專利名稱：：使用改進(jìn)量的氯和鉀在微藻類中產(chǎn)生高水平的dha的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及通過海洋微生物在培養(yǎng)基中使用改進(jìn)量的氯和鉀離子產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法。更具體地，本發(fā)明直接涉及通過培養(yǎng)海洋微藻類(microalage),包括異養(yǎng)的海洋溝鞭藻類，隱曱藻(T>_y/^eco^7/wm」，在發(fā)酵罐中在無腐蝕性的條件下產(chǎn)生高水平的二十二碳六烯酸(DHA)的方法，包括在低氯離子和高鉀離子環(huán)境中培養(yǎng)。本發(fā)明也涉及通過海洋微生物在低pH水平產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸，包括DHA的方法。
背景技術(shù)：
：已充分證明增加人體內(nèi)長(zhǎng)鏈omega-3脂肪酸的飲食攝入量的有益效果，戶斤述有益歲文果包j舌;咸少心血管疾病(cardiovascular)牙口炎'l"生疾病(inflammatorydiseases)(即關(guān)節(jié)炎(arthritis)和動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)),減少抑郁(depression),增加在妊娠末三個(gè)月的懷孕期(gestation)長(zhǎng)度，和抑制腫瘤生長(zhǎng)。已發(fā)現(xiàn)幾種異養(yǎng)的海洋微生物產(chǎn)生高水平的這些重要的必需脂肪酸，所述海洋微生物包括隱曱藻屬的海洋微生物(Jiang和Chen，ProcessBiochemistry35(2000)1205-1209;Jiang和Chen,JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,(1999)Vol.23,508-513;Vazhappilly和Chen,JournaloftheAmericanOilChemistsSociety,(1998)Vol.75，No.3p393-397;Kyle，美國(guó)專利No,5,407,957;美國(guó)專利No.5,397,591;美國(guó)專利No.5,492,938;和美國(guó)專利No.5,711,983)?？苁想[曱藻fD7j^/2ecoA"/MWco/zm》是用于產(chǎn)生DHA(C22:6n-3)的最理想的生物體之一，所述的DHA是最重要的長(zhǎng)鏈omega-3脂肪酸之一。C.co/zm'/是有利的因?yàn)镈HA是唯一的通過此生物體以可感知的(appreciable)量產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸(PUFA)。其他生物體在它們的脂質(zhì)中產(chǎn)生兩種或更多的多不飽和脂肪酸(PUFAs)，而且它們的脂質(zhì)分布(profile)的復(fù)雜性可限制它們的油在一些食物和藥物應(yīng)用中的用途(例如由于在油中存在其他不合需要的PUFAs或由于不同的PUFAs的比例落于具體應(yīng)用的理想范圍之外)。在海洋環(huán)境中，寇氏隱曱藻(Co^f/zecc^z'w/Mmco/wzX)通常存在于滿鹽度(fullsalinity)海水中并且，同樣地適于在具有高氯濃度的環(huán)境中生長(zhǎng)。實(shí)際上，在已發(fā)表的關(guān)于C.co/7""的研究中大多數(shù)培養(yǎng)物顯示生長(zhǎng)和DHA生產(chǎn)在鹽度大于海水的大約20。/o中最佳(Jiang和Chen)。相當(dāng)于20%海水的氯離子濃度為大約3870ppm氯離子或3.87g/1氯離子(Horne1969)。Tuttle和Loeblich(1975)開發(fā)了C.co/zm7的最佳的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。所公開的培養(yǎng)基包含342毫摩爾(mM)的氯化鈉濃度。在342mM氯化鈉溶液中鈉離子和氯離子的等效的克每升為7.86g/L鈉離子和12.12g/L的氯離子。Beach&Holz(1973)報(bào)道當(dāng)在NaCI濃度的范圍中(0.3%、1.8%和5.0%(分別為1.82g/l、10.9g/l和30.3g/1氯離子))培養(yǎng)Cco/zm'/時(shí)，脂質(zhì)產(chǎn)量(表示為mg每109個(gè)細(xì)胞)隨著NaCl濃度減少而下降。在0.3%NaCl的脂質(zhì)產(chǎn)量為在5.0%NaCl的脂質(zhì)產(chǎn)量的大約三分之一。新近，Jiang和Chen(1999)用三種寇氏隱曱藻菌抹測(cè)定了鹽度對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和DHA含量的影響，并發(fā)現(xiàn)在所有情況下，最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)速率和DHA產(chǎn)量為5g/L至9g/L氯化鈉，其分別對(duì)應(yīng)于3.0和5.5g/L氯離子。海水的天然氯濃度(19，353ppm或19.35g/1氯離子)(Home1969,151頁(yè))加速不銹鋼發(fā)酵罐中的腐蝕。例如，在用于制造;^酵罐的兩種普通等級(jí)的不銹鋼中，當(dāng)氯水平超過300ppm(0.3g/1氯離子)時(shí)304-不銹鋼是容易腐蝕的，且當(dāng)氯水平超過1000ppm(1g/1氯離子)時(shí)316-不銹鋼是容易腐蝕的。存在其他等級(jí)的對(duì)氯腐蝕更有抵抗力的不銹鋼，但它們非常昂貴且通常只用于生產(chǎn)非常貴重的化合物的發(fā)酵設(shè)備。雖然可以預(yù)測(cè)通過降低培養(yǎng)基中的氯濃度可以使不銹鋼發(fā)酵罐的腐蝕實(shí)現(xiàn)最小化，但是實(shí)際上這并不是簡(jiǎn)單的任務(wù)。當(dāng)源自大海的海洋微藻類在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)，通常需要一定量的氯離子，優(yōu)選如氯化鈉，以保持生長(zhǎng)和脂質(zhì)產(chǎn)生。然而，至今在低氯濃度生長(zhǎng)海洋微藻類同時(shí)保持omega-3多不飽和的脂肪酸如DHA的產(chǎn)生水平的嘗試還不成功。Jiang和Chen(1999)不能證明在NaCl水平小于5g/L,對(duì)應(yīng)于大約3033ppm或3g/L的氯水平時(shí)顯著的DHA產(chǎn)量。2002年6月25日頒布給Barclay的美國(guó)專利No.6,410,281提供了在低氯培養(yǎng)基中在降低氯化鈉水平時(shí)通過以非氯化物鈉鹽取代以補(bǔ)償鈉的損失而生長(zhǎng)廣鹽性生物(euryhalineorganism)如石皮嚢壺菌屬菌種(772raustoc/z3^n'wmsp.)和/Sc/z/zoc/z;^n'wm^sp.的方法需要能由寇氏隱曱藻產(chǎn)生高產(chǎn)量DHA，同時(shí)抑制或防止在商業(yè)上最理想的生產(chǎn)容器，不銹鋼發(fā)酵罐中腐蝕的方法。此方法必須能使所述微生物在含有優(yōu)選小于300ppm氯的培養(yǎng)基中有效地生長(zhǎng)。三百ppm氯代表比由Jiang&Chen(1999)證明的對(duì)隱曱藻的菌抹的生產(chǎn)反而更好的最低氯水平低10-18倍的水平。-微生物發(fā)酵的另一個(gè)理想的特性是在低pH(小于或等于大約pH:5.0)生長(zhǎng)細(xì)胞以抑制真菌發(fā)酵中細(xì)菌生長(zhǎng)的能力。然而，文獻(xiàn)表明隱曱藻在中性pH(大約pH7)生長(zhǎng)最佳。Tuttle和Loeblich在PhycologiaVol.14(1)1-8(1975)中，公開了隱曱藻生長(zhǎng)的最適pH為6.6，而低于pH5.5生長(zhǎng)是"非常慢"的。需要在低pH生長(zhǎng)隱甲藻同時(shí)保持正常生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生的菌抹(strain)和/或方法。
