專利名稱：一種搖瓶培養(yǎng)基及提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種搖瓶培養(yǎng)基及提高葡萄糖氧化桿菌 催化能力的方法。
背景技術(shù)：
米格列醇(migliton)是拜耳公司在1997年度上市的新型抗糖尿病藥物。它是 從桿菌肉湯培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的一種新型腸道a-葡萄糖苷酶抑制劑，是1-脫氧野尻霉 素的母體修飾產(chǎn)物，屬于N-取代-1-脫氧野尻霉素類型，結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似。盡管 用化學合成的方法能夠制備米格列醇，但化學全合成法制備米格列醇的步驟較多， 米格列醇分子中含有的四個手性中心也給化學合成帶來了很大的困難。目前生產(chǎn)規(guī) 模大多采用生物合成來制備米格列醇。米格列醇的生物合成法據(jù)文獻報道大致有二 條路線:一是先由野尻霉素或1-脫氧野尻霉素產(chǎn)生菌進行發(fā)酵，制備獲得野尻霉素 或1-脫氧野尻霉素，然后再經(jīng)過化學合成方法獲得米格列醇，這是最原始的途徑; 二是應(yīng)用氧化葡糖酸菌轉(zhuǎn)化制備米格列醇關(guān)鍵中間體N-取代-1-脫氧野尻霉素，其 主要通過化學合成-生物轉(zhuǎn)化-化學合成的方法來制備，該工藝路線圖如下
葡萄糖
(I) (II) (III)
上述(I )為1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇，(II)為呋喃型葡萄糖胺，(III) 為米格列醇。
US4266025, EP0477160, USP2001/0019837公布了另外的米格列醇的生產(chǎn)方法， 即化學合成結(jié)合生物催化的方法。但由于菌體活力不高，導(dǎo)致生物催化時間過長， 造成生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長，給工業(yè)化生產(chǎn)帶來很大的障礙。
由于微生物酶的高效專一性，省略了化學合成過程中為達到專一地改造某個目的基團必須進行的加入和脫除保護基團的步驟，大大簡化了制備過程，提高了反應(yīng) 收率。氧化葡糖酸桿菌用于轉(zhuǎn)化特定底物制備1-脫氧野尻霉素及其衍生物具有很多 優(yōu)點l)轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心除去菌體，無需分離純化出中間體，就可進行下一步合成。 2)無需基團保護，成本大大降低，且避免因去除保護劑而造成的回收率下降。3)中 間體6-(取代胺基)-6-脫氧-a-L-山梨呋喃糖具有較高的溶解度和穩(wěn)定性，不易被 降解。但對于轉(zhuǎn)化機理的報道還沒有，可以肯定的是，葡萄糖氧化桿菌中含有參與 該轉(zhuǎn)化反應(yīng)的生物酶或酶系，葡萄糖氧化桿菌的催化能力與其含有的生物酶系的數(shù) 量和活力有直接關(guān)系。
目前，米格列醇雖然已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。但由于菌種活力低，使利用微生物 將1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇轉(zhuǎn)化為呋喃型葡萄糖胺時轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化時間 長，勞動強度大，生產(chǎn)成本高。傳統(tǒng)菌種選育主要采用誘變育種的方法，誘變的方 法歷史悠久，過去一直依賴誘變的方法來提高產(chǎn)量，目前大多數(shù)生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn) 仍然在使用這些方法。但是這種方法具有相當大的隨機性，而且菌種若長期使用誘 變劑處理，其生活能力會逐漸下降。
目前，還沒有文獻報道通過改進培養(yǎng)基的方式來提高葡萄糖氧化桿菌催化能力 的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明另辟蹊徑，通過優(yōu)化發(fā)酵條件的方式，提出了一種可以增強葡萄糖氧化 桿菌脫氫酶系活力的搖瓶培養(yǎng)基，以及一種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。
本發(fā)明人在試驗過程中意外地發(fā)現(xiàn)，在已有的搖瓶培養(yǎng)基中加入1-羥乙胺基 -l-脫氧-D-山梨醇，可以提高葡萄糖氧化桿菌脫氫酶系活力，這種偶然發(fā)現(xiàn)是我們 意想不到的。為了進一步優(yōu)化培養(yǎng)基的成分配比，發(fā)明人經(jīng)過大量試驗摸索研究發(fā) 現(xiàn)，當l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度在0.05 0.9g/L時，底物的轉(zhuǎn)化率得 到了很大提高；優(yōu)選地，l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度在0.2 0.7g/L時， 底物的轉(zhuǎn)化率更高；進一步優(yōu)選地，當1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度為 0.4g/L時，底物的轉(zhuǎn)化率最高。
本發(fā)明的搖瓶培養(yǎng)基，其成分含有1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇，除此之外， 還可以含有以下所有成分葡萄糖、山梨醇、酵母膏、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。同時，發(fā)明人對上述組分的配比做了篩選，發(fā)現(xiàn)當上述組分的濃度為葡萄糖5g/L， 山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L時，底物轉(zhuǎn)化率 得到了很大的提高。
無論對本發(fā)明的搖瓶培養(yǎng)基做出任何改進，其ra值均控制在7. 0。
另外，本發(fā)明的第二個目的是提供一種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。 為了達到這個目的，發(fā)明人對發(fā)酵工藝作了一定的優(yōu)化。具體地，所述的提高葡萄 糖氧化桿菌催化能力的方法，包括斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化過程。
其中，斜面培養(yǎng)采用常規(guī)的工藝；搖瓶培養(yǎng)時，培養(yǎng)葡萄糖氧化桿菌的培養(yǎng)基 為上述含有l(wèi)-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的搖瓶培養(yǎng)基，pH為7. 0，其它步驟采用 常規(guī)工藝，1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.05 0.9g/L范圍內(nèi)，優(yōu) 選地，1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.2 0.7g/L范圍內(nèi)，進一步優(yōu) 選地，1-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的濃度控制在0.4g/L;生物轉(zhuǎn)化過程中菌體與 l-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨醇的重量比為1: 1，其它采用常規(guī)工藝。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案，縮短了米格列醇生產(chǎn)過程的生物催化時間和提高轉(zhuǎn)化 水平。克服目前現(xiàn)有技術(shù)中菌體催化能力差，催化時間長的缺點。由具體實施方式
