專利名稱：：聚合酶穩(wěn)定的制作方法聚合酶穩(wěn)定
背景技術(shù)：
：本公開內(nèi)容涉及熱穩(wěn)定DNA聚合酶，包含熱穩(wěn)定DNA聚合酶的組合物和試劑盒，以及用于分離和使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法。DNA聚合酶是催化模板指導(dǎo)的DNA由脫氧核糖核苷酸三磷酸合成的酶。一般地，DNA聚合酶(例如在微生物中的DNA聚合酶I、II和III,在動物細(xì)胞中的DNA聚合酶a、卩或Y)指導(dǎo)從DNA模板合成DNA鏈，然而，一些DNA聚合酶(一般稱為"逆轉(zhuǎn)錄酶")指導(dǎo)從RNA模板合成DNA鏈。一般地，這些通過IUPAC-IUBMB聯(lián)合生化命名委員會(JointCommissiononBiochemicalNomenclature)(www.chem.qmul.ac.ulliupac/jcbn/)在酶委員會編號EC.2.7.7.7和EC.2.7.7.49下識別。已對來自各種生物包括細(xì)菌、酵母和人的DNA聚合酶的分離和表征進(jìn)行了廣泛研究，特別是用于在體外反應(yīng)中使用。當(dāng)選擇DNA聚合酶用于特別在體外反應(yīng)中使用時，技術(shù)人員必須考慮許多變量。例如，可以選擇DNA聚合酶，以使其天然5'-3'或3'-5'外切核酸酶活性缺失(例如通過誘變或通過翻譯后修飾例如酶促消化)，以顯示低錯誤率，以顯示高持續(xù)合成能力和延伸率，和/或以顯示有利的熱穩(wěn)定性。來自嗜熱微生物的DNA聚合酶的鑒定，和熱穩(wěn)定DNA聚合酶在諸如PCR的方法中的使用已導(dǎo)致鑒定且處理DNA的能力中的革命。已從嗜熱真細(xì)菌、嗜熱古細(xì)菌等中分離了許多熱穩(wěn)定DNA聚合酶。熱穩(wěn)定DNA聚合酶的例子包括但不限于衍生自水生棲熱菌(Thermusaquaticus)的TaqDNA聚合酶(參見例如美國專利號4,889,818);衍生自嗜熱棲熱菌(Thermusthe畫philus)的TthDNA聚合酶(參見例如美國專利號5,192,674;5,242,818;5,413,926);衍生自棲熱菌屬(Thermus)物種spsl7,現(xiàn)在稱為Thermusoshimai的Tspspsl7DNA聚合酶(參見例如美國專利號5,405,774);衍生自激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的PfuDNA聚合酶(美國專利號5,948,663);衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的BstDNA聚合酶(美國專利號5,747,298);衍生自Thermococcuslitoralis的TliDNA聚合酶(美國專利號5,322,785);衍生自火球菌屬物種(Pyrococcussp.)K0D1的KODDNA聚合酶(美國專利號6,033,859);衍生自Thermococcusbarosii的nTba和TbaDNA聚合酶(美國專利號5,602,011和5,882,904);以及商購可得的DNA聚合酶例如ThermoSequenase(Amersham)和AmpliTaqTM(AppliedBiosystems，Tabor,S&Richardson,C.C.(1995)ProcNatlAcadSciUSA92,6339-6343)。去污劑已在本領(lǐng)域中用于穩(wěn)定膜，以增強各種化學(xué)試劑的透化作用，并且用于破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，從而促進(jìn)來自微生物的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)例如DNA聚合酶制備。Goldstein等人公開了制備基本上不含核酸的熱穩(wěn)定酶的方法(美國專利號5,861,295)。Gelfand等人公開了在包含一種或多種非離子型聚合去污劑的緩沖液中包括純化的、穩(wěn)定的熱穩(wěn)定聚合酶的穩(wěn)定酶組合物(美國專利號6,127,155)。Simpson等人，Biochem.Cell.Biol.68:1292-6(1990)公開了通過添加劑例如TritonX-100穩(wěn)定的DNA聚合酶的純化。去污劑可以難以從所得到的純化種類中完全去除。此外，在酶促反應(yīng)中，例如DNA測序反應(yīng)中，去污劑的存在可能影響結(jié)果。參見例如，Rmz-Martinez等人，Anal.Chem.70:1516-1527,1998。