專利名稱：：用于體細(xì)胞核移植的犬科出生率的提高方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過體細(xì)胞核移植(SCNT)來增加在生產(chǎn)屬于犬類(犬科)的動物中的后代的生產(chǎn)率的方法，更具體涉及通過SCNT來增加在克隆的犬類中的生產(chǎn)率的方法。該方法包括犬類卵母細(xì)胞的去除并將其與核供體細(xì)胞融合以形成核移植胚胎，并將該核移植胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體(surrogatemother)的輸卵管中。在特定細(xì)胞循環(huán)同步誘導(dǎo)物質(zhì)諸如在其制備過程中的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑(roscovitine)的存在下培養(yǎng)核供體細(xì)胞。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著基因技術(shù)或者遺傳工程的發(fā)展，報道了許多通過將所需特性結(jié)合到有用作物中得到的各種重組有機體的生產(chǎn)的成功例子。并且近年來，同樣報道了克隆動物，諸如綿羊生產(chǎn)的許多成功例子?？寺游锏纳a(chǎn)實際上只有在生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中高度積累的技術(shù)之后才可能變?yōu)槭聦?，因此可以被認(rèn)為是相關(guān)技術(shù)水平的晴雨計。SCNT技術(shù)是一種使有生命后代出生的不需要經(jīng)過減數(shù)分裂和通常在生殖過程中生產(chǎn)的單倍體生殖細(xì)胞保持的技術(shù)，是通過將成體雙倍體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到去核卵母細(xì)胞中生產(chǎn)胚胎，然后在體內(nèi)移植胚胎的新個體發(fā)育的方法。一般說來，在SCNT技術(shù)中，與體細(xì)胞移植的受體卵母細(xì)胞在經(jīng)過體外人工培養(yǎng)到減數(shù)分裂中期II之后被使用。然后，為了防止由SCNT導(dǎo)致的染色體異常的出現(xiàn)，在移植體細(xì)胞之前將成熟卵母細(xì)胞去核。在將體細(xì)胞注射到成熟卵母細(xì)胞的卵黃周隙或者細(xì)胞質(zhì)中之后，將去核卵母細(xì)胞和體細(xì)胞通過電刺激彼此物理融合。融合的偶聯(lián)體通過電刺激或者化學(xué)物質(zhì)活化，然后移植到代孕母體中以生產(chǎn)有生命的后代。這種SCNT技術(shù)可在下述領(lǐng)域中廣泛地被使用，例如在高級動物的繁殖中，在稀有或者幾乎滅絕的動物的保護中，在特定營養(yǎng)物的生產(chǎn)中，在治療用生物材料的生產(chǎn)中，在用于器官移植的動物生產(chǎn)中，在患有疾病或生理紊亂的動物的生產(chǎn)中，以及在醫(yī)療上適用于作為器官移植的替代治療諸如基因治療的動物生產(chǎn)中。通過體細(xì)胞核移植克隆哺乳動物的技術(shù)首先由RoslinInstitute,England的Dr.Wilmut完成，其通過從六歲的老綿羊中獲取乳腺細(xì)胞，將該細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中制備核移植胚胎，并在體內(nèi)移植胚胎，從而生產(chǎn)了克隆動物Dolly。從那以后，使用得自成年動物的體細(xì)胞通過核移植生產(chǎn)了克隆牛、鼠、山羊、豬和兔(WO99/37143A2，EP930009A1，WO99/34669A1，WO99/01164A1和US5,945,577)。同時，不僅工業(yè)動物諸如牛和豬的克隆，而且寵物，諸如狗的克隆吸引了許多人的興趣。近年來，在寵物中，貓首先被克隆，在研究基金中也投入了數(shù)百萬美元對狗的克隆進行了研究。但是，從沒有發(fā)情的母狗的卵巢中取出不成熟的卵母細(xì)胞并且在體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞以生產(chǎn)成熟的卵母細(xì)胞是非常困難的。這是為什么與其他動物相比通過體細(xì)胞核移植克隆狗非常困難的原因之一，即由于狗的獨特物種特異性生殖特征。不過，狗具有與人類類似的生理特性，并具有與人類類似的發(fā)病模式，因此人和狗在病理和生理條件方面是類似的。實際上可在人類疾病研究中使用的遺傳疾病的數(shù)量在狗中有224種，這顯著大于豬中的65種或者貓中的136種(http:〃omia.angis.org.au/)。因此，如果這種遺傳特定被用于生產(chǎn)克隆狗以便研究人類疾病模式，克隆狗將極大地有助于人類疾病研究。出于這種原因，克隆狗的嘗試已經(jīng)進行了很長時間，但狗克隆的成功率仍然很低，并且狗的克隆被認(rèn)為難以成功。因此，需要發(fā)展對于提高犬類克隆效率的有效方法。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)進行了使用SCNT方法來生產(chǎn)克隆犬類的改進方法的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆犬類可以通過這種方法高效生產(chǎn)，即在該方法中的核供體細(xì)胞制備過程中加入特定物質(zhì)，諸如細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的在于提供生產(chǎn)犬類核移植胚胎的方法，以及使用SCNT技術(shù)增加克隆有生命的后代的生產(chǎn)率的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過所述方法生產(chǎn)的犬科核移植胚胎。本發(fā)明的還以目的在于提供增加了生產(chǎn)率的生產(chǎn)克隆犬的方法，所述方法包括將所述核移植胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體中以生產(chǎn)有生命的后代的步驟o為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了使用SCNT技術(shù)生產(chǎn)犬類核移植胚胎的方法，其中核移植胚胎使用經(jīng)過在細(xì)胞循環(huán)同步誘導(dǎo)物質(zhì)，諸如在其制備過程中的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑的存在下的培養(yǎng)過程在特定循環(huán)中同步化的核供體細(xì)胞來生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了根據(jù)所述方法生產(chǎn)的犬類核供體胚胎。本發(fā)明還提供了具有增加的效率的生產(chǎn)克隆犬類的方法，所述方法包括將所述核移植胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體中以生產(chǎn)有生命的后代的步驟。通過下列詳細(xì)描述和所附的權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征和實施方式將更加明顯。