專利名稱：：一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應(yīng)用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測(cè)出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。
背景技術(shù)：
：在本文中，術(shù)語(yǔ)"Rh"是恒河猴(RhesusMacacus)外文名稱的頭兩個(gè)字母。RhD抗原自1939年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因?qū)е滦律鷥喝苎　l(fā)生血管外遲發(fā)性溶血性輸血反應(yīng)而成為紅細(xì)胞中僅次于ABO血型的重要抗原。Rh血型的抗原性很強(qiáng)，尤其以D抗原最強(qiáng)，僅次于ABO系統(tǒng)的A和B抗原。凡是人紅細(xì)胞上有RhD抗原者，為Rh陽(yáng)性，反之為陰性。RhD陰性血型在中國(guó)人中所占比例約為3596e，屬于稀有血型。50%75。/。的Rh陰性個(gè)體通過(guò)輸血和妊娠，可受D抗原紅細(xì)胞免疫而產(chǎn)生抗D;隨著對(duì)Rh血型的不斷研究，認(rèn)為Rh血型系統(tǒng)可能是紅細(xì)胞血型中最為復(fù)雜的一個(gè)血型系。世界各國(guó)的衛(wèi)生組織都嚴(yán)格規(guī)定，個(gè)體在輸血時(shí)，只能輸用Rh陰性血液。Rh血型的發(fā)現(xiàn)，對(duì)更加科學(xué)地指導(dǎo)輸血工作和進(jìn)一步提高新生兒溶血病的實(shí)驗(yàn)診斷和維護(hù)母嬰健康，都有非常重要的意義。Rh抗原是由位于l號(hào)染色體短臂上的兩個(gè)同源及緊密連鎖的基因所編碼，即RhD和RhCE基因，每個(gè)基因都是由10個(gè)外顯子組成；RhD基因編碼D抗原，RhCE基因編碼Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內(nèi)含子有93.8%的同源性，外顯子l7編碼5060個(gè)氨基酸，外顯子810編碼最后58個(gè)殘基。兩者最顯著的區(qū)別是內(nèi)含子4，RhD的內(nèi)含子4少了約600bp。RhD和RhCE基因分別長(zhǎng)57295bp和57831bp，兩個(gè)基因相隔約30kb，尾對(duì)尾形成排列(5，RhD3，-3，RhCE5，)，中間隔差一個(gè)功能未知的小膜蛋白l基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個(gè)具有98.6M同源性的區(qū)域被稱為Rh盒子(Rhboxes);RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。見(jiàn)附圖l。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一些血清學(xué)初檢RhD陰性的個(gè)體經(jīng)過(guò)進(jìn)一步敏感的血清學(xué)檢驗(yàn)，如吸收放散試驗(yàn)，可以能檢出D抗原的存在，即部分RhD陰性個(gè)體擁有難以檢測(cè)出的D抗原。進(jìn)一步的研究顯示，此類D抗原又可以分為部分D(partrial-D)和弱表現(xiàn)型D(weak-D)兩種類型；部分D個(gè)體制表達(dá)部分而非完整的D抗原，在數(shù)量和本質(zhì)上都與RhD陽(yáng)性的D抗原有區(qū)別，而弱D表達(dá)的D抗原是完整的與RhD陽(yáng)性相比，只有在D抗原數(shù)量上有顯著區(qū)別。這兩類特殊血型中都可以檢出D基因，這就有兩個(gè)方面值得探討一是這些個(gè)體的基因?qū)儆诔聊蚧驘o(wú)效基因；二是這些個(gè)體并非真實(shí)RhD陰性，而是D抗原較弱，一般檢測(cè)方法未檢測(cè)到RhD抗原?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RhD陰性的個(gè)體中存在著一種重要的RhD的弱表現(xiàn)型DEL(D-elution，elution中文意為洗脫)，DEL在所占比例在不同文獻(xiàn)報(bào)告中所占的比例也不同，國(guó)外報(bào)告在黑人和日本人中DEL4比例較高，約3050%，中國(guó)人初篩RhD陰性的人群中香港報(bào)告DEL占30X，內(nèi)地占20~30%。目前已證實(shí)DEL基因外顯子均無(wú)缺失，RhD基因表達(dá)調(diào)控的差異可能是DEL的產(chǎn)生原因，已有的研究顯示在中國(guó)大陸、中國(guó)臺(tái)灣和日本等地的DEL血型，都是由于在RhD基因第9外顯子的1227位發(fā)生GA的突變引起的，導(dǎo)致mRNA產(chǎn)生變異，使蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少，但抗原性質(zhì)未變；而1227位的G〉A(chǔ)突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標(biāo)記。DEL血型引起了日益增加的關(guān)注主要源于兩個(gè)方面一是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)DEL血型作為RhD陰性血型對(duì)待，DEL血液仍用于供給RhD陰性患者使用，但國(guó)內(nèi)外都有越來(lái)越多的報(bào)道證實(shí)RhD陰性患者輸用DEL血液后，產(chǎn)生了抗-D抗體或體內(nèi)抗-D抗體效價(jià)升高，可能引起輸血反應(yīng)，成為臨床輸血中的不安全因素；二是DEL表達(dá)的D抗原是完整的D抗原，DEL血型的患者是否能夠輸用D陽(yáng)性血液，從而節(jié)約寶貴的RhD陰性血液資源？以上的研究都必須對(duì)DEL血型進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，同時(shí)大規(guī)模的檢測(cè)也需要采用可靠、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的方法才能夠進(jìn)行。用免疫血清學(xué)的方法對(duì)DEL血型的檢出有賴于使用的抗-D試劑和操作方法，可靠性較低，而且由于步驟繁瑣而不適合臨床大規(guī)模應(yīng)用，可靠的方法是應(yīng)用基因檢測(cè)的方法來(lái)檢出DEL血型。目前，國(guó)外已有多種根據(jù)1227位發(fā)生G〉A(chǔ)的突變而設(shè)計(jì)的檢測(cè)試劑盒問(wèn)世，可用于DEL血型的檢出，但存在以下缺點(diǎn)1、價(jià)格昂貴產(chǎn)自德國(guó)的BAG和INNO-TRAIN公司的D基因檢測(cè)試劑雖然可靠性好，但每人份約需12001300人民幣元，非常昂貴；產(chǎn)自美國(guó)G&T公司試劑，雖然每人份約需100人民幣元，但可靠性較差，而且這個(gè)價(jià)格仍然是大規(guī)模檢測(cè)難以承受的；2、操作繁瑣德國(guó)的BAG和IVIN公司的D基因檢測(cè)試劑每人份需要48個(gè)反應(yīng)管，而美國(guó)G&T公司試劑每人份需要12個(gè)反應(yīng)管，樣本DNA和耗材的消耗量很大，而且加樣繁瑣，容易出錯(cuò)，同時(shí)判讀困難，不適于大規(guī)模的檢測(cè)工作；3、內(nèi)對(duì)照均為人類生長(zhǎng)激素基因，但我們實(shí)際使用中發(fā)現(xiàn)有內(nèi)對(duì)照有擴(kuò)增條帶，但檢測(cè)帶無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，不能判斷有些陰性結(jié)果是否是由于Rh基因降解所致。