可以看出，實施例1的搖瓶培養(yǎng)基中沒有添加1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇， 在其它工藝不變的情況下，底物的轉(zhuǎn)化率只有5 0%;在實施例2 _ 7的搖瓶培養(yǎng) 基中均添加了不同濃度的l一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，在其它工藝不變的 情況下，底物的轉(zhuǎn)化率均有所提高，達到5 5%以上，最高達到了8 0%。
具體實施方式
實施例1
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱，瓊脂融化后攪拌均勻裝入10 支大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5 毫升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度2『C， 濕度40_60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基500毫升， 裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到 搖瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在250rpm，溫度28。C，濕度40 — 60%條件下， 培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0gl—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配制好的底物溶液，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為20°C， 250rpm的 條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約50%。
實施例2
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L, 瓊脂20g/L， pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28'C,濕 度40_60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.05g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸 氫二鉀3g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液 量50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpm，溫度28。C，濕度40 — 60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5. 1 g。稱取5. lg l —羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)p恥.0。在搖瓶中，投 入菌體和配制好的底物溶液，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為2(TC， 250rpm的 條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約62%。
實施例3
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基:'葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L,酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， PH為7. 0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆谩⒗鋬霰２氐钠咸烟茄趸瘲U菌菌種用無菌水5毫升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28i:，濕 度40—60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨
醇0. 2g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpm，溫度28。C，濕度40 — 60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0g 1_羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)p服.0。在搖瓶中，投 入菌體和配制好的底物溶液，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為2CTC， 250rpm的 條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約72%。
實施例4
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28。C，濕 度40_60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.4g/L,葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7.0。配制培養(yǎng)基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpm，溫度28。C，濕度40—60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5.3 g。稱取5.3g l—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以66亳升純化水溶解并調(diào)節(jié)pH至6.0。在搖瓶中， 投入菌體和配制好的底物溶^，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為20°C， 250rpm 的條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約80%。
實施例5斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻涂布在IO支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28。C，濕 度40 — 60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.7g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpra，溫度28。C，濕度40_60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5.1 g。稱取5.1g 1-羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配制好的底物溶液，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為20°C， 250rpm的 條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約69%。
