專利名稱::Znrd1基因的小干擾rna序列及其真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,涉及胃癌細(xì)胞ZNRD1表達(dá)的逆轉(zhuǎn),尤其涉及ZNRDl基因的小干擾RNA序列及其真核表達(dá)載體。
背景技術(shù):
:ZNRDl(zincribbondomain-containing1protein)是一種鋅帶蛋白,能夠通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的選擇,或通過RNA合成的延長(zhǎng)和終止,在轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用;作為轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白,ZNRDl能夠參與對(duì)多種生理病理過程的調(diào)控。ZNRDl基因定位于人的HLA位點(diǎn),具有潛在的MHC基因治療的作用。迄今為止,化療仍是胃癌的主要治療方法之一。在反復(fù)接觸某種抗癌藥物后,腫瘤細(xì)胞可以獲得對(duì)該藥物以及其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不盡相同的多種藥物的耐受性,即多藥耐藥性(MDR)。腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的抗藥性是目前化療最棘手的問題,所以,進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞抗藥性的分子基礎(chǔ),已成為提高腫瘤治療和預(yù)后的熱點(diǎn)問題。目前,許多藥物可以用來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR,但不能從根本上解決問題,效果欠佳,而且具有一定的毒副作用。與傳統(tǒng)的藥物治療相比,基因治療具有作用特異、敏感、毒副作用低等諸多優(yōu)點(diǎn),在MDR逆轉(zhuǎn)中有廣闊的發(fā)展前景。ZNRDl基因在對(duì)化療藥物長(zhǎng)春新堿耐藥的胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR中的表達(dá)比非耐藥胃癌細(xì)胞SGC7901明顯增高,提示ZNRDl基因的表達(dá)可能在胃癌細(xì)胞多藥耐藥中扮演重要角色。將ZNRDl基因的反義核酸轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR,可降低ZNRDl蛋白的表達(dá),致使胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR對(duì)化療藥物的敏感性增強(qiáng)。但因?yàn)榉戳x核酸下調(diào)ZNRD1蛋白表達(dá)的能力有限,所以還需尋找能高度抑制ZNRD1蛋白表達(dá)的分子工具。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種ZNRDl基因的小干擾RNA(siRNA)序列,它能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞ZNRDl基因的表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種含有上述ZNRDl基因的小干擾RNA序列的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染該載體的胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物更加敏感,能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的MDR。為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)1、一種ZNRDl基因的小干擾RNA(siRNA)序列,其核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。該小干擾RNA序列以ZNRDlcDNA為模板,以正反向引物對(duì)F:ttgagccgcaatctgccaacaacatctcttcagattgcggctcttttt,R:ctagaaaaagagccgcaatctgaagagatgttgttggcagattgcggct,通過PCR擴(kuò)增得到。2、含有上述ZNRD1基因的小干擾RNA(siRNA)序列的真核表達(dá)載體,該載體的通過XbaI、BbsI多克隆位點(diǎn),將上述的ZNRDlsiRNA序列構(gòu)建于mU6pro載體質(zhì)粒中,構(gòu)建成mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體,其引入mU6pro載體質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。將mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901/VCR,通過RT-PCR和Westernblot進(jìn)行鑒定、篩選,經(jīng)過兩個(gè)月的篩選后獲得了1個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNRDl的小干擾RNA、降低了胃癌細(xì)胞ZNRDl表達(dá)的胃癌細(xì)胞克隆SGC7901/VCR-siRNA,說明mU6pro-ZNRDlsiRNA載體在真核宿主中表達(dá)成功。MTT法對(duì)上述的SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞進(jìn)行體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn),表明mU6pro-ZNRDlsiRNA載體表達(dá)下調(diào)ZNRD1的胃癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)、阿霉素(ADR),5-氟尿嘧啶(5-Flu)和順鉑(CDDP)的敏感性顯著增強(qiáng)了。將SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞和SGC7901/VCR-mU6細(xì)胞制備成纖維蛋白腫瘤細(xì)胞凝塊,然后移植正常免疫力小鼠,進(jìn)行體內(nèi)藥物敏感性實(shí)驗(yàn);結(jié)果表明,mU6pro-ZNRDlsiRNA載體表達(dá)下調(diào)ZNRDl,并顯著減少了移植瘤體積,說明下調(diào)ZNRD1顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的體內(nèi)藥物敏感性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積,結(jié)果表明,mU6pro-ZNRDlsiRNA載體表達(dá)下調(diào)ZNRD1的胃癌細(xì)胞的藥物蓄積濃度顯著增強(qiáng)了。SGC7901/VCR-siRNA凋亡細(xì)胞的DNAladder的檢測(cè)以及Annexin/PI染色法,表明mU6pro-ZNRDlsiRNA載體表達(dá)下調(diào)ZNRD1的胃癌細(xì)胞對(duì)抗凋亡能力降低。綜上體內(nèi)體外試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染mU6pro-ZNRDlsiRNA載體構(gòu)建成功且成功表達(dá)。轉(zhuǎn)染宿主后,胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素和長(zhǎng)春新堿更加敏感,與同樣劑量的化療藥物共同培養(yǎng),未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有明顯變化,而轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞則明顯凋亡。本發(fā)明提供的ZNRD基因的siRNA序列能夠與ZNRD1的RNA結(jié)合,降低ZNRD1的表達(dá);mU6pro-ZNRDlsiRNA載體是一種能高度抑制ZNRD1蛋白表達(dá)的分子工具,相較于反義核酸對(duì)下調(diào)ZNRD1表達(dá)有顯著的進(jìn)步,為胃癌細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)提供一種新的分子工具,為實(shí)現(xiàn)胃癌的基因治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。圖1是mU6pro載體質(zhì)粒圖譜。圖2是mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖3是mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體DNA測(cè)序圖。圖4a是SGC7卯l/VCR-siRNA細(xì)胞的RT-PCR鑒定圖,圖4b是SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞的免疫印跡鑒定圖。圖5是SRCA小鼠體內(nèi)SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性檢測(cè)圖;橫坐標(biāo)ADR+,藥物試驗(yàn)組;縱坐標(biāo)移植瘤體積(mm3)。圖6是流式細(xì)胞儀檢測(cè)SGC7卯l/VCR-siRNA細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積檢測(cè)圖;橫坐標(biāo)為阿霉素蓄積狀態(tài),縱坐標(biāo)為流式細(xì)胞儀測(cè)量值。圖7是SGC7901/VCR-siRNA凋亡細(xì)胞DNAladder瓊脂糖凝膠電泳圖。圖8是SGC7901/VCR-siRNA凋亡細(xì)胞Annexin/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明1、克隆ZNRD1基因小干擾RNA(siRNA)序列本發(fā)明根據(jù)GenBank提供的ZNRDl基因cDNA序列為模板,通過人工PCR設(shè)計(jì)合成發(fā)卡樣ZNRD1小干擾RNA(siRNA),克隆ZNRDl基因的siRNA的正向弓l物(forwardprimer)、反向弓l物(reverseprimer)為F:ttgagccgcaatctgccaacaacatctcttcagattgcggctctttttR:ctagaaaaagagccgcaatctgaagagatgttgttggcagattgcggct反應(yīng)體系為5^1的forwardprimer+5|il的reverseprimer+2x緩沖液(Buffer)20|il+10(xl的去離子水,95""C孵育45min后緩慢(約1.53h)降溫至室溫。反應(yīng)條件95'C預(yù)變性5分鐘,30個(gè)循環(huán)(94"C變性30秒,56'C退火1分鐘,72"C延伸1分鐘),72"C延伸IO分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,按凝膠回收試劑盒說明書操作進(jìn)行,獲得的擴(kuò)增的退火產(chǎn)物(引物對(duì)+siRNA)溶液-20'C保存?zhèn)溆谩?、構(gòu)建mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體(1)mU6pro載體質(zhì)粒酶切大學(xué)的Turner教授惠贈(zèng),其多克隆位點(diǎn)分布如圖1所示。mU6pro載體質(zhì)粒酶切具體為13|ilmU6pro質(zhì)粒+2pl的10xBuffer+lpl的限制性核酸內(nèi)切酶XbaI+lpl的限制性核酸內(nèi)切酶BbsI+3^1的滅菌去離子水,37'C孵育5h。7%瓊脂糖凝膠電泳,回收線性化載體約3320bp。(2)以DL2000(DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000)將回收的線性化載體和siRNA擴(kuò)增的退火產(chǎn)物(引物對(duì)+siRNA)定量。(3)連接反應(yīng)siRNA退火產(chǎn)物與線性化載體的摩爾比為10:1,反應(yīng)體系為lpl的siRNA退火產(chǎn)物+1.6pl的線性化載體+0.5nl的T4ase(丁4連接酶)+*1的Buffer,16。C孵育1216h。(4)轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5(x感受態(tài)細(xì)菌,37"C培養(yǎng)1218h。