圖1是顯示使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑(Roscovitine)處理的核供體細(xì)胞構(gòu)建的克隆胚胎的核重塑的圖片。在圖1中，白色的箭頭表示各個階段的核形狀。圖2是根據(jù)本發(fā)明的方法克隆的7個1月齡獵犬(Retriever)的圖片(圖2(a))，狗在4個月大時的圖片(圖2(b))和通過SCNT克隆的狗的圖片(圖2(c))。圖3是根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的四只癌癥探查(cancer-sniffing)狗的圖片(圖3(a))和根據(jù)本發(fā)明的方法的五只克隆的美洲叭啦狗(PitBullterrie)的圖片(圖3(b))。具體實施例方式在本文中使用的術(shù)語的定義如下。本文中使用的術(shù)語"核移植"指的是通過將去核卵母細(xì)胞與細(xì)胞或者細(xì)胞核人工結(jié)合，使有生命的后代生產(chǎn)與母體相同特征和性質(zhì)的基因操作技術(shù)。本文中使用的術(shù)語"核移植胚胎"指的是被注射或者融合有核供體細(xì)胞的胚胎。本文中使用的術(shù)語"克隆的(或者克隆)"指的是用于制備具有與另一個體單位相同基因組的新的個體單位的基因操作技術(shù)。特別是，在本發(fā)明中，術(shù)語"克隆的"在本文中被用于指細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞和/或動物細(xì)胞具有核DNA序列，該核DNA序列大體上與另一細(xì)胞的核DNA序列類似或相同。本文中使用的術(shù)語"核供體細(xì)胞"指的是被移植到作為核受體的受體卵母細(xì)胞中的細(xì)胞或者細(xì)胞核。在本文中，術(shù)語"繼代培養(yǎng)"指的是在從前一培養(yǎng)板上分離達到匯聚的粘附細(xì)胞以防止過度生長，之后在新的培養(yǎng)板上重新培養(yǎng)細(xì)胞的方法。特別是，它指的是從動物中分離細(xì)胞并連續(xù)對細(xì)胞進行傳代以進行初級培養(yǎng)、次級培養(yǎng)、三級培養(yǎng)等的方法，即通過以周期性替換新鮮培養(yǎng)基來保持細(xì)胞系的方法。本文中使用的術(shù)語"受體卵母細(xì)胞"指的是在除去其原始細(xì)胞核之后接受來自核供體細(xì)胞的細(xì)胞核的卵母細(xì)胞。7本文中使用的術(shù)語"卵母細(xì)胞"指的是已經(jīng)達到減數(shù)分裂中期II的成熟卵母細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"去核卵母細(xì)胞"指的是其細(xì)胞核已經(jīng)被除去的卵母細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"融合"指的是核供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的脂質(zhì)膜結(jié)合。例如，脂質(zhì)膜可以是細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜或者核膜。當(dāng)將核供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞彼此相鄰放置時或者當(dāng)核供體細(xì)胞被放置在受體卵母細(xì)胞的卵黃周隙中時，在它們之間施加電刺激時可發(fā)生融合。本文中使用的術(shù)語"活化"指的是在核移植之前、過程中或之后刺激細(xì)胞使其分裂。優(yōu)選地，在本發(fā)明中其意味著在核移植之后刺激細(xì)胞使其分裂。本文中使用的術(shù)語"有生命的后代"的意思是在子宮外可生存的動物。優(yōu)選地，其為可生存一秒、一分鐘、一天、一周、一個月、六個月或者一年以上的動物。即動物可以不需要在子宮環(huán)境內(nèi)才能生存。在本發(fā)明中，屬于犬類(犬科)的動物可在廣義上被分成TribeCanini和TribeVulpini，包括狗、狼、狐貍、豺、山狗、韓國狼和貍。優(yōu)選地，它們包括狗和狼。已知狗來自野生狼的馴養(yǎng)，狼和狗具有相同的染色體數(shù)目并在妊娠期顯示相似性和性激素變化(Seal,US等人，BiologyReproduction,21:1057-1066,1979)。在本發(fā)明中，術(shù)語"術(shù)語犬類的動物"也簡單地所寫為"犬"。在一個方面，本發(fā)明涉及通過體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法。特別是，制備犬核移植胚胎的方法包括下列步驟(a)從犬卵母細(xì)胞中除去細(xì)胞核以制備去核卵母細(xì)胞；(b)當(dāng)培養(yǎng)來自犬的組織的體細(xì)胞時通過在細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的存在下培養(yǎng)體細(xì)胞制備核供體細(xì)胞；(c)將步驟(b)的核供體細(xì)胞微注射到步驟(a)的去核卵母細(xì)胞并將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞之間進行融合；并且(d)活化步驟(C)融合的卵母細(xì)胞。特別是，用于制備犬核移植胚胎的方法的特征在于，從犬組織中分離的體細(xì)胞在細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的存在下被培養(yǎng)。細(xì)胞周期同步化物質(zhì)是在細(xì)胞循環(huán)中的任一時期，包括有減數(shù)分裂期(M)、DNA合成前期(Gl期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)中暫時抑制細(xì)胞的物質(zhì)，并且當(dāng)該物被除去時，在特定循環(huán)中被抑制的細(xì)胞循環(huán)將再次進行。通過加入上述細(xì)胞同步化誘導(dǎo)物質(zhì)，經(jīng)體細(xì)胞核移植的犬后代的生產(chǎn)率被增加。細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的例子包括作為阻斷G0/G1期的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdk)的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑(分子式1);阻斷G0/G1期的放線菌酮(分子式2);阻斷G0/G1期的二甲基亞砜(DMSO)(分子式3);作為阻斷Gl/S期的Cdk抑制劑的丁內(nèi)酯I(分子式4);作為阻斷早期S期的DNA聚合酶A、D的抑制劑的巴菲敵柯林(aphidicolin，分子式5);阻斷減數(shù)分裂期的M期的秋水仙胺(分子式6);作為阻斷S期的DNA復(fù)制抑制劑的含羞草氨酸(分子式7);作為阻斷G2/M期的微管抑制劑的秋水仙素(分子式8);以及作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的熒光染料的Hoechst33342(分子式9)，每種物質(zhì)的化學(xué)分子式如下。