專利名稱：一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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本發(fā)明涉及分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域和環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體的說涉及硝化細(xì)菌16srDNA的熒 光原位雜交技術(shù)。
背景技術(shù)：
FISH技術(shù)可以實現(xiàn)同步顯影、鑒定、計算和單個微生物細(xì)胞的固定。其突出特點是可 以克服純培養(yǎng)的技術(shù)限制，可以在原位水平進(jìn)行探測和分析生物處理工藝系統(tǒng)中微生物群 落的組成及演替，以及不同種群的空間聯(lián)系等生態(tài)學(xué)變化規(guī)律。20世紀(jì)90年代以來，F(xiàn)ISH 技術(shù)在國外已被廣泛應(yīng)用于硝化細(xì)菌的快速檢測中。利用硝化細(xì)菌特異性的靶寡核苷酸探 針，在原位檢測水環(huán)境或生物膜上的硝化細(xì)菌時，不僅能對它們定性地檢測，而且還能定 量地反映出環(huán)境中硝化細(xì)菌的分布和量，為研究硝化系統(tǒng)中硝化細(xì)菌類群的空間和數(shù)量分 布提供了有效的檢測手段。
由于硝化細(xì)菌的生長易受溫度、pH、溶氧和一些化學(xué)因子等環(huán)境因素的抑制，且生長 時往往附著在不溶性固體顆?；蚱鞅诒砻嫔希尺B在一起給分離檢測工作帶來不便。而目 前通用的熒光原位雜交技術(shù)由于不能確定檢測硝化細(xì)菌的最適溫度、pH和雜交時間，并且 未能解決硝化細(xì)菌生長易粘連的難題，因此不能對硝化細(xì)菌的時間和空間分布做出精確定 位
發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于夠克服由于硝化細(xì)菌生長緩慢，長成的菌落細(xì)小，容易聚集成團(tuán)造 成難以觀察計數(shù)的困難，提供一種能對環(huán)境中硝化細(xì)菌時間和空間的數(shù)量分布分布進(jìn)行精 確到種屬的熒光原位雜交檢測方法。
本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在于包括如下步驟
(1) 玻片進(jìn)行處理:對玻片進(jìn)行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備；
(2) 樣品的采集及預(yù)處理取硝化細(xì)菌原始菌液，離心去上清后加入等體積培養(yǎng)基， 通入空氣，活化1一2天，用去離子水稀釋至10—2-10—5倍，隨后離心，棄上清液，加入5ml 磷酸鹽緩沖液PBS，充分搖勻分散，取10 u 1分散后的菌液涂至玻片上，調(diào)節(jié)pH至6. 0-7. 0，再將玻片放置到烘箱內(nèi)熱固定，時間一般為l-3h，再用質(zhì)量比為4免的多聚甲醛PFA室溫下 固定10-20min,沖洗風(fēng)干；最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min;
(3) 雜交是以16SrDNA作為靶DNA進(jìn)行熒光原位雜交將NIT3探針用HEX標(biāo)記，將 CNIT3探針與標(biāo)記熒光的NIT3探針與雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜 交溫度控制在46。C-48°C，雜交時間為2-3h，雜交后用洗脫液清洗探針；
(4) 熒光顯微鏡觀察載玻片在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)硝化細(xì)菌菌體個數(shù)。 為進(jìn)一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述步驟(1)玻片進(jìn)行清洗是指用熱肥皂水刷洗，自來
水沖洗多次，％%酒精浸泡，灼燒，然后在1% (質(zhì)量)鹽酸中浸泡24h以上，用自來水沖洗， 去離子水洗3-5次。
所述步驟(1)硅化處理是指玻片和蓋玻片在1%(質(zhì)量)鹽酸中煮沸10min,去離子水洗， 烘干，錫紙包好4°C以下保存?zhèn)溆谩?br> 所述步驟(3) NIT3探針序列為5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3'的18個核苷酸的寡 核苷酸序列，探針在5' —端用HEX標(biāo)記；CNIT3探針序列為5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG 一 3，。
所述步驟(3)清洗探針是將雜交盒中取出的載玻片放入48 'C雜交洗脫液,洗脫液中 NaCl濃度控制為60鵬ol/L。
本發(fā)明所采用的熒光原位雜交方法，具有如下優(yōu)點
1、 本發(fā)明對熒光原位雜交中預(yù)處理條件和雜交反應(yīng)條件的發(fā)明，大大提高了環(huán)境中硝 化細(xì)菌數(shù)量以及分布檢測的精確性和時效性。
2、 可用于繪制高精度的硝化細(xì)菌生長曲線，直接應(yīng)用于環(huán)境中硝化細(xì)菌生長狀態(tài)的檢 測，直接指導(dǎo)了廢水處理中投加硝化細(xì)菌的時間控制。
3、 大大提高了硝化細(xì)菌DNA熒光原位雜交的分辨率。


圖1為實施例利用熒光顯微鏡觀察到的雜交效果圖。
具體實施例方式
以下實施例用于對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例h
1、玻片處理
