專利名稱：一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的制作方法
專利說明一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌 所屬技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種微生物菌株，特別是一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌菌株。
背景技術(shù) 膽汁酸(bile acid)是一類結(jié)構(gòu)相似化合物的統(tǒng)稱。根據(jù)來源上分類可分為初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸兩大類。初級(jí)膽汁酸是由肝細(xì)胞以膽固醇為原料直接合成，包括膽酸和鵝脫氧膽酸。初級(jí)膽汁酸在腸道中受細(xì)菌作用生成的膽汁酸，稱為次級(jí)膽汁酸(secondary bile acid)，包括脫氧膽酸和石膽酸。大部分進(jìn)入腸內(nèi)的初級(jí)和次級(jí)膽汁酸可以被小腸和大腸分別吸收。由于膽汁酸的主要代謝過程是由肝臟完成的，因此肝功能的異常會(huì)影響膽汁酸的代謝?，F(xiàn)代臨床研究表明，以末梢血管中血液膽汁酸的濃度變化作為衡量肝功能的一個(gè)指標(biāo)是非?？煽康?。早期膽汁酸的測定方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法和放射免疫法等。由于這些方法測定所需樣品量大，測定時(shí)間長，使臨床應(yīng)用受到了限制。為此，近年來人們提出了以酶促反應(yīng)測定膽汁酸的方法，擬解決以上測定方法中存在的問題。
睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)是一種革蘭氏陰性菌，類固醇誘導(dǎo)下會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)多種羥類固醇脫氫酶，其中之一為3α-羥類固醇脫氫酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase，簡稱3α-HSD)。睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD酶可作用于多種類固醇基質(zhì)，可逆地催化C19-27的類固醇3位羥基/酮基的氧化還原反應(yīng)。醫(yī)學(xué)上，用3α-HSD酶進(jìn)行血液中總膽汁酸(total bile acid，TBA)的測定。3α-HSD酶主要有兩個(gè)來源，一是通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)重組3α-HSD酶，二是直接從睪丸酮叢毛單胞菌中提取天然3α-HSD酶。重組3α-HSD酶由于酶活性低下，因此將其應(yīng)用于TBA臨床測定還未見報(bào)道。因此，目前TBA測定中所用的工具酶3α-HSD均是從睪丸酮叢毛單胞菌中直接提取而來的。然而，自然條件下睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD酶的表達(dá)量低，在經(jīng)多步層析和制備性凝膠電泳技術(shù)純化后，酶得率低下，這使得直接從細(xì)菌中分離的天然3α-HSD酶價(jià)格昂貴，在一定程度上限制了TBA測定的臨床推廣。
因此，應(yīng)用生物技術(shù)手段對(duì)細(xì)菌進(jìn)行定向調(diào)控，提高睪丸酮叢毛單胞菌3α-HSD酶的表達(dá)量，勢必可以解決3α-HSD酶得率低下的問題，對(duì)降低醫(yī)療成本，解決3α-HSD酶依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于應(yīng)用DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮從毛單胞菌進(jìn)行定向調(diào)控，構(gòu)建高表達(dá)3α-HSD酶的睪丸酮叢毛單胞菌工程菌。
本發(fā)明的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌(Comamonas testosteroniAMP8，簡稱工程菌AMP