專利名稱：同時檢測和鑒別眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細菌、真菌、寄生蟲和病毒感染的新方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于在能夠引起感染的許多可能病原體中鑒別眼睛和中樞系統(tǒng)感染的致病的單種病原體或一種以上病原體的診斷方法。所有影響眼睛或中樞系統(tǒng)的個別區(qū)域的病原體一般引起相同的表現(xiàn)或癥狀。本發(fā)明涉及以單一的檢驗在這組可能的病原體中檢測和鑒別該病原體，而不需要借助于一種病原體一種檢測的成套檢驗。本發(fā)明致力于基于癥狀的診斷替代基于個別病原體檢測的診斷。

背景技術：
眼睛的感染在臨床上可以按照載有感染物及隨后被感染影響的解剖學分區(qū)分類。有許多的生物體能夠引起眼睛感染，它們在“Principles and Practice of Infectious Diseases，6th Edition，GeraldMandell et al(Eds)Elsevier Churchill Livingston，pp 1387-1418(2005)”中有詳細描述，其公開內容通過引用并入本文。
眼感染可以基于臨床初期診斷分為以下幾類 1.外眼感染，如角膜炎和結膜炎 2.感染性眼內炎 3.葡萄膜炎 4.視網(wǎng)膜炎 許多外眼感染由幾種細菌和真菌引起。事實上，由于暴露在環(huán)境中，結膜和角膜載有許多作為寄生者的非病原性細菌和真菌，這一事實不利于從結膜和角膜刮屑或拭子提取的特定病原體(細菌和真菌)的檢測。在存在化膿或有膿液的潰瘍的情況下，醫(yī)生作出細菌感染的臨時診斷(provisional dignosis)并用局部使用的廣譜抗生素治療病人。但是，難于診斷卻特別可治愈的重要感染有 ●單純性皰疹(引起角膜炎) ●腺病毒性結膜-角膜炎(有時造成流行性擴散) ●沙眼衣原體(引起導致沙眼的濾泡性結膜炎和成人包涵體性結膜炎) ●水痘結膜炎(也稱為帶狀皰疹結膜炎) ●快速生長的分枝桿菌，如龜分支桿菌(M.chelonae)和偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)(引起用于減輕屈光異常的LASIK手術后的感染) 感染性眼內炎可能通常由以下病原體引起 ●革蘭氏陽性細菌 ●革蘭氏陰性細菌 ●厭氣生物體，即痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes) ●真菌。
非常常見的是感染在手術后發(fā)生且蔓延非?？?，導致失明。治療需要的最重要的信息是，病原體是細菌還是真菌，而如果是細菌，它是需氧的還是厭氧的。由血源性傳播引起的內源性感染是很少見的。
葡萄膜炎通常由以下病原體引起 ●結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis) ●龜分支桿菌(M.chelonae) ●偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum) ●鼠弓形體(Toxoplasma gondii)。
視網(wǎng)膜炎一般在免疫抑制個體中見到，且由以下病原體引起 ●巨細胞病毒 ●單純皰疹病毒 ●水痘帶狀皰疹病毒 嚴重的視力損失在所有這些病人中發(fā)生，因而早期和及時的對這些生物體的診斷對于防止整個眼球的失明很是重要的。這些感染的實際發(fā)生率在發(fā)展中國家可能相對較高。許多診斷技術是如在現(xiàn)有技術部分詳細說明的用于眼睛感染的診斷。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染可以分為以下幾類 急性化膿性腦膜炎一般在兒童中發(fā)現(xiàn)，且由以下所列的生物體引起 ●流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza) ●腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)和 ●肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) 腦脊液(CSF)的細菌培養(yǎng)或涂片鏡檢缺乏靈敏度。額外的復雜因素是，先前用抗生素對病人進行治療可能導致CSF的革蘭氏染色和培養(yǎng)兩項的假陰性結果。由于這些原因，醫(yī)生們不太愿意信任培養(yǎng)結果而傾向于完成一個靜脈注射抗生素的10-14天完整療程，這在大多數(shù)情況下是不必要的。一旦部分地進行了治療，這些情況就不能與由下面的病原體引起的慢性腦膜炎區(qū)分開了 ●結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis) ●各種真菌 ●由一系列可通過治療控制的病毒-如HSV、CMV和VZV-引起的病毒性腦炎。
腦炎通常由各種各樣的病毒(地方性的和流行性的都有)引起。但是，單純皰疹、巨細胞病毒和水痘帶狀皰疹是具有特定的抗病毒療法的病毒。其它的可治療腦炎病原體是鼠弓形體(Toxoplasma gondii)?，F(xiàn)有技術 檢測臨床樣本中的病原體(細菌、酵母和其它真菌、寄生蟲和病毒)的經(jīng)典方法包括培養(yǎng)該樣本以擴大所存在病原體的數(shù)目，直到可觀察的菌落生長，然后該菌落生長可以通過標準的實驗室檢驗鑒定和計數(shù)。在需要的時候，所述培養(yǎng)也可以進行附加的檢驗以確定病原體對藥物治療的敏感性。為了準確地鑒定感染種類，醫(yī)生必須依賴于可能需要從3天(如在大多數(shù)細菌的情況下，包括快速生長的分枝桿菌)到8周(如在結核桿菌的情況下)之間的任何長度的時間的培養(yǎng)結果。為了準確地鑒別細菌的種類，該培養(yǎng)隨后進行可能需要另外數(shù)天甚至數(shù)周時間的大范圍生物化學檢驗。大多數(shù)情況下，由于疾病的嚴重程度和即時的藥物干預的必要性，使這一確定過程快速完成是重要的。這里所指的培養(yǎng)技術在細菌感染和真菌感染的診斷中多半是有用的，而它們一般不用于病毒感染情況下的診斷，特別是因為通過培養(yǎng)從臨床樣本中分離病毒的頻率小于15％。
用于診斷感染(如眼睛感染和神經(jīng)系統(tǒng)感染)的適當?shù)臉颖臼菣z測某癥狀(如角膜結膜炎、眼內炎、葡萄膜炎、腦膜炎和腦炎)的發(fā)病原因進行成功診斷的另一個關鍵問題。在這些情況下，感染是高度局部化的，而因此局限于眼睛或CNS。體液，如血液、血漿或血清，不包含感染物。外眼感染需要如角膜刮屑或結膜拭子的樣本，而感染性眼內炎需要或者在眼科診所進行玻璃體吸出或者更好是玻璃體切除的樣本，在這樣情況下，在手術室中取出20ml漢克平衡鹽溶液的玻璃體洗液。簡單的玻璃體吸出物經(jīng)常不足以通過涂片檢查和培養(yǎng)診斷真菌和細菌性眼內炎。在葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎兩種情況下，較好的樣本是收集在27號針中的0.2-0.3mL玻璃體液。用于診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的最好的生物液體是腦脊液。在本發(fā)明的一種實施方式中，在眼內炎的情況下房水或玻璃體液足以檢測和鑒別感染物。這消除了在手術室中進行手術步驟(如玻璃體切除)的必要性。
基于DNA的鑒別病原體的方法提供了對費時和需要具有專門訓練和技術的人員的經(jīng)典方法的簡單、穩(wěn)定和可靠的替代方案。在進行經(jīng)典方法時，有可能會產(chǎn)生錯誤，這些錯誤有時導致對病原體的不明確的鑒定，而因此導致錯誤的診斷/治療。另一方面，基于DNA的病原體鑒別具有在早得多的階段鑒定病原體的優(yōu)勢，有時比觀察到臨床癥狀還早(亞臨床階段)。一旦條件被標準化，病原體的鑒別是十分簡單可靠的，且能夠由半熟練人員完成?；贒NA的方法也可以用于評價醫(yī)療干預的結果(預后價值)。采用基于DNA的方法(如PCR)篩查人的病原體的臨床樣本提供了靈敏和確定的診斷和有效治療的開始，甚至對于每個樣本包含非常少(大約20-50)病原生物體的小量的臨床樣本(房水、玻璃體液、淚水、唾液、血液、腦脊液、粘膜或上皮刮屑，如角膜刮屑、結膜拭子、組織樣本等)也是如此。
采用聚合酶鏈反應(PCR)技術的潛在利益是在相對短的時期內鑒定特定的細菌或病毒病原體?？尚械幕赑CR的檢測具有在病人仍在急救室中時就幫助醫(yī)生決定如何開始治療的能力。由于基于PCR的檢測方法不依賴于活的生物體的存在，而是依賴于遺傳物質，基于PCR的技術可應用于所有患者的情況，甚至在提取收集臨床樣本前使用了抗生素的時候也是如此。但是，基于PCR的方法還有一些困難，如由于污染的核酸產(chǎn)生的假陽性結果和由于復雜試樣導致的PCR反應的抑制。下面的PCR檢測已被用于引起眼睛和CNS感染的生物體。
單純皰疹1 & 2HSV的基于PCR的DNA檢測已顯示具有比病毒培養(yǎng)高4-5倍的靈敏度，并且對轉運狀態(tài)(transport condition)不敏感，如Waid A.，et al.“Polymerase chain reaction for detection of Herpessimplex virus(HSV)on mucosal surfaceComparison with HSV isolationin cell culture”.J.Inf.Dis.1881345-1351(2003)中所述。PCR已用于檢測眼睛樣本(如房水、角膜刮屑、晶狀體吸出物、晶狀體袋囊材料和玻璃體液)和其它臨床樣本(如CSF、生殖道拭子和子宮頸拭子)中的HSV(Madhavan HN et al.“Detection of herpes simplex virus(HSV)using polymerase chain reaction(PCR)in clinical samplesComparisonof PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV”.J.Clin.Virol.14145-15(1999))。這里，PCR能夠在一個臨床樣本中檢測1-3個HSV顆粒。PCR也有效地用于鑒別皰疹病毒血清型，如發(fā)明人之一在公開的文章中所提到的，通過結合PCR和擴增子的限制性長度多態(tài)性(Madhavan HN et al.“Phenotypic and Genotypicmethods for the detection of herpes simplex virus serotypes”.J.Virol.Methods，10897-102(2003))，其公開內容通過引用并入本文。
水痘帶狀皰疹病毒PCR已用于檢測水痘感染(Burke DG，et al.“Polymerase chain reaction detection and clinical significance ofvaricella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virusinfected patients”.J.Inf.Dis，1761080(1996))。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中HSV和VZV兩者的檢測也通過使用PCR實現(xiàn)(Sauerbrei A and Wutzler P.“Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused byherpes viruses”.J.Clin.Virol，25s45-s51，(2002))，作者從中得出結論，PCR是檢測VZV的黃金標準，其公開內容通過引用并入本文。
巨細胞病毒A可商購的稱作COBAS Amplicor CMV Monitor ofRoche Molecular diagnostics(Pleasanton，CA，USA)的PCR檢驗試劑盒利用CMV的DNA聚合酶基因的365堿基對區(qū)域進行擴增檢測。許多檢測方法利用早期速發(fā)抗原和DNA聚合酶的基因以檢測CMV在各種體液中的存在(Stanier P，et al.“Detection of humancytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples usingPCR”.Mol.Cell Probes，651-58(1992)and Gerna G，et al.“Monitoringhuman cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in hearttransplant recipients by determination of viraemia，antigenemia andDNAemia”.J.Inf.Dis.，164，488-498(1991)，其公開內容通過引用并入本文)?；颊叩腃MV感染也通過各種不同樣本(如血液、羊水、鼻吸出物、支氣管肺泡灌洗液、尿、胎盤材料和支氣管吸出物)的巢式PCR(nested PCR)檢測。
由所有三種皰疹病毒(HSV、VZV和CMV)引起的眼睛感染通過如發(fā)明人之一在公開的文章(Priya K et al.“Association of herpesviruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditisapolymerase chain reaction based study”.Ocular Immunology andInflammation 91-9(2003)，其公開內容通過引用并入本文)中所描述的PCR方法檢測。在該研究中，為了獲得必要的靈敏度，進行巢式PCR以檢測VZV。但是，由于第一輪擴增的產(chǎn)物必須被轉移到包含第二組引物(用于擴增第一輪PCR擴增基因中更小區(qū)域)的第二PCR管中，巢式PCR具有在實驗室中引入擴增子污染的伴生問題。
通過PCR檢測結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是兩個FDA批準的檢驗的方案(參見The Amplified Mycobacterium tuberculosisDirect test Gen-Probe，San Deigo，USA and Amplicor M.tuberculosistest of Roche Diagnostic Systems，Basel，Switzerland)?，F(xiàn)有技術中已知有許多其它的檢驗方法。但是，有人用PCR檢測了眼結核(MadhavanHN et al.“Polymerase chain reaction for detection of Mycobacteriumtuberculosis in epiretinal membrane in Eales’”.Disease.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41822-825(2000))。
通過核酸擴增檢測沙眼衣原體已經(jīng)在臨床檢驗中采用，并且該方法在Black CM，“Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydiatrachomatis infection”.Clin.Microbiol.Rev.10160-184(1997)中有詳細描述。衣原體性結膜炎采用PCR對結膜拭子進行檢測，且少至30個生物體在臨床樣本中被檢測出來，如Malathi.Jet al.“A hospitalbased study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydiatrachomatis”.Ind.J.Med.Res.，11771-75(2003)中所詳細描述的。
腺病毒結膜炎如前所述通過結膜拭子的巢式PCR進行診斷(Dalapathy S et al.“Development and use of nested polymerase chainreaction(PCR)for the detection of Adenoviruses from conjunctivitisspecimen”.J.Clin.Virol.1177-84(1998))。