發(fā)明內(nèi)容在隱曱藻用的培養(yǎng)基中最小化氯化鈉水平的嘗試中，其中氯化鈉導(dǎo)致腐蝕發(fā)酵罐的問題，本發(fā)明人令^a京訝地發(fā)現(xiàn)可以通過在培養(yǎng)基中控制鈉鹽和優(yōu)選鉀鹽以補(bǔ)償氯離子的減少(降至300ppm或0.3g/L氯離子)而降低氯化鈉水平，同時(shí)保持與在大約4.5g/LNaCl(對(duì)應(yīng)于2.73g/1氯離子)所獲得的相似的DHA產(chǎn)量。本發(fā)明人已確定了培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)條件允許應(yīng)f漠在具有顯著降低的氯水平(降至大約0.3g/1氯離子)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而當(dāng)與在正常的"高氯"培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)進(jìn)行比較時(shí)沒有對(duì)干重、脂肪含量或DHA含量的不良影響。獲得可比較的DHA產(chǎn)量不僅僅是在培養(yǎng)基中用其他鈉鹽代替氯化鈉的問題。實(shí)際上，用來自其他鈉鹽(即硫酸鈉)的等量(equivalentamount)的鈉代替氯化鈉不導(dǎo)致與高氯對(duì)照情況可比較的DHA產(chǎn)量，卻實(shí)際上導(dǎo)致培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量進(jìn)一步降低。然而本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)鉀濃度(相對(duì)于在4.5g/1NaCl的海水中或17。/。的海水中)顯著增加時(shí)得到最佳的DHA產(chǎn)量。出乎意料，鈉量的基本減少和鉀濃度的增加在補(bǔ)償培養(yǎng)基的氯含量減少中是有效的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱(Dinophyceae)的異養(yǎng)的微藻類(heterotrophicmicroalage)產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/1的氯離子和濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA每升7天培養(yǎng)物(0.04gDHAperliterof7dayculture)。7天培養(yǎng)物通常具有大約5x106個(gè)細(xì)胞/1111或大約5x109個(gè)細(xì)胞/升。因此，在第7天具有大約0.2g/1DHA的培養(yǎng)物含有大約0.04gDHA/l(f個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱曱藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱曱藻。優(yōu)選地，氯離子的濃度為小于或等于大約lg/1,甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l。優(yōu)選地，鉀離子為大于或等于大約0.4g/l,并甚至更優(yōu)選等于或大于大約0.8g/l。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約lg/l至大約8g/1。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/l至大約5g/l。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量(biomass)包含于本發(fā)明中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子和以鈉:鉀小于或等于大約27:1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述^:藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物或0.04gDHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱曱藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱曱藻。優(yōu)選地，氯離子濃度為小于或等于大約1g/1,甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l。優(yōu)選地，鉀離子為大于或等于大約0.4g/l，和甚至更優(yōu)選為等于或大于大約0.8g/l。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子以d、于鉀離子重量的27倍(重量)(表示為27:1的鈉:鉀重量比)的比例存在于培養(yǎng)基中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，鈉:鉀比例為小于大約15:1。更優(yōu)選的是大約4:1的鈉:鉀比例。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于本發(fā)明中。本發(fā)明人也已確定了培養(yǎng)基條件和菌抹，所述培養(yǎng)基條件和菌抹允許隱曱藻在具有顯著降低的pH水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，同時(shí)仍保持商業(yè)上可實(shí)現(xiàn)的生長(zhǎng)速率和脂質(zhì)，包括DHA的生產(chǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法，其中所述培養(yǎng)基具有低于大約6的pH,而且其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA/109+細(xì)胞。所述培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/l的鉀離子和以鈉:鉀小于或等于大約27:1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述微藻類是隱曱藻屬的。更優(yōu)選的微藻類是寇氏隱曱藻。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH小于或等于大約pH5.5，更優(yōu)選小于或等于大約5.0,和甚至更優(yōu)選小于或等于大約4.5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含小于或等于大約2g/1,優(yōu)選小于或等于大約1g/l，甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的氯離子濃度。所述培養(yǎng)基也包含濃度大于或等于大約0.25g/1,大于或等于大約0.4g/1,和甚至更優(yōu)選大于或等于大約0.8g/1的鉀離子。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約1g/1至大約8g/1。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/l至大約5g/1。鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于本發(fā)明中。本發(fā)明也包括選擇曱藻綱的耐受低pH的異養(yǎng)的微藻類的方法，其包括將所述的微藻類在低pH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)(subculture)直到DHA的產(chǎn)量大于或等于大約0.04gDHA/l()S個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH小于或等于大約6，小于或等于大約5，小于或等于大約4.5。通過此方法產(chǎn)生的微藻類和生物量包含于本發(fā)明中。通過如下的最佳方式說明、附圖和權(quán)利要求，本發(fā)明的這些和其他目的、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)會(huì)變得顯而易見。圖1是在pH6.3和3g/1氯離子中(表示為pH6.3SSM)生長(zhǎng)的C.co/m//菌抹T-HF和適于低pH，在pH5和1g/1氯離子中(表示為pH5.0LCSSI)生長(zhǎng)C.co/zm7菌林T-HF的重復(fù)的DHA產(chǎn)量的時(shí)間過程圖示。圖2是在pH6.3和3g/1氯離子中(表示為pH6.3SSM)生長(zhǎng)的C.co/w〃菌抹T-HF和適于低pH,在pH4.5和1g/1氯離子中(表示為pH5.0LCSSI)生長(zhǎng)的C.co/zm7菌抹T-HF的重復(fù)的DHA產(chǎn)量的時(shí)間過程圖示。發(fā)明詳述本發(fā)明解決了前面確定的由于生長(zhǎng)曱藻綱的海洋微藻類的高氯化鈉水平而引起的發(fā)酵罐腐蝕的問題。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過在培養(yǎng)基中使用改進(jìn)量的氯離子和鉀離子發(fā)現(xiàn)了培養(yǎng)基組分，所述組分在低氯化鈉條件下允許生長(zhǎng)商業(yè)上可行的水平的曱藻綱的海洋微藻類和產(chǎn)生DHA。更具體地，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)由于將氯化鈉降低至非-腐蝕的水平而引起的鈉的損失可至少部分地通過在培養(yǎng)基中增加鉀水平而補(bǔ)償。本發(fā)明也解決了前面確定的允許生長(zhǎng)曱藻綱的海洋微藻類同時(shí)阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)的問題。更具體地，本發(fā)明提供培養(yǎng)海洋生物的方法以使它們變?yōu)槟褪艿蚿H。本發(fā)明也提供耐受低pH的上述微生物的菌抹。