優(yōu)選的是細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑、放線菌酮或者二甲基亞砜(DMSO)，最優(yōu)選地是細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑。[分子式1]9[分子式2]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>[分子式7]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>[分子式9]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>[分子式8]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>在本發(fā)明的一種實施方式中，核供體細(xì)胞可通過將細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑加入到分離自犬組織的體細(xì)胞中然后培養(yǎng)該細(xì)胞來制備。當(dāng)對添加和不添加細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑的克隆狗的生產(chǎn)率進行比較時發(fā)現(xiàn)，沒有使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的對照組的懷孕率僅為10%，而使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的組的懷孕率為大約40%，表明在核供體細(xì)胞制備中加入細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑顯著地增加了克隆狗的生產(chǎn)率。因此，本發(fā)明包括根據(jù)上面描述的方法制備的核移植胚胎。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于使用的是所述核移植胚胎。更具體地說，本發(fā)明的生產(chǎn)克隆犬的方法包括下列步驟(a)從犬卵母細(xì)胞中除去細(xì)胞核以制備去核卵母細(xì)胞；(b)當(dāng)培養(yǎng)來自犬組織的體細(xì)胞時通過在細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的存在下培養(yǎng)體細(xì)胞制備核供體細(xì)胞；(C)將步驟(b)的核供體細(xì)胞微注射到步驟(a)的去核卵母細(xì)胞并將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞之間進行融合；(d)活化步驟(C)的融合卵母細(xì)胞；并且(e)將活化的卵母細(xì)胞移植到代孕母體的輸卵管中。在本發(fā)明的用于生產(chǎn)克隆犬的方法的步驟(b)中，為了增加通過體細(xì)胞核移植的犬后代的生產(chǎn)率，核供體細(xì)胞通過將細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)，諸如細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑、放線菌酮、二甲基亞砜(DMSO)、丁內(nèi)酯I、巴菲敵柯林、秋水仙胺、含羞草堿、秋水仙素、Hoechst33342或者類似物加入到分離自犬組織的體細(xì)胞中來制備，然后培養(yǎng)該體細(xì)胞。上面這些物質(zhì)的特定描述見上述。下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法和生產(chǎn)克隆犬的方法。步驟l:受體卵母細(xì)胞的去核一般說來，哺乳動物(例如牛、豬和綿羊)的卵母細(xì)胞在卵母細(xì)胞成熟時進行排卵，即在減數(shù)分離的中期II時排卵，而與其他動物不同，犬卵母細(xì)胞在減數(shù)分離的前期I時進行排卵并保持在輸卵管中48-72小時的時候成熟。受體卵母細(xì)胞可以是犬未成熟的卵母細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞和初始老化的卵母細(xì)胞、中度老化和嚴(yán)重老化的卵母細(xì)胞。優(yōu)選地，為了用作受體卵母細(xì)胞，從犬中收集的未成熟卵母細(xì)胞可在體外成熟，或者收集在體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞。由于犬卵母細(xì)胞核在體外成熟的比例非常低，并且犬的排卵時間和生殖生理與其他動物不同，優(yōu)選在體內(nèi)收集成熟的犬卵母細(xì)胞以便用作受體卵母細(xì)胞。更具體地說，收集來自犬的成熟卵母細(xì)胞優(yōu)選在犬中排卵誘導(dǎo)之后的48-72小時進行，更優(yōu)選為72小時。關(guān)于這方面，犬排卵的日期可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來確定。用于確定排卵日期的方法的例子包括但不限于陰道涂片檢測，血清性激素水平測定，以及超聲診斷系統(tǒng)的使用。犬發(fā)情期的開始可通過外陰膨脹和血性漿液排出(serosanguinousdischarge)來確認(rèn)。在本發(fā)明的一個例子中，進行陰道涂片檢測和血清孕酮濃度分析。結(jié)果，未角化上皮細(xì)胞達到80%以上并且血清孕酮濃度開始達到大約4.0ng/mL以上的日期被認(rèn)為是排卵日期。作為收集體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的方法，可使用外科手術(shù)的方法，包括麻醉動物然后進行剖腹手術(shù)。更具體地說，體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞的收集可使用本領(lǐng)域已知的輸卵管切除術(shù)進行。輸卵管切除術(shù)是包括如下步驟的方法外科切除輸卵管，將卵母細(xì)胞收集培養(yǎng)基沖洗到輸卵管中并從沖洗液中收集卵母細(xì)胞。在另一種方法中，體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞可通過將導(dǎo)管插入到輸卵管的毛緣端中，并使用留置針將沖洗液注射到子宮輸卵管接頭處。該方法具有的優(yōu)點在于，其不引起對輸卵管的損傷，由此允許卵母細(xì)胞供體動物在下一發(fā)情期時還可以使用。收集成熟的卵母細(xì)胞之后，卵母細(xì)胞的單倍體核被去除。卵母細(xì)胞的去核可使用本領(lǐng)域已知的任何方法來進行(US4994384，US5057420,US5945577，EP0930009A1,KR10-0342437,Kanda等人，J.Vet.Med.Sci.，57(4):641-646,1995;Willadsen,Nature,320:63-65，1986,Nagashima等人，Mol.Reprod.Dev.,48:339-343，1997;Nagashima等人，J.ReprodDev.,38:37-78，1992;Prather等人，Biol.Reprod.,41:414-418,1989，Prather等人，J.Exp.Zool"255:355-358，l朔；Saito等人，AssisR印rodTechAndro,259:257-266,1992;Terlouw等人，Theriogenology37:309，1992)。