鼠弓形體在具有免疫缺陷的病人中引起嚴重的腦炎和葡萄膜炎。許多PCR檢驗方案已被用于研究各種體液和組織，且所有PCR檢驗依賴于B1基因的擴增(Danise A，et al.“Use of polymerase chainreaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differentialdiagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiencyvirus”.Clin.Infect.Dis 241100-1106(1997)，Montoyo.et al.“Use ofpolymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis.Ophthalmology”，1061554-1563(1999))。
如Anand AR et al.“Use of polymerase chain reaction(PCR)andDNA probe hybridization to determine the gram reaction of theinteracting bacterium in the intraocular fluids of patients withendophthalmitis”.J.Infection，41221-226(2000)中詳細公開的，由眼睛的術后感染導致的感染性眼內炎采用真細菌基因的PCR反應和通過區(qū)分革蘭氏陽性和革蘭氏陰性的探針進行了研究。該研究能夠檢測臨床樣本中的低至6個的細菌。由厭氧生物(如痤瘡丙酸桿菌)引起的眼睛感染如Therese KL et al.“Polymerase chain reaction in thediagnosis of bacterial endophthalmitis”，Brit.J.Opthal.821078-1082(1998)中詳細描述的采用PCR快速檢測。如Anand AR et al.“Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillusendophthalmitis”.Ind.J.Med.Res.114133-140(2001)and Anand ARet al.“Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis”.Ophthalmology 108326-330(2001)中詳細描述的，真菌性眼內炎也可以采用PCR快速診斷。在這兩項研究中，約0.4pgs的真菌DNA能被檢測到。
這里描述的各種PCR檢驗采用了不同的反應熱循環(huán)，因為在各個PCR中引物組和被檢測的基因是不同的。另外，上述各PCR的試劑濃度經(jīng)過了調整，為了達到對于這里描述的該組反應物的最高靈敏度而優(yōu)化PCR。最佳的反應條件根據(jù)待擴增核苷酸鏈的序列、其大小和待檢測的生物體或病原體的整個靶DNA的復雜性而變化。
但是，還需要一種能夠在引起眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細菌性、真菌性、寄生性和病毒性感染的病原體之間同時進行檢測和鑒別的基于PCR的檢驗方法，它除了快速之外，不易于污染，且具有超過其它方法的增強的靈敏度和特異性。該方法易于在臨床環(huán)境中使用，其中在24-48小時內進行感染物的鑒定對于挽救生命是重要的。準確診斷眼睛和腦感染的關鍵問題可以歸納為 ●眼睛和腦的感染是高度局部化的。在容易獲得的生物液體-如血液、血清、血漿、唾液或者外部傷口或潰瘍的膿液或膿性排出物-中沒有病原體的痕跡。
●任何急性感染的公認的生物標志，如C反應蛋白，對于所有影響人體的感染是普遍的和共有的。因此是非特異的。
●為鑒定特定的病原體，需要來自眼睛或CSF的樣本。所獲得的樣本對于角膜感染是角膜刮屑，對于結膜炎是結膜拭子，對于眼內炎是房水，對于葡萄膜炎和視網(wǎng)膜炎是玻璃體液。在腦感染的情況下，優(yōu)選的樣本始終是CSF。所有這些樣本中，都存在著通過單次取樣從病人獲得的樣本的量的限制。一般，你在角膜刮屑或拭子中取得數(shù)千個細胞及可能兩到三毫克的樣本。任何時候可能從病人的眼睛取得的房水大約為100μL，而玻璃體切除樣本最多可達200μL。可以取得最多5ml的CSF樣本，但PCR需要的CSF樣本的體積小于0.5ml。
●樣本體積的限制導致存在于樣本中的細菌/病毒/寄生蟲的數(shù)目受到限制。另外，感染物的量同樣低于在許多其它體室(bodycompartment)如血液中觀察到的量。
●存在于樣本中的感染粒子的總數(shù)與檢測的成功直接相關。低于臨界質量，感染物細菌和真菌不能在培養(yǎng)基中生長，因此難于診斷。存在于眼樣本中的病毒顆粒的數(shù)目通常低于熒光抗體檢測實驗及病毒培養(yǎng)的檢測限，因此使檢測靈敏度低于25％?，F(xiàn)有沒有用于寄生蟲如鼠弓形體(Toxoplasma gondii)的方便的檢測系統(tǒng)，且寄生蟲的數(shù)目對于檢測來說也太少。如對于HSV、CMV、VZV、腺病毒、衣原體和弓形體的IgM或IgG檢測是非常非特異性的，因而沒有診斷意義。
●診斷中的另一個主要困難是所有上面描述的眼睛疾患都是急性的，且需要即時和準確的診斷以指導適當?shù)闹委煛Ｓ刹《靖腥疽鸬母腥拘匝蹆妊缀蛪乃佬砸暰W(wǎng)膜炎需要在首個癥狀出現(xiàn)的96小時內進行治療，在這種情況下延遲超過48小時將導致失明。
多重PCR也已被用于既定情形下的某些病原體，且通過用質譜確定分子量來鑒定擴增產(chǎn)物。詳細描述見Detection and identificationof pathogens by mass spectrometric determination of the basecomposition of PCR products.(Ecker，David J.Griffey Richard 11.Sampath，Rangarajan；Hofstandler，Steven A.Meneil，John；Crooke，Sstanley T.(USA).美國專利申請公開U.S.Pat.Appl.Publ.(2004)，168頁，美國申請?zhí)?23,233的部分繼續(xù)申請。專利申請US 2003-66012220030911.優(yōu)先權US 2001-79800720010302；US 2002-43131920021206；US 2002-323233 20021218；US 2002-326051 20021218；US2002-325526 20021218；US 2002-325527 20021218；US 2003-44344320030129；US 2003-443788 20030130；US 2003-447529 20030214)。
多重PCR之后進行鑒定產(chǎn)物的凝膠電泳被試圖用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，如Read，SJ.and Kurtz，JB.“Laboratory diagnosis of commonviral infections of the central nervous system by using a single multiplexPCR screening assay”.J.Clin.Microbiol.371352-1355(1999)中所述。
多重PCR之后進行用于檢測病原體的微陣列據(jù)報道用于引起呼吸道疾病的病原體的檢測(Wang D et al.“Microarray based detectionand genotyping of viral pathogens”.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9915687-15692(2002))。擴增子的檢測也試圖采用比色微滴定板分析系統(tǒng)，其中擴增子用洋地黃毒苷11-dUTP標記，且生物素化的探針被用于捕獲滴定板上的擴增子。該產(chǎn)物采用酶標記的抗地高辛展現(xiàn)(Smalling TW et al.“Molecular approaches to detecting herpes simplexvirus and enteroviruses in the central nervous system”.J.Clin.Microbiol.402317-2322(2002))。
如Madhavan HN et al.，“Development and application of a novelmultiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of humancytomegalovirus in clinical specimen”，J Virol Methods.141166-72(2007)中所詳細描述的，對于同一生物體的三個不同基因，即巨細胞病毒的形態(tài)轉化區(qū)II、UL83和糖蛋白O基因，成功地嘗試了多重PCR分析，以定量臨床樣本中的病毒。
在擴增所有19個高危險基因型的L1區(qū)后，線性探針分析也被用于檢測和鑒別乳頭瘤病毒的基因型(Bauer HM et al.“Detection ofhuman papilloma viruses by polymerase chain reaction”US Patent No5639871)。
如質譜這樣的方法即使在先進的三級醫(yī)護中心也不是切實可行的，而基于昂貴的掃描儀的微陣列檢測在臨床環(huán)境下是不可能提供的。線性探針分析易發(fā)生擴增子污染。
I.定義 “核苷酸”意指DNA或RNA的結構單元，由一個堿基、一個磷酸分子和一個糖分子(DNA中為脫氧核糖，RNA中為核糖)組成。
“寡核苷酸”意指核苷酸的短鏈。寡核苷酸經(jīng)常用作發(fā)現(xiàn)DNA或RNA的匹配序列的探針，且可用各種標記物進行標記，如放射性同位素及熒光和化學發(fā)光基團。
“引物”意指與DNA的特定靶序列互補的寡核苷酸短鏈，其用于起動DNA合成。
“單重(uniplex)”意指在擴增單個病原體特異的DNA序列的各反應中利用單組引物的基于PCR的分析。
“多重”意指在單反應中利用多個引物組的基于PCR的分析，其中每個引物可以擴增單個病原體特異的DNA序列。
術語“探針”指的是由靶DNA的PCR擴增產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物(擴增子)。
術語“靶”指的是對于某個病原體特異性的DNA序列，其固定在惰性基質如尼龍上。
“雜交”指的是將兩條互補的DNA鏈結合以形成雙鏈分子的過程，在這里更具體地指“探針”和“靶”DNA序列之間的過程。
這里所用的術語“檢測系統(tǒng)”指的是使PCR擴增的DNA產(chǎn)物可視化的方法。合適的檢測系統(tǒng)的例子包括依賴于色彩、放射性、熒光或化學發(fā)光的系統(tǒng)。
“泛真菌的”意指在所有病原性真菌-如隱球菌、假絲酵母、毛霉菌、曲霉菌和根霉菌等-中發(fā)現(xiàn)的共有基因序列，且被用于鑒別任何/所有的真菌種類。


發(fā)明內容
本發(fā)明提供一系列化學標記的病原體特異性的正向和反向引物，其被獨一地設計為在95℃的變性溫度、58-65℃的退火溫度和在72℃延伸的多重聚合酶鏈反應中特異地擴增來自病原體的靶序列。本發(fā)明還提供一系列源自病原體特異性基因的靶DNA序列，其被固定在惰性載體上并特異地與使用病原體特異性正向和反向PCR引物獲得的PCR擴增產(chǎn)物雜交。
本發(fā)明提供同時檢測引起眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體的快速分析方法，對于這些病原體，免疫學的參數(shù)并不顯示出活動的感染而僅表現(xiàn)為暴露于病原體，且對于這些病原體，經(jīng)典的微生物學分析如細菌和真菌培養(yǎng)，既不足夠靈敏以檢測到病原體，也不足夠快速以在48小時內鑒定出病原體。
本發(fā)明結合了PCR分析的高靈敏性和通過雜交到宏陣列上用色彩檢測方法檢測雜交的鑒別方法的高特異性，其最終結果可以通過肉眼監(jiān)測。但是，如Quantum Dots、Cy3、Cy5和FITC的熒光標記也可使用，且產(chǎn)物可以通過熒光顯微鏡觀察到。
本發(fā)明的特征是同時檢測和鑒別引起眼睛和CNS感染的病原體的多重分析，包括 i)對來自懷疑患有眼睛或CNS感染的病人的臨床樣本(如角膜刮屑或結膜拭子或房水或玻璃體液或收集的玻璃體切除洗液或腦脊液吸出物或從腦膿腫材料收集的膿液或視網(wǎng)膜前膜)進行處理以通過標準方法分離DNA。
ii)使用已知引起CNS和眼睛感染的各病原體的標記的擴增引物通過單管PCR技術擴增各病原體特異性的基因的特定DNA區(qū)域。
iii)利用DNA雜交檢測和鑒別病原體，其中各病原體特異性的固定化的靶序列與由PCR反應產(chǎn)生的擴增的DNA探針反應，并且通過利用特定的試劑組的顯色監(jiān)測雜交。

具體實施例方式 適用于眼睛感染患者臨床樣本病原體DNA多重PCR的獨特PCR引物設計。
下面來自各種已知引起眼睛感染的病原體的基因是基于文獻中的已知信息選擇的。
1.單純皰疹病毒1&2糖蛋白D 2.單純皰疹病毒1&2UL 44基因 3.單純皰疹病毒1&2DNA聚合酶基因 4.巨細胞病毒糖蛋白O基因 5.巨細胞病毒形態(tài)轉化基因 6.巨細胞病毒UL 88基因 7.水痘帶狀皰疹ORF 29 8.水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因 9.腺病毒六鄰體(Hexon)基因 10.真細菌16s核糖體RNA基因I 11.真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)II 12.16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分 13.結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)MPB 64基因 14.偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)16s-23s RNA基因 15.龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)16s-23s RNA基因 16.鼠弓形體(Toxoplasma gondii)B1基因 17.沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)多態(tài)蛋白(polymorphicprotein)II 18.28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分 19.16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)特異性部分 20.gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分 21.革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因 22.革蘭氏陰性核糖核酸酶1基因 為進一步提高檢測某些生物體(如單純皰疹1和2、巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹和革蘭氏陰性細菌)的可靠性，選擇擴增各生物體的一種以上的基因。在單純皰疹1和2和巨細胞病毒的情況中，選擇各生物體的三種不同基因，而對于水痘帶狀皰疹，選擇兩種基因。