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服前述試劑的缺點(diǎn)，提供一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便和直觀的分子生物學(xué)方法以及實(shí)施該方法的試劑盒。本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及為實(shí)施該方法制備的體外診斷試劑盒，用于檢測(cè)人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發(fā)明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點(diǎn)的改變，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)完成的。因此，本發(fā)明可被視為是基于PCR-SSP(Sequencespecificprimer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對(duì)不同位點(diǎn)而設(shè)計(jì)出序列特異性引物，然后通過(guò)優(yōu)化序列特異性引物的混合比例、反應(yīng)緩沖液組分和PCR反應(yīng)條件，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)出人類RhD血型基因型的目的。在本文中，術(shù)語(yǔ)"多重PCR"是指通過(guò)在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)完成多個(gè)基因的擴(kuò)增的篩選檢測(cè)方法。研究表明，對(duì)于成功進(jìn)行多重PCR尤為重要的因素是用于擴(kuò)增不同基因的不同引物對(duì)之間的相對(duì)濃度、PCR緩沖液的濃度、循環(huán)溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入12.8^1PCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0pldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA,充分混合；(2)將Ependofff放入PCR擴(kuò)增儀中，94'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(94°C、40秒，56°C、40秒和72'C、2分鐘)，隨后72"延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;(3)取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照其中，所淑CR引物緩沖液包含2.0pl500mMKCl、2.0nl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.0pl25mMMgCl2、0.2nl1.0M(NH4)2SO4、0~2.0plDMSO、0~1.0(il甘油和4.06.1plDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp，其設(shè)計(jì)原理見(jiàn)附圖2，序列見(jiàn)表l。所有引物的濃度均為25pmol/pJ，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA，充分混合；(2)將Ependofff放入PCR擴(kuò)增儀中，94。C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(94°C、40秒，56°C、40秒和72'C、2分鐘)，隨后72'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;以及(3)取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；其中，所^PCR引物緩沖液包含.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pi25mMMgCl2、0.2nl1.OM(NH4)2S04、1.0plDMSO和5.0plDDW。所有引物的濃度均為25pmol/nl，所述引物混合物混合比例為SEQIDN01:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:65:6i在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物l管；(5)陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及(6)使用說(shuō)明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.0tU25mMMgCl2、0.2p1.0M(NH4)2SO4、02.0nlDMSO、0~1.0^1甘油和4.0~6.1plDDW;所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp，其設(shè)計(jì)原理見(jiàn)附圖2，序列見(jiàn)表l。所有引物的濃度均為25pmol/pl，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及(6)使用說(shuō)明書；其中，所淑CR引物緩沖液包含.Ojil500mMKC1、2.0pi100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2fill.OM(NH4)2S04、〗.0filDMSO和5.0filDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08?；旌媳壤秊镾EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及所述試劑盒在檢測(cè)人類RhD血型基因型中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測(cè)人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在附圖和下面的說(shuō)明中有描述。通過(guò)閱讀附圖、詳細(xì)描述和權(quán)利要求可以清楚地了解本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。附圖1描述的是Rh血型基因組結(jié)構(gòu)圖。RhD和處CE基因尾對(duì)尾形成排列(5'RhD3，-3，RhCE5')，中間隔差一個(gè)功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基因)，RhD基因的兩端存在有兩個(gè)具有98.6%同源性的區(qū)域被稱為Rh盒子(Rhboxes);從圖中可以看到RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基因部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基因的特征。附圖2是RhD血型基因型檢測(cè)試劑盒引物設(shè)計(jì)原理圖，描述的是設(shè)計(jì)的引物所針對(duì)的D基因位置及特異性示意圖。