由本發(fā)明人提供的耐受低pH的菌抹，可在低pH水平生長(zhǎng)至細(xì)胞稠密(celldensities)并獲得DHA產(chǎn)生水平，該DHA產(chǎn)生水平可與在更中性的pH水平生長(zhǎng)的菌抹獲得的DHA產(chǎn)生水平相比較。由于本發(fā)明的概念可容易地應(yīng)用于其他生產(chǎn)生物體和如下詳述的其他需要的PUFAs，這只是本發(fā)明包含的技術(shù)的一個(gè)實(shí)施例。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，所述培養(yǎng)基包含如下的組分濃度小于大約2g/L的氯離子，和濃度大于大約0.25g/L的鉀離子，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物。所述7天培養(yǎng)物通常具有5x106個(gè)細(xì)月包/ml,導(dǎo)致大約0.04gDHA/l(f個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異養(yǎng)的^(鼓藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA/1(^個(gè)細(xì)胞，至少大約0.06gDHA/1(^個(gè)細(xì)胞，至少大約0.08gDHA/1()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.10gDHA/1()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.12gDHA/1()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.14gDHA/1()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.16gDHA/l()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.18gDHA/l()9個(gè)細(xì)胞，至少大約0.20gDHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.22gDHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.24gDHA/109個(gè)細(xì)胞，至少大約0.26gDHA/l(^個(gè)細(xì)胞，至少大約0.28gDHA/l(^個(gè)細(xì)胞，或至少大約0.30gDHA/1(^個(gè)細(xì)胞。如本文中使用的，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)濃度(neutrientconcentration)是指在培養(yǎng)步驟一開始培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)濃度，其包括從所述方法中之前的階段，如接種物的制備帶來的任何營(yíng)養(yǎng)物。適合于本發(fā)明的微生物包括異養(yǎng)的微藻類，其包括曱藻綱成員(溝鞭藻類)。此綱的優(yōu)選的成員是隱曱藻屬的成員。隱曱藻屬的優(yōu)選的成員是C.co/zm'/?？苁想[曱藻是專性異養(yǎng)生物(obligateheterotroph),其需要減少的石友源用于生長(zhǎng)，并含有脂肪酸分布(profile),其中DHA是唯一以可感知的量存在的多不飽和脂肪酸?？蓮脑S多可公開利用的來源，包括通過從自然環(huán)境收集而獲得合適的生物體。例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)目前列出了45抹可用的寇氏隱甲藻的菌抹，其鑒定為ATCCNos.30021、30334-30348、30541-30543、30555-30557、30571、30572、30772-30775、30812、40750、50050-50060和50297-50300。如本文中使用的，任何微生物或生物體的任何具體類型，包括野生菌抹、突變體或重組類型。除去作為本發(fā)明主題并在下面更充分討"^侖的鈉、氯和鉀濃度之外，本發(fā)明的培養(yǎng)基的其他組分可為本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的促進(jìn)生長(zhǎng)和以商業(yè)上可實(shí)用的水平生產(chǎn)DHA的任何組分，并包括如在美國(guó)專利5，130,242，美國(guó)專利No.5,407,957，美國(guó)專利No.5,397,591;美國(guó)專利No.5,492,938;和美國(guó)專利No.5,711,983中公開的那些組分，上述所有專利都全部并入本文作為參考。更具體地，可使用碳源，如葡萄糖、各種淀粉、糖蜜、磨碎的玉米(groundcorn)等。培養(yǎng)基中也包括可吸收的(assimilable)有機(jī)或無機(jī)氮的來源。氮源可包括硝酸鹽、尿素、銨鹽、氨基酸等。也可提供可吸收的磷的來源。所述培養(yǎng)基也可含有微生物生長(zhǎng)因子的來源，該生長(zhǎng)因子是未指明的或指明的化合物，其增強(qiáng)單細(xì)胞微生物的異養(yǎng)的生長(zhǎng)，并可包括酵母或其他提取物，土壤提取物等。C.co/zm'/和相關(guān)生物體的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的具體實(shí)例，例如，可見于Jiang和Chen,ProcessBiochemistry35(2000)1205-1209;Jiang和Chen，JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,(1999)Vol.23,508-513;Vazhappilly和Chen，JournaloftheAmericanOilChemistsSociety,(1998)Vol.75,No.3p393-397。本發(fā)明中使用的優(yōu)選培養(yǎng)基的具體實(shí)施例可見于，例如，本文中下面的實(shí)施例部分。在本發(fā)明的培養(yǎng)基的一個(gè)方面，氯離子濃度以小于或等于大約2000ppm或大約2克每升培養(yǎng)物，更優(yōu)選小于或等于大約1.9g/l,更優(yōu)選小于或等于大約1.8g/l,更優(yōu)選小于或等于大約1.7g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.6g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.5g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.4g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.3g/l,更優(yōu)選小于或等于大約1.2g/l,更優(yōu)選小于或等于大約1.1g/l，更優(yōu)選小于或等于大約1.0g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.9g/l,更優(yōu)選小于或等于大約0.8g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.7g/l,更優(yōu)選小于或等于大約0.6g/l,更優(yōu)選小于或等于大約0.5g/l，更優(yōu)選小于或等于大約0.4g/l，和最優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的濃度存在。在可替換的實(shí)施方案中，最小氯濃度為至少大約0.025g/1，至少大約0.05g/1,或至少大約0.1g/1。培養(yǎng)基的氯離子組分是優(yōu)選由氯化物鹽得到的，其優(yōu)選的鹽為氯化鈉。培養(yǎng)基中氯的其他來源包括氯化鉀和氯化4丐。氯離子的來源可包括培養(yǎng)基中的多于一種的含氯化合物，并可包括用來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH的氫氯酸，以及MnCl2和FeCl3。在本發(fā)明的培養(yǎng)基的另一個(gè)方面，鉀離子濃度為大于大約0.25g/L。鉀離子通常以低水平存在于海水中，為大約0.38g/1海水。本領(lǐng)域已知的用于生長(zhǎng)海洋微藻類的培養(yǎng)基嚴(yán)格(closely)遵循海水的組成，具有通常相同或更少的鉀離子水平。例如，Tuttle和Loeblich(1975)公開了9mMKC1，其相當(dāng)于大約0.35g/1鐘離子。在藻類學(xué)方法手冊(cè)(HandbookofPhycologicalMethods)(JanetR.Stein,Ed.,CambridgeUniversityPress,1973)中，公開了培養(yǎng)基中的鉀離子作為氯化鉀為9.83mM,其相當(dāng)于大約0.36g/1鉀離子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括濃度為大于大約0.39g/l的鉀離子。