皰疹病毒的DNA聚合酶基因是一種賦予PCR靈敏性的基因，且被用于許多研究中。在第一個研究中，179bp產(chǎn)物使用95℃變性45秒、64℃退火45秒和72℃延伸45秒的熱循環(huán)條件進行擴增(Madhavan HN et al，Detection of herpes simplex virus(HSV)usingpolymerase chain reaction(PCR)in clinical samples Comparison of PCRwith standard laboratory methods for the detection of HSV，J.Clin.Virol.14145-151(1999))。而在另一個研究中，相同基因的469和391bp區(qū)域使用不同的引物組和熱循環(huán)條件(95℃變性45秒、60℃退火45秒和72℃延伸45秒)進行擴增(Madhavan HN et al，Phenotypic andGenotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes.J.Virol.Methods，10897-102.(2003))。總之在檢測不同病毒時，使用不同的熱條件，如在用于鑒定眼睛感染的HSV、CMV和VZV的PCR的情況中(Priya K et al，Association of herpes viruses in aqueoushumour of patients with serpigenous choroiditisa polymerase chainreaction based study，Ocular Immunology and Inflammation 91-9(2003))。在這一研究中，反應條件和引物濃度對于不同病毒是不同的。因此很明顯，難于設計出用于一系列已知病原體的引物和特異性靶序列以能夠實現(xiàn)使快速檢測和鑒別給定的臨床樣本中的一種或多種病原體的單管多重PCR反應。
因此，考慮有必要探索使用已知生物信息學方法設計合適的PCR引物和與PCR擴增產(chǎn)物互補的靶DNA序列的可能性。
為達到這一目的，本發(fā)明首先確定下面的優(yōu)先用于進行HSV、CMV和VZV的檢測的多重PCR反應的條件，即在95℃變性、隨后在58℃-65℃退火，然后在72℃延伸。如此獲得的PCR擴增產(chǎn)物與固定在固相基質上的各病原體特異性的靶DNA序列的最佳雜交溫度確定在48℃到55℃。因此考慮有必要設計所研究的各病原體的靶DNA序列組，從而特異性的PCR擴增產(chǎn)物在統(tǒng)一溫度下與其互補靶DNA序列雜交，而不產(chǎn)生DNA序列的非特異性的結合。
在設計多重PCR反應的引物中最困難的部分是設計成所有引物具有相同的解鏈溫度，從而使所有基因在相同的熱循環(huán)溫度下擴增成為可能。
用于擴增的這些引物組從上面提到的基因序列中選擇以使所有的引物具有58-65℃范圍內的退火溫度，從而所有23個基因可以在同一個管中利用PCR擴增，其總是代表所研究的特定病原體的所有種株或基因型。
不同大小的擴增子可能干擾PCR方法的多重擴增的效率。因此選擇引物的第二個標準確定為擴增子在66-90核苷酸范圍內的均勻大小。對上節(jié)中提到的所有基因選擇包含66-90bp長度的區(qū)域(包括引物序列)。
為保持解鏈溫度均一，引物長度在17-29堿基對之間變化。
另外，在多重反應中，由于存在互補區(qū)域導致引物中成環(huán)或交叉雜交可能干擾PCR擴增本身。為避免所有這種復雜情況，所有引物被仔細地設計以消除它們自身之間的成環(huán)或引物的交叉雜交。也注意避免引物組的任何非特異性的(交叉的)擴增，即一種生物體/基因的引物不應該與反應混合物中任何其它生物體/基因的基因反應。
所有引物被設計為它們一般匹配病原體基因的所有核苷酸堿基。但是，如果在某些株或物種中存在錯配，如在設計擴增革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和真菌的引物的情況中，錯配限制為引物中間的最多兩個核苷酸。各引物的3’端確保在診斷的物種的所有株中總是具有完全的匹配。
所描述的標準之外，這里引用現(xiàn)有技術中用于選擇引物序列的一般標準，在Molecular cloningA laboratory manual，Vol 2，Sambrook.J，Russell DW(Eds)Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(2001)中對此有詳細說明。這些標準是，3’端為G或C，避免串列的GC重復和一般任何引物不以T終止等。
設計后，利用所列的所有病原體的標準DNA序列(基因)，引物被個別地和以復合的形式使用以檢驗靈敏性和特異性。在識別一些生物體或病毒顆粒中，當靈敏性達不到現(xiàn)有技術中報道的水平的時候，采用相同的標準選擇了不同的引物組，所述現(xiàn)有技術例如有Madhavan HN，et al，Detection of herpes simplex virus(HSV)usingpolymerase chain reaction(PCR)in clinical samples Comparison of PCRwith standard laboratory methods for the detection of HSV，J.Clin.Virol.14145-151(1999)；Malathi.Jet al.A hospital based study on prevalenceof conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis Ind.J.Medical research，11771-75(2003)；Anand ARet al Use of polymerase chain reaction(PCR)and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of theinteracting bacterium in the intraocular fluids of patients withendophthalmitis.Journal of Infection，41221-226(2000)；Anand AR et al.Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitisOphthalmology 108326-330(2001)。即使某些引物在58℃退火，也在實驗上確保所有的引物在60℃產(chǎn)生良好的擴增。
在本實施方式中，經(jīng)過仔細的評價，選擇了下面這些獨特引物并用于病原體的檢測和鑒別。這些序列是獨特的和現(xiàn)有技術中未知的。
1.通過包括SEQ ID No.1和2(FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQID No.1)和RP5′gcccccagagacttgttgtagg 3′(SEQ ID No.2))的引物組1擴增單純皰疹病毒1和2糖蛋白D基因 2.通過包括SEQ ID No.3和4(FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQ ID No.3)和RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4))的引物組2擴增單純皰疹病毒1和2 UL 44基因 3.通過包括SEQ ID No.5和6(FP5′caagctgacggacatttacaagg3′(SEQ ID No.5)和RP5′gtcccacacgcgaaacacg 3′(SEQ ID No.6))的引物組3擴增單純皰疹病毒1和2DNA聚合酶基因 4.通過包括SEQ ID No.7和8(FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQID No.7)和RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8))的引物組4擴增巨細胞病毒糖蛋白O基因 5.通過包括SEQ ID No.9和10(FP5′cggcgacgacgacgataaag3′(SEQ ID No.9)和RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10))的引物組5擴增巨細胞病毒形態(tài)轉化基因 6.通過包括SEQ ID No.11和12(FP5′gggcacgtcctcgcagaag3′(SEQ ID No.11)和RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12))的引物組6擴增巨細胞病毒UL 88基因 7.通過包括SEQ ID No.13和14(FP5′ggtcttgccggagctggtattac3′(SEQ ID No.13)和RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14))的引物組7擴增水痘帶狀皰疹ORF 29 8.通過包括SEQ ID No.15和16(FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg3′(SEQ ID No.15)和RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16))的引物組8擴增水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因 9.通過包括SEQ ID No.17和18(FP5′cgccgccaacatgctctacc3′(SEQ ID No.17)和RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18))的引物組9擴增腺病毒六鄰體基因 10.通過包括SEQ ID No.19和20(FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg3′(SEQ ID No.19)和RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20))的引物組10擴增真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)I 11.通過包括SEQ ID No.21和22(FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc3′(SEQ ID No.21)和RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22))的引物組11擴增真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)II 12.通過包括SEQ ID No.23和24(FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat3′(SEQ ID No.23)和RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24))的引物組12擴增16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分 13.通過包括SEQ ID No.25和26(FP5′gcggaacgtgggaccaatac3′(SEQ ID No.25)和RP5′cgacggggtgattttcttcttc 3’(SEQ ID No.26))的引物組13擴增結核桿菌MPB 64基因 14.通過包括SEQ ID No.27和28(FP5′aacttttttgactgccagacacactattg 3′(SEQ ID No.27)和RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28))的引物組14擴增偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因 15.通過包括SEQ ID No.29和30(FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt3′(SEQ ID No.29)和RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30))的引物組15擴增龜分枝桿菌16s-23s RNA基因 16.通過包括SEQ ID No.31和32(FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ ID No.31)和RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32))的引物組17擴增鼠弓形體B1基因 17.通過包括SEQ ID No.33和34(FP5′aatcgtatctcgggttaatgttgc3′(SEQ ID No.33)和RP5′tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34))的引物組18擴增沙眼衣原體多態(tài)蛋白II 18.通過包括SEQ ID No.35和36(FP5′gctgggactgaggactgcgac3′(SEQ ID No.35)和RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36))的引物組19擴增28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分 19.通過包括SEQ ID No.37和38(FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)和RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38))的引物組20擴增16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分 20.通過包括SEQ ID No.39和40(FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQ ID No.39)和RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40))的引物組21擴增gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分 21.通過包括SEQ ID No.41和42(FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ ID No.41)和RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42))的引物組22擴增革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因 22.通過包括SEQ ID No.43和44(FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)和RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44))的引物組23擴增革蘭氏陰性核糖核酸酶1基因 在本發(fā)明的另一實施方式中，具有SEQ ID No.45-67的探針序列通過用于設計識別所述病原體獨有的特定基因片段的引物的計算機程序獲得。探針序列的長度在66-90核苷酸之間變化。探針自身內不形成發(fā)夾環(huán)。它們與任何其它擴增子不共有同源性。探針可以從病原體DNA兩條鏈的任一條鏈擴增。