此外，在不存在去污劑的情況下，一些熱穩(wěn)定的DNA聚合酶可能隨著時間過去相當(dāng)大地減少活性。參見例如美國專利號6,127,155,其公開了在非離子型聚合去污劑中的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。Tween20是公開的一種具體去污劑。美國專利號6,242,235公開了添加基于聚乙氧基化胺的陽離子型表面活性劑用于DNA聚合酶穩(wěn)定。發(fā)明概述本公開內(nèi)容涉及允許控制在其中純化且使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶的環(huán)境的組合物和方法。公開內(nèi)容提供了熱穩(wěn)定DNA聚合酶和陰離子去污劑的添加。特別地去污劑可以是聚氧乙烯烷基苯基(alkyllphenyl)醚，磷酸酯，例如聚氧乙烯壬基盼醚，磷酸酯。這種去污劑在商品名RhodafacRE-960或聚氧乙烯烷基醚，磷酸酯下出售，例如聚氧乙烯十三烷基醚磷酸酯。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>這種去污劑在商品名RhodafacRS-960下出售。包括在這個類別內(nèi)的其他相似陰離子型去污劑可以以如下的更一般結(jié)構(gòu)描述-烷基乙氧基化磷酸酯(I),其中R是具有C8-C22的烷基，直鏈、支鏈、環(huán)狀或多環(huán)烴。R基團也可以是鏈烯基，其中一個或多個不飽和雙鍵在結(jié)構(gòu)中。N可以是3-100。隱烷基酚乙氧基化磷酸酯(II),其中R基團是C8-C22直鏈或支鏈烷基。N可以是3-100。-二烷基酚乙氧基化磷酸酯(III),其中R和R'基團分別是C8-C22基團。N是3-100。-三烷基酚乙氧基化磷酸酯(IV),其中R、R'和R"分別是C8-C22烷基。N是3-100。結(jié)構(gòu)V是IV基團的具體情況。這些磷酸酯表面活性劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)顯示在下文<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>R基團可以是但不限于烷基、芳烷基、多環(huán)、三苯乙烯基(tristynl)酚。M可以是氫、銨、金屬離子，例如鈉、鋰和鉀。附圖簡述圖1顯示了在去污劑的不存在和存在下，1kbXDNA和人基因組DNA片段的PCR擴增。泳道1和7,在不存在去污劑的情況下，使用無需去污劑純化的Tba的PCR;泳道2和8，在去污劑的存在下，使用無需去污劑純化的Tba的PCR;泳道3和9，在不存在去污劑的情況下，使用由去污劑純化的Tba的PCR;泳道4和10,在去污劑的存在下，使用由去污劑純化的Tba的PCR。圖2顯示了陰離子磷酸鹽去污劑的篩選使用0.1或0.01%測試去污劑擴增1kbDNA。頂部實驗對象組，PCR產(chǎn)物的凝膠樣照片。泳道1,陽性對照(0.05%Tween20),泳道2,0.05%RhodafacRE610,泳道3~8,0.01%RhodafacRE410、RhodafacRE960、RhodafacRS960、RhodafacRS410、RhodafacRS710和RhodafacRS610,泳道9~12,0.1%RhodafacRE710、RhodafacRE960、RhodafacRS960和RhodafacRS710。底部實驗對象組，用每種測試去污劑的PCR得率柱狀圖。圖3顯示了在95。C下加熱15分鐘后在IXPCR緩沖液中的剩余活性結(jié)果。去污劑％顯示在PCR反應(yīng)中最終量的去污劑。對于、每種去污劑以指示量存在。NP40和Tween20■RhodafacRE-960發(fā)明詳述優(yōu)選地，熱穩(wěn)定DNA聚合酶I得自或衍生自選自下述的屬的微生物棲熱菌屬、火球菌屬、熱球菌屬(Thermococcus)、產(chǎn)液菌屬(Aquifex)、石克化葉菌屬(Sulfolobus)、熱原體屬(Thermoplasma)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、紅嗜熱鹽菌屬(Rhodothermus)、甲烷球菌屬(Methanococcus)和棲熱袍菌屬(Thermotoga)。本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶可以得自任何來源，并且可以是天然或重組蛋白質(zhì)。因此，如這個段落中使用的，短語"衍生自"意指重組表達(dá)熱穩(wěn)定DNA聚合酶，并且所表達(dá)的DNA序列是得自嗜熱生物的野生型序列，或其的突變型。