實施例6
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆?。將冷凍保藏的葡萄糖氧化桿菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28'C，濕 度40 — 60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇0.9g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫 二鉀3g/L, pH為7. 0。配制培養(yǎng)基500毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpm，溫度28。C，濕度40—60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5. 1 g。稱取5. lg l—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以64毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)pH6.0。在搖瓶中，投 入菌體和配制好的底物溶液，放入振蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為20°C， 250rpm的條件下，催化15小時，釆用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約65%。 實施例7
斜面培養(yǎng)按如下比例配制培養(yǎng)基葡萄糖5g/L，山梨醇50g/L，酵母膏30g/L， 瓊脂20g/L， pH為7.0。配制培養(yǎng)基300毫升，加熱瓊脂融化后攪拌均勻裝入10支 大試管中，滅菌，做成斜面?zhèn)溆谩⒗鋬霰２氐钠咸烟茄趸瘲U菌菌種用無菌水5毫 升溶解，用接種鏟均勻涂布在10支斜面上，放入生化培養(yǎng)箱中，在溫度28'C，濕 度40—60%條件下，培養(yǎng)72小時。加無菌水制成懸浮液。
搖瓶種子液制備按如下比例配制培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D—山梨 醇lg/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二 鉀3g/L， pH為7. 0。配制培養(yǎng)基200毫升，裝500mL三角瓶10瓶(每瓶裝液量 50mL)，滅菌，備用。將菌種懸浮液2mL接種到搖瓶中。放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中， 在250rpm，溫度28。C，濕度40—60%條件下，培養(yǎng)30小時。
生物轉(zhuǎn)化將上述培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液離心，收集菌體5.0g。稱取5.0gl—羥 乙胺基一1一脫氧一D—山梨醇，以62毫升純化水溶解并調(diào)節(jié)pH至6.0。在搖瓶中， 投入菌體和配制好的底物溶液，放入振.蕩恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度為2(TC， 250rpm 的條件下，催化15小時，采用TLC檢測方法檢測，轉(zhuǎn)化率約55%。
通過具體實施的試驗驗證，確定了搖瓶培養(yǎng)基1一羥乙胺基一1一脫氧一D— 山梨醇0.4g/L，葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L，酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷 酸氫二鉀3g/L。使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體的催化效率明顯高于不添加l一羥乙胺基 一1一脫氧一D—山梨醇的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1. 一種搖瓶培養(yǎng)基，可以提高葡萄糖氧化桿菌脫氫酶系活力，其特征在于，含有1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇。
2. 如權(quán)利要求1所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，含有l(wèi)-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨 醇0. 05 0. 9g/L。
3. 如權(quán)利要求2所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，含有1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨 醇0. 2 0. 7g/L。
4. 如權(quán)利要求3所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，含有l(wèi)-羥乙胺基-l-脫氧-D-山梨 醇0.4g/L。
5. 如權(quán)利要求1-4任一所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，含有以下所有成分葡萄糖、 山梨醇、酵母膏、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀。
6. 如權(quán)利要求5所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，含有葡萄糖5g/L，山梨醇70g/L， 酵母膏30g/L，磷酸二氫鉀3g/L，磷酸氫二鉀3g/L。
7. 如權(quán)利要求l-4任一所述的搖瓶培養(yǎng)基，其特征在于，其pH值為7.0。
8. —種提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法，包括斜面培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)及生物轉(zhuǎn)化， 其特征在于，搖瓶培養(yǎng)葡萄糖氧化桿菌的培養(yǎng)基為權(quán)利要求l-4任一所述的搖瓶培 養(yǎng)基。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，搖瓶培養(yǎng)葡萄糖氧化桿菌的培養(yǎng)基為權(quán)利 要求6所述的搖瓶培養(yǎng)基。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，生物轉(zhuǎn)化過程中菌體與1-羥乙胺基-l-脫 氧-D-山梨醇的重量比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種搖瓶培養(yǎng)基及提高葡萄糖氧化桿菌催化能力的方法。通過在已有的搖瓶培養(yǎng)基中加入1-羥乙胺基-1-脫氧-D-山梨醇，并控制其濃度在0.05～0.9g/L時，底物的轉(zhuǎn)化率得到了很大提高。本發(fā)明縮短了米格列醇生產(chǎn)過程的生物催化時間和提高轉(zhuǎn)化水平?？朔壳艾F(xiàn)有技術(shù)中菌體催化能力差，催化時間長的缺點。
文檔編號C12P17/12GK101440387SQ20081018704
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月14日
發(fā)明者趙志全 申請人:魯南制藥集團股份有限公司