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)一旦鉀離子大于閾值(thresholdlevel)，培養(yǎng)對(duì)于鉀離子的精確濃度、在鉀離子濃度的范圍生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生商業(yè)上可行的水平的DHA相對(duì)不敏感。優(yōu)選地，鉀離子濃度的下界為至少大約0.2g/l,至少大約0.25g/1，至少大約0.3g/1，至少大約0.35g/1，至少大約0.4g/l，至少大約0.45g/l，至少大約0.5g/l，至少大約0.6g/1和至少大約0.7g/1。優(yōu)選地，鉀離子濃度的上界為至多大約10g/l，至多大約6g/1，至多大約4g/1,至多大約3g/1,至多大約2.8g/1,至多大約2.6g/1，至多大約2.4g/l，至多大約2.2g/1，至多大約2g/1，至多大約1.9g/1，至多大約1.8g/1，至多大約1.7g/1,至多大約1.6g/1，至多大約1.5g/1，和至多大約lg/1。鉀離子的最優(yōu)選的濃度為大約0.75g/1、0.8g/l、0.85g/l、0.9g/l和0.95g/l。鉀離子的優(yōu)選范圍為大約0.45g/1至大約1.5g/1;更優(yōu)選大約0.5g/1至大約1.2g/l;更優(yōu)選大約0.6g/1至大約1g/1;甚至更優(yōu)選大約0.7g/1至大約0.9g/1;和最優(yōu)選大約0.8g/l。鉀離子的來源可來自適合細(xì)胞培養(yǎng)并尤其適合曱藻綱的微藻類的任何鉀鹽。鉀離子可源自培養(yǎng)基中的鹽的混合物。優(yōu)選的鉀鹽包括氯化鉀、硫酸鉀、乙酸鉀、^暖酸氫鉀、磷酸鉀等。優(yōu)選的鉀離子來源是石充酸鉀。在本發(fā)明的一個(gè)方面，^^人培養(yǎng)物收獲的(atharvest)DHA產(chǎn)量大于不在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中的DHA產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用低氯濃度使用本發(fā)明的方法的DHA產(chǎn)量為至少0.2克DHA每升7天培養(yǎng)物或0.04gDHA/l()9個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述培養(yǎng)基也會(huì)包含除氯化鈉之外附加的鈉離子來源。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)鈉離子水平對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵性的。本發(fā)明的海洋生物的培養(yǎng)對(duì)于鈉離子的精確濃度、在鈉離子濃度的范圍生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生商業(yè)上可行的水平的DHA相對(duì)不敏感。許多不同來源的鈉離子適合本發(fā)明，其包括硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氬鈉和乙酸鈉。附加的鈉離子的優(yōu)選的來源是硫酸鈉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含至少大約1g/l鈉離子直至大約8g/l鈉離子。在該范圍的下界，優(yōu)選的鈉離子濃度為至少大約1g/1,至少大約丄5g/1,至少大約2g/1,和至少大約2.5g/1。優(yōu)選地，鈉離子濃度的上界為至多大約15g/1，至多大約12g/1,至多大約10g/1,至多大約9g/1，至多大約8g/1,至多大約7g/1,至多大約6g/1,至多大約5.5g/1,至多大約5g/1,至多大約4.5g/1,至多大約4g/1。最優(yōu)選的鈉離子濃度為大約2.75g/1、3g/1、3.25g/1、3.5g/1和3.75g/1。鈉離子的優(yōu)選范圍是大約1.5g/1直至大約7.5g/1，甚至更優(yōu)選的是大約2.0g/1直至大約6g/1，和甚至更優(yōu)選的是大于大約2.5g/1直至大約5g/1。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，鈉離子為至少大約3g/1至大約3.5g/l。最優(yōu)選的鈉的水平為大約3.25g/1。如前所述，培養(yǎng)對(duì)于鈉的精確水平相對(duì)不敏感，并由此可使用甚至更高的水平。然而，一旦使用大于大約8g/1的鈉水平，培養(yǎng)產(chǎn)量開始輕微下降。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法。所述培養(yǎng)基包含濃度小于或等于大約2g/l的氯離子，濃度大于或等于大約0.25g/1的鉀離子和以鈉:鉀小于或等于大約27:1重量比的比例存在的鈉離子。在此實(shí)施方案中，所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物或0.04gDHA/l(^個(gè)細(xì)胞。在此實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有鈉離子，其與鉀離子的比例小于或等于大約27:1重量比。在海水中，鈉離子與鉀離子的比例為大約27.3:1。換言之，鈉離子的量比鉀離子的量高大約27.3倍。在本發(fā)明中，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)相對(duì)于鈉離子增加鉀離子增加了培養(yǎng)物中的DHA產(chǎn)量。優(yōu)選的鈉離子與鉀離子的比例為小于或等于大約27:1,小于或等于大約25:1，小于或等于大約23:1，小于或等于大約21:1，小于或等于大約19:1。更優(yōu)選的是小于或等于大約17:1，小于或等于大約15:1，小于或等于大約13:1，小于或等于大約11:1的比例。甚至更優(yōu)選的是小于或等于大約9:1,小于或等于大約7:1，或小于或等于大約5:1的比例。優(yōu)選的比例為大約4:1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在培養(yǎng)基中通過培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生DHA的方法，其中所述培養(yǎng)基具有小于大約6的pH,且其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.2gDHA每升7天培養(yǎng)物或0.04gDHA/109個(gè)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為小于或等于大約5.5,和更優(yōu)選小于或等于大約5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，pH為小于或等于大約4.5。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含小于或等于大約2g/1，優(yōu)選小于或等于大約1g/1,甚至更優(yōu)選小于或等于大約0.3g/l的氯離子濃度。所述培養(yǎng)基也優(yōu)選包含濃度大于或等于大約0.25g/1，大于或等于大約0.4g/l,和甚至更優(yōu)選大于或等于大約0.8g/1的鉀離子。優(yōu)選地，鉀離子的來源是硫酸鉀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基還包含鈉離子的來源以使鈉離子濃度為大約1g/l至大約8g/1。更優(yōu)選地，鈉離子為大約1.5g/1至大約5g/l。優(yōu)選的鈉離子的來源是硫酸鈉。通過此方法產(chǎn)生的生物量包含于此實(shí)施方案中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括制備曱藻綱的菌種的耐受低pH的菌抹的方法和由此產(chǎn)生的菌林。方法包括低pH培養(yǎng)基的制備和理想的曱藻綱菌種的傳代培養(yǎng)直到所述培養(yǎng)產(chǎn)生所需量的DHA?？捎萌缦碌姆绞竭M(jìn)行傳代培養(yǎng)。將理想的曱藻綱菌種的接種物置于低pH培養(yǎng)基中并允許生長(zhǎng)限定的時(shí)間，優(yōu)選7天。此時(shí)間長(zhǎng)度不是關(guān)鍵性的，但應(yīng)進(jìn)行選擇以使菌抹在到達(dá)衰老之前具有足夠的時(shí)間生長(zhǎng)。計(jì)算培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量。如果小于所需的量，以如下的方式進(jìn)行附加的傳代培養(yǎng)。制備新鮮的低pH培養(yǎng)基并用低pH培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種，而且溫育合適的時(shí)間。計(jì)算培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量。如果DHA產(chǎn)量小于所需的量，重復(fù)傳代培養(yǎng)直到獲得所需的DHA產(chǎn)量。優(yōu)選的用于選擇耐受性的pH為大約6或以下，更優(yōu)選為大約5.5或以下，甚至更優(yōu)選為大約5或以下，和甚至更優(yōu)選為4.5或以下。