探針序列詳述如下 1.單純皰疹病毒1和2糖蛋白D基因的探針DNA序列“cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No.45)(通過包括FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQ ID No.1)和RP5′gcccccagagacttgttgtagg3′(SEQ ID No.2)的引物組1擴增) 2.單純皰疹病毒1和2UL 44基因的探針DNA序列“ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No.46)(通過包括FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQID No.3)和RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4)的引物組2擴增) 3.單純皰疹病毒1和2DNA聚合酶基因的探針DNA序列“caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No.47)(通過包括FP5′caagctgacggacatttacaagg 3′(SEQ ID No.5)和RP5′gtcccacacgcgaaacacg3′(SEQ ID No.6)的引物組3擴增) 4.巨細胞病毒糖蛋白O基因的探針DNA序列“ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No.48)(通過包括FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQ IDNo.7)和RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8)的引物組4擴增) 5.巨細胞病毒形態(tài)轉化區(qū)II基因的探針DNA序列“cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49)(通過包括FP5′cggcgacgacgacgataaag 3′(SEQ ID No.9)和RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10)的引物組5擴增) 6.巨細胞病毒UL 88基因的探針DNA序列“gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)(通過包括FP5′gggcacgtcctcgcagaag 3′(SEQ IDNo.11)和RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12)的引物組6擴增) 7.水痘帶狀皰疹ORF 29的探針DNA序列“ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No.51)(通過包括FP5′ggtcttgccggagctggtattac3′(SEQ ID No.13)和RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14)的引物組7擴增) 8.水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因的探針DNA序列“tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No.52)(通過包括FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg 3′(SEQ ID No.15)和RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16)的引物組8擴增) 9.腺病毒六鄰體基因的探針DNA 序列“cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No.53)(通過包括FP5′cgccgccaacatgctctacc 3′(SEQ IDNo.17)和RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18)的引物組9擴增) 10.真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)I的探針DNA序列“tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No.54)(通過包括FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg 3′(SEQ ID No.19)和RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20)的引物組10擴增) 11.真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)II的探針DNA序列“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SEQ ID No.55)(通過包括FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc 3′(SEQ ID No.21)和RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22)的引物組11擴增) 12.16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分的探針DNA序列“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No.56)(通過包括FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat 3′(SEQ ID No.23)和RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24)的引物組12擴增) 13.結核桿菌MPB 64基因的探針DNA序列“gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No.57)(通過包括FP5′gcggaacgtgggaccaatac 3′(SEQ ID No.25)和RP5′cgacggggtgattttcttcttc3’(SEQ ID No.26)的引物組13擴增) 14.偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因的探針DNA序列“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No.58)(通過包括FP5′aacttttttgactgccagacacactattg3′(SEQ ID No.27)和RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28)的引物組14擴增) 15.龜分枝桿菌16s-23s RNA基因的探針DNA序列“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No.59)(通過包括FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt 3′(SEQ IDNo.29)和RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30)的引物組15擴增) 16.鼠弓形體B1基因的探針DNA序列“cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No.60)(通過包括FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ IDNo.31)和RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32)的引物組16擴增) 17.沙眼衣原體多態(tài)蛋白II 的探針DNA序列“aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No.61)(通過包括FP5′aatcgtatctcgggttaatgttgc 3′(SEQID No.33)和RP5′tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34)的引物組17擴增) 18.28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分的探針DNA序列“gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No.62)(通過包括FP5′gctgggactgaggactgcgac 3′(SEQ IDNo.35)和RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)的引物組18擴增) 19.16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分的探針DNA序列“tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No.63)(通過包括FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)和RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38)的引物組19擴增) 20.Gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分的探針DNA序列“cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No.64)(通過包括FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQID No.39)和RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40)的引物組20擴增) 21.革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因的探針DNA序列“ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No.65)(通過包括FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ IDNo.41)和RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42)的引物組21擴增) 22.革蘭氏陰性核糖核酸酶1基因的探針DNA序列“gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc(SEQ ID No.66)(通過包括FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)和RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44)的引物組22擴增) 似乎重復一遍。
在本發(fā)明的另一實施方式中，具有SEQ ID No.67-88的靶序列使用計算機程序從探針序列產(chǎn)生。這些靶用于固定在惰性材料上，如尼龍，并用UV輻射交聯(lián)或化學固定。靶按照下面的標準選擇 1.所有靶序列是病原體特異性的且不與其它病原體的任何其它序列重疊。
2.所有靶序列在23-28堿基長度的范圍內。
3.所有靶具有在58.9℃-88℃范圍內的均勻的解鏈溫度。
4.靶序列落在擴增子區(qū)域且不包含正向或反向引物序列，從而標記的探針(具有SEQ ID No.67-91)不與這些靶非特異性地結合。
5.所有靶以它們一般匹配所有核苷酸堿基的方式設計。但如果在某些探針中存在錯配，錯配限制為探針中部最多兩個核苷酸。
靶序列詳細描述如下 1.5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’(SEQ ID No.67)，通過引物組1擴增的HSV糖蛋白D的靶 2.5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’(SEQ ID No.68)，通過引物組2擴增的HSV UL 44的靶 3.5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’(SEQ ID No.69)，通過引物組3擴增的HSV聚合酶的靶 4.5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No.70)，通過引物組4擴增的CMV糖蛋白O的靶 5.5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No.71)，通過引物組5擴增的巨細胞病毒形態(tài)轉化基因II的靶 6.5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No.72)，通過引物組6擴增的巨細胞病毒UL 88基因的靶 7.5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No.73)，通過引物組7擴增的水痘帶狀皰疹病毒ORF 29基因的靶 8.5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No.74)，通過引物組8擴增的水痘帶狀皰疹病毒DNA聚合酶基因的靶 9.5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No.75)，通過引物組9擴增的腺病毒六鄰體基因的靶 10.5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No.76)，通過引物組10擴增的真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)I的靶 11.5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No.77)，通過引物組11擴增的真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)II的靶 12.5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No.78)，通過引物組12擴增的革蘭氏陽性生物體的16s核糖體RNA基因的靶 13.5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No.79)，通過引物組13擴增的結核桿菌MPB 64基因的靶 14.5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No.80)，通過引物組14擴增的偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因的靶 15.5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No.81)，通過引物組15擴增的龜分枝桿菌16s-23s RNA基因的靶 16.5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No.82)，通過引物組16擴增的鼠弓形體B1基因的靶 17.5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No.83)，通過引物組17擴增的沙眼衣原體多態(tài)蛋白II的靶 18.5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No.84)，通過引物組18擴增的所有真菌的28s核糖體RNA基因的靶 19.5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No.85)，通過引物組19擴增的痤瘡丙酸桿菌的16s核糖體RNA基因的靶 20.5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No.86)，通過引物組20擴增的革蘭氏陰性生物體的促旋酶基因的靶 21.5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No.87)，通過引物組21擴增的革蘭氏陰性生物體的烏頭酸水合酶基因的靶 22.5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SE Q ID No.88)，通過引物組2，2擴增的革蘭氏陰性生物體的核糖核酸酶基因的靶 上面報告的用于固定在惰性基質上的這些寡核苷酸，使用由標準DNA產(chǎn)生的產(chǎn)物以及臨床樣本(通過序列分析)進行確認。這些序列是獨特的且是未知的或沒有被提到過用于多重或單重PCR。