優(yōu)選地，受體卵母細(xì)胞的去核可通過下列兩種方法之一來進行。一種方法包括除去成熟受體卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞，使用微注射針通過形成裂縫局部切割受體卵母細(xì)胞的透明帶，并經(jīng)過裂縫除去第一極體、核和細(xì)胞質(zhì)(以可能的最小量)。另一種方法包括除去成熟受體卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞，對卵母細(xì)胞染色，并使用抽吸移液管除去卵母細(xì)胞的第一極體和細(xì)胞核。更優(yōu)選地是，就卵母細(xì)胞的去核而言，抽吸法被用于具有高發(fā)育能力的卵母細(xì)胞，而用于形成裂縫的方法被用于具有低發(fā)育能力的卵母細(xì)胞，所述發(fā)育能力通過視覺檢査受體卵母細(xì)胞來決定。步驟2:核供體細(xì)胞的制備在通過體細(xì)胞核移植技術(shù)來表達目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)中，需要核供體細(xì)胞。作為本發(fā)明的核供體細(xì)胞，使用來自犬的體細(xì)胞。特別是，在本發(fā)明中使用的體細(xì)胞可以是犬胚胎細(xì)胞、來自胎兒的細(xì)胞、來自幼犬的細(xì)胞或者來自成年犬的細(xì)胞，優(yōu)選來源自成年犬的組織細(xì)胞，諸如來源于卵丘、皮膚口腔粘膜、血液、骨髓、肝臟、肺、腎臟、肌肉和生殖器官等?？稍诒景l(fā)明中使用的體細(xì)胞的例子包括但不限于，卵丘細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞。更優(yōu)選地，可在本發(fā)明中使用的體細(xì)胞可包括胎兒成纖維細(xì)胞、成體成纖維細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。更優(yōu)選地是，使用分離自犬胎兒和成體的成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞具有的優(yōu)點在于大量細(xì)胞可在初始分離階段得到，細(xì)胞的培養(yǎng)相當(dāng)容易，并且細(xì)胞在體外培養(yǎng)和操作也很容易。作為核供體細(xì)胞提高的體細(xì)胞可通過制備外科樣品或活檢樣品的方法并從樣品中得到，在優(yōu)化條件下培養(yǎng)的單個細(xì)胞可使用下列方法得到。從動物體收集組織，并且從組織中分離細(xì)胞。然后，在組織培養(yǎng)基基中培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)加入到其中，接著對細(xì)胞進行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長完成時，細(xì)胞通過胰蛋白酶處理被收集，然后可被用作核供體細(xì)胞。本發(fā)明的特征在于，細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)被加入一邊增加克隆犬的生產(chǎn)效率。可在本發(fā)明中使用的細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)包括作為阻斷G0/G1期的Cdk(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶)的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑(分子式l);阻斷G0/G1期的放線菌酮(分子式2);阻斷G0/G1期的二甲基亞砜(DMSO)(分子式3);作為阻斷Gl/S期的Cdk抑制劑的丁內(nèi)酯I(分子式4);作為阻斷早期S期的DNA聚合酶A、D的抑制劑的巴菲敵柯林(aphidicolin，分子式5);阻斷減數(shù)分裂期的M期的秋水仙胺(分子式6);作為阻斷S期的DNA復(fù)制抑制劑的含羞草堿(分子式7);作為阻斷G2/M期的微觀抑制劑的秋水仙素(分子式8);以及作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的Hoechst33342(分子式9)，每種物質(zhì)的化學(xué)分子式如下。優(yōu)選的是細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑、放線菌酮或者二甲基亞砜(DMSO)，最優(yōu)選地是細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑。在一種實施方式中，來自待克隆的動物的組織被無菌切割以得到外科樣品或者活檢樣品，并將樣品切碎，使用胰蛋白酶處理然后在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用本領(lǐng)域已知的那些組織培養(yǎng)基，其包括TCM-199,DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle's培養(yǎng)基)以及類似物。在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天之后，細(xì)胞在培養(yǎng)板上的生長被確認(rèn)。當(dāng)細(xì)胞生長完成時，使用胰蛋白酶對細(xì)胞進行處理，將一部分組織冰凍并儲存在液氮中以便以后使用，將剩余組織進行繼代培養(yǎng)以便在核移植中使用。將連續(xù)培養(yǎng)以用于核移植的細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)板繼代培養(yǎng)，然后使用胰蛋白酶處理以制備在核移植中使用的單個細(xì)胞。最后，將細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑加入到細(xì)胞中，所述細(xì)胞然后再繼續(xù)進行培養(yǎng)。然后，細(xì)胞通過胰蛋白酶處理被收集并進行體細(xì)胞核移植。這里，加入的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑的濃度優(yōu)選為5-3(HiM，更優(yōu)選10-20pM，培養(yǎng)時間優(yōu)選18-72小時，更優(yōu)選24-48小時。在一種實施方式中，當(dāng)在新鮮培養(yǎng)板中培養(yǎng)后細(xì)胞濃度達到大約60%時，將細(xì)胞使用15pM的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理18-24小時，然后使用胰蛋白酶處理以制備單個細(xì)胞。然后，細(xì)胞在核移植中使用。步驟3:核供體細(xì)胞的微注射和融合-核移植胚胎的制備在步驟2中制備的核供體細(xì)胞被微注射到在步驟1中制備的去核卵母細(xì)胞中。這里，微注射通過使用移液管將核供體細(xì)胞微注射到去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和透明帶之間來進行。將微注射了核供體細(xì)胞的去核卵母細(xì)胞使用細(xì)胞操作儀與核供體細(xì)胞進行電刺激融合。