實(shí)施此方法的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的pH調(diào)節(jié)至所需水平的任何培養(yǎng)基。其中進(jìn)行傳代培養(yǎng)的優(yōu)選的培養(yǎng)基是實(shí)施例1中描述的培養(yǎng)基。本發(fā)明也包括通過本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的生物量。與本發(fā)明的生物體和方法相一致的培養(yǎng)條件可通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，并包括在美國(guó)專利5,130,242，美國(guó)專利No.5,407,957,美國(guó)專利No.5，397，591;美國(guó)專利No.5,492,938;和美國(guó)專利No.5,711,983中公開的方法，而且本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可容易地確定最佳條件。簡(jiǎn)單地，可在任何合適的發(fā)酵罐，優(yōu)選在攪拌釜(stirredtank)發(fā)酵罐或氣升式(airlift)發(fā)酵罐中完成培養(yǎng)，所述的發(fā)酵罐給微生物提供氧的來源。應(yīng)將微生物的攪拌保持在一定水平以使在溶氧濃度足夠支持培養(yǎng)物生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生的同時(shí)，所述攪拌不剪切或以另外的方式損害微生物。優(yōu)選的溶氧水平為至少10%的空氣飽和水平。更優(yōu)選地，將溶氧水平保持為大約10%至大約50%的空氣飽和水平?？稍谌魏尉S持生命的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。通常，微生物將在大約15。C至大約34。C的溫度范圍生長(zhǎng)。優(yōu)選將溫度保持在大約20。C至大約28°C?？赏ㄟ^本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的常規(guī)手段收獲生物體，所述手段諸如離心、絮凝或過濾，并可立即處理或進(jìn)行干燥用于將來的加工。無論哪一樣都可提取脂質(zhì)。如本文中使用的，術(shù)語"脂質(zhì)"包括磷脂；游離脂肪酸；脂肪酸的酯類；三酰甘油(triacylglycerol);二酰基甘油酯(diacylglyceride);單?；视陀现?monoacylglyceride);溶血石粦脂(lysophospholipid);月巴皂(soap);石壽脂(phosphatide);固醇(sterol)和固醇酯(sterolester);類胡蘿卜素(carotenoids);葉黃素(xanthophyll)(例如，氧合類胡蘿卜素(oxycarotenoids));碳?xì)浠衔?hydrocarbons);和本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其他脂質(zhì)。如技術(shù)人員充分理解的，本發(fā)明涉及的DHA可為這些不同脂質(zhì)的形式，并且不限于游離的脂肪酸。依賴于使用的提取技術(shù)，可提取脂質(zhì)的不同形式或組分?？捎糜行Я康娜軇┨崛≈|(zhì)。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員可確定合適的溶劑。通常用極性溶劑(例如，氯仿/曱醇)提取極性脂質(zhì)(例如，磷脂)而且通常用非極性溶劑(例如，己烷)提取中性脂質(zhì)(例如，三酰甘油)。優(yōu)選的溶劑是純己烷。己烷與干生物量(drybiomass)的合適的比例為大約4升己烷每千克干生物量。優(yōu)選將己烷與生物量在攪拌反應(yīng)容器在大約50。C的溫度混合大約2小時(shí)?；旌虾螅瑢⑸锪窟^濾并與含油的己烷分離。通過本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的蒸餾技術(shù)從油中移除己烷。常規(guī)的含油種子(oilseed)加工設(shè)備適于進(jìn)行過濾、分離和蒸餾。如果具體應(yīng)用要求或需要，可進(jìn)行本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的附加的加工步驟。在如下的參考文獻(xiàn)中描述了脂質(zhì)回收的可替換的方法，所述參考文獻(xiàn)整體并入作為參考PCTPublicationWO0176715，題目是"MethodfortheFractionationofOilandPolarLipid-ContainingNativeRawMaterials";PCTPublicationWOO176385，題目是"MethodForTheFractionationOfOilandPolarLipid-ContainingNativeRawMaterialsUsingAlcoholandCentrifUgation";PCTPublicationWO0153512，題目是"SolventlessExtractionProcess"。本發(fā)明，雖然是依據(jù)具體的生物體和方法公開的，但意欲包括所有這樣的方法和菌抹，它們可根據(jù)在本文中公開的教導(dǎo)得到而且是有用的，所述的教導(dǎo)包括所有替換、修飾和優(yōu)化，其對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是可利用的手段。為了說明的目的而不是限制本發(fā)明的范圍提供了如下的實(shí)施例和試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例1此實(shí)施例描述了含4.5g/1NaCl的標(biāo)準(zhǔn)篩選培養(yǎng)基(StandardScreeningMedium)(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入蒸餾水至90%的最終需要的體積，如表1所示。所有化合物可從SigmaAldrich,St.Louis,MO得到。表l.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1二水合氯化鉤為244g/mol,含氯28.7%。2將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每?jī)芍苤苽湫迈r的。3將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4。C。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。4將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100%體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形并瓦(Erlenmeyerflask)。每個(gè)錐形瓶加入1ml的接種物用于1X1()S個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5。C在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長(zhǎng)培養(yǎng)物。實(shí)施例2此實(shí)施例描述了含1.41g/1NaCl(其連同氯化鈣和氯化鉀產(chǎn)生大約1000ppm，1gZl氯離子)的1000ppm氯離子彈選培養(yǎng)基(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入去離子的蒸餾水至90%的最終需要的體積，如表2所示。所有化合物可從SigmaAldrich，St.Louis，MO得到。表2.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>1將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每?jī)芍苤苽湫迈r的。2將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4。C。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。3將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100%體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形瓶。每個(gè)錐形瓶加入1ml的接種物用于1X1()S個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5。C在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長(zhǎng)培養(yǎng)物。實(shí)施例3此實(shí)施例描述了含0.211g/1NaCl(其連同氯化鈣和氯化鉀產(chǎn)生大約0.3g/1氯離子)的300ppm氯離子篩選培養(yǎng)基(SSM)的制備。為了制備該培養(yǎng)基，第一步包括將如下化合物加入去離子的蒸餾水至90%的最終需要的體積，如表3所示。