在本發(fā)明的再另一實施方式中，提供了使用所有或一些上述引物組的多重PCR分析方法，其中所有引物可以利用統(tǒng)一的熱循環(huán)條件在單個管中一起使用，包括94℃5分鐘的變性步驟，隨后是40次循環(huán)的60℃-64℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃延伸反應10分鐘。
在進一步的實施方式中，在5’端用生物素標記的引物組使得可以檢測有色產(chǎn)物。
在再另一實施方式中，所述引物用熒光標記(如異硫氰酸熒光素FITC的有機熒光標記或如Quantum DotsTM或Cy3或Cy5的無機熒光納米顆粒)進行標記以便可以通過任何熒光掃描裝置或顯微鏡進行檢測。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供所述引物和探針集合的用途，其中檢驗分析是用于檢測病原體的實時PCR。
在再另一實施方式中，本發(fā)明提供所述引物和探針集合的用途，其中檢驗分析是用于定量測定臨床樣本中病原體的實時PCR，以監(jiān)測疾病的預后或治療。
在再另一實施方式中，本發(fā)明提供所述引物集合的用途，其中擴增產(chǎn)物的檢測可以是宏陣列或狹縫雜交或線性探針分析的形式。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供由固定在含硝基纖維素、尼龍、帶電尼龍、玻璃或聚苯乙烯的固體相上的所述探針組成的宏陣列。
在另一個實施方式中，本發(fā)明提供用于檢測和鑒別引起如感染性眼內炎或角膜炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜炎的病癥的病原體的方法，其中被檢測的病原體為單純皰疹病毒1和2、巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腺病毒、真細菌、革蘭氏陽性生物體、革蘭氏陰性細菌、真菌、結核桿菌、龜分支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鼠弓形體、沙眼衣原體。
在再另一實施方式中，本發(fā)明提供用于在一組引起具有相似癥狀的眼睛或中樞系統(tǒng)疾病的可能病原體中檢測出個別的病原體的方法。
在再另一實施方式中，本發(fā)明提供使用選定的一些或所有前述引物的任何多重PCR分析，其中由一些或所有所述生物體引起的任何臨床癥狀被研究，用于檢測存在于臨床樣本中的任何一種個別病原體或病原體組。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的方法，包括如下步驟 a)從患有所述感染的患者取得臨床樣本， b)從步驟a)中取得的樣本的一部分或全部提取DNA， c)采用生物素或熒光示蹤劑標記的如權利要求1中所述的引物集合和標準的PCR試劑對步驟b)中獲得的DNA進行多重PCR， d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性， e)使步驟d)中獲得的PCR產(chǎn)物與固定在固體基質上的靶雜交， f)通過酶或熒光方法檢測在步驟e)中獲得的固體基質上的DNA雜交體。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的試劑盒，包括 a)如前所述的正向和反向引物的集合， b)固定在合適的固體載體上的如前所述的DNA靶基質， c)通過聚合酶鏈反應擴增DNA所需的標準試劑， d)將PCR擴增產(chǎn)物雜交到DNA探針的固定基質所需的標準試劑， e)檢測用于檢測和鑒別特定病因病原體的最終雜交產(chǎn)物所需的標準試劑。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供用于同時檢測引起外眼感染、眼內炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的方法，包括 a)從患有所述感染的患者取得臨床樣本， b)從步驟a)中取得的樣本的一部分或全部提取DNA， c)采用生物素或熒光示蹤劑標記的如前所述的引物集合和標準的PCR試劑對步驟b)中獲得的DNA進行多重PCR， d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性， e)使步驟d)中獲得的PCR產(chǎn)物與固定在固體基質上的如前所述的靶雜交， f)通過酶或熒光方法檢測在步驟e)中獲得的固體基質上的DNA雜交體。
實施例 下面的實施例以對本發(fā)明舉例說明的方式給出，因此不應構成對本發(fā)明的范圍的限制。
實施例1 使用能夠分別擴增腺病毒六鄰體基因和沙眼衣原體多態(tài)蛋白II基因的引物組9和18進行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50℃進行2分鐘，94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。產(chǎn)物通過6％瓊脂糖凝膠進行分析。如

圖1中所見，兩個基因都得到擴增。1pg腺病毒和10fg衣原體DNA的標準DNA用于擴增。
圖1顯示腺病毒六鄰體基因和沙眼衣原體基因組的單重和多重PCR擴增產(chǎn)物的6％瓊脂糖凝膠電泳圖
道 NC-陰性對照 1-陽性對照-腺病毒 2-陽性對照-沙眼衣原體 3-陽性對照-多重PCR(腺病毒和沙眼衣原體) MW-100bp DNA梯狀條帶 實施例2 使用能夠分別擴增糖蛋白D、UL 44和DNA聚合酶基因的引物組1、2和3進行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mMTris-HCl(pH 7.5)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50℃進行2分鐘，94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。產(chǎn)物通過6％瓊脂糖凝膠進行分析。如圖2中所見，所有三個基因都得到擴增。
圖2顯示單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白D、DNA聚合酶、UL-44區(qū)域的擴增產(chǎn)物的4％瓊脂糖凝膠電泳圖
道 NC-陰性對照 1-陽性對照糖蛋白D區(qū)域 2-陽性對照DNA聚合酶區(qū)域 3-陽性對照UL-44區(qū)域 MW-100bp梯狀條帶 實施例3 使用能夠分別擴增HSV糖蛋白D基因、UL 44基因和DNA聚合酶基因、腺病毒六鄰體基因和沙眼衣原體多態(tài)蛋白II基因的引物組1、2、3、9和17進行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mMTris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50℃進行2分鐘，94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。5管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC沒有添加任何DNA，管1包含1pg的HSV DNA，管2包含4fg的沙眼衣原體，管3包含10pg的腺病毒DNA，而管4包含上述量的所有三種DNA。產(chǎn)物通過6％瓊脂糖凝膠進行分析。如圖3中所見，所有基因都得到擴增。
圖3顯示外眼感染的多重PCR擴增產(chǎn)物的6％瓊脂糖凝膠電泳圖
道 NC-陰性對照 1-陽性對照(HSV) 2-陽性對照(沙眼衣原體) 3-陽性對照(腺病毒) 4-陽性對照(所有三種基因組) MW-

174DNA的HinfI消化物 尼龍膜各點有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.67、68、69、75和83的靶(圖4)。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
圖4與多重PCR擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別HSV、沙眼衣原體、腺病毒的基因組的外眼感染的鑒定
DNA陣列(左至右)顯示尼龍膜上DNA探針點樣的模板。HSV-單純皰疹病毒，顯示點樣處標記為HGD＝HSV糖蛋白D，HDP＝HSV DNA聚合酶，HUL＝UL 44基因；1stComp.＝HGD的互補鏈探針，CT-沙眼衣原體，AV-腺病毒。NC-陰性對照，HSV-用管1的擴增子雜交的膜，CT-用管2的擴增子雜交的膜，AV-用管3的擴增子雜交的膜。
實施例4 使用能夠分別擴增結核桿菌的MPB 64基因、偶發(fā)分枝桿菌的16s-23s RNA基因、龜分枝桿菌的16s-23s RNA基因和鼠弓形體的B1基因的引物組13、14、15和16進行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50℃進行2分鐘，94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。5管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含1fg的結核桿菌DNA，管2包含100fg的偶發(fā)分枝桿菌DNA，管3包含100fg的龜分枝桿菌DNA，而管4包含1fg的鼠弓形體DNA。圖5顯示了五片尼龍膜，各點有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.79、80、81和82的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的1ml 2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
圖5與多重PCR擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別鼠弓形體、結核桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和龜分枝桿菌的基因組的葡萄膜炎及其它可疑分枝桿菌感染的檢測
從左至右，第一是顯示靶如何點在膜上的模板。MBT-結核桿菌，MBF-偶發(fā)分枝桿菌，MBC-龜分枝桿菌，TG-鼠弓形體。
第二是與標記為NC的陰性對照管雜交的NC，與從管1、2、3和4獲得的擴增子雜交的尼龍膜分別標記為MBT、MBF、MBC和TG。
實施例5 使用能夠分別擴增HSV的糖蛋白D基因、UL 44基因和DNA聚合酶基因、CMV的糖蛋白O基因、形態(tài)轉化和UL 88基因及VZV的ORF29基因和DNA聚合酶基因的引物組1、2、3、4、5、6、7和8進行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，50℃進行2分鐘，和94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。
4管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含1pg的HSV DNA，管2包含10pg的CMV DNA，管3包含1pg的VZV DNA。圖6顯示了四片尼龍膜，各點有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.67、68、69、70、71、72、73和74的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
圖6.與多重PCR的擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列照片，用于特異性識別HSV、CMV和VZV的基因組的病毒性視網(wǎng)膜炎的鑒定
從左至右，顯示探針如何點在各尼龍膜上的模板。HSV-單純皰疹病毒，顯示為HGD＝HSV糖蛋白D，HDP＝HSV DNA聚合酶，HUL＝UL 44基因，1st Comp.＝HGD的互補鏈探針；CMV-巨細胞病毒，顯示為CMT＝形態(tài)轉化基因II，CGO＝巨細胞病毒糖蛋白O，CUL＝UL 83基因，5th Comp.＝CMT的互補鏈探針；VZV-水痘帶狀皰疹病毒，顯示為VO＝水痘帶狀皰疹ORF29基因，VDP＝水痘帶狀皰疹DNA聚合酶；NC與標記為NC的管的內容雜交的膜；HSV-與從1號管獲得的擴增子雜交的尼龍膜；CMV-與從2號管獲得的擴增子雜交的尼龍膜和VZV-與3號管的內容雜交的尼龍膜。
實施例6 使用能夠分別擴增真細菌基因組的16s核糖體RNA基因I和II組、革蘭氏陽性細菌的16s核糖體RNA基因、所有真菌的28sRNA基因、痤瘡丙酸桿菌的16s核糖體RNA基因、革蘭氏陰性細菌的gyrB基因、烏頭酸水合酶基因和核糖核酸酶基因的引物組10、11、12、18、19、20、21和22進行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、50mM Tris-HCl(pH 7.5)中的2單位的Taq聚合酶、5mM MgCl2、5mMKCl、0.01％牛血清白蛋白、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃進行10分鐘的延伸反應。5管如上所述的PCR混合物與下面的DNA制劑一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含5fg的大腸桿菌(E.coli)DNA，管2包含10fg的金黃色釀膿葡萄球菌(S.aureus)DNA，管3包含10fg的痤瘡丙酸桿菌(P.acnes)DNA，和管4包含10fg的白色念珠菌(C.albicans)DNA。圖7顯示了五片尼龍膜，各點有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.76、77、78、84、85、86、87和88的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在。
圖7.與多重PCR的擴增子雜交的尼龍膜上的宏陣列的照片，用于感染性眼內炎特別是真細菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、痤瘡丙酸桿菌和真菌的基因組鑒定
NC＝陰性對照，GN顯示ERR＝真細菌組I的16s核糖體RNA基因，ERW＝真細菌組II的16s核糖體RNA基因，GN31＝革蘭氏陰性細菌的gyr B基因，GN67＝革蘭氏陰性細菌的烏頭酸水合酶基因，GN87＝革蘭氏陰性細菌的核糖核酸酶基因，GP＝革蘭氏陽性細菌的16s核糖體RNA基因，PA＝痤瘡丙酸桿菌16s核糖體RNA基因，PF＝真菌28s核糖體RNA基因。頂端左角為探針點樣的模板。NC為與陰性對照管雜交的尼龍膜。GN、GP、PA和PF為分別與管1、2、3和4的擴增子雜交的尼龍膜。