電融合可使用直流電或者交流電來進行。優(yōu)選地，其可在2.0-6.0kV/cm的電壓下進行，更優(yōu)選其可在3.0-5.0kV/cm的直流電壓下10-30ps進行1-3次。最優(yōu)選的是施加兩次直電流，每次3.5-5.0kV/cm、進行15|is。上面描述的在電融合中的電壓范圍的特征在于，其比到目前為止已知的常規(guī)電融合中的電壓范圍更高。該范圍是對于電融合的最佳條件，并允許克隆犬以更高的克隆率生產(chǎn)。核供體細(xì)胞通過電刺激與卵母細(xì)胞的融合可以在各種融合培養(yǎng)基中進行，例如齊默曼(Zimmerman)或者甘露醇。優(yōu)選地，使用含有甘露醇、MgS04,鹽緩沖液(Hepes)和牛血清蛋白(BSA)的培養(yǎng)基。在去核卵母細(xì)胞進行體細(xì)胞核移植，然后電融合之后，卵母細(xì)胞的核經(jīng)歷了重塑過程。作為表明重塑平穩(wěn)發(fā)生的證據(jù)，在電融合之后大約1小時在融合的卵母細(xì)胞中出現(xiàn)早熟染色體凝集(PCC)。已知經(jīng)歷了早熟染色體凝集的融合卵母細(xì)胞在重塑和活化之后很容易發(fā)育并重新程序化。在其中使用細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)，諸如細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的核供體細(xì)胞己經(jīng)被移植的情況下，PCC以比其中核供體細(xì)胞沒有被移植的情況下更高的比例出現(xiàn)。而且，甚至在融合的胚胎活化之后，核的繼續(xù)膨脹和收縮仍在發(fā)生(參見本發(fā)明的實施例l)。特別是，作為在其正常形成過程中細(xì)胞核經(jīng)歷的過程早熟染色體凝集(PCC)、核增大(NE)和核膨脹(NS)隨著時間的流逝按照PCC—NE—NS的順序出現(xiàn)。在通過移植使用細(xì)胞核同步化誘導(dǎo)物質(zhì)，諸如細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的核供體細(xì)胞得到的克隆卵母細(xì)胞中，PCC以非常高的比例出現(xiàn)，因此核重塑活化的程度更大。步驟4:核移植胚胎的活化融合的核移植MM的活化是在成熟過程中重新活化暫時被抑制的細(xì)胞循環(huán)的步驟。出于該目的，需要降低作為細(xì)胞再循環(huán)抑制因子的細(xì)胞信號傳遞物質(zhì)諸如MPF、MAP激酶等的活性。一般說來，活化核移植胚胎的方法包括電方法和化學(xué)方法。在本發(fā)明的一種實施方式中，化學(xué)方法可被用于活化核移植胚胎。根據(jù)本發(fā)明，與電方法相比，化學(xué)方法可更好的促進核移植胚胎的活化?；瘜W(xué)方法包括使用物質(zhì)下列物質(zhì)處理核移植胚胎的方法，諸如使用乙醇、纖維醇三磷酸、二甲離子(例如Ca"或者Sr2+)、微管抑制劑(例如細(xì)胞松弛素B)、二價離子載體(例如Ca^離子載體ionophoreionomycin),蛋白激酶抑制劑(例如6-二甲基氨基嘌呤)、蛋白質(zhì)合成抑制劑(例如放線菌酮)或者佛波醇12-豆蔻酸13-醋酸。優(yōu)選地，作為用于核移植胚胎活化的化學(xué)方法，使用鈣離子載體和6-二甲基氨基嘌呤同時或者逐步處理核移植胚胎的方法可在本發(fā)明中被使用。更優(yōu)選地是，核移植胚胎使用5-l(HiM鈣離子載體在37-39"下處理3-6分鐘，然后使用1.5mM-2.5mM6-二甲基氨基嘌呤在37-39。C下處理4-5小時。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)上述方法制備的犬核移植胚胎。步驟5:將核移植胚胎移植到代孕母體中和有生命的后代的生產(chǎn)此外，通過將它們移植到代孕母體中以允許有生命的后代出生，犬核移植胚胎可被用于生產(chǎn)克隆犬。在犬屬的情況下，核移植胚胎在活化之后沒有體外培養(yǎng)的情況下立即被移植。移植可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行，優(yōu)選地，可使用導(dǎo)管來移植克隆的胚胎。選擇適于核移植胚胎移植并能夠?qū)⑴咛グl(fā)育成正常胎兒的代孕母體。用于移植的最佳時間是通過監(jiān)測在達到成熟以后顯示自然發(fā)情的犬，或者在性成熟之前或之后其發(fā)情期已經(jīng)通過人工激素處理誘導(dǎo)的犬的發(fā)情期和排卵來確定。一般說來，合適的移植時間可在與提供了在核移植中使用的卵母細(xì)胞的犬卵母細(xì)胞供體的排卵日期一致的l-2天的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，移植時間為犬卵母細(xì)胞受體的排卵期的一天之后，更優(yōu)選與犬卵母細(xì)胞供體的排卵期同一天。代孕母體的發(fā)情周期的優(yōu)選的評定可基于其體內(nèi)孕酮的濃度來進行。將核移植胚胎移植到代孕母體中的方法是通過剖腹手術(shù)將胚胎移植到代孕母體的輸卵管中來進行的。在將核移植胚胎移植到代孕母體的過程中，核移植胚胎可優(yōu)選處于l-細(xì)胞期、2-細(xì)胞期或者4-細(xì)胞期。出于這種目的，核移植胚胎移植到代孕母體中優(yōu)選在活化之后4小時內(nèi)進行。而且，核移植胚胎可在覆蓋有礦物油的25nlmSOF微滴中培養(yǎng)，直到代孕母體被準(zhǔn)備好，然后移植到代孕母體中。在胚胎移植3周后，代孕母體通過超聲波來評估其懷孕情況。此后，每兩周進行一次超聲診斷以監(jiān)測代孕母體的懷孕情況和胎兒的生長狀態(tài)。如果有生命的后代在甚至超過分娩間隔30分鐘之后仍沒有分娩，則經(jīng)驗豐富的助手應(yīng)當(dāng)幫助代孕母體的分娩。當(dāng)預(yù)期的分娩日期已過，通過將激素制劑注射到代孕母體中誘導(dǎo)有生命的后代的分娩，或者通過外科操作諸如剖腹產(chǎn)手術(shù)誘導(dǎo)分娩。本發(fā)明的用于克隆犬生產(chǎn)的方法具有增加在現(xiàn)有技術(shù)中犬類非常低的懷孕成功率的效果。因此，本發(fā)明的方法可克服在實踐中由于低克隆效率而難以使用的先前己知方法的缺點，因此其可在實踐中被應(yīng)用于增加克隆犬的生產(chǎn)率。實施例此后，將參照實施例對本發(fā)明進一步詳細(xì)描述。但是，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅僅用于說明的目的，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明的范圍的限制。實施例l:從狗中收集受體卵母細(xì)胞在實驗中用作卵母細(xì)胞供體的狗為有規(guī)律的發(fā)情周期并且生殖器官沒有疾病的1-5歲的母狗。用作卵母細(xì)胞供體的狗由根據(jù)SeoulNationalUniversityforAccreditationofLaboratoryAnimalCare建立的標(biāo)準(zhǔn)來保存。排卵期通過進行陰道涂片檢測并通過每天測定顯示自然發(fā)情的發(fā)情期狗的血清孕酮濃度來確定。而且，成熟卵母細(xì)胞在排卵之后72小時通過外科手術(shù)獲取。