所有化合物可從SigmaAldrich,St.Louis,MO得到。表3.高壓滅菌之前培養(yǎng)基的量和終濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌并以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基；每?jī)芍苤苽湫迈r的。2將儲(chǔ)液通過0.2微米過濾器過濾除菌；在黑暗中貯存于4。C。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。3將儲(chǔ)液?jiǎn)为?dú)高壓滅菌。以無菌的方式加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基。用無菌水使高壓滅菌的培養(yǎng)基達(dá)到100%體積。對(duì)于篩選實(shí)驗(yàn)，將35ml的SSM培養(yǎng)基加入無菌的250ml錐形瓶。每個(gè)錐形瓶加入1ml的接種物用于1X1()S個(gè)細(xì)胞每ml的初始細(xì)胞濃度。接種物為5-6天的培養(yǎng)物。在26.5。C在旋轉(zhuǎn)振蕩器上以135rpm生長(zhǎng)培養(yǎng)物。實(shí)施例4.此實(shí)施例描述了在pH6.3SSM中生長(zhǎng)和收獲寇沃應(yīng)f^"的步驟。依據(jù)將哪種培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如實(shí)施例1-3之一所述制備SSM培養(yǎng)基。如實(shí)施例1-3所述制備附加的培養(yǎng)基組分并加入培養(yǎng)基。收獲之前的所有步驟在無菌條件進(jìn)行。為了制備接種培養(yǎng)物，使用如下的步驟。向250ml錐形瓶中，將49mlSSM(實(shí)施例1中所述)加入250ml錐形瓶。加入1mlC.c0/2m'/菌抹T-HF(菌抹T-HF鑒定為已被重復(fù)培養(yǎng)的生物體ATCC40750)的五天培養(yǎng)物。將培養(yǎng)瓶放置在27。C無光的培養(yǎng)箱中以135rpm旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器上。生長(zhǎng)三天后，將培養(yǎng)物移至無菌防護(hù)罩(sterilehood),移出1ml并使用庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器(CoulterCounter)(CoulterZ2ParticleCountandSizeAnalyzer,由BeckmanCoulter,Inc.得到)計(jì)數(shù)。使用細(xì)胞數(shù)計(jì)算接種培養(yǎng)物的量，所述接種培養(yǎng)物的量必須用于開始新的50ml培養(yǎng)物，其細(xì)胞密度為l.Ox1()S個(gè)細(xì)胞每ml。為了測(cè)試不同的培養(yǎng)基組分，如下所述配制適合的培養(yǎng)基并導(dǎo)入無菌的250ml錐形瓶。將如前計(jì)算的接種物的量導(dǎo)入含有在錐形瓶中制備的培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶。將所述培養(yǎng)瓶放置在27。C無光的培養(yǎng)箱中以135rpm旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)器上。7天的生長(zhǎng)之后，如下收獲培養(yǎng)物。對(duì)于每種培養(yǎng)物而言，將50ml離心管(從VWRScientific得到)作標(biāo)記并稱重。對(duì)于每種培養(yǎng)物而言，標(biāo)記另一個(gè)50ml離心管，但不稱重。然后將培養(yǎng)物注入標(biāo)記的50ml管。記錄體積并用CoulterZ2ParticleCountandSizeAnalyzer進(jìn)4亍細(xì)月包計(jì)l丈。測(cè)量pH。將一半培養(yǎng)物注入配衡的(tared)50ml管，并加入擦洗用異丙醇(isopr叩ylrubbingalcohol)(IPA)的70%溶液以使管內(nèi)的總體積達(dá)到50ml。通過將管倒轉(zhuǎn)2-3次混合培養(yǎng)物。然后使用SorvallGeneralPurposeRC-3Centrifuge將培養(yǎng)物在4000rpm離心5分鐘。倒掉上清。將另一半培養(yǎng)物注入上述沉淀(pellet)上并從IPA的70%溶液開始重復(fù)上述步驟。然后以39%IPA使用如下步驟將沉淀洗滌兩次將35mL39%IPA加入細(xì)胞沉淀；(使用來自VWRScientific的VortexGenie-2)將管以全速渦旋10秒；收集后，將沉淀冷凍-干燥至少48小時(shí)。將含有沉淀(生物量)的管稱重并計(jì)算生物量的干重。如下計(jì)算干重確定含有生物量的管的重量減去管的自重。將此數(shù)字除以收獲時(shí)記錄的培養(yǎng)物的體積，除以1000?？刹鹏匏戮釉贛orrison和Smith,"PreparationofFattyAcidMethylEsters和DimethylacetalsfromLipidwithBoronFluoride-Methanol",JournalofLipidResearch,Vo.5,1964,和theAmericanOilChemist'sSocietyOfficialMethodsusedtoquantitatelongchainFattyAcidandeicosapentaenoicacid(EPA)和DHAinmarineoils(MethodCelb-89)中公開的步驟測(cè)定脂肪酸組成(和％DHA)。簡(jiǎn)單地，將樣品與標(biāo)準(zhǔn)量的油(內(nèi)標(biāo))混合，用0.5N曱醇化氫氧化鈉(methanolicsodiumhydroxide)皂化，并用三氟化硼(borontrifluoride)/曱醇衍生。提取月旨肪酸曱酯并在氣相色譜上用火焰離子化4企測(cè)器(使用30mx0.25mmx0.25pimRestekFAMEWAX#12497柱的HewlettPackard5890SeriesIIPlus氣相色譜)分析。實(shí)施例5此實(shí)施例描述了使用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基在低NaCl水平生長(zhǎng)C.co/zm'z'并產(chǎn)生DHA。制備1升不含NaCl的SSM并高壓滅菌。制備4種濃縮的NaCl的貯存物(135g/l、90g/l、45g/l和22.5g/l)。在每個(gè)含有48.75ml無NaCl的SSM培養(yǎng)基的搖瓶中加入1.25ml適合的NaCl貯存物。建立兩種對(duì)照4.5g/1NaCl使用如實(shí)施例1中所述的正常SSM，和無NaCl使用不加NaCl的SSM。使用每個(gè)NaCl水平的重復(fù)。如實(shí)施例4所述進(jìn)行生長(zhǎng)和收獲。表5描述了此實(shí)施例的結(jié)果。所有給出的數(shù)字為兩次培養(yǎng)的平均值。表5.在含有減少量的NaCl的SSM中生長(zhǎng)的C.co/7""的生物量、。/。DHA、。/。脂肪和DHA產(chǎn)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表明只來自氯化鈉的氯離子的量(0.20g/1)。參見實(shí)施例1-3。表5顯示在含有減少量的NaCl的SSM中生長(zhǎng)的C.co/zm7的生物量的產(chǎn)量、％脂肪、和DHA產(chǎn)量?？梢钥闯鲭S著加入培養(yǎng)物的NaCl量的減少，生物量產(chǎn)量和脂肪水平都下降，導(dǎo)致DHA的產(chǎn)量降低。實(shí)施例6此實(shí)施例描述了用實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中的4.5g/1NaCl獲得的DHA產(chǎn)量。如實(shí)施例4所述生長(zhǎng)培養(yǎng)物。表6顯示此實(shí)施例的結(jié)果。表6.在實(shí)施例1的SSM中生長(zhǎng)的C.co/m"的生物量、％DHA、％脂肪和DHA產(chǎn)量。(<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表明只來自氯化鈉的氯離子的量。實(shí)施例7此實(shí)施例描述了使用以辟u酸鉀和石克酸鈉形式的鉀離子和鈉離子的不同濃度，在低氯培養(yǎng)基中增強(qiáng)的C.co/zm7生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生。使用0.18g/1乙酸鈣并省去氯化鈣和氯化鉀，以實(shí)施例3中描述的方式制備低氯SSM。使用二維矩陣相對(duì)于4.9g/1,9.8g/1,14.7g/1,19.6g/1和24.5g/1的Na2S04濃度測(cè)試0.16g/1,0.80g/1,1.6g/1,3.2g/1和4.8g/1的K2S04濃度的每種可能的組合。如實(shí)施例4所述生長(zhǎng)所有的培養(yǎng)物。結(jié)果顯示于表7中。表7.