實施例7 由11名死前出現(xiàn)葡萄膜炎/視網(wǎng)膜炎的AIDS患者的尸檢中收集玻璃體液，樣本在多重PCR上測試，隨后在宏陣列上鑒定擴增子。使用QIAGEN DNA純化試劑盒從100μl的各玻璃體樣本提取DNA。DNA在50μl的洗脫緩沖液中重配。多重PCR使用可以擴增所有23個基因的引物組1-23進行，所述基因有單純皰疹病毒1&2糖蛋白D、單純皰疹病毒1&2UL 44基因、單純皰疹病毒1&2DNA聚合酶基因、巨細胞病毒糖蛋白O基因、巨細胞病毒形態(tài)轉化基因、巨細胞病毒UL 88基因、水痘帶狀皰疹ORF 29、水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因、腺病毒六鄰體基因、真細菌16s核糖體RNA基因I、真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域II、16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分、結核桿菌MPB 64基因、偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因、龜分枝桿菌16s-23s RNA基因、鼠弓形體B1基因、沙眼衣原體多態(tài)蛋白II、28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分、16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分、gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分、革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因、革蘭氏陰性細菌核糖核酸酶I基因。
PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)以及10μl從樣本中提取的DNA。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，在50℃處理2分鐘，和94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及隨后在72℃進行10分鐘的延伸反應。
如上所述，PCR使用濃度為10-20pmol/50μl反應混合物的包括SEQ ID NO.1-46的23組引物進行。所有樣本的PCR產(chǎn)物在用SEQ IDNo.47-71的探針點樣的尼龍膜上進行雜交。尼龍膜各點有0.26NNaOH中的100pmol具有SEQ ID No.67-88的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶連接體在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在 所獲得的結果概括于表1中。所有11個樣本被鑒定為HSV視網(wǎng)膜炎和結核桿菌的葡萄膜炎，同時其中10個樣本玻璃體中另外有鼠弓形體。多重PCR和DNA宏陣列準確地鑒定了所有樣本。
表1使用多重PCR和宏陣列上的雜交對11份從AIDS病人得到的尸檢玻璃體液樣本進行病原體同時檢測和鑒別的結果 實施例8 六份從AIDS病人尸檢得到的CSF樣本在多重PCR上測試，隨后進行宏陣列分析。死亡的原因被確定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染。使用可商購的QIAGEN DNA提取試劑盒從200μl樣本中提取DNA。DNA在50μl的洗脫緩沖液中重配。多重PCR使用可以擴增所有23個基因的引物組1-23進行，所述基因為單純皰疹病毒1&2糖蛋白D、單純皰疹病毒1&2UL 44基因、單純皰疹病毒1&2DNA聚合酶基因、巨細胞病毒糖蛋白O基因、巨細胞病毒形態(tài)轉化基因、巨細胞病毒UL 88基因、水痘帶狀皰疹ORF 29、水痘帶狀皰疹DNA聚合酶基因、腺病毒六鄰體基因、真細菌16s核糖體RNA基因I、真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域II、16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分、結核桿菌MPB 64基因、偶發(fā)分枝桿菌16s-23s RNA基因、龜分枝桿菌16s-23s RNA基因、鼠弓形體B 1基因、沙眼衣原體多態(tài)蛋白II、28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分、16s-23s核糖體RNA基因的痤瘡丙酸桿菌特異性部分、gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分、革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因、革蘭氏陰性細菌核糖核酸酶I基因。
PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2單位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明膠、1mM EDTA和1單位的UDP糖基化酶(以防止擴增子污染)以及10μl從樣本中提取的DNA。循環(huán)條件是在37℃孵育30分鐘以完全消化任何擴增子污染物，在50℃處理2分鐘，和94℃進行5分鐘的變性步驟，接著40個循環(huán)的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及隨后在72℃10分鐘的延伸反應。如上所述，PCR使用濃度為10-20pmol/50μl反應混合物的包括SEQ ID NO.1-46的23組引物進行。所有樣本的PCR產(chǎn)物在用100pmol的0.26N NaOH中的具有SEQ ID No.67-88的靶點樣的尼龍膜進行雜交。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封閉1小時。擴增子加熱到95℃10分鐘，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃雜交2小時。雜交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分鐘，清洗5次。膜與鏈霉抗生物素-過氧化物酶偶聯(lián)物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1MTris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分鐘后，膜各以相同的緩沖液清洗3分鐘，清洗5次。為顯色，膜在37℃與每毫升磷酸鹽緩沖鹽水0.5mg的鹽酸二氨基聯(lián)苯胺一起孵育10分鐘。棕色色斑的出現(xiàn)表明特定病原體的存在 表2使用多重PCR和宏陣列上的雜交對6份從AIDS病人得到的尸檢CSF樣本進行病原體同時檢測和鑒別的結果 實施例9 從各種臨床診斷病例獲得一系列(19)眼部樣本(房水或者玻璃體液)。使用可商購的DNA提取試劑盒從大約50-100μl樣本中提取DNA，且DNA在50μl水中重配。10μl用于包含10-20pmol各引物組1-23(包括SEQ ID No.1-46)的多重PCR。PCR試劑組成和熱循環(huán)條件與上面實施例6和7中所述的相同。如在上面的實施例中描述的，擴增子與具有SEQ ID No.67-88的靶雜交。結果概括如下，其表明了引物組和探針的臨床效用。
表3使用多重PCR和宏陣列上的雜交對從病人得到的房水和玻璃體液樣本進行病原體的同時檢測和鑒別的結果 優(yōu)點 1.高效和節(jié)省時間的試劑盒。
2.在感染的早期鑒定特定的病原體將有助于醫(yī)生選擇合適的針對疾病蔓延和醫(yī)治的治療方案。
3.從同一樣本鑒定多種感染也將有利于使用藥物組合的高效療法的治療。
序列表
<110>科學與工業(yè)研究委員會
<120>同時檢測和鑒別眼睛和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細菌、真菌、寄生蟲和病毒感染的新方法
<130>LLS073(210NF2006)
<160>88
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>1
cgcttggttt cggatgggag20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>2
gcccccagag acttgttgta gg 22
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>3
ggcaatcgtg tacgtcgtcc g 21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>4
cgggggggtc ttgcgttac 19
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>5
caagctgacg gacatttaca agg23
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>6
引cccacacg cgaaacacg 19
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>7
ttccggctca tggcgttaac c 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>8
cgccctgctt ttacgttacg c21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>巨細胞病毒形態(tài)轉化基因
<400>9
cggcgacgac gacgataaag 20
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>10
caatctggtc gcgtaatcct ctg 23
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>11
gggcacgtcc tcgcagaag 19
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>12
ccaagatgca ggtgataggt gac 23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹ORF 29
<400>13
ggtcttgccg gagctggtat tac 23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹ORF 29
<400>14
tgcctccgtg aaagacaaag aca 23
<210>15
<211>26
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>15
tccatttaac gttgcatcat tttgtg 26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>16
acgttccggt agcgagttat ctg23
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>17
cgccgccaac atgctctacc20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>腺病毒六鄰體基因
<400>18
gttgcgggag gggatggata20
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因I
<400>19
tgggctacac acgtgctaca atgg 24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因I
<400>20
cggactacga tcggttttgt gaga 24
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因II
<400>21
ggcctaacac atgcaagtcg agc23
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因II
<400>22
ggcagattcc taggcattac tcacc 25
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分
<400>23
acgtcaaatc atcatgcccc cttat 25
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分
<400>24
tgcagccctt tgtaccgtcc at 22
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>結核桿菌
<400>25
gcggaacgtg ggaccaatac20
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>結核桿菌
<400>26
cgacggggtg attttcttct tc 22
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>偶發(fā)分枝桿菌
<400>27
aacttttttg actgccagac acactattg 29
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>偶發(fā)分枝桿菌
<400>28
ggatgccacc ccccaaaag 19
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>龜分枝桿菌
<400>29
tggttactcg cttggtgaat atgt 24
<210>30
<211>23
<212>DNA
<213>龜分枝桿菌
<400>30
gacgttttgc cgactaccta tcc23
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>鼠弓形體
<400>31
cccctctgct ggcgaaaagt g 21
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>鼠弓形體
<400>32
ggcgaccaat ctgcgaatac ac 22
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>沙眼衣原體
<400>33
aatcgtatct cgggttaatg ttgc24
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>沙眼衣原體
<400>34
tcgaggaaaa ccgtatgaga aac 23
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>28s核糖體RNA基因
<400>35
gctgggactg aggactgcga c 21
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>28s核糖體RNA基因
<400>36
ttcaagacgg gcggcatata ac 22
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>痤瘡丙酸桿菌
<400>37
tggcgaacgg gtgagtaaca 20
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>痤瘡丙酸桿菌
<400>38
ccggtattag ccccagtttc c 21
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分
<400>39
cggcggcaag ttcgacgac 19
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分
<400>40
ccaccgagac gcccacacc 19
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因