為了測定血清孕酮濃度，每天收集3-5ml血液并將其離心以得到血清，使用DSL-3900孕酮活性涂層管放射免疫測定試劑盒(ACTIVEProgesteroneCoated-TubeRadioimmunoassayKit)(DiagnosticSystemsLaboratories,Inc.,USA)對血清進行分析。孕酮濃度開始達到4.0ng/ml以上的日期被認(rèn)為是排卵期(Hase等人，J.Vet.Med.Sci.,62:243-248,2000)。為了進行陰道涂片檢測，從發(fā)情前期的初始標(biāo)記的那天起每天獲得涂片。涂片通過將拭子插入陰唇中并在載玻片上滾動來收集。在使用精子形態(tài)學(xué)快速染液(Diff-Quik)(InternationalChemicalCo.,Japan)染色19后，使用顯微鏡對涂片進行檢査；表層細(xì)胞達到上皮細(xì)胞的80%以上(角化指數(shù)coraifiedindex,Evans,J.M.等人，Vet.Rec.，7:598-599,1970)的時間被認(rèn)為是排卵時間。本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)上述方法確定了排卵時間，然后以下列方式通過剖腹手術(shù)從供體狗中獲取卵母細(xì)胞。首先，將作為卵母細(xì)胞供體的母狗通過給以6mg/kg克他命HCl和lmg/kg甲苯噻嗪麻醉。麻醉通過給以異氟烷來保持。將具有圓形前端的針經(jīng)過滑囊縫隙插入到被麻醉狗的輸卵管的毛緣端。插入的針使用縫合線保持在原位。這里，使用快速釋放裝置包括3cm塑料管(直徑2mm)和止血鉗。為了使輸卵管的管易于可看，將數(shù)字壓力表(digitalpressure)應(yīng)用到輸卵管和周圍的子宮-輸卵管結(jié)合部上，并插入靜脈導(dǎo)管(24gauge)。然后，經(jīng)過導(dǎo)管沖洗Hepes緩沖液作為表1中顯示的卵母細(xì)胞收集介質(zhì)，其含有10%(v/v)牛血清(FBS)、2mMNaHC03和5mg/ml牛血清蛋白(BSA)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以使得卵母細(xì)胞被沖出。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例2:受體卵母細(xì)胞的去核將實施例1中得到的卵母細(xì)胞加入到表1中的卵母細(xì)胞收集介質(zhì)中，并通過重復(fù)移液介質(zhì)中的透明質(zhì)酸酶(Sigma,USA)從而在卵母細(xì)胞中除去卵丘細(xì)胞。然后，使用5嗎/mL的精子形態(tài)學(xué)快速染液(Hoechst33342)將已經(jīng)除去卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞染色5分鐘，并在200X放大倍數(shù)的倒置顯微鏡下觀察以便選擇僅僅具有突出的第一極體的卵母細(xì)胞。選擇的卵母細(xì)胞使用顯微操作儀(Narishige,Tokyo,Japan)在添加了5|ig/mL細(xì)胞松弛素B的上述介質(zhì)(表1)中去核。特別是，卵母細(xì)胞使用微量移液管(直徑大約為15(Him)保持，然后使用抽吸移液管(直徑大約為2(Him)將第一極體、相鄰細(xì)胞質(zhì)(不到5%)和卵母細(xì)胞核去除。將去核卵母細(xì)胞儲存在添加了10%(v/v)牛血清(FBS)的TCM-199培養(yǎng)基(表2)中。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例3:核供體細(xì)胞的制備作為核供體細(xì)胞，使用從狗中收集的成體成纖維細(xì)胞。出于這種目的，對狗進行耳部皮膚活檢。使用磷酸鹽緩沖注(DPBS)(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)將小片耳組織片段洗滌3次并使用外科刀片切碎。將切碎的組織加入到含有1mM含有乙二胺四乙酸(EDTA)的DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle's培養(yǎng)基)(DMEMLifeTechnologies,Rockville，MD)中并以300xg離心2分鐘。然后，將細(xì)胞接種到60mm培養(yǎng)板(BectonDickinson,LincolnPark,NJ)上。然后，將細(xì)胞在添加了10%(v/v)牛血清(FBS)、lmM谷氨酸鹽、25mMNaHC03禾口1%(v/v)最低必需培養(yǎng)基(MEM)非必需氨基酸溶液(Invitrogen,CA)的DMEM中，39。C下，在含5%C02和95%的潮濕空氣中培養(yǎng)3-4天。在細(xì)胞培養(yǎng)融合后，將未附著的細(xì)胞除去，使用在培養(yǎng)基中添加0.1%的胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶處理剩余的附著細(xì)胞1分鐘并進一步以4-6天為間隔在三個新鮮培養(yǎng)板繼代培養(yǎng)。然后，將繼代培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)置在由80%(v/v)DMEM,10%(v/v)二甲基亞砜(DMSO)和10。/。(v/v)牛血清(FBS)組成的冰凍培養(yǎng)基中，并儲存在-196'C的液氮中。在進行體細(xì)胞核移植之前，將細(xì)胞解凍并在添加了15|liM細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑的培養(yǎng)基中(即DMEM+10。/。牛血清(FBS)+15pM細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑)培養(yǎng)24小時。然后在體細(xì)胞核移植過程中使用胰蛋白酶對細(xì)胞處理2分鐘并從單層中收集細(xì)胞。實施例4:體細(xì)胞核移植將在實施例3中制備的核供體細(xì)胞微注射到在實施例2中制備的去核卵母細(xì)胞中。核供體細(xì)胞以下列方式被微注射到去核卵母細(xì)胞的卵黃周隙中。在表1的培養(yǎng)基中使用100/mL植物凝集素處理去核卵母細(xì)胞，并且去核卵母細(xì)胞的裂縫由保持移液管支撐。然后，移植移液管被插入裂縫中，并且分離自實施例3中的成纖維細(xì)胞的單個細(xì)胞通過移植移液管被注射到去核卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與透明帶之間。然后，將核供體細(xì)胞-卵母細(xì)胞偶聯(lián)體設(shè)置在融合培養(yǎng)基中(含有0.26M甘露醇、0.1mMMgSO4、0.5mMHEPES和0.05%BSA)，并插入到與顯微操作儀(Nikon-Narishige,Japan)連接的兩個平行電極之間。然后，偶聯(lián)體的融合通過使用電-細(xì)胞融合設(shè)備(NEPAGENECo.，Chiba,Japan)以4kV/cm的電壓每次15ps施加兩次電刺激來誘導(dǎo)。在電刺激1小時后，核供體細(xì)胞與卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的融合在立體顯微鏡下觀察。融合胚胎被選擇并在添加了10%(v/v)牛血清(FBS)的TCM-199(表2)中培養(yǎng)1.5-4小時.