在含有變化濃度的硫酸鉀和硫酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的C.co/2剛7得到的生物量、％DHA、。/。脂肪和DHA產(chǎn)量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>包括由0.45g/1氯化鈉或0.18g/l鈉離子加入的鈉離子。表7中顯示的結(jié)果表明增加的鉀水平使C.co/zw'/的生長(zhǎng)和DHA的產(chǎn)量可與在高氯水平獲得的情況相比較。此實(shí)施例中的增強(qiáng)效果出現(xiàn)在0.8g/l硫酸鉀，其為測(cè)定的第二低的水平，并且其后對(duì)于硫酸鉀的量相對(duì)地不敏感。在測(cè)定的硫酸鉀的最高水平4.8g/1，好像產(chǎn)量有輕微的下降。生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)量也顯得對(duì)于使用的硫酸鈉的量相對(duì)不敏感，然而，從大約19.6g/1硫酸鈉開始，隨著使用的硫酸鈉的量的增加，生長(zhǎng)和產(chǎn)量輕微地降低。基于DHA以g/L表示的量的最佳組合是那些使用0.8g/LK2S04和9.8g/LNa2S04，其代表在(實(shí)施例3中描述的)正常的低氯SSM之上鉀的5x增加和鈉的2x增加；和1.6g/LK2S04和9.8g/LNa2S04,其代表在(實(shí)施例3中描述的)正常的低氯SSM之上^t甲的10x增加和鈉的2x增加。實(shí)施例8此實(shí)施例說明使用含有0.32g/1，0.64g/1，0.96g/1，1.28g/1,1.60g/1和1.9g/1的硫酸鉀和4.9g/1和9.8g/1的硫酸鈉的范圍的培養(yǎng)基的C.co/7m7生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)生的增強(qiáng)。以實(shí)施例7中描述的方式制備低氯SSM，并如實(shí)施例4所述生長(zhǎng)所有的培養(yǎng)物。結(jié)果顯示于表8中。表8.在含有變化濃度的硫酸鉀和石克酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的C.co/m"得到的生物量、％DHA、。/。脂肪和DHA產(chǎn)量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>包括由0.45g/1氯化鈉或0.18g/I鈉離子加入的鈉離子。表8所示的結(jié)果顯示最佳的DHA產(chǎn)量出現(xiàn)在K2S04濃度為1.28g/L及Na2S04濃度為9.8g/L。表8所示的結(jié)果說明在硫酸鉀水平低至0.32g/1時(shí)可看出附加鉀的效果，并呈現(xiàn)相對(duì)的恒定直到1.90g/l。對(duì)于4.9g/1或9.8g/1的石克酸鈉水平而言，生長(zhǎng)和產(chǎn)量相對(duì)不敏感。實(shí)施例9如下實(shí)施例描述了傳代培養(yǎng)C.co/zw'z'以獲得適于在pH5生長(zhǎng)的菌株。以實(shí)施例4中描述的方式在搖瓶中，在實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)C.co/7"z7菌抹T-HF,除了在培養(yǎng)開始時(shí)培養(yǎng)基的pH為pH5。7天之后，使用來自該培養(yǎng)物的接種物在相同條件下在pH5開始新的培養(yǎng)。起初在pH5生長(zhǎng)是緩慢的，但在多次傳代(multipletransfers)后，DHA產(chǎn)量開始增加而且一段時(shí)間后已經(jīng)達(dá)到在pH6.3生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中所見的產(chǎn)量，從而產(chǎn)生低pH菌抹。參見圖1。注意到在7天生長(zhǎng)期的結(jié)尾所述培養(yǎng)物的pH為5.4。由于檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、乙酸鹽和乳酸鹽緩沖液對(duì)于菌抹T-HF的毒性作用(toxiceffect),使用這些緩沖液以使所述菌抹適應(yīng)(adapt)的嘗試是不成功的。然后在前述的pH5培養(yǎng)基中生長(zhǎng)低pH菌抹，但將pH保持在5.0。所述適應(yīng)低pH的菌抹在pH5和在pH5.4同樣生長(zhǎng)良好。實(shí)施例10如下的實(shí)施例描述了來自在pH6.3和2730ppm氯離子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的C.co/zm'z'菌抹T-HF的DHA產(chǎn)量與在pH5在1000ppm氯離子培養(yǎng)基中的低pH菌抹的DHA產(chǎn)量的比較。在如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中，如實(shí)施例4所述生長(zhǎng)C.co/zm'/菌抹T-HF。在添加了硫酸鉀和硫酸鈉的如實(shí)施例2所述的低氯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)C.co/zw7菌林。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行，每天收獲所有的搖瓶以測(cè)定DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)。結(jié)果顯示于圖1中。圖1顯示在兩種不同的培養(yǎng)基條件下DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)幾乎相同。實(shí)施例11如下的實(shí)施例描述了使C.co/m"菌抹T-HF適應(yīng)于在pH4.5在2730ppm氯離子培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的嘗試。以實(shí)施例10中描述的方式生長(zhǎng)C.co/zw'〖菌抹T-HF,除了將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到pH4.5并用賴氨酸代替一半的MSG，同時(shí)保持培養(yǎng)基中有機(jī)氮的恒定水平。重復(fù)培養(yǎng)后，得到的DHA產(chǎn)量為在pH5或pH6.3所見產(chǎn)量的大約三分之一。實(shí)施例12如下的實(shí)施例描述了通過控制鉀濃度限定在pH4.5C.co/zw'Z生長(zhǎng)和DHA產(chǎn)量的條件的嘗試。A.在pH4.5在2.73g/1氯離子進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)(factorialexperiment)以評(píng)估鉀離子的效果(0.16g/1至3.2g/l)。結(jié)果顯示鉀離子的更高水平使DHA產(chǎn)量增加到在pH6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的C.co/zm'/得到的產(chǎn)量的大約三分之二。B.以上述A部分所述的方式進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)，除了將氯離子水平保持恒定在1.0g/l。結(jié)果顯示鉀離子的更高水平使DHA產(chǎn)量增加到在pH6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基生長(zhǎng)的C.co/^/Z得到的產(chǎn)量的大約三分之二。在2.73g/1氯離子(上面A部分所述)和在1.0g/1氯離子得到的DHA產(chǎn)量是可以比較的。實(shí)施例13此實(shí)施例描述了比較使用實(shí)施例12中所述的pH4.5菌林和菌抹T-HF在pH6.3，1.0g/1氯離子得到的DHA的產(chǎn)量的時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)。在如表9具體說明的低氯，pH4.5培養(yǎng)基中以實(shí)施例4所述的方式后，在搖瓶中生長(zhǎng)實(shí)施例12的pH4.5菌抹。使用實(shí)施例1中所述的培養(yǎng)基以實(shí)施例4所述的方式生長(zhǎng)C.co/m"菌抹T-HF。在pH4.5制備用于pH4.5實(shí)驗(yàn)的接種物，并由于細(xì)胞在pH4.5聚結(jié)(clumping)而估計(jì)接種物的量。表9.低氯，pH4.5培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>每天收獲搖瓶以測(cè)定DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖2)顯示在pH4.5的DHA產(chǎn)量總是低于在pH6.3的產(chǎn)量，但是DHA產(chǎn)量增加的速率作為時(shí)間的函數(shù)在每個(gè)pH是大約相同的。這說明在pH4.5，所述培養(yǎng)物能夠以與pH6.3的培養(yǎng)物相同的速率積累DHA，然而，與pH6.3相比，在pH4.5生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量存在遲滯。