(1)玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗5次，96%酒精浸泡，灼燒，然后在1%(質(zhì) 量)鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗4次，去離子水洗3-5次。
(2) 硅化處理玻片和蓋玻片在rU質(zhì)量)鹽酸中煮沸10min,去離子水洗3次，50°C 烘干，錫紙包好4'C保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失。
(3) 明膠涂片制備將玻片放入明膠液中10min，然后6(TC烘干過夜備用。 明膠液配制稱取明膠l.Og溶于500-800mlddH20中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶
解后，加入甲明礬0.5g，溶解后稀釋至1000ml即可使用。
2、 樣品的釆集及預(yù)處理
(1) 取用以改善魚蝦塘水質(zhì)量的硝化細(xì)菌菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上 層液體，加入等體積新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化l一2天。所述的培養(yǎng)基配方為NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， Na線1. 6g, FeS04 7H20 0. 03g， 蒸餾水1000ml 。
(2) 取活化后的硝化細(xì)菌菌液用去離子水稀釋，取5ml樣品稀釋104倍，4000r/min 條件下離心，棄上清液，加入5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)，充分搖勻分散。取10ul分散后 的菌液涂至玻片上，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0。
(3) 熱固定將玻片放置到5(TC烘箱內(nèi)熱固定lh。
(4) 多聚甲醛固定熱固定后，再用4y。多聚甲醛(pareforaldehyde， PFA)室溫下固 定10min，用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干。
4。/o多聚甲酸(Pareforaldehyde, PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 0，定容至1000ml。 10XPBS是指PBS使用時稀釋十倍。
(5) 脫水將固定后的樣品，分別在50%、 80%及96%的乙醇中(乙醇浸沒玻片即可) 室溫下脫水3min，自然風(fēng)干。
3、 雜交反應(yīng)
NIT3是硝化細(xì)菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探針，能與硝化細(xì)菌的保守序列進(jìn) 行堿基互補配對，檢測出環(huán)境中的硝化細(xì)菌，序列為5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的 18個核苷酸的寡核苷酸序列，探針在5' —端用HEX標(biāo)記。
競爭性探針CNIT3序列為5， 一 CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3',目的是與硝化細(xì)菌保守區(qū) 序列相似的的其他雜菌的DNA序列雜交，從而保證硝化細(xì)菌原位雜交的精確性。
NIT3和CNIT3探針各0. 5 u L與9. 6 ii L的雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交 反應(yīng)。反應(yīng)時間為2h，雜交溫度46'C。 4、探針的清洗
雜交盒中取出載玻片放入50ml 48 'C雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為
60mmol/L。 5、鏡檢
載玻片在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光經(jīng)過3號濾光片，即綠色激發(fā)光。目鏡放大倍數(shù) 為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20。結(jié)果如圖1所示，圖1是鏡檢出與熒光探針雜交的硝化細(xì) 菌，放大200倍，圖中可見，通過使用本發(fā)明確定的樣品稀釋度，樣品菌液pH，樣品熱固 定時間，4%多聚甲醛固定時間，乙醇脫水時間，以及雜交溫度和雜交時間，使得環(huán)境因素 對硝化細(xì)菌的生長抑制降至最低，雜交后帶有熒光的硝化細(xì)菌在視野中非常明顯，可以清 楚的數(shù)出視野中硝化細(xì)菌的數(shù)量，從而計算硝化細(xì)菌的分布情況，通過對視野中的菌體形 態(tài)觀察，可以看出，通過本發(fā)明提供的熒光原位雜交條件得到的硝化細(xì)菌雜交率接近100%， 極大地提高了通過常規(guī)熒光原位雜交方法得到的雜交結(jié)果。并且無菌體凝結(jié)成團(tuán)現(xiàn)象，改 變了以往熒光原位雜交技術(shù)對于硝化細(xì)菌的計數(shù)不能精確到菌體個數(shù)，只能數(shù)出凝結(jié)菌團(tuán) 的弊端，本發(fā)明可以對硝化細(xì)菌的計數(shù)精確到菌體個數(shù)，解決了硝化細(xì)菌嚴(yán)重的菌團(tuán)凝結(jié) 的難題。
后面實施例熒光顯微鏡觀察到的圖片與圖1相似，不具體說明了。 實施例2:
1、 玻片處理
