法，對水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行檢測，靈敏度高、特異性強(qiáng)。技術(shù)方案
本發(fā)明的目的意在克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供快速、可靠、靈敏度高、 特異性強(qiáng)的檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針和檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌的 padlock探針以及能夠同時檢測這兩種病原菌的分子檢測方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案
1) 用于檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列
2) 用于檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針序列
探針的靶標(biāo)識別序列(即5'末端和3'末端)取自待測病原菌16S-23S rDNA (ITS)區(qū)域特異的核酸序列。探針中間PiP2 (CTCGACCGTTAGCAGCATGACCG AGATGTACCGCTATCGT)為通用引物結(jié)合區(qū)，加下劃線的堿基序列(即Zipcode 序列)用于識別固定在尼龍膜上的cZipcode探針。
3) Padlock探針是一種長寡核苷酸探針，其兩端的序列可通過核酸間的互補(bǔ)與靶 標(biāo)DNA結(jié)合。通過和耙標(biāo)DNA的雜交，padlock探針的兩端在連接酶的作用下連 成環(huán)狀，具有非常高的特異性。Padlock探針可與Macroarray技術(shù)結(jié)合進(jìn)行多重 檢測。Padlock探針結(jié)合Macroarray技術(shù)檢測方法，包括如下步驟(1)探針 的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，在 TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測靶標(biāo)物的DNA序列互 補(bǔ)而相結(jié)合，探針的5'末端和3'末端連成環(huán)狀。采用核酸外切酶去除沒有形成環(huán) 狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴(kuò)增。采用兩條探針P-x.o.o、 P-x.o.oc經(jīng)
地高辛標(biāo)記的通用引物對連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。(3) Macroaary多重檢測。將擴(kuò) 增后的產(chǎn)物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補(bǔ)的探針(cZipcode探針) 進(jìn)行雜交。通過膜上的地高辛標(biāo)記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。 有益效果采用上述技術(shù)方案，突出的技術(shù)進(jìn)步在于 (1)本發(fā)明設(shè)計了分別適用于水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌檢測的 padlock探針。(2)本發(fā)明利用padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對水 稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的多重檢測，檢測方法可靠、靈敏度高、特異性 強(qiáng)。(3)采用padlock探針作為分子檢測工具，有效地避免傳統(tǒng)PCR檢測方法的假陽性現(xiàn)象。傳統(tǒng)的基于PCR擴(kuò)增的分子檢測通常只能檢測單種病原物，熒光 定量PCR的出現(xiàn)在一定程度上解決了這一問題，通過在反應(yīng)的體系中添加不同熒 光染料，可以同時檢測l種以上的病原物。但是由于熒光染料種類的限制和彼此 之間的干擾，采用這種方法對多種病原物進(jìn)行檢測時候效果往往不好。采用 padlock探針作為分子檢測工具，結(jié)合Macroaary技術(shù)彌補(bǔ)了實(shí)時定量PCR檢測 因受到引物設(shè)計問題、熒光染料的種類和熒光定量PCR儀光源是單一光源等問題 而不能同時檢測非常多的病原物的不足。 (四)說明書附圖
圖1. Padlock探針結(jié)構(gòu)示意圖及檢測原理。 圖2A.水稻白葉枯病菌特異性驗(yàn)證結(jié)果。
M為DNA Maker DL2000, 1~10為水稻白葉枯病菌，11~21為其他細(xì)菌，22為陰性 對照。
圖2B.水稻細(xì)菌性條斑病菌特異性驗(yàn)證結(jié)果
M為DNA Maker DL2000, 1~10為水稻細(xì)菌性條斑病菌，11 22為其他細(xì)菌，23為 陰性對照。
圖3水稻白葉枯和水稻細(xì)菌性條斑的靈敏度驗(yàn)證結(jié)果。
M為DNA Maker DL2000, 1-6為病原菌DNA依次為10 ng 、 lng、 100pg、 10pg、 lpg、 lOOfg 7為陰性對照。分別以十倍梯度稀釋的DNA為模板，利用padlock探針檢 測，最低可檢測到lpg。
圖4水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的多重檢測結(jié)果。 ， A. Jfawf/zoOTOwos oryzae pv. oryzae; B. A2 "^zo附owo oryzore pv.ofyz/co/a; CJTa加/20附owos or少zae pv. 0^/zag and Xaw^ 歸owas or_yzfl6 pv.o;-戸'co/a; D. Layout of multi-chamber universal tag array on nylon membrane. cZip control= TATGGTCGG CAATTCCCTGC。
結(jié)果表明，利用padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)可以成功地對水稻白葉枯病 菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行多重檢測。
圖5利用Padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)對田間發(fā)病的水稻樣品檢測結(jié)果。
結(jié)果表明，利用padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)可以成功地對田間發(fā)病的水 稻樣品進(jìn)行檢測。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1: 一種利用padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)的多重檢測方法，用于同 時檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌。 用于檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列
用于檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針序列