此結(jié)果說明給定額外的時(shí)間，即大約24小時(shí)，在pH4.5的DHA產(chǎn)量與在pH6.3相同。不清楚所述的遲滯是否是由于在pH4.5DHA積累的延遲引起，并作為結(jié)果，所述pH4.5培養(yǎng)物總是具有低于相同菌齡(sameage)的pH6.3培養(yǎng)物的DHA產(chǎn)量，或所述的遲滯是否是由于所述pH4.5培養(yǎng)物未接受等量的接種物引起。在pH4.5,菌抹T-HF細(xì)胞聚結(jié)以致不可能得到培養(yǎng)物的準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，而且必須估計(jì)使用的接種物的量。因此，可能所述pH4.5培養(yǎng)物接受較少的接種物并因此在DHA產(chǎn)量的動(dòng)力學(xué)中產(chǎn)生明顯的遲滯。無論如何，這些數(shù)據(jù)表明通過使用所述適應(yīng)低pH的C.co/m"菌林和直接的(instant)pH4.5培養(yǎng)基，如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可獲得與在pH6.3的培養(yǎng)基相同的DHA產(chǎn)量。實(shí)施例14使用實(shí)施例10中描述的技術(shù)，進(jìn)行上面實(shí)施例13中描述的離子濃度的進(jìn)一步優(yōu)化和已經(jīng)適應(yīng)pH5的C.co/7m7菌株T-HF的進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，以減少遲滯時(shí)間，導(dǎo)致在pH4.5的7天DHA產(chǎn)量可與在pH6.3及如實(shí)施例1所述的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的C.co/zm'z'得到的產(chǎn)量相比較。在前述說明書中已經(jīng)描述了本發(fā)明的原理、優(yōu)選的實(shí)施方案和操作模式。因?yàn)樗鼈儗⒈徽J(rèn)為是說明性的而不是限制性的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的精神的前提下進(jìn)行變化和改變。因此，應(yīng)將前述實(shí)施本發(fā)明的最佳方式認(rèn)為實(shí)際上是說明性的，并且不作為如在所附的權(quán)利要求中列出的本發(fā)明的范圍和精神的限制。權(quán)利要求1.通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含(a)濃度小于或等于大約2g/l的氯離子；和(b)濃度大于或等于大約0.25g/L的鉀離子；其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA每109個(gè)細(xì)胞。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類是隱曱藻屬的。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述微藻類是寇氏隱曱藻菌種的。4.權(quán)利要求1的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約1.0g/l。5.權(quán)利要求l的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約0.3g/l。6.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.4g/L。7.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.8g/L。8.權(quán)利要求1的方法，其中鉀離子的來源是硫酸鉀。9.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步包括濃度為大約1g/L至大約8g/l的鈉離子。10.權(quán)利要求9的方法，其中鈉離子的濃度為大約1.5g/l至大約5g/L。11.權(quán)利要求9的方法，其中鈉離子的來源是硫酸鈉。12.權(quán)利要求9的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L和鈉離子的濃度為大約3.2g/L。13.通過權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的生物量。14.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約O.lOgDHA每109個(gè)細(xì)月包。15.權(quán)利要求1的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.20gDHA每109個(gè)細(xì)月包。16.權(quán)利要求l的方法，還包括從所述微藻類中回收含DHA的脂質(zhì)。17.通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)曱藻綱的異養(yǎng)的微藻類產(chǎn)生二十二碳六烯酸(DHA)的方法，其中所述的培養(yǎng)基包含(a)濃度小于或等于大約2g/l的氯離子；(b)濃度大于或等于大約(USg/L的鉀離子；和(c)鈉:鉀比例為小于或等于大約27:1重量比的鈉離子；其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.04gDHA每109個(gè)細(xì)胞。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類是隱甲藻屬的。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類是寇氏隱曱藻菌種的。20.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的來源是硫酸鉀。21.權(quán)利要求17的方法，其中鈉離子的來源是硫酸鈉。22.權(quán)利要求17的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約1.0g/l。23.權(quán)利要求17的方法，其中氯離子的濃度小于或等于大約0.3g/1。24.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.4g/L。25.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度大于或等于大約0.8g/L。26.權(quán)利要求17的方法，其中鈉:鉀比例為小于或等于大約15:1重量比。27.權(quán)利要求17的方法，其中鉀離子的濃度為大約0.8g/L而鈉:鉀比例為大約4:1重量比。28.通過權(quán)利要求17的方法產(chǎn)生的生物量。29.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.10gDHA每109個(gè)細(xì)胞。30.權(quán)利要求17的方法，其中所述微藻類產(chǎn)生至少大約0.20gDHA每109個(gè)細(xì)月包。31.權(quán)利要求17的方法，還包括從所述微藻類中回收含DHA的脂質(zhì)。32.選擇耐受低pH的曱藻綱的異養(yǎng)微藻類的方法，其包括將所述的微藻類在低pH培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)直到DHA的產(chǎn)量大于或等于大約0.04gDHA每109個(gè)細(xì)胞。33.權(quán)利要求32的方法，其中pH小于或等于大約6。34.權(quán)利要求32的方法，其中pH小于或等于大約5。35.權(quán)利要求32的方法，其中pH小于或等于大約4.5。36.通過權(quán)利要求32的方法產(chǎn)生的生物量。全文摘要本發(fā)明公開了通過海洋微生物，包括異養(yǎng)的海洋溝鞭藻類隱甲藻，使用低水平的氯離子產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法。具體地，通過控制鈉離子和鉀離子水平在低氯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)海洋微生物增加高度不飽和的脂肪酸產(chǎn)量的方法。本發(fā)明也涉及通過海洋生物在低pH水平產(chǎn)生高度不飽和的脂肪酸的方法，并包括產(chǎn)生耐受低pH的菌株的方法。文檔編號(hào)C12N1/12GK101386873SQ20081016613公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2004年10月1日優(yōu)先權(quán)日2003年10月2日發(fā)明者喬恩·漢森,保羅·W·貝倫斯,柯克·阿普特,約瑟夫·W·法伊弗第三,約翰·M·湯普森,詹姆斯·C·利普邁耶,詹姆斯·P·溫,賈奧亞德·菲克塔里申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)公司