本發(fā)明引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，SEQIDNOl最末堿基針對(duì)1227位發(fā)生G>A的突變而設(shè)計(jì)，SEQIDN02位于第9、10外顯子之間的內(nèi)含子中，引物擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDNO4分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物,作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，其中SEQIDN052位于第9、IO外顯子之間的內(nèi)含子中，無(wú)序列特異性，SEQIDN06位于RhD基因第IO外顯子中，與同位置RhCE基因有11個(gè)堿基差異，具有序列特異性，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQIDN07位于上游Rh盒子基因內(nèi)，在下游Rh盒子基因無(wú)相同序列，SEQIDN08位于下游Rh盒子基因內(nèi)，在上游Rh盒子基因無(wú)相同序列，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp。圖中紅色為3，端位點(diǎn)不符，不能進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增，顯示出本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物具有很好的特異性。附圖3為單對(duì)引物的PCR反應(yīng)電泳圖，通過(guò)單對(duì)引物的PCR反應(yīng)結(jié)果，A為SEQIDNOl和SEQIDN02擴(kuò)增結(jié)果，產(chǎn)物大小為102bp,與目標(biāo)產(chǎn)物相符；B為SEQIDN03和SEQIDN04、SEQIDN05和SEQIDN06擴(kuò)增結(jié)果，都獲得了目的片斷；C為SEQIDN07和SEQBDN08擴(kuò)增結(jié)果，比對(duì)DL2000的標(biāo)尺，產(chǎn)物大小為2000bp左右，與目的片斷的大小相符，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物合適。附圖4為引物不同比例混合PCR電泳圖，其中，模板為DEL/d型，Marker為DL2000，描述的引物在不同比例的混合后PCR反應(yīng)電泳的結(jié)果，樣本為DEL/d，目標(biāo)條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp,從圖中可見(jiàn)，混合組分3和4可以將樣本DEL/d的所有4個(gè)條帶擴(kuò)增出來(lái)，適用于本發(fā)明的多重PCR方法，其中組分3各產(chǎn)物的量較組分4更為均衡，為最佳混合比例，組分4為可選混合比例，其他混合比例都不能擴(kuò)增出全部條帶。附圖5顯示的是不同配方緩沖液對(duì)混合PCR的影響，模板DNA為已知的DEL/d型，目標(biāo)條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp，從圖中可見(jiàn)只有7號(hào)配方能夠是PCR反應(yīng)擴(kuò)增出所有目標(biāo)條帶，而其他配方都有條帶丟失，說(shuō)明不適于本發(fā)明。雖然在多重反應(yīng)中，有報(bào)道5e/^10。/。的DMSO和甘油可以改善擴(kuò)增的效率(提高產(chǎn)物量)和特異性(沒(méi)有非特異性產(chǎn)物)，但在本發(fā)明中，5。/。的DMSO是反應(yīng)的最佳濃度，增加和減少都對(duì)反應(yīng)不利。而甘油的添加對(duì)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴(kuò)增的效率，但在本發(fā)明中也沒(méi)有作用。'附圖6顯示的是不同的退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響。樣本DNA為4例DEL，目的條帶3條，分別為102bp、206bp和261bp;2例DEL/d，目標(biāo)條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;l例d/d，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和1921bp;1例D/D型，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和261bp。圖中可見(jiàn)，5'C和5°C的退火溫度是反應(yīng)出現(xiàn)了非特異性的條帶，而5'C的退火溫度使部分條帶未被擴(kuò)增出來(lái)，而5"C退火溫度條件下，己知基因型的樣本都被正確檢出。附圖7'為本試劑盒檢測(cè)RhD基因型電泳圖，其中，M:Marker,Takara，DL2000。1、2為INNO-TRAIN公司的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控對(duì)照，l為D/d型，2為d/d型，38為待測(cè)樣本，3為D/D，4為D/d,5為del/d,6為d/d,7為del/d，8為d/d。描述的是檢測(cè)本試劑盒靈敏度和特異性的試驗(yàn)結(jié)果，判定格局為D/d型，目標(biāo)條帶為3條，分別為206bp、261bp和1921bp;d/d型，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和1921bp;D/D型，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和261bp。DEL/d，目標(biāo)條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;根據(jù)不同的條帶可以判斷出檢測(cè)結(jié)果，INNO-TRAIN公司的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控對(duì)照D/d型和d/d型也被準(zhǔn)確檢出。附圖8為INNO-TRAIN公司試劑盒RhD基因分型電泳圖。描述的是用本發(fā)明試劑檢出的D/d型、DEL/d型和d/d型用INNO-TRAIN公司的D基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行復(fù)檢，根據(jù)表5的格局判斷結(jié)果，兩種試劑盒結(jié)果相符。附圖9為對(duì)西安市Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者RhD基因型檢測(cè)圖，根據(jù)擴(kuò)增條帶判斷結(jié)果，D/d型，目標(biāo)條帶為3條，分別為206bp、261bp和1921bp;d/d型，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和1921bp;D/D型，目標(biāo)條帶為2條，分別為206bp和261bp。DEL/d，目標(biāo)條帶為4條，分別為102bp、206bp、261bp和1921bp;從反應(yīng)結(jié)果可以看出，樣本中有D/d型、DEL/d型、D/D型和d/d型，本發(fā)明只要一個(gè)反應(yīng)孔就可以鑒定出RhD血型的基因型，操作簡(jiǎn)便，成本低，結(jié)果易于判定，適于大樣本量篩選和檢測(cè)。已采用本試劑盒篩選了437例西安市Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者的基因型，檢出del/d基因型88例，占Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者20%，無(wú)效D基因型(D/D和D/d)33例，占7.5%。