(1) 玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗3次，96%酒精浸泡，灼燒，然后在1% (質(zhì) 量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗5次，去離子水洗3-5次。
(2) 硅化處理玻片和蓋玻片在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中煮沸10min,去離子水洗3次， 5(TC烘干，錫紙包好4X:保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失。
(3) 明膠涂片制備將玻片放入明膠液中10min,然后6(TC烘干過夜備用。 明膠液配制稱取明膠l.Og溶于500-800mlddH20中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶
解后，加入甲明礬0.5g，溶解后稀釋至1000ml即可使用。
2、 樣品的采集及預(yù)處理
(1) 取用以改善魚蝦塘水質(zhì)量的硝化細(xì)菌菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上 層液體，加入等體積新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化l一2天。所述的培養(yǎng)基配方為NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， NaHC03 1. 6g， FeS04 7H20 0. 03g， 蒸餾水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去離子水稀釋，取5ml樣品稀釋103倍，4000r/min條件下離 心，棄上清液，加入5mlPBS,充分搖勻分散。取10y 1分散后的菌液涂至玻片上，用稀鹽
酸調(diào)節(jié)pH至7.0。
(3) 熱固定將玻片放置到50。C烘箱內(nèi)熱固定3h。
(4) 多聚甲醛固定熱固定后，4%多聚甲醛(pareforaldehyde,PFA)室溫下固定20min， 用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干。
4免多聚甲醛(Pareforaldehyde，PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1000ml
(5) 脫水將固定后的樣品，分別在50%、 80%及96%的乙醇中室溫下脫水5min (乙 醇浸沒玻片即可)，自然風(fēng)干。
3、 雜交反應(yīng)
NIT3是硝化細(xì)菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探針，能與硝化細(xì)菌的保守 序列進(jìn)行堿基互補配對，序列為5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18個核苷酸的寡核苷
酸序列，探針在5' —端用HEX標(biāo)記。
競爭性探針CNIT3序列為5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3'，目的是與硝化細(xì)菌保守區(qū)
序列相似的的其他雜菌的DNA序列雜交，從而保證硝化細(xì)菌原位雜交的精確性。NIT3和
CNIT3探針各0.5wL與9.6uL的雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)。反應(yīng)
時間為3h，雜交溫度47。C。
4、 探針的清洗
雜交盒中取出載玻片放入50ml 48 'C雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為 60mmol/L。
5、 鏡檢
載玻片在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光經(jīng)過3號濾光片，即綠色激發(fā)光。目鏡放大倍數(shù)為 10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20。放大200倍，圖中可見雜交信號非常明顯且無菌體凝結(jié)成團(tuán) 現(xiàn)象。
實施例3: 1、玻片處理
(1) 玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96%酒精浸泡，灼燒，然后在1% (質(zhì) 量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h,自來水沖洗多次，去離子水洗3-5次。
(2) 硅化處理玻片和蓋玻片在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中煮沸10min,去離子水洗3次， 5(TC烘干,錫紙包好4'C保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失。(3)明膠涂片制備將玻片放入明膠液中10min,然后6(TC烘干過夜備用。明膠液配 制稱取明膠1.0g溶于500-800mlddH20中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解后，加入甲 明礬0. 5g，溶解后稀釋至1000ml即可使用。
2、 樣品的采集及預(yù)處理