提供熱穩(wěn)定DNA聚合酶(序列和/或蛋白質(zhì))來源的合適生物的例子包括黃棲熱菌(Thermusflavus)、紅棲熱菌(Thermusruber)、嗜熱棲熱菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、水生棲熱菌(Thermosaquaticus)、享L棲熱菌(Thermuslacteus)、Meiothermuscuber、Thermusoshimai、熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermusfervidus)、硫碌礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸熱石克化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)、嗜酸熱原體(Thermoplasmaaddophilum)、熱自養(yǎng)甲烷桿菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)和運動石克還原球菌(Desulfurococcusmobilis)。優(yōu)選的DNA聚合酶包括但不限于，TaqDNA聚合酶；TthDNA聚合酶；PfuDNA聚合酶；BstDNA聚合酶；TliDNA聚合酶；KODDNA聚合酶；nTba和/或TbaDNA聚合酶。在某些實施方案中，與野生型序列相比較，本發(fā)明的熱穩(wěn)定DNA聚合酶已通過缺失、置換或添加一個或多個氨基酸進(jìn)行修飾，例如TaqA271F667Y、TthA273F668Y和TaqA271F667YE681W。合適的熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以得自表征為JSER(WO2003/004632)或The畫coccusba蘭"(美國專利號5,602,011和US5,882,904)的生物。熱穩(wěn)定DNA聚合酶優(yōu)選從天然表達(dá)該酶或已經(jīng)工程改造以表達(dá)該酶的細(xì)胞(例如表達(dá)外源DNA聚合酶例如TaqDNA聚合酶的大腸桿菌(E.cold))中純化。在各種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的純化法包括一個或多個下述步驟(i)使細(xì)胞裂解物加熱以使一種或多種蛋白質(zhì)變性；(ii)使細(xì)胞裂解物離心以取出所有或部分上清液，以提供澄清的裂解物；和(iii)使用層析介質(zhì)最優(yōu)選包含丁基官能性的層析介質(zhì)，使澄清的裂解物分級分離。術(shù)語"熱穩(wěn)定的"指在超過5(TC的溫度下保留活性的酶；因此，熱穩(wěn)定DNA聚合酶在這個升高的溫度下保留指導(dǎo)DNA鏈合成的能力。酶可以具有超過一種酶促活性。例如，DNA聚合酶還可以包含內(nèi)切核酸酶和/或外切核酸酶活性。此種酶可以顯示就一種活性而并非另一種而言的熱/穩(wěn)定性。優(yōu)選地，熱穩(wěn)定酶在約50°C-80°C、更優(yōu)選約55°C-75°C;并且最優(yōu)選約60°C-70"下保留活性。此外，在這些升高溫度之一下顯示的活性優(yōu)選超過相同酶在37°C下在相同周圍環(huán)境(例如在相同緩沖液組成中)中的活性。因此，特別優(yōu)選的熱穩(wěn)定酶在約6(TC-95。C的溫度下，最優(yōu)選在約70°C-801:的溫度下顯示最大催化活性。在這個背景中的術(shù)語"約"指給定溫度的+/-10%。如本文所使用的，術(shù)語"活性"指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力。酶將具有最大活性率(activityrate),這優(yōu)選在飽和底物濃度的條件下和在所選環(huán)境條件組下進(jìn)行測量，所述環(huán)境條件組包括溫度、pH和鹽濃度。對于本文描迷的DNA聚合酶，用于測量活性的優(yōu)選條件是25mMTAPS(三羥甲基25甲氨基丙磺酸)緩沖液，pH9.3(在25。C下測量)，50mMKC1,2mMMgCl2，1mM2-巰基乙醇，0.2mM每種dGTP、dCTP、dTTP、0.2mM[a-33P]-dATP(0.05-0.1Ci/mmol)和0.4mg/mL活化鮭精DNA。允許反應(yīng)在74。C下進(jìn)行。用于在此種條件下測量酶的DNA聚合酶活性的示例性方法在下文中提供。如本文所使用的，術(shù)語"無活性的"指對于酶小于10%、更優(yōu)選小于5%、和最優(yōu)選小于1%最大活性率的活性。