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法以及用于實(shí)施該方法的體外診斷試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可用于檢出人類RhD血型基因荊，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發(fā)明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點(diǎn)的改變，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)完成的。因此，本發(fā)明可被視為是基丁PCR-SSP(Sequencespecificprimer,序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對(duì)不同位點(diǎn)而設(shè)計(jì)山序列特異性引物，然后通過(guò)優(yōu)化序列特異性引物的混合比例、反應(yīng)緩沖液組分和PCR反應(yīng)條件，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)出人類RhD血型基閔型的目的。本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于對(duì)Rh血型基丙的認(rèn)識(shí)。Rh抗原是由位于1號(hào)染色體短臂上的兩個(gè)同源及緊密連鎖的基閔所編碼，即RhD和RhCE基因，每個(gè)基閔都是由IO個(gè)外顯子組成；RhD基丙編碼D抗原，RhCE基因編碼Cc和Ee抗原。RhD和RhCE的外顯子與內(nèi)含子有93.8%的同源性。RhD和RhCE基閔分別長(zhǎng)57295bp和57831bp，兩個(gè)基因相隔約30kb,尾對(duì)尾形成排列(5'RhD3'-3'RhCE5')，中間隔差一個(gè)功能未知的小膜蛋白1基因(SMP1基W)，RhD基因的兩端存在有兩個(gè)具有98.6^同源性的區(qū)域被稱為Rh盒子(Rhboxes);RhD陰性的RhD基因缺失，兩端的Rhboxes基岡部分缺失后熔合形成單一雜合的Rh盒子(Rhbox-hybrid),成為RhD陰性基肉的特征。中國(guó)人陸、中國(guó)臺(tái)灣和日本等地的DEL血刑，都是由丁-在RhD基閔第9外顯子的1227位發(fā)生G〉A(chǔ)的突變引起的，導(dǎo)致mRNA產(chǎn)生變異，使蛋白質(zhì)的表達(dá)量減少，但抗原性質(zhì)未變；而1227位的G〉A(chǔ)突變也成為東亞人群的特異的很重要的基因標(biāo)記。W此，設(shè)計(jì)出的引物必須能夠特異性地?cái)U(kuò)增出RhD基因而非RhCE基因，同時(shí)還能夠?qū)Σ煌腄基因型加以區(qū)分。原理見(jiàn)附圖2。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基閔型的多重PCR方法，基丁對(duì)PCR-SSP以及由此發(fā)展出的多重PCR原理的應(yīng)用。成功進(jìn)行多重PCR尤為重要的因素是用于擴(kuò)增不同基因的不同引物對(duì)之間的相對(duì)濃度、PCR緩沖液的濃度、循環(huán)溫度、氯化鎂和dNTP濃度間的平衡。該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependofft內(nèi)加入12.8plPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0pldNTP混合物、0.2^1T叫DNA聚合酶和3.0pl模板DNA，充分混合；(2)將Ependofft放入PCR擴(kuò)增儀中，9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9°C、40秒，5°C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;(3)取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。其中，緩沖液基于普通PCR緩沖液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐劑而配制，在實(shí)施方式中，試驗(yàn)過(guò)不同濃度的甘油、DMSO、(NH4)2S04和BSA等佐劑。雖然在多重反應(yīng)中，有報(bào)道5。/"10n/。的DMSO和10甘油可以改善擴(kuò)增的效率(提高產(chǎn)物量)和特異性(沒(méi)有非特異性產(chǎn)物)。本發(fā)明所述PCR引物緩沖液包含2.0pi500mMKC1、2,0pl100mMTris陽(yáng)HCl(PH9.0)、2.0pJ25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0~2.0HiDMSO、0-1.0nl甘油和4.04.1nlDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQ1DN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基岡的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQ1DN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基丙的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp，其設(shè)計(jì)原理見(jiàn)附圖2，序列見(jiàn)表l。所有引物的濃度均為25pmol/nl，在實(shí)施方式中，試驗(yàn)了多種不同引物對(duì)之間的相對(duì)濃度，采用同一模板(已知D基閔型)和反應(yīng)條件下，對(duì)比產(chǎn)物的均衡性，最終確定了引物的的最佳比例。其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQ1DN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEGIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:7。反應(yīng)條件如下9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9°C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C?？蛇x反應(yīng)條件為9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9°C、35秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7t:延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.(^ldNTP混合物、0.2WTaqDNA聚合酶和3.0jil模板DNA，充分混合；(2)將Ependofft放入PCR擴(kuò)增儀中，9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;(3)取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；在本發(fā)明中，5。/。的DMSO是反應(yīng)的最佳濃度，增加和減少都對(duì)反應(yīng)不利。而甘油的添加對(duì)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴(kuò)增的效率，但在本發(fā)明中沒(méi)有作用。