隨機(jī)挑選數(shù)株單克隆菌落接種到約5ml的LB/Amp+培養(yǎng)基中,37。C劇烈搖菌培養(yǎng)過夜。(5)mU6pro-ZNRDlsiRNA載體鑒定單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取DNA并測(cè)序,構(gòu)建的質(zhì)粒命名為mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體,引入mU6pro載體質(zhì)粒的核苷酸是前引物+siRNA+后引物,即引物對(duì)+siRNA序列,其序列如SEQIDN0.2所示,其插入的序列與設(shè)計(jì)的ZNRD1基因的小干擾RNA序列相符。將mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體和空載體mU6pro分別J^aI和Bbsl雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖2所示,泳道l為DNAmark,泳道2為mU6pro空載體雙酶切,泳道3為mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)載體雙酶切;泳道3分別形成的400bp左右的DNA插入片段和ZNRD1的cDNA長(zhǎng)度相同。如圖3所示,載體的DNA測(cè)序結(jié)果,符合預(yù)期序列。3、mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞3.1脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞(1)將耐藥胃癌細(xì)胞株SGC7901/VCR接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)到體積比80卯%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染;(2)以mU6pro空載體+PCDNA3.1載體作為空白對(duì)照,250pl無血清培養(yǎng)液RPMI1640(購(gòu)自美國(guó)英杰生命技術(shù)公司)稀釋mU6pro-ZNRDlsiRNA載體+PCDNA3.1載體,和mU6pro空載體+PCDNA3.1載體;(3)250W無血清RPMI1640培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000,購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司),室溫放置5min;(4)將稀釋好的mU6pro-ZNRDlsiRNA載體+PCDNA3.1載體和脂質(zhì)體,mU6空載體+PCDNA3.1載體和脂質(zhì)體,混勻室溫放置20min;(5)每孔加入無血清RPMI1640培養(yǎng)液1.5ml,再加入載體和脂質(zhì)體混懸液0.5ml;(6)于37。C培養(yǎng)46h后換含10%胎牛血清(購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4860h。3.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定(1)蛋白濃度測(cè)定取SGC7901/VCR-siRNA對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,三去污裂解液裂解細(xì)胞,提取蛋白質(zhì),Bradford法測(cè)定蛋白濃度。10ml的三去污裂解液配方如下50mmol/LTris-cl(pH8.0):0.07882g,150mmol/LNaCl:0.08775g,0.2g/L疊氮鈉0.002g,1g/LSDSO.Olg,100mg/LAprotinO.OOlg,10g/LNP-40O.lg,5g/L去氧膽酸鈉0.05g,100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)O.OOlg??偟鞍壮樘岢绦騛、PBS磷酸緩沖液洗細(xì)胞3次;b、加入三去污裂解緩沖液(1.5xl(^個(gè)細(xì)胞大約加入lOOpL裂解液,或100ml細(xì)胞瓶中加入lOOpL裂解液),冰上放置20min;c、收集裂解液;d、離心12000轉(zhuǎn)/min,210min;e、吸取上清,用UV-2201紫外分光光度計(jì)(購(gòu)自日本島津公司)測(cè)定蛋白濃度,蛋白定量以保證實(shí)驗(yàn)樣品的蛋白量相等,進(jìn)行分裝,保存在-80°C備用。(2)反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblot)進(jìn)行鑒定利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將mU6pro-ZNRDlsiRNA載體轉(zhuǎn)染進(jìn)耐藥胃癌細(xì)胞系SGC7901/VCR,轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞1:10傳代同時(shí)培養(yǎng)液中加入G418(終濃度為1000pg/m),每3-5天換一次含G418的培養(yǎng)液,待長(zhǎng)出克隆后將其挑出擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行RT-PCR和Westernblot鑒定。經(jīng)過兩個(gè)月的篩選后分別獲得了1個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ZNRD1的小干擾RNA載體的細(xì)胞克隆SGC7901/VCR-siRNA及1個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的細(xì)胞克隆SGC7901/VCR-mU6pro。RT-PCR和Westernblot的結(jié)果分別如圖4a、圖4b所示;其中,泳道1:SGC7901/VCR細(xì)胞;泳道2:SGC7901/VCR-mU6pro細(xì)胞;泳道3:SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞。圖4a、圖4b顯示,以e-actin作為對(duì)照,P-actin的表達(dá)在三個(gè)泳道沒有明顯變化,說明RT-PCR和Westernblot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信。