對于本文描述的DNA聚合酶，這優(yōu)選指使活性與在前迷段落中描述的用于測量活性的優(yōu)選條件下獲得的比率相比。最優(yōu)選地，當(dāng)實施獲得包括無外源添加的去污劑的純化熱穩(wěn)定酶的組合物所需的純化步驟時，本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶并非不可逆低滅活。對于本文目的的"不可逆滅活"指不能通過改變酶暴露于其的條件恢復(fù)的酶促活性的喪失。熱穩(wěn)定DNA聚合酶優(yōu)選在用于在DNA擴增法例如PCR中使用所需的條件下并非不可逆地滅活。例如，在PCR過程中，可以對聚合酶實施用于使互補DNA鏈解鏈和退火所需的加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)。此種條件可以例如依賴于緩沖鹽濃度和組成以及待擴增或用作引物的核酸的長度和核苷酸組成，但一般地所使用的最高溫度為約90°C-約105。C,一般約0.5-4分鐘。隨著緩沖液鹽濃度和/或核酸的GC組成增加，可能需要增加的溫度。優(yōu)選地，酶在最高達(dá)90°C、更優(yōu)選最高達(dá)95°C、甚至更加優(yōu)選最高達(dá)98。C、和最優(yōu)選高達(dá)IO(TC下不會成為不可逆變性的。經(jīng)得住增加的溫度的能力經(jīng)常也就"半衰期"而言進(jìn)行表達(dá)，指當(dāng)給定量酶的酶促活性已減少至最初活性一半時，在給定溫度下的時間。優(yōu)選地，酶在90。C下具有超過30分鐘的半衰期。如本文所使用的，術(shù)語"去污劑"指表面活性試劑("表面活性劑")，當(dāng)加入液體中時，與在不存在去污劑的情況下的相同液體相比較，其減少液體的表面子長力。參見例如，Detergents:Aguidetothepropertiesandusesofdetergentsinbiologicalsystems，Calbiochem-NovabiochemCorporation,2001。如本文所使用的，術(shù)語"純化的"就酶而言不指絕對純度。相反，"純化的"意指與它所起源的生物相比較，在除目的酶外包含較少的蛋白質(zhì)種類的組合物中的物質(zhì)。優(yōu)選地，酶是"基本上純化的"，指酶代表在包含酶的組合物的質(zhì)量基礎(chǔ)上至少50%的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，基本上純化的酶在組合物的質(zhì)量基礎(chǔ)上是至少75%，并且最優(yōu)選在組合物的質(zhì)量基礎(chǔ)上是至少95%。在另一個方面，本公開內(nèi)容提供了用于給測定提供純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法。這些方法包括將一種或多種去污劑加入包含純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的組合物中，其中包含純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的組合物先前不含外源添加的去污劑。最優(yōu)選地，將去污劑加入先前不含外源添加的去污劑的純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶中，使無活性的DNA聚合酶轉(zhuǎn)變成活性形式，或增加DNA聚合酶的活性。在各種方面，一種或多種去污劑可以加入上文描述的組合物中，并且所得到的組合物可以加入用于在測定中使用的反應(yīng)混合物中；可替代地，純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以加入反應(yīng)混合物中，并且去污劑可以隨后加入；和/或去污劑可以加入反應(yīng)混合物中，并且熱穩(wěn)定DNA聚合酶可以隨后加入。在任何情況下，結(jié)果是先前不含外源添加的去污劑的純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶目前在包含去污劑的組合物中。如本文所使用的，術(shù)語"測定"指任何反應(yīng)混合物，其中純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化模板指導(dǎo)的DNA由脫氧核糖核苷酸三磷酸或類似物例如雙脫氧核糖核普酸三磷酸的合成。優(yōu)選測定包括DNA聚合酶活性測定、單或雙鏈外切核酸酶活性測定、單或雙鏈內(nèi)切核酸酶活性測定、核酸擴增反應(yīng)和核酸測序反應(yīng)。