(1)連接反應(yīng)液包括20mM Tris-HCL， pH 9.0， 25 mM KCH3COO， 10 mM Mg(CH3COO)2， 10 mM DTT, 1 tnM NAD, 0.1% Triton X-100, 2.4 U T叫DNA連接 酶，lpl待測模板，探針P-x.o.oc 、 P-x.o.oc各100pm。連接的反應(yīng)程序?yàn)?5。C預(yù) 變性5分鐘；然后進(jìn)入循環(huán)，95'C變性30秒，65'C連接5分鐘，反應(yīng)共進(jìn)行20 個循環(huán)；然后95'C滅活15分鐘。采用核酸外切酶切除自連和錯連的探針在連 接后的產(chǎn)物中加入2個單位的核酸外切酶I和2個單位的核酸外切酶III， 37'C反 應(yīng)2個小時，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物95'C滅活3小時。
(2) 采用經(jīng)地高辛標(biāo)記的通用引物P1-F (5'-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3，) P2-R(5'-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3')對連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液包括 0.5 nMPl-F和P2-R，4種dNTP各50 ^M，2.5 (jl 10xPCR反應(yīng)緩沖液，2 mMc Mg2+， 2.5|all%BSA， 1.25單位Taq酶(TaKaRa)， 3pl經(jīng)核酸外切酶處理后的連接產(chǎn)物。 反應(yīng)程序?yàn)?4'C預(yù)變性5 min;然后進(jìn)入循環(huán)，94。C變性30 sec， 6(TC退火30 sec， 72。C延伸30sec，共35個循環(huán)；最后72。C延伸7 min。
(3) Macroaary多重檢測。各取lpL cZipcode探針點(diǎn)于尼龍膜上，，每條 cZipcode探針重復(fù)4次，經(jīng)紫外交聯(lián)30s固定。將固定好的膜放入雜交管中，加 入預(yù)雜交液(0.02% SDS、 5xSSC、 50%去離子甲酰胺、0.1%N-laurysarosine、 50 mmol丄-1磷酸鈉、pH 7.0 2%封閉劑)于雜交爐中42。C預(yù)雜交lh,棄預(yù)雜交液， 將經(jīng)地高辛標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物沸水浴中變性10rain，迅速移至冰上，5分鐘后加入預(yù) 雜交液中，42'C雜交過夜后，用大量2XSSC、 0.1% SDS室溫洗膜2次，每次5 min，再用0.5XSSC、 0.1% SDS于68。C洗膜2次，每次15min。洗膜后把膜加 入洗滌液(0.1 mol.L"馬來酸、0.15mol.L"NaCl， pH7.5、 0.3%吐溫)中洗膜2 min,棄去，用封閉液(1%封閉劑、0.1 mol.L"馬來酸、0.15 mol.L" NaCl， pH7.5)封閉30min后，加入用封閉液稀釋了 5 000倍的Anti-DIG-AP，輕搖30 min。 最后，將結(jié)合完抗體的膜用洗滌液洗膜2次，每次15min，加入檢測液(O.lmoH/1 Tris-HCl、 0.1 mol.L"NaCl、 pH9.5)平衡3 min,再加入NBT/BCIP溶液，黑暗 中靜止顯色2h，待觀察到理想的顯色后，用無菌水浸泡10min終止反應(yīng)，進(jìn)行 拍照。通過膜上的地高辛標(biāo)記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。 實(shí)例l從安徽發(fā)病的水稻中檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌
上述水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的padlock檢測探針及其多重檢測方法 用于檢測安徽的發(fā)病水稻，方法包括
1) 將安徽發(fā)病的水稻樣品分別從其根部(R)、莖桿(S)以及葉片(L)提取DNA作為 檢測模板，提取方法參照McMcouchSR (1988)。
2) 參照上述技術(shù)方案利用padlock檢測探針P-xoo、 P-xooc結(jié)合Macroaary檢測
樣品。檢測結(jié)果見圖5。結(jié)果表明從安徽發(fā)病的60份水稻樣品中共檢測出19份 帶有白葉枯病菌，17分帶有細(xì)菌性條斑病菌。證明了上述技術(shù)方案能夠應(yīng)用于水 稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的實(shí)際檢測。
權(quán)利要求
1、用于檢測水稻白葉枯病菌的padlock探針序列P-x.o.o5’-GGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTAPIP2＊GAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC-3’
2、 用于檢測水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針序列
3、 權(quán)利要求Padlock探針結(jié)合Macroarray技術(shù)檢測方法，包括如下步驟(1)探針的連接與外切酶處理。首先將padlock探針和待檢測的目標(biāo)DNA進(jìn)行 雜交，在TaqDNA連接酶的作用下，探針的兩端通過與特定的檢測耙標(biāo)物的DNA 序列互補(bǔ)而相結(jié)合，探針的5'末端和3，末端連成環(huán)狀。采用核酸外切酶去除沒有 形成環(huán)狀的探針和錯配的探針。(2)探針的擴(kuò)增。采用兩條探針P-x.0.0、 P-x.o.oc 經(jīng)地高辛標(biāo)記的通用引物對連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。(3) Macroaary多重檢測。將 擴(kuò)增后的產(chǎn)物與固定在膜上的與探針上的ZipCode序列互補(bǔ)的探針(cZipcode探 針)進(jìn)行雜交。通過膜上的地高辛標(biāo)記信號來判斷檢測樣品中哪些病原物。
全文摘要
本發(fā)明用于檢測水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針及其多重檢測方法屬于農(nóng)作物防病治病及植物檢疫范疇。水稻白葉枯病菌的padlock探針序列P-x.o.oGGAGCTATATGCCGTGCTGTGTGGAGTACTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGAATCGCCTACAATTCTGTCCCCCAAGTTGCCTC。水稻細(xì)菌性條斑病菌的padlock探針序列P-x.o.ocCCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC。以此探針為基礎(chǔ)結(jié)合Macroaary技術(shù)能夠同時檢測水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌，這種多重檢測方法具較強(qiáng)的特異性、靈敏性及穩(wěn)定性，為水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的檢測提供了快速、靈敏、特異的技術(shù)方法。圖為Padlock探針結(jié)合Macroaary技術(shù)同時檢測水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌結(jié)果。
文檔編號C12R1/64GK101608235SQ20091003012
公開日2009年12月23日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 王源超, 田艷麗, 胡白石, 鄭小波 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)