如圖4a所示,SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞中的ZNRDl的RNA水平比SGC7901/VCR細(xì)胞和SGC7901/VCR-mU6pro細(xì)胞明顯下降,說明ZNRD1的小干擾RNA載體可以顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR中的ZNRD1表達(dá)。圖4b從蛋白水平上說明,SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞中的ZNRD1的表達(dá)水平比SGC7901/VCR細(xì)胞和SGC7901/VCR-mU6pro細(xì)胞明顯下降,ZNRD1的小干擾RNA載體可以顯著抑制胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR中的ZNRD1表達(dá)。以上說明mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)成功表達(dá),成功構(gòu)建了低表達(dá)ZNRD1的SGC7卯l/VCR-siRNA胃癌細(xì)胞模型。4、MTT法mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體外藥物敏感性的影響實(shí)驗(yàn)4.1抗腫瘤藥物選擇根據(jù)各種藥物的血漿高峰濃度分別設(shè)置4個(gè)濃度梯度,如表l所示,實(shí)驗(yàn)中每種藥物的每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。表1體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)抗腫瘤藥物濃度設(shè)置(fig/mL)藥物0.01X0.IXIX10XADR(阿霉素)0.0040.040.44VCR(長(zhǎng)春新堿)0.0050.050.555-FU(5—氟尿嘧啶)0.0200.202.020CDDP(順鉑)0.0060.060.664.2實(shí)驗(yàn)步驟(1)收獲SGC7901/VCR-siRNA對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的細(xì)胞,按照每孔8xl03個(gè)細(xì)胞/200pL接種入96孔板,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜;(2)加入不同濃度的抗腫瘤藥物,繼續(xù)培養(yǎng)34天;(3)每孔加新鮮配制MTT溶液(5g/L)20^iL,37'C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí);(4)吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清,每孔加入150pL的DMSO或異丙醇,振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解;(5)波長(zhǎng)490nm,在ELISA儀上測(cè)各孔光吸收值,取每4個(gè)孔光吸收值的平均數(shù),計(jì)算細(xì)胞的存活率細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)X100%;(6)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算細(xì)胞對(duì)每種藥物的IC5Q值,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。4.3mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體外藥物敏感性的影響根據(jù)胃癌細(xì)胞對(duì)不同抗腫瘤藥物的細(xì)胞存活率計(jì)算不同藥物的IC50值,結(jié)果如表2所示,表中每組數(shù)據(jù)以"均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差"-±-)"表示。表2.胃癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性(ICso值,jig/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b,;0.05wSGC7901/VCR細(xì)胞和SGC7901/VCR-mU6細(xì)胞的ICso值采用SPSS10.0軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)t檢驗(yàn),P<0.05則被認(rèn)為有顯著差異。結(jié)果表明,SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞的IC5()值比SGC7901/VCR細(xì)胞和SGC7901/VCR-mU6細(xì)胞的ICso值顯著下降。這些結(jié)果說明,mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)下調(diào)ZNRD1,顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞SGC7901/VCR-siRNA對(duì)長(zhǎng)春新堿(VCR)、阿霉素(ADR),5-氟尿嘧啶(5-Flu)和順鉬(CDDP)的敏感性(p<0.05);而轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照細(xì)胞則沒有明顯變化。5.mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外藥物敏感性的影響實(shí)驗(yàn)5.1正常免疫力小鼠(SRCA)體內(nèi)藥物敏感性實(shí)驗(yàn)(1)制備纖維蛋白腫瘤細(xì)胞凝塊收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901/VCR-siRNA細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞SGC7901/VCR-mU6,用PBS沖洗2次,細(xì)胞計(jì)數(shù)后離心1000rpmx5min,棄去上清。