本發(fā)明所述PCR引物緩沖液包含.O^500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0^DMSO和5.0plDDW。所有引物的濃度均為25pmol/nl，所述引物混合物混合比例為SEQ1DNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。在另一個(gè)實(shí)施方式中提供了本發(fā)明不同退火溫度下的反應(yīng)結(jié)果，盡管許多基因能在退火溫度為5C6'C被特異的擴(kuò)增，我們的經(jīng)驗(yàn)表明，，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增許多特異的基因時(shí)，擴(kuò)增效率高的基因會(huì)使擴(kuò)增效率低的基因的擴(kuò)增產(chǎn)量降低。將退火溫度降低4。C6。C對(duì)于在多重PCR中擴(kuò)增出同樣的基因是必需的。過(guò)低的退火溫度會(huì)出現(xiàn)非特異性的擴(kuò)增條帶，高的退火溫度會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增缺失。最終確定的反應(yīng)條件如下9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4i:。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基閑型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP泡合物1管；(5)陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及(6)使用說(shuō)明書；其中，所述的PCR引物緩沖液包含2.0^1500mMKCl、2.0pllOOmMTris-HCl(PH9.0)、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2SO4、0~2.0plDMSO、0~1.0^1甘油和4.0~6.1plDDW;所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基閑的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯于的上下游引物，作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp，其設(shè)計(jì)原理見(jiàn)附圖2，序列見(jiàn)表l。所有引物的濃度均為25pmol/nl，其混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5，可選比例EQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQTDN05:SEQIDN06:SEQTDN07:SEQIDN08=3.5:3.5:1.5:在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血辨基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及(6)使用說(shuō)明書；其中，所述PCR引物緩沖液包含2.0pi500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0nlDMSO和5.0nlDDW。所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDNCM、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。泡合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。反應(yīng)條件如下9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9°C、40秒，5°C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4i:。取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及所述試劑盒在檢測(cè)人類RhD血型基肉荊中的用途。試劑盒為體外診斷試劑盒，用于檢測(cè)人類RhD血型基因荊，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因難。包含本發(fā)明所使用的多種其他試劑，如dNTP-Mk和Taq酶為非限制性的?，F(xiàn)在已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考下面的實(shí)施例可以更容易地理解本發(fā)明，下面的實(shí)施例是通過(guò)說(shuō)明的方式提供的，并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制，除非特別說(shuō)明。實(shí)施例實(shí)施例l引物序列的設(shè)計(jì)根據(jù)特異性的位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列，所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQTDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08。其中SEQIDNOl和SEQIDN02分別為特異性擴(kuò)增位于第9外顯子的DEL基因的上下游引物，SEQIDNOl最末堿基針對(duì)1227位發(fā)生G>A的突變而設(shè)計(jì)，SEQIDN02位于第9、10外顯子之間的內(nèi)含子中，引物擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為102bp;SEQIDN03和SEQIDN04分別為擴(kuò)增位于RhD和RhCE基因第8外顯子的上下游引物，作為內(nèi)對(duì)照使用，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為206bp;SEQIDN05和SEQIDN06分別為特異性擴(kuò)增位于第10外顯子的RhD基因的上下游引物，其中SEQIDN052位于第9、10外顯子之間的內(nèi)含子中，無(wú)序列特異性，SEQIDN06位于RhD基因第lO外顯子中，與同位置RhCE基因有11個(gè)堿基差異，具有序列特異性，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為261bp;SEQIDN07和SEQIDN08分別為特異性擴(kuò)增雜合的Rh盒子基因的上下游引物，其中SEQIDN07位于上游Rh盒子基因內(nèi)，在下游Rh盒子基因無(wú)相同序列，SEQIDN08位于下游Rh盒子基因內(nèi)，在上游Rh盒子基因無(wú)相同序列，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為在1921bp，其設(shè)計(jì)原理見(jiàn)附圖2，序列見(jiàn)表l表l本發(fā)明引物序列表引物名稱引物序列產(chǎn)物大小引物特異性SEQIDNOl5'-ATGACCAAGTTTTCTGGAAA-3'102bpDEL基因SEQIDN025'-CAGCAAGTCAACATATATACT-3'SEQIDN035'-ACTGACACCGACAGTCCTT-3'206bp內(nèi)對(duì)照SEQIDN045'-GCTGTGTCCTGGCAATGGT-3'SEQIDN055'-GTAATGAGACATTTAGGCT-3'261bpD基因SE(JIDN065'-CAACTCCATTTTCTCTGACT-3'SEQIDN075'-AAGGTTTCCAAACCCCAA-3'1921bpRhbox勿brid(RhD陰性)SEQIDN085'-CTCTTTTCTGGCCTTAACAT-3'實(shí)施例2單對(duì)引物的PCR反應(yīng)通過(guò)單對(duì)引物的PCR反應(yīng)來(lái)驗(yàn)證引物設(shè)計(jì)的合理性，以最終確定能夠用于多重PCR反應(yīng)的引物組分。