陰離子去污劑和具體地陰離子去污劑RE-960和RS-960可以以最高達(dá)3%(范圍0.002%-3%)的終濃度使用。超過0.5%的濃度不改善穩(wěn)定性但也不減少活性。有效量的陰離子去污劑定義為與熱穩(wěn)定DNA聚合酶的穩(wěn)定性和功能性一致的合適陰離子去污劑濃度。常規(guī)實驗將測定任何具體陰離子去污劑的有效量。除非另有說明，濃度作為MW/V給出。已觀察到盡管DNA聚合酶可以無需去污劑的存在進(jìn)行純化且貯存，但聚合酶在不存在去污劑例如先前提及的陰離子去污劑的情況下不發(fā)揮作用。實施例呈現(xiàn)的實施例僅提供用于舉例說明目的，并且不應(yīng)解釋為限制如由附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍。下文和本說明書其他地方給出的所有參考文獻(xiàn)均在此引入本文作為參考。圖1顯示了在去污劑的不存在和存在下，來自XDNA和人基因組DNA的1kb片段的擴增結(jié)果。在這個實驗中，測試了在含/不含去污劑的緩沖液中純化且貯存的2批DNA聚合酶。在PCR前，每種測試的DNA聚合酶首先分別在含和不含Tween20的緩沖液中稀釋至20倍，并且隨后將相等單位的酶加入PCR混合物內(nèi)。PCRs以25體積執(zhí)行，其中具有200nM正向和反向引物、200|uMdNTP、1.0單位Tba和1.0ng才莫板DNA。擴增1kb人基因組DNA和1kb人DNA片段。反應(yīng)緩沖液包含10mMTris-HCl、pH9.0、50mMKC1和1.5mMMgCl2。PCR反應(yīng)通過于95。C2分鐘最初加熱開始，隨后為95°C30秒、55。C30秒和72°C60秒的35個循環(huán)，以及隨后于72°C5分鐘的最后延伸。用AgilentBioanalyzer分析PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物僅得自酶在包含去污劑的緩沖液中稀釋的反應(yīng)。對于在不含去污劑的緩沖液中稀釋的那些，酶完全無活性，并且未形成PCR產(chǎn)物。即使對于最初貯存于具有去污劑的緩沖液中的DNA聚合酶，在用不含去污劑的緩沖液20倍稀釋后，酶喪失活性。這個數(shù)據(jù)證實去污劑是DNA聚合酶維持其活性所需的。已知許多離子型去污劑與蛋白質(zhì)協(xié)同結(jié)合。協(xié)同結(jié)合正常促使蛋白質(zhì)變性。協(xié)同結(jié)合的發(fā)生依賴于去污劑的結(jié)合親和力和CMC。結(jié)合親和力與去污劑的親水頭極性和疏水尾長度相關(guān)。與基于強硫酸鹽和磺酸鹽的表面活性劑(其在親和力或極性方面可能太強以致于不促使蛋白質(zhì)變性)相比較，磷酸酯具有相對溫和的酸性基團。磷酸酯還是用于多種不同應(yīng)用的非常有效表面活性劑家族。由于磷酸酯的特有性質(zhì)，它們是用于聚合酶穩(wěn)定應(yīng)用的合適表面活性劑。下述7種陰離子有機磷酸酯去污劑就其穩(wěn)定且活化DNA聚合酶的能力進(jìn)行測試(RhodafacREs是基于壬基酚乙氧基化物的磷酸酯，并且RhodafacRSs是十三烷基乙氧基化磷酸酯)。RhodafacRE-%0RhodafacRE-610RhodafacRE-410化cRS-610RhodafacRS-410PCR測定用于去污劑篩選。所測試的去污劑首先溶解于分子生物學(xué)級別的水中，并且用氬氧化鈉溶液中和至pH7,以制備5%(W/V)終濃度的貯存液。通過將其加入酶稀釋緩沖液內(nèi)或摻料到PCR混合物內(nèi)，5%去污劑溶液隨后用于篩選。使用1kbXDNA片段的擴增，測試每種去污劑對Tba穩(wěn)定性和活性的作用。PCR條件與較早描述的相同。在不存在去污劑的情況下純化且貯存的Tba用于測試。將所測試的去污劑分別以0.01%、0.05%和0.1%的終濃度摻料到PCR反應(yīng)內(nèi)。PCR得率通過AgilentBioanalyzer進(jìn)行定量。圖2顯示部分篩選結(jié)果，其中將去污劑分別以0.0r/。和0.1。/c)的終濃度直接加入PCR反應(yīng)混合物內(nèi)。這個數(shù)據(jù)顯示RhodafacRE-960和RhodafacRS-960在DNA聚合酶的穩(wěn)定和活化方面工作非常良好。所有7種磷酸酯去污劑以3種不同濃度的篩選結(jié)果在表1中列出，其中每種PCR反應(yīng)的PCR得率轉(zhuǎn)變成相對于Tween20的活性％。在篩選的7種陰離子去污劑中，RhodafacRE-960和RhodafacRS-960在DNA聚合酶的穩(wěn)定和活化方面是最佳候選物。