將纖維蛋白原溶液(按20mg/ml濃度溶于PBS中)和凝血酶溶液(200u/ml)按2:1的體積比混均,加入細(xì)胞團(tuán)中,加入量約占總體積的10%。將混合液置于37。C孵育510min,待形成纖維蛋白腫瘤細(xì)胞凝塊后,在RPMI1640中將凝塊切割成lmn^大小,置于容器中備用。(2)小鼠腎包膜下腫瘤移植小鼠稱重后用戊巴比妥鈉(70mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉或乙醚吸入麻醉。無菌條件下剖腹暴露腎臟,將纖維蛋白腫瘤細(xì)胞凝塊小心置入腎包膜下,每側(cè)置入23塊。測(cè)量并記錄瘤塊的長(zhǎng)徑(L)和橫徑(W)。還納腎臟,以無損傷縫線分別縫合腹膜和皮膚及皮下組織。(3)于術(shù)后第一天尾靜脈給藥,阿霉素用量為60mg/m3體表面積。連續(xù)給藥5天。于術(shù)后第6天處死動(dòng)物,測(cè)量瘤塊的大小(L和W)。(4)藥物敏感性分析,按下列公式計(jì)算V=(LW2)/2;ATS-V「V2△TS:用藥前后移植瘤體積的變化率(mm3);V1:移植當(dāng)天移植瘤的體積(mm3);V2:移植術(shù)后第6天移植瘤的體積(mm3)。5.2mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)藥物敏感性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,橫坐標(biāo)ADR+,藥物試驗(yàn)組;縱坐標(biāo)移植瘤體積(mm3)。mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)下調(diào)ZNRD1,顯著減少了移植瘤體積,說明顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的體內(nèi)藥物敏感性。6、mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積的影響6.1細(xì)胞膜藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積和泵出的檢測(cè)(1)收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的SGC7901/VCR-siRNA和細(xì)胞,按照每孔105個(gè)細(xì)胞接種入6孔板中;(2)培養(yǎng)過夜后,每孔加入(阿霉素)ADR至終濃度為5mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)lh;(3)收獲細(xì)胞用于ADR蓄積的檢測(cè),或換新鮮無藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)lh后再收獲細(xì)胞用于ADR潴留的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)中以未加藥物的細(xì)胞為陰性對(duì)照;(4)以冷PBS洗滌細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ADR熒光強(qiáng)度,檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為488nm,接收波長(zhǎng)為575nm;實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未接觸藥物的細(xì)胞為陰性對(duì)照。根據(jù)如下公式計(jì)算藥物的泵出率細(xì)胞藥物泵出率=(阿霉素的蓄積量一阿霉素的潴留量)/阿霉素的蓄積量,實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未加藥物的細(xì)胞為陰性對(duì)照。6.2mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)藥物敏感性的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)胃癌細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積,結(jié)果如圖6所示,橫坐標(biāo)為阿霉素蓄積狀態(tài),縱坐標(biāo)為流式細(xì)胞儀測(cè)量值。mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)下調(diào)ZNRDl,顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的藥物蓄積濃度。7、mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡的影響7.1凋亡細(xì)胞的DNAladder(DNA梯度)的檢測(cè)(1)收獲SGC7901/VCR-siRNA和對(duì)照細(xì)胞SGC7901/VCR-mU6對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于6孔板中;(2)細(xì)胞貼壁后加入ADR,劑量為1.5ug/ml,37'C培養(yǎng)36h;(3)細(xì)胞刮小心刮取細(xì)胞,PBS洗細(xì)胞2次,離心棄上清;(4)提取細(xì)胞的DNA(按DNAladder試劑盒說明書操作);(5)1.2%瓊脂糖凝膠電泳。7.2mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡的影響結(jié)果結(jié)果如圖7所示,泳道1:SGC7901/VCR-vector;泳道2:SGC7901/VCR-siRNA;泳道3:DNAmarker。如泳道2所示,mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)下調(diào)ZNRD1的SGC7卯1/VCR細(xì)胞出現(xiàn)凋亡條帶,說明下調(diào)ZNRD1顯著降低了胃癌細(xì)胞的抗凋亡能力。而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞沒有呈現(xiàn)凋亡變化,如泳道1所示。