試驗(yàn)材料為d/d、D/d和DEL型DNA，反應(yīng)緩沖液為普通PCR緩沖液，Taq酶購(gòu)自上海Promega公司，dNTP購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技公司。反應(yīng)體系為20nl:在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入1.0jil引物、2.0plPCR緩沖液、2.0pl25mMMgCl2、l.OfildNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶、3.0pl模板DNA和11.8pl雙蒸水，充分混合.根據(jù)引物的Tm值確定退火溫度，反應(yīng)條件分別如下SEQIDN01和SEQIDN02:9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、30秒，6'C、30秒和7°C、30秒)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN03和SEQIDN04:9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、30秒)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN05和SEQ1DN06:9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、30秒)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。SEQIDN07和SEQIDN08:9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附圖3，可見(jiàn)都有目的條帶，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)合理，可以擴(kuò)增出目的條帶。實(shí)施例3引物混合比例的優(yōu)化由于不同引物在同一個(gè)發(fā)應(yīng)條件下的序列親和性和擴(kuò)增效率有很大的不同，從而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物量的不同，因此通過(guò)本實(shí)施例的優(yōu)化挑選，確定能夠?qū)崿F(xiàn)各對(duì)引物都有較為明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物。弓I物同PH8.0的TE緩沖液溶解為濃度25pmol/fi1，按照表2所示為其中一次混合比例的試驗(yàn)，按照表中所示比例分組配制混合引物。根據(jù)多重PCR退火溫度設(shè)定原則，退火溫度為5°C，模板DNA為DEL/d型，反應(yīng)體系為20^1:在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入2.0nl引物混合液、2力nPCR緩沖液、2.0^25mMMgCl2、2.0nldNTP混合物、0.2^1T叫DNA聚合酶、1.0nlDMSO,3.0nJ模板DNA和7.8jxl雙蒸水，充分混合；反應(yīng)條件分別如下'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、30秒，5'C、30秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖4，從圖中可見(jiàn)，混合組分3和4可以將樣本DEL/d的所有條帶擴(kuò)增出來(lái)，適用于本發(fā)明的多重PCR方法，其中組分3各產(chǎn)物的量較組分4更為均衡，為最佳混合比例，組分4為可選混合比例，其他混合比例都不能擴(kuò)增出全部條帶，不適于本發(fā)明。表2引物混合比例表組別SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN0811:1:1:1:1:1:4:421:1:1:1:2:2:4:434:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.543.5:3.5:1.5:1.5:1.5:1.5:7:75lr1:2:2:2:361:1.5:1.5:1.5:1.5:4:473:3r1:1:2:2:4:481:1:1:1:0J:0.5:5:5實(shí)施例4PCR緩沖液的配制緩沖液基于普通PCR緩沖液的基本配方(KCl+Tris-HCl)添加佐劑而配制，在實(shí)施方式中，試驗(yàn)過(guò)不同濃度的甘油、DMSO和BSA等佐劑以及Mg^濃度等。表3為其中一組配方，以不斷增加甘油、DMSO和Mg^濃度，以對(duì)比反應(yīng)產(chǎn)物特異性和量。根據(jù)多重PCR退火溫度設(shè)定原則，退火溫度為5'C，模板DNA為DEL/d荊，反應(yīng)體系為20pl:在0.5mL的Ependoff費(fèi)內(nèi)加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶和3.0nl模板DNA,充分混合；將Ependofff放入PCR擴(kuò)增儀中，9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C;取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附圖5。從圖中可見(jiàn)，根據(jù)配方7的擴(kuò)增產(chǎn)物可以判斷出待檢DNA為DEL/d型，其他配方不能完全擴(kuò)增出所有的條帶，不適于本發(fā)明。在另一組反應(yīng)中，BSA被證明對(duì)本發(fā)明無(wú)明顯作用，而10mM(NH^SO4的終濃度被認(rèn)為是一個(gè)合適的佐劑濃度。雖然在多重反應(yīng)中，有報(bào)道5。/。10。/。的DMSO和甘油可以改善擴(kuò)增的效率(提高產(chǎn)物量)和特異性(沒(méi)有非特異性產(chǎn)物)，但在本發(fā)明中，5n/。的DMSO是反應(yīng)的最佳濃度，增加和減少都對(duì)反應(yīng)不利。而甘油的添加對(duì)反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用。同樣有描述BSA比加入DMSO和甘油更能提高PCR擴(kuò)增的效率，但在本發(fā)明中沒(méi)有作用。因此，本發(fā)明提供的PCR反應(yīng)緩沖液配方比例如下2.0^1500mMKCl、2.0^1100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6pl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0(ilDMSO和5.0(ilDDW。表3PCR緩沖液配方表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例5不同退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響在確定了引物混合比例和緩沖液配制組分后，通過(guò)不同退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響，以確定最佳反應(yīng)溫度。