實施例5:核移植胚胎的活化22將在實施例4中得到的核移植胚胎在含有l(wèi)O[iM離子載體(Sigma)的mSOF中在39'C下培養(yǎng)4分鐘，由此誘導(dǎo)核移植胚胎的活化。然后，洗滌核移植胚胎，并進一步在添加了1.9mM的6-二甲基氨基嘌呤的mSOF(表3)中培養(yǎng)4小時。在它們被移植到代孕母體中之前，將核移植胚胎在由礦物油覆蓋的25pl的mSOF微滴中培養(yǎng)。表3成分濃度體積NaC1(54.44)2.900-3.100g/mlStock-T107.7mM(3.14g)2mlKcl(74.55)0.2669g7.2mMKH2P04(136.1)0.0810g1.2mMSod乳酸0.28ml3.3mM卡那霉素0.0375gPhenel-Red0.0050gNaHCO3(84.01)1.053lg/50ml0.42124g/20mlStock-B25.1mM2mlSod.丙酮酸鹽(l10.0)0.0182g/5mlStock-C0.3mM200^1MgCl26H2O(147.0)0.0996g/10mlStock-M0.5mM200plCaCl22H2O(203.3)0.2514g/10mlStock-D1.71mM200^1葡萄糖(180)0.27024g/10ml1.5mM200^1谷氨酸鹽(146.1)0.14618g/10mlImM檸檬酸(192)0.096g/10mlStock-CA0.5mM200[ilHEPES(238.3)0.5958g/10mlStock-E2.5mM200^1EAA(Gibco11051-018)400^1NEAA(Gibco11140-019)200^1ITS(I-3146)簡plBSA(fattyacidfree)O掘Og透明質(zhì)酸0.5mg/mlINNaOHD.W.總體積20mlpH7.2-7.4/滲透壓275-285/EAA，NEAA:對光敏感23實施例6:將胚胎移植到代孕母體中并生產(chǎn)克隆狗將來自實施例5中的核移植胚胎外殼移植到發(fā)情同步化的代孕母體的輸卵管中。移植在核移植胚胎活化之后4小時內(nèi)進行。作為代孕母體，使用沒有疾病、顯示正常發(fā)情周期重復(fù)并具有正常子宮狀態(tài)的狗。為了移植，代孕母體通過血管注射0.1mg/kg的乙酰丙嗪和6mg/kg的丙泊酚麻醉，并使用2%的異氟烷保持麻醉狀態(tài)。作為麻醉的母狗的手術(shù)臺進行無菌處理，并按照常規(guī)剖腹手術(shù)在腹部中央切口以便暴露輸卵管。腹腔通過手刺激以便將卵巢、輸卵管和子宮拉到切口。仔細(xì)處理被拉卵巢的卵巢系膜以識別輸卵管的開口，將裝備有l(wèi).Oml結(jié)核菌素注射器(Latexfree,BectonDickinson&CO.Franklinlakes,NJ07417)的3.5FTomcat導(dǎo)管(Sherwood，St.Louis,MO)插入到輸卵管中以保證導(dǎo)管前面有足夠空間。然后，將核移植胚胎經(jīng)導(dǎo)管注射到輸卵管中。在顯微鏡下觀察核移植胚胎是否成功地被注射。使用吸收性縫合材料進行腹部縫合，然后進行皮膚縫合。為了防止術(shù)后感染，注射3天廣譜抗生素。在將核移植胚胎已知到代孕母體中之后23天，使用具有連接的7.0MHZ線性探頭的SONOACE9900(MedisonCo.LTD,Seoul,Korea)超聲掃描儀檢査懷孕的情況。在最初確認(rèn)之后每兩周通過超聲來監(jiān)測懷孕情況。結(jié)果，確認(rèn)狗已經(jīng)懷孕，克隆狗通過誘導(dǎo)自然分娩或者進行剖腹產(chǎn)手術(shù)進行生產(chǎn)?？寺」吩趫D2和圖3中顯示。測試實施例1:使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑的組與對照組之間的比較在使用微注射法將犬體細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中之后，檢測了沒有使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的對照組與使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理24小時的組之間的細(xì)胞核的形成和變化。結(jié)果，可以看到，在使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的組中，早熟染色體凝集(PCC)以比對照組中更高的比例發(fā)生，并且細(xì)胞核的24繼續(xù)膨脹和重新濃縮甚至在融合胚胎活化之后仍然出現(xiàn)，同時顯示與對照組的顯著差別。這種結(jié)果表明，即使在犬卵母細(xì)胞的細(xì)胞核在使用微注射方法被替代之后，狗的重建克隆胚胎仍然可正常重塑，并且與對照組相比處理組以更好的方式發(fā)育。得自所述核重塑的細(xì)胞核的各種形態(tài)模式在表4和圖1中顯示。表4顯示了在將體細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中之后細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理組與對照組之間的重建卵母細(xì)胞的核重塑比較。在表4中，PCC、NE和NS表示在其正常發(fā)育過程中隨著時間的流逝細(xì)胞核經(jīng)歷的現(xiàn)象，所述過程隨著時間的流逝按照PCC—NE—NS的順序出現(xiàn)?？梢杂^察到，在電融合1小時后，在處理組中以比對照組中更高的比例出現(xiàn)PCC。而且可以觀察到，在融合胚胎活化之后4小時，核膨脹(NS)在處理組中以比對照組中更多地出現(xiàn)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>然后，將根據(jù)本發(fā)明的方法使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的核供體細(xì)胞的組和未使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的培養(yǎng)的核供體細(xì)胞的對照組進行體細(xì)胞核移植，然后檢査每組的懷孕率。25結(jié)果，在對照組中，478個移植了體細(xì)胞核的胚胎被移植到26個代孕母體中，其中，4個動物懷孕(15.3%，懷孕的代孕母體數(shù)/代孕母體總數(shù))。在使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理的對照組中，體細(xì)胞核移植后556個胚胎被移植到29個代孕母體中，其中，11個動物成功懷孕(39.9%，懷孕的代孕母體數(shù)/代孕母體總數(shù))。通過所述結(jié)果可以看出，當(dāng)體細(xì)胞核移植在使用細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑處理之后懷孕率顯著增加。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>工業(yè)實用性如上面詳細(xì)描述的那樣，根據(jù)本發(fā)明的方法可通過使用特定物質(zhì)誘導(dǎo)用于核移植的供體細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)同步化增加在犬克隆中成功地核移植的效率。