7.3Annexin/PI染色法檢測(cè)(1)收獲SGC7901/VCR-siRNA和對(duì)照細(xì)胞SGC7901/VCR-mU6對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種于6孔板中;(2)細(xì)胞貼壁后加入ADR,劑量為1.5^ig/ml,37'C培養(yǎng)36h;(3)加入5jal的AnnexinV-FITC于含1.5mmo1CaC12的細(xì)胞培養(yǎng)液中,37°C孵育10min;(4)收集細(xì)胞前用含1.5mmolCaC12的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次;(5)橡皮細(xì)胞刮小心刮取并收集細(xì)胞,加49(^1的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞;加入5pl的PI染液,輕輕混懸,4-C孵育10min;流式細(xì)胞儀FCM分析。7.4mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡的影響結(jié)果結(jié)果如圖8所示,第一象限為機(jī)械損傷細(xì)胞區(qū),第二象限為繼發(fā)性壞死和晚期凋亡細(xì)胞區(qū),第三象限為活細(xì)胞區(qū),第四象限為凋亡細(xì)胞區(qū);圖8a:SGC7901/VCR空載體;圖8b:SGC7901/VCR-siRNA;可以明顯看出圖8b第四象限所表達(dá)的凋亡細(xì)胞明顯增多,說明mU6pro-ZNRDlsiRNA表達(dá)下調(diào)ZNRD1降低了胃癌細(xì)胞的抗凋亡能力。核苷酸序列表〈110〉中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)〈120〉ZNRD1基因的小干擾RNA序列及其真核表達(dá)載體〈160>2<210〉1<211>381<212>DNA<213〉人工合成〈400>1atgtctgtcatggacctcgccaatacttgctccagctttcagtcggacctggatttctgt60tcagattgcggctcggtcctgcctctgcccggggctcaggatacggtcacctgtattcgc120tgtggcttca8cstcaacgttcgggactttgaggggaaggttgtgaagacttcggttgtg180ttccaccaactggggacagccatgcctatgtcggtggagg鄉(xiāng)ggcctgagtgccaggga240cctgtggttgsc鄉(xiāng)cgctgccctcgatgtggtcatgaaggaatggcata300cagatgcgttcagccgatgaagggcaaactgtcttctacacctgtaccaactgcaagttc360c已ggag已a(bǔ)ggaagactctta£1381〈210>2〈211>478<212〉職<213>人工合成〈400〉2ttgagccgcaatctgccaacaacatctcttcagattgcggctctttttatgtctgtcatg60gacctcgccaatacttgctccagctttcagt;cggacctggatttctgttcagattgcggc120tcggtcctgcctctgcccggggctcaggatacggtcacctgtattcgctgtggcttcaac18015atcaacgttcgggactttgaggggaaggttgtgaagacttcggttgtgttccaccaactg240gggacagccatgcctatgtcggtggaggaagggcctgagtgccagggacctgtggttgac300觀gcgctgccctcgatgtggtc已tgaaggaatggcstaccacaccagacagatgcgttca360gccgatgaagggcaaactgtcttctacacctgtaccaactgcaagttccaggagaaggaa420gactctt犯cteig犯aaagagccgcaatctgaagagatgttgttggcagattgcggct478權(quán)利要求1、一種ZNRD1基因的小干擾RNA序列,其特征在于,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種ZNRD1基因的小干擾RNA序列,其特征在于,該序列折疊成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)。3、一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的ZNRD1基因的小干擾RNA序列構(gòu)建的真核表達(dá)載體,其特征在于,通過XbaI、Bbsl多克隆位點(diǎn),將ZNRD1基因的小干擾RNA序列構(gòu)建于mU6pro載體質(zhì)粒中,構(gòu)建成mU6pro-ZNRDlsiRNA真核表達(dá)載體,其引入mU6pro載體質(zhì)粒的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。全文摘要本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,涉及胃癌細(xì)胞ZNRD1表達(dá)的逆轉(zhuǎn),尤其公開了一種ZNRD1基因的小干擾RNA序列及其真核表達(dá)載體。它的核苷酸序列序列折疊成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)。它的真核表達(dá)載體,通過XbaI、BbsI多克隆位點(diǎn),將ZNRD1基因的小干擾RNA序列構(gòu)建于mU6pro載體質(zhì)粒中。本發(fā)明提供的ZNRD基因的siRNA序列能夠與ZNRD1的RNA結(jié)合,降低ZNRD1的表達(dá);mU6pro-ZNRD1siRNA載體是一種能高度抑制ZNRD1蛋白表達(dá)的分子工具,相較于反義核酸對(duì)下調(diào)ZNRD1表達(dá)有顯著的進(jìn)步,為胃癌細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)提供一種新的分子工具,為實(shí)現(xiàn)胃癌的基因治療提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101629175SQ200910021299公開日2010年1月20日申請(qǐng)日期2009年2月27日優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日發(fā)明者張洪偉,李孟彬,樊代明,流洪,崢陳申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)