樣本為4例DEL,2例DEL/d，l例d/d和l例D/D艱DNA。在0.5mL的Ependo贈(zèng)內(nèi)加入12,8nlPCR引物緩沖液、2.0nl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶禾n3.0pl模板DNA，充分混合；將Ependoff管放入PCR擴(kuò)增儀中，9。C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9"C、40秒'X'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠屯泳(200V，20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照；X為不同的退火溫度，按照表4所示設(shè)置，1、2、3、4為4組不同退火溫度的反應(yīng)組。表4設(shè)置的不同退火溫度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附圖6，從圖中可見(jiàn)，5r和5'C的退火溫度是反應(yīng)出現(xiàn)了非特異性的條帶，而5'C的退火溫度使部分條帶未被擴(kuò)增出來(lái)，而5"C退火溫度條件下，已知基因型的樣本都被正確檢出。本發(fā)明提供的最終反應(yīng)條件為9"C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4"C。實(shí)施例6本發(fā)明與其他試劑盒對(duì)比在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明一種檢測(cè)人類RhD血荊基因型的試劑盒，該試劑盒包含引物混合物l管；PCR引物緩沖液1管；Taq聚合酶l管；dNTP混合物l管；陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及使用說(shuō)明書其中，所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0nl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2SO4、1.0plDMSO和5.0nlDDW。待檢DNA包括有INNO-TRAIN公司的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控對(duì)照，D/d型和d/d型；按照使用說(shuō)明書，在0.5mL的Ependo贈(zèng)內(nèi)加入12.8^dPCR引物緩沖液、2.0pl引物混合物、2.0nldNTP混合物、0.2nlTaqDNA聚合酶禾U3.(^l模板DNA，充分混合；反應(yīng)條件如下9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7'C、2分鐘)，隨后7'C延仲5分鐘，然后將溫度降低到4'C;取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠電泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。INNO-TRAIN公司的檢測(cè)試劑盒可以檢出RhD基因型，，其使用方法如下取1.5ml離心管l支，按照樣木的多少(設(shè)為X個(gè)樣本)加雙蒸水42Xpl、試劑盒的紅色反應(yīng)液(redPCR)21X(il、T叫瞎(5U巾1)0.56Xnl，混勻備用；PCR反應(yīng)液配制根據(jù)樣本數(shù)的多少，取X支1.5ml離心管，并標(biāo)記好樣本編號(hào)，每管加入63^1前述配制的混合液，在加入7(ilDNA，混勻。將樣本加入試劑盒的反應(yīng)管屮，10nl/孔，共6孔。反應(yīng)條件如下9。C變性2分鐘，然后進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、20秒和6"C、l分鐘)，20個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、20秒，6'C、l分鐘和7'C、30秒)，隨后7。C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4'C。根據(jù)其反應(yīng)格局判斷檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)格局見(jiàn)表5<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>附圖7為本發(fā)明試劑盒對(duì)樣本DNA的檢出結(jié)果，試劑盒可以于檢出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。將檢出的D/d、DEL/d和d/d基因型采用INNO-TRAIN公司的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行相符性的檢測(cè)，結(jié)果完全相符，見(jiàn)附圖8;在其他的實(shí)施方式中，隨機(jī)抽取20份樣本DNA，分別采用德國(guó)INNO-TRAIN公司和美國(guó)G&T公司D基因檢測(cè)試劑檢測(cè)，其結(jié)果與本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果相符，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒有很好的可靠性。實(shí)施例7本發(fā)明試劑盒檢測(cè)RhD基因性本發(fā)明提供的一種檢測(cè)人類RhD血型基丙刑的試劑盒，該試劑盒包含弓l物混合物l管；PCR引物緩沖液l管T叫聚合酶l管；dNTP混合物l管；陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及使用說(shuō)明書；采用本試劑盒檢測(cè)西安市Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者的RhD基丙型，按照使用說(shuō)明書，在0.5mL的Ependoff管內(nèi)加入12.8nlPCR引物緩沖液、2.0^1引物混合物、2.0(xldNTP混合物、0.2^1TaqDNA聚合酶和3.0^1模板DNA，充分混合；反應(yīng)條件如下9'C變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(9'C、40秒，5'C、40秒和7°C、2分鐘)，隨后7"C延伸5分鐘，然后將溫度降低到4。C;取出PCR產(chǎn)物，4%瓊脂糖凝膠屯泳(200V,20分鐘)，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)附圖9，結(jié)果判斷參見(jiàn)附圖7，本發(fā)明只要一個(gè)反應(yīng)孔就可以鑒定出RhD血刑的基閑型，包括純合子和雜合子'如D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型，操作簡(jiǎn)便'成本低，結(jié)果易T判定，適丁-大樣本量篩選和檢測(cè)。已采用本試劑盒篩選了"7例西安市Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者的基因型，檢出del/d基因型88例'占Rh陰性無(wú)償獻(xiàn)血者加％'無(wú)效D基丙型(D/D和D/d)33例，占7.5%。