<400>41
ccaggtcggc ggagaagc 18
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因
<400>42
ccaccggccc gatgacc 17
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌核糖核酸酶1基因
<400>43
gccgccctga ccaccttc 18
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌核糖核酸酶1基因
<400>44
gcgggttgtt cggcatcag 19
<210>45
<211>87
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>45
cgcttggttt cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga60
atgctcctac aacaagtctc tgggggc87
<210>46
<211>70
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>46
ggcaatcgtg tacgtcgtcc gcacatcaca gtcgcggcag cgtcatcggc ggtaacgcaa60
gacccccccg 70
<210>47
<211>79
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>47
caagctgacg gacatttaca aggtccccct ggacgggtac ggccgcatga acggccgggg60
cgtgtttcgc gtgtgggac 79
<210>48
<211>72
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>48
ttccggctca tggcgttaac caggtagaaa ctgtgtgtac agttgcgttg tgcgtaacgt60
aaaagcaggg cg72
<210>49
<211>65
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>49
cggcgacgac gacgataaag aatacaaagc cgcagtgtcg tccagaggat tacgcgacca60
gattg65
<210>50
<211>68
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>50
gggcacgtcc tcgcagaagg actccaggta caccttgacg tactggtcac ctatcacctg60
catcttgg 68
<210>51
<211>79
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>51
ggtcttgccg gagctggtat taccttaaaa ctcactacca gtcatttcta tccatctgtc60
tttgtctttc acggaggca 79
<210>52
<211>85
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>52
tccatttaac gttgcatcat tttgtgttat catagaactg cgtaaacact cggcaagtaa60
tacagataac tcgctaccgg aacgt 85
<210>53
<211>70
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>53
cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca tatccatccc60
ctcccgcaac 70
<210>54
<211>86
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域I
<400>54
tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggtcg ccaaaccgcg aggtggagct60
aatctcacaa aaccgatcgt agtccg 86
<210>55
<211>86
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域II
<400>55
ggcctaacac atgcaagtcg agcggatgaa aggagcttgc tcctggattc agcggcggac60
gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcc 86
<210>56
<211>71
<213>16s核糖體RNA基因的革蘭氏陽性細菌特異性部分
<400>56
acgtcaaatc atcatgcccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac60
aaagggctgc a 71
<210>57
<211>84
<212>DNA
<213>結核桿菌
<400>57
gcggaacgtg ggaccaatac ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg60
ttgaagaaga aaatcacccc gtcg 84
<210>58
<211>74
<212>DNA
<213>偶發(fā)分枝桿菌
<400>58
aacttttttg actgccagac acactattgg gctttgagac aacaggcccg tgcccctttt60
ggggggtggc atcc 74
<210>59
<211>70
<212>DNA
<213>龜分枝桿菌
<400>59
tggttactcg cttggtgaat atgttttata aatcctgtcc accccgtgga taggtagtcg60
gcaaaacgtc 70
<210>60
<211>70
<212>DNA
<213>鼠弓形體
<400>60
cccctctgct ggcgaaaagt gaaattcatg agtatctgtg caactttggt gtattcgcag60
attggtcgcc 70
<210>61
<211>79
<212>DNA
<213>沙眼衣原體
<400>61
aatcgtatct cgggttaatg ttgcatgatg ctttatcaaa tgacaagctt agatccgttt60
ctcatacggt tttcctcga 79
<210>62
<211>68
<212>DNA
<213>28s核糖體RNA基因的真菌特異性部分
<400>62
gctgggactg aggactgcga cgtaagtcaa ggatgctggc ataatggtta tatgccgccc60
gtcttgaa 68
<210>63
<211>77
<212>DNA
<213>痤瘡丙酸桿菌
<400>63
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccttga ctttgggata acttcaggaa60
actggggcta ataccgg 77
<210>64
<211>68
<212>DNA
<213>gyr B基因的革蘭氏陰性細菌特異性部分
<400>64
cggcggcaag ttcgacgaca acacctacaa ggtgtccggc ggcttgcacg gtgtgggcgt60
ctcggtgg 68
<210>65
<211>66
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌烏頭酸水合酶基因
<400>65
ccaggtcggc ggagaagccg aggcaggcga ggtccttcag ttcgtcgcgg gtcatcgggc60
cggtgg 66
<210>66
<211>64
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性細菌核糖核酸酶1
<400>66
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ccgc 64
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>67
gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgct45
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>68
cacatcacag tcgcggcagc gtcatcggcg 30
<210>69
<211>37
<212>DNA
<213>單純皰疹病毒
<400>69
tccccctgga cgggtacggc cgcatgaacg gccgggg 37
<210>70
<211>31
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>70
aggtagaaac tgtgtgtaca gttgcgttgt g 31
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>71
aatacaaagc cgcagtgtcg tc22
<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>巨細胞病毒
<400>72
gactccaggt acaccttgac gtactg26
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>73
cttaaaactc actaccagtc atttctatcc atc33
<210>74
<211>36
<212>DNA
<213>水痘帶狀皰疹
<400>74
ttatcataga actgcgtaaa cactcggcaa gtaata 36
<210>75
<211>30
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>75
ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca30
<210>76
<211>38
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域I
<400>76
tcggtacaga gggtcgccaa accgcgaggt ggagctaa 38
<210>77
<211>38
<212>DNA
<213>真細菌16s核糖體RNA基因區(qū)域II
<400>77
ggatgaaagg agcttgctcc tggattcagc ggcggacg 38
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>革蘭氏陽性生物體的16s核糖體基因
<400>78
gacctgggct acacacgtgc taca 24
<210>79
<211>42
<212>DNA
<213>結核桿菌
<400>79
ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg tt 42
<210>80
<211>26
<212>DNA
<213>偶發(fā)分枝桿菌
<400>80
ggctttgaga caacaggccc gtgccc 26
<210>81
<211>23
<212>DNA
<213>龜分枝桿菌
<400>81
tttataaatc ctgtccaccc cgt 23
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>鼠弓形體
<400>82
aaattcatga gtatctgtgc aactttg 27
<210>83
<211>32
<212>DNA
<213>沙眼衣原體
<400>83
atgatgcttt atcaaatgac aagcttagat cc32
<210>84
<211>25
<212>DNA
<213>真菌的28s核糖體RNA基因
<400>84
gtaagtcaag gatgctggca taatg25
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>痤瘡丙酸桿菌
<400>85
gcttcagcgc cgtcagcgag gataac 26
<210>86
<211>30
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性生物體的促旋酶基因
<400>86
aacacctaca aggtgtccgg cggcttgcac 30
<210>87
<211>31
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性生物體的烏頭酸水合酶基因
<400>87
cgaggcaggc gaggtccttc agttcgtcgc g31
<210>88
<211>27
<212>DNA
<213>革蘭氏陰性生物體的核糖核酸酶基因
<400>88
atcagcctgg ccggccgtta cctggtg2權利要求
1.用于檢測和鑒別引起病癥的病原體的引物組
組1為 FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQ ID No.1)
RP5′gcccccagagacttgttgtagg 3′(SEQ ID No.2)
組2為 FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQ ID No.3)
RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4)
組3為 FP5′caagctgacggacatttacaagg 3′(SEQ ID No.5)
RP5′gtcccacacgcgaaacacg 3′(SEQ ID No.6)
組4為 FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQ ID No.7)
RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8)
組5為 FP5′cggcgacgacgacgataaag 3′(SEQ ID No.9)
RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10)
組6為 FP5′gggcacgtcctcgcagaag 3′(SEQ ID No.11)
RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3′(SEQ ID No.12)
組7為 FP5′ggtcttgccggagctggtattac 3′(SEQ ID No.13)
RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14)
組8為 FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg 3′(SEQ ID No.15)
RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16)
組9為 FP5′cgccgccaacatgctctacc 3′(SEQ ID No.17)
RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18)
組10為 FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg 3′(SEQ ID No.19)
RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20)
組11為 FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc 3′(SEQ ID No.21)
RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22)
組12為 FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat 3′(SEQ ID No.23)
RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24)
組13為 FP5′gcggaacgtgggaccaatac 3′(SEQ ID No.25)
RP5′cgacggggtgattttcttcttc 3′(SEQ ID No.26)
組14為 FP5′aacttttttgactgccagacacactattg 3′(SEQ ID No.27)
RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28)
組15為 FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt 3′(SEQ ID No.29)
RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30)
組16為 FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ ID No.31)
RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32)
組17為 FP5’aatcgtatctcgggttaatgttgc 3′(SEQ ID No.33)
RP5’tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34)
組18為 FP5′gctgggactgaggactgcgac 3′(SEQ ID No.35)
RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3′(SEQ ID No.36)
組19為 FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)
RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38)
組20為 FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQ ID No.39)
RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40)
組21為 FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ ID No.41)
RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42)
組22為 FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)
RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44)
其中所述引物單獨或組合使用。
2.如權利要求1所述的引物組，可用于通過對臨床樣本進行多重聚合酶鏈反應擴增病原體的目標基因來檢測和鑒別引起感染性眼內炎或角膜炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜炎的病癥的病原體。
3.如權利要求1所述的引物組，其特征在于具有58℃-65℃范圍內的均勻的退火溫度，長度在17-29個堿基的范圍內。
4.一組如下所列的病原體特異性DNA探針序列，其通過單重或多重PCR反應利用權利要求1中所述的引物從標準或臨床樣本擴增
1)探針DNA序列
“cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No.45)
2)探針DNA序列
“ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No.46)
3)探針DNA序列
“caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No.47)
4)探針DNA序列
“ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No.48)
5)探針DNA序列
“cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49)
6)探針DNA序列
“gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)
7)探針DNA序列
“ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No.51)
8)探針DNA序列
“tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No.52)
9)探針DNA序列
“cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No.53)
10)探針DNA序列
“tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No.54)
11)探針DNA序列
“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SE Q ID No.55)
12)探針DNA序列
“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No.56)
13)探針DNA序列
“gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No.57)
14)探針DNA序列
“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No.58)
15)探針DNA序列
“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No.59)
16)探針DNA序列
“cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No.60)
17)探針DNA序列
“aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No.61)
18)探針DNA序列
“gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No.62)
19)探針DNA序列
“tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No.63)
20)探針DNA序列
“cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No.64)
21)探針DNA序列
“ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No.65)
22)探針DNA序列
“gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc”(SEQ ID No.66)。
5.一組如下所列的DNA靶序列，具有58.9℃-83℃范圍內的均勻的解鏈溫度，雜交過程中在固定在固相基質上后與使用的擴增序列互補以進一步檢測和鑒別所研究的特定病原體，該序列為
1)5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’(SEQ ID No.67)
2)5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’(SEQ ID No.68)
3)5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’(SEQ ID No.69)
4)5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No.70)
5)5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No.71)
6)5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No.72)
7)5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No.73)
8)5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No.74)
9)5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No.75)
10)5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No.76)
11)5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No.77)
12)5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No.78)
13)5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No.79)
14)5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No.80)
15)5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No.81)
16)5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No.82)
17)5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No.83)
18)5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No.84)
19)5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No.85)
20)5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No.86)
21)5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No.87)
22)5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SEQ ID No.88)。
6.用于檢測和鑒別引起如感染性眼內炎或角膜炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜炎的病癥的病原體的方法，其中通過使用如權利要求1所述的正向和反向引物組的獨特集合對臨床樣本進行多重PCR(聚合酶鏈反應)擴增該病原體的特定基因，且在進一步的步驟中，擴增的產(chǎn)物(探針)通過已知的方法與以多重形式固定在固相基質上的互補DNA序列(靶)雜交，并且雜交產(chǎn)物通過已知方法檢測以進一步檢測和鑒別引起所研究病癥的特定病原體。
7.使用權利要求1中所述的所有或一些引物組的多重PCR分析，其中所有引物可以采用統(tǒng)一的熱循環(huán)條件在單個管中一起使用，所述熱循環(huán)條件特征在于，具有94℃5分鐘的變性步驟，隨后40個循環(huán)的60℃-64℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及72℃10分鐘的延伸反應。
8.如權利要求6中所述的方法，其中所述引物采用生物素基團在5’端標記，導致通過形成有色產(chǎn)物進行檢測。
9.如權利要求6中所述的方法，其中所述引物通過熒光標記，例如，如異硫氰酸熒光素的有機熒光標記或如Quantum DotsTM或Cy3或Cy5的無機熒光納米顆粒，使得能夠通過任何熒光掃描設備或顯微鏡檢方法檢測。
10.如權利要求1中所述的引物集合、如權利要求4中所述的探針、如權利要求5中所述的靶的用途，其中所述分析是用于檢測病原體的實時PCR。
11.如權利要求1中所述的引物集合、如權利要求4中所述的探針、如權利要求5中所述的靶的用途，其中所述分析是定量測定臨床樣本中病原體的實時PCR，用于監(jiān)測疾病的預后或治療。
12.采用如權利要求4中所述的特定探針對如權利要求6中所述的擴增產(chǎn)物的檢測，其采取宏陣列或狹縫雜交或線性探針分析的形式。
13.如權利要求12中所述的宏陣列，其由固定在含硝基纖維素、尼龍、帶電尼龍、玻璃或聚苯乙烯的固體相上的如權利要求5中所述的靶組成。
14.如權利要求12中所述的檢測方法，其中待檢測的病原體為單純皰疹病毒1和2、巨細胞病毒、水痘帶狀皰疹病毒、腺病毒、真細菌、革蘭氏陽性生物、革蘭氏陰性細菌、真菌、結核桿菌、龜分支桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鼠弓形體、沙眼衣原體。
15.如權利要求6中所述的檢測方法，其使得能夠從引起具有相似表現(xiàn)的眼睛或神經(jīng)系統(tǒng)疾病的權利要求14中所述的一組可能病原體中檢測出個別的病原體。
16.采用如權利要求1中所述的一些選定的或所有的引物的多重PCR分析，其中由如權利要求14中所述的生物體中的一些或所有引起的任何臨床癥狀被研究，以檢測臨床樣本中存在的任何一種個別病原體或病原體組。
17.用于同時檢測引起外眼感染、眼內炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的方法，包括如下步驟
a)從患有感染的患者取得臨床樣本，
b)從步驟a)中取得的臨床樣本的一部分或全部提取DNA，
c)采用用生物素或熒光示蹤劑標記的如權利要求1中所述的引物集合和標準的PCR試劑對步驟b)中獲得的模板DNA進行多重PCR，
d)使步驟c)中獲得的PCR產(chǎn)物變性，
e)使所述PCR產(chǎn)物與固定在固體基質上的如權利要求5中所述的靶雜交，
f)通過酶法或熒光方法檢測固體基質上的在步驟e)中獲得的DNA雜交體。
18.用于同時檢測引起外眼感染、眼內炎或葡萄膜炎或視網(wǎng)膜炎或腦膜腦炎的所有病原體的試劑盒，包括
a)如權利要求1中所述的正向和反向引物的集合，
b)固定在合適的固體相上的如權利要求5中所述的DNA序列的基質，
c)通過聚合酶鏈反應擴增DNA所需的標準試劑，
d)將PCR擴增產(chǎn)物雜交到固定在合適固體相上的DNA序列基質所需的標準試劑，
e)檢測和鑒別最終的雜交產(chǎn)物所需的標準試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在能夠引起感染的許多可能病原體中鑒別眼睛和中樞系統(tǒng)感染的單種病原體或一種以上病原體的診斷方法。所有感染眼睛或中樞系統(tǒng)的個別區(qū)域的病原體一般引起相同的表現(xiàn)或癥狀，本發(fā)明涉及以單一的檢驗在這組可能的病原體中檢測或鑒別到該病原體，而不需要借助于各針對每一種病原體的檢測的成套檢驗。本發(fā)明致力于用基于癥狀的診斷替代基于個別病原體檢測的診斷。
文檔編號C12Q1/68GK101541979SQ200880000035
公開日2009年9月23日 申請日期2008年5月27日 優(yōu)先權日2007年6月1日
發(fā)明者C·M·拉奧, K·S·拉奧, P·V·拉姆錢德, H·N·瑪?shù)鹿? S·沙瑪, G·薩特帕泰, V·B·拉維庫瑪 申請人:科學與工業(yè)研究委員會