因此，本發(fā)明的方法可有助于獸醫(yī)藥、人類學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)諸如高級犬類的繁殖、稀有或者幾乎滅絕犬類的保護、異種器官移植領(lǐng)域研究的開展。雖然已經(jīng)參照具體特征對本發(fā)明進行了詳細(xì)描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，該描述僅僅是優(yōu)選實施方式，而不是限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實際范圍將由所附的權(quán)利要求書及其等同技術(shù)來限定。權(quán)利要求1、一種生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，包括下列步驟制備去核卵母細(xì)胞；制備核供體細(xì)胞；將核供體細(xì)胞微注射到去核卵母細(xì)胞中然后將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞之間進行電融合；和活化融合的卵母細(xì)胞，制備核供體細(xì)胞的步驟包括，當(dāng)培養(yǎng)來自犬組織的核供體細(xì)胞時在選自下組的細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的存在下培養(yǎng)核供體細(xì)胞，該組由細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑、放線菌酮，DMSO，丁內(nèi)酯I，巴菲敵柯林，秋水仙胺，含羞草堿，秋水仙素，Hoechst33342所組成。2、根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，其特征在于細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)是胞周期蛋白B激酶抑制劑。3、根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，其特征在于細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)以5-30pM的濃度加入。4、根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，其特征在于所述通過加入細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)物質(zhì)進行的核供體培養(yǎng)進行18-72小時。5、根據(jù)權(quán)利要求1的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，其特征在于核供體細(xì)胞選自由卵丘細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、胎盤細(xì)胞和成體細(xì)胞所組成的組中。6、根據(jù)權(quán)利要求5的生產(chǎn)犬核移植胚胎的方法，其特征在于核供體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或者卵丘細(xì)胞。7、一種生產(chǎn)克隆犬的方法，包括下列步驟制備去核卵母細(xì)胞；制備核供體細(xì)胞；將核供體細(xì)胞微注射到去核2卵母細(xì)胞中然后將供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞之間進行電融合，活化融合的卵母細(xì)胞并將活化的卵母細(xì)胞移植到代孕母體的輸卵管中，其中，制備核供體細(xì)胞的步驟包括當(dāng)培養(yǎng)來自犬組織的核供體細(xì)胞時在選自下組的細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)的存在下培養(yǎng)核供體細(xì)胞，該組由細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑、放線菌酮，二甲基亞砜，丁內(nèi)酯I,巴菲敵柯林，秋水仙胺，含羞草堿，秋水仙素，Hoechst33342所組成。8、根據(jù)權(quán)利要求7的生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)是胞周期蛋白B激酶抑制劑。9、根據(jù)權(quán)利要求7的生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于細(xì)胞循環(huán)同步化誘導(dǎo)物質(zhì)以5-3(HiM的濃度加入。10、根據(jù)權(quán)利要求7的生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于所述通過加入細(xì)胞周期同步化誘導(dǎo)物質(zhì)進行的核供體培養(yǎng)進行18-72小時。11、根據(jù)權(quán)利要求7的生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于核供體細(xì)胞選自由卵丘細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、角化細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、胎盤細(xì)胞和成體細(xì)胞所組成的組中。12、根據(jù)權(quán)利要求11的生產(chǎn)克隆犬的方法，其特征在于核供體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞或者卵丘細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及通過體細(xì)胞核移植來增加屬于犬類(犬科)的動物中后代生產(chǎn)率的方法。更具體地說，涉及通過克隆犬的方法來增加克隆犬的生產(chǎn)率的方法，該方法包括犬類卵母細(xì)胞的去核以制備去核卵母細(xì)胞，并將核供體細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞融合以制備核移植胚胎，并將該核移植胚胎轉(zhuǎn)移到代孕母體(surrogatemother)的輸卵管中，其中在含有特定細(xì)胞循環(huán)同步誘導(dǎo)物質(zhì)，諸如在其制備過程中的細(xì)胞周期蛋白B激酶抑制劑(roscovitine)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)核供體細(xì)胞。該方法能夠高效地克隆犬，因此可有助于在獸醫(yī)藥、人類學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)，諸如高級犬類的繁殖、稀有或者幾乎滅絕犬類的保護、異種器官移植領(lǐng)域研究的開展。文檔編號C12N15/877GK101668847SQ200880001327公開日2010年3月10日申請日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2007年11月19日發(fā)明者吳炫周,姜貞宅,龜張,樸正恩,李炳千,洪少君,金敏奎申請人:財團法人首爾大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力財團