引物序列表<110>陜西省血液中心<120>—種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法及試劑盒<140><141><160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ATGACCAAGTTTTCTGGAAA<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2CAGCAAGTCAACATATATACT<210>3<211>19<212>DNA<220><223><400>3ACTGACACCGACAGTCCTT<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4GCTGTGTCCTGGCAATGGT<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5GTAATGAGACATTTAGGCT<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6CAACTCCATTTTCTCTGACT<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>7AAGGTTTCCAAACCCCAA<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8CTCTTTTCTGGCCTTAACAT權(quán)利要求1、一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，該方法包括步驟(1)在0.5mL的Ependoff內(nèi)加入12.8μlPCR引物緩沖液、2.0μl引物混合物、2.0μldNTP混合物、0.2μlTaqDNA聚合酶和3.0μl模板DNA，充分混合；(2)將Ependoff管放入PCR擴(kuò)增儀中，9℃變性5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，包括9℃、40秒，5℃、40秒和7℃、2分鐘，隨后7℃延伸5分鐘，然后將溫度降低到4℃；(3)取出PCR產(chǎn)物，4％瓊脂糖凝膠電泳，200V20分鐘，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。2、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMPH9.0Tris-HCI、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0~2.0jilDMSO、0~1.0nl甘油和4.06.1plDDW。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述PCR弓I物緩沖液包含2.0nl500mMKC1、2.0pl100mMTris-HCl(PH9.0)、2.6nl25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、1.0plDMSO和5.0nlDDW。4、如權(quán)利耍求l所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物木發(fā)明引物泡合物包含SEQIDNOl、SEQ1DN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDNOS，其序列見(jiàn)說(shuō)明書中表l。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQ1DN02、SEQ1DN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQ1DN06、SEQIDN07和SEQIDN08，本發(fā)明提供的最佳混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:6.5:6.5。6、一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的試劑盒，該試劑盒包含(1)引物混合物l管；(2)PCR引物緩沖液1管；(3)Taq聚合酶1管；(4)dNTP混合物1管；(5)陽(yáng)性對(duì)照2管，陰性對(duì)照l(shuí)管；以及(6)使用說(shuō)明書。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其中所述的PCR引物緩沖液包含2.0pl500mMKC1、2.0pl100mMPH9.0Tris-HCl、2.0pi25mMMgCl2、0.2pi1.0M(NH4)2S04、0-2.0|ilDMSO、0~1.0|^1甘油和4.0~6.1HiDDW。8、如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其中所述PCR引物緩沖液包含2.0nl500mMKCl、2.0^1100mMPH9.0Tris-HCl、2.6pi25mMMgC12、0.2nl1.0M(NH4)2S04、1.0piDMSO和5.0nlDDW。9、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08,其序列見(jiàn)說(shuō)明書中表l。10、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，其中所述引物混合物包含SEQIDNOl、SEQIDN02、SEQIDN03、SEQIDN04、SEQIDN05、SEQIDN06、SEQIDN07和SEQIDN08,本發(fā)明提供的最佳混合比例為SEQIDNOl:SEQIDN02:SEQIDN03:SEQIDN04:SEQIDN05:SEQIDN06:SEQIDN07:SEQIDN08=4:4:1:1:1.5:1.5:65:6.5。11、如權(quán)利要求6-10中任一權(quán)利要求所述的試劑盒用于檢測(cè)人類RhD血型基因型，可以檢測(cè)出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。全文摘要本發(fā)明涉及一種能夠檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法，以及應(yīng)用此方法制備的體外診斷試劑盒，可以檢測(cè)出人類RhD血型基因型，包括D/D、D/d、DEL、DEL/d和d/d基因型。本發(fā)明的方法是利用人類RhD血型不同基因型的特異性序列位點(diǎn)的改變，設(shè)計(jì)多對(duì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)完成的。因此，本發(fā)明可被視為是基于PCR-SSP(Sequencespecificprimer，序列特異性引物)的原理而建立的。利用針對(duì)不同位點(diǎn)而設(shè)計(jì)出序列特異性引物，然后通過(guò)優(yōu)化序列特異性引物的混合比例、反應(yīng)緩沖液組分和PCR反應(yīng)條件，從而達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)出人類RhD血型基因型的目的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的多重PCR方法；在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人類RhD血型基因型的試劑盒。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)在附圖和說(shuō)明中有描述。通過(guò)閱讀附圖、詳細(xì)描述和權(quán)利要求可以清楚地了解本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101597642SQ20091002215公開(kāi)日2009年12月9日申請(qǐng)日期2009年4月23日優(yōu)先權(quán)日2009年4月23日發(fā)明者葉世輝,張建耕,華徐,邢荷香申請(qǐng)人:陜西省血液中心