與Tween20(陽性對照)相比較，來自包含這2種去污劑的反應(yīng)的PCR得率比陽性對照高約30%,^^而暗示這2種去污劑在DNA聚合酶的穩(wěn)定方面比Tween20更有效。此外，這2種去污劑在廣泛濃度范圍中發(fā)揮作用。在所有3種測試濃度下，它們顯示比Tween20更佳的穩(wěn)定或活化功能。這2種去污劑的穩(wěn)定功能同樣對于SJSERDNA聚合酶進(jìn)行測試。它們顯示對于5JSERDNA聚合酶相同的活化。此外，這2種去污劑對DNA聚合酶的穩(wěn)定作用也在活性測定和熱穩(wěn)定性測定中進(jìn)行測試。在活性測定和熱穩(wěn)定性測試中，這2種去污劑顯示與Tween20的那種相同或更佳的穩(wěn)定作用。所有測試結(jié)果證實RhodafacRE-960和RhodafacRS-960是關(guān)于常用非離子型去污劑的良好替代物。使用這2種去污劑，我們可以配制用于DNA聚合酶的貯存緩沖液和PCR反應(yīng)緩沖液。表1.陰離子磷酸酯去污劑篩選結(jié)果概括。在每種測試濃度下每種去污劑的穩(wěn)定活性％使用Tween20作為參考進(jìn)行計算。相對于Tween20的活性％<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>圖3中顯示的結(jié)果證實當(dāng)PCR反應(yīng)于95。C在合適去污劑的存在下進(jìn)行時，當(dāng)PCR反應(yīng)在RhodafacRE-960的存在下進(jìn)行時，與用NP-40或Tween相比較，更多的DNA聚合酶保持活性。本文提及的所有專利、專利公布和其他公開的參考文獻(xiàn)在此整體引入作為參考，如同各自已個別且特別引入本文作為參考一樣。盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選舉例說明性實施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明可以通過除所述實施方案外的其他進(jìn)行實踐，所述實施方案僅呈現(xiàn)用于舉例說明目的而不是作為限制。本發(fā)明僅由下迷權(quán)利要求限制。權(quán)利要求1.一種熱穩(wěn)定DNA聚合酶組合物，其包含陰離子去污劑。2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述陰離子去污劑是聚氧乙烯醚磷酸酯。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述陰離子去污劑是聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸酯或聚氧乙烯烷基醚磷酸酯。4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述陰離子去污劑以最高達(dá)0.5%的濃度存在。5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述陰離子去污劑以高達(dá)0.5%存在。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述陰離子去污劑是聚乙烯壬基酚醚磷酸酯。7.—種穩(wěn)定和或增強DNA聚合酶活性的方法，其使用有效量的陰離子去污劑。8.—種用于執(zhí)行PCR的方法，其包括陰離子去污劑。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述陰離子去污劑是聚氧乙烯磷酸酯。10.權(quán)利要求7-9的方法，其中所述陰離子去污劑是聚乙烯壬基酚醚磷酸酯。全文摘要本發(fā)明涉及用于提供不含外源去污劑的純化的熱穩(wěn)定酶，特別是熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法和組合物。本發(fā)明還提供了通過添加一種或多種去污劑用于以活性形式給測定提供此種純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于在多種應(yīng)用中使用的包含純化的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的組合物和試劑盒，所述應(yīng)用包括核酸的擴增和測序。文檔編號C12N9/96GK101679957SQ200880019744公開日2010年3月24日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者R·韋斯特貝里,S·哈米爾頓,Y·劉申請人:通用電氣醫(yī)療集團生物科學(xué)公司