(1) 取用以改善魚蝦塘水質(zhì)量的硝化細(xì)菌菌液500ml，放置半小時使其沉淀，倒掉上 層液體，加入等體積新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化l一2天。所述的培養(yǎng)基配方為NaN02 0. 5g， KH2P04 0. 136g， MgS04 7H20 0. 14g NaCl 0. 3g， Na跳1. 6g， FeS04 7H20 0. 03g， 蒸餾水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去離子水稀釋，取5ml樣品稀釋105倍，4000r/rain條件下離 心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取lOiil分散后的菌液涂至玻片上，用稀鹽 酸調(diào)節(jié)pH至6.5。
(3) 熱固定將玻片放置到5(TC烘箱內(nèi)熱固定2h。
(4) 多聚甲酸固定熱固定后，4"/。多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min， 用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干。
4。/o多聚甲醛(Pareforaldehyde，PFA): PFA 40g、 1. Omol/L的NaOH 100ml IOXPBS、用 稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1000ml
(5) 脫水將固定后的樣品，分別在50%、 80%及96%的乙醇中室溫下脫水5min (乙 醇浸沒玻片即可)，自然風(fēng)干。
3、 雜交反應(yīng)
NIT3是硝化細(xì)菌Nitrobacter a -proteobacteria的通用探針，能與硝化細(xì)菌的保守 序列進(jìn)行堿基互補配對，序列為5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18個核苷酸的寡
核苷酸序列，探針在5' —端用HEX標(biāo)記。競爭性探針CNIT3序列為5' —
CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3，，目的是與硝化細(xì)菌保守區(qū)序列相似的的其他雜菌的DNA
序列雜交，從而保證硝化細(xì)菌原位雜交的精確性。
NIT3和CNIT3探針各0. 5 y L與9. 6 u L的雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交
反應(yīng)。反應(yīng)時間為3h，雜交溫度48。C。
4、 探針的清洗
雜交盒中取出載玻片放入50ml 48 'C雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為 60鵬ol/L。
5、 鏡檢
載玻片在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)光經(jīng)過3號濾光片，即綠色激發(fā)光。目鏡放大倍數(shù)為 10,物鏡放大倍數(shù)Mob為20。放大200倍，圖中可見雜交信號非常明顯且無菌體凝結(jié)成團(tuán) 現(xiàn)象。
實施例4:
1、 玻片處理
(1) 玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96%酒精浸泡，灼燒，然后在1% (質(zhì) 量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3-5次。
(2) 硅化處理玻片和蓋玻片在1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中煮沸l(wèi)Omin，去離子水洗3次， 5(TC烘干，錫紙包好4'C保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失。
(3) 明膠涂片制備將玻片放入明膠液中10min，然后6(TC烘千過夜備用。明膠液配 制稱取明膠l.Og溶于500-800mlddH20中，加熱攪拌助溶，待明膠完全溶解后，加入甲 明礬0. 5g，溶解后稀釋至1000ml即可使用。
2、 樣品的采集及預(yù)處理
(1) 取實驗室富集培養(yǎng)的用以改善魚蝦塘水質(zhì)量的硝化細(xì)菌菌液500ffll，放置半小時 使其沉淀，倒掉上層液體，加入等體積新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1一2天。所述的 培養(yǎng)基配方為NaN02 0.5g， KH2P040, 136g， MgS04 *7仏0 0. 14g NaCl 0. 3g， NaHC031. 6g， FeS04 7H20 0. 03g，蒸餾水1000ml 。
(2) 取活化后的菌液用去離子水稀釋，取5ml樣品稀釋102倍，4000r/min條件下離
心，
棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10ul分散后的菌液涂至玻片上，用稀鹽 酸調(diào)節(jié)pH至6.7。
(3) 熱固定將玻片放置到5(TC烘箱內(nèi)熱固定2h。
(4) 多聚甲醛固定熱固定后，4y。多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min， 用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干。4免多聚甲醛(Pareforaldehyde,PFA): PFA 40g、 1. 0mol/L的 Na0H 100ml 10XPBS、用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至7. 0，定容至1000ml
(5) 脫水將固定后的樣品，分別在50%、 80%及96%的乙醇中室溫下脫水4min (乙 醇浸沒玻片即可)，自然風(fēng)干。
3、 雜交反應(yīng)
NIT3是硝化細(xì)菌Nitrobacter a-proteobacteria的通用探針，能與硝化細(xì)菌的保守序列進(jìn)
行堿基互補配對，序列為5' -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18個核苷酸的寡核苷酸序列， 探針在5' —端用HEX標(biāo)記。
競爭性探針CNIT3序列為5， 一 CCTGTGCTCCAGGCTCCG — 3'，目的是與硝化細(xì) 菌保守區(qū)序列相似的的其他雜菌的DNA序列雜交，從而保證硝化細(xì)菌原位雜交的精確性。
NIT3和CNIT3探針各0.5 u L與9.6 u L的雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交 反應(yīng)。反應(yīng)時間為3h，雜交溫度45'C。
4、 探針的清洗
雜交盒中取出載玻片放入50ml 48 'C雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為 60mmol/L。
5、 鏡檢
載玻片在熒光顯微鏡下觀察,激發(fā)光經(jīng)過3號濾光片，即綠色激發(fā)光。目鏡放大倍數(shù)為 10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20。放大200倍，圖中可見雜交信號非常明顯且無菌體凝結(jié)成團(tuán) 現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1、一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)玻片進(jìn)行處理對玻片進(jìn)行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備；(2)樣品的采集及預(yù)處理取硝化細(xì)菌原始菌液，離心去上清后加入等體積培養(yǎng)基，通入空氣，活化1-2天，用去離子水稀釋至10-2-10-5倍，隨后離心，棄上清液，加入5ml磷酸鹽緩沖液PBS，充分搖勻分散，取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調(diào)節(jié)pH至6.0-7.0，再將玻片放置到烘箱內(nèi)熱固定，時間一般為1-3h，再用質(zhì)量比為4％的多聚甲醛PFA室溫下固定10-20min，沖洗風(fēng)干；最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min；(3)雜交將NIT3探針用HEX標(biāo)記，將CNIT3探針與標(biāo)記熒光的NIT3探針與雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交溫度控制在46℃-48℃，雜交時間為2-3h，雜交后用洗脫液清洗探針；以16SrDNA作為靶DNA進(jìn)行熒光原位雜交。(4)熒光顯微鏡觀察載玻片在熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)硝化細(xì)菌菌體個數(shù)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在 于所述步驟(1)玻片進(jìn)行清洗是指用熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96%酒精浸泡，灼 燒，然后在1% (質(zhì)量)鹽酸中浸泡24h以上，用自來水沖洗，去離子水洗3-5次。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在 于所述步驟(1)硅化處理是指玻片和蓋玻片在1%(質(zhì)量)鹽酸中煮沸10min，去離子水洗， 烘干，錫紙包好4°C以下保存?zhèn)溆谩?br> 4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在 于所述步驟(3) NIT3探針序列為5， -CCTGTGCTCCATGCTCCG-3的18個核苷酸的寡 核苷酸序列，探針在5， 一端用HEX標(biāo)記；CNIT3探針序列為5' — CCTGTGCTCCAGGCTCCG 一 3，。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，其特征在 于所述步驟(3)清洗探針是將雜交盒中取出的載玻片放入45'C-48'C的雜交洗脫液,洗 脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種硝化細(xì)菌16SrDNA的熒光原位雜交檢測方法，該方法先對玻片進(jìn)行處理，然后對樣品采集及預(yù)處理，再進(jìn)行雜交，最后在熒光顯微鏡觀察，計數(shù)硝化細(xì)菌菌體個數(shù)。其雜交是將NIT3探針用HEX標(biāo)記，將CNIT3探針與標(biāo)記熒光的NIT3探針與雜交液混合于載玻片上在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)，雜交溫度控制在46℃-48℃，雜交時間為2-3h，雜交后用洗脫液清洗探針。該發(fā)明可直接應(yīng)用于硝化系統(tǒng)中硝化細(xì)菌的數(shù)量分布和空間分布的檢測，直接指導(dǎo)了自然界以及人工條件下硝化細(xì)菌群落多樣性的測定；大大提高了硝化細(xì)菌群落分布監(jiān)測的精確度和時效性，本發(fā)明尤其適用于硝化細(xì)菌的熒光原位雜交。
文檔編號C12Q1/06GK101348836SQ20081019830
公開日2009年1月21日 申請日期2008年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月31日
發(fā)明者星 張, 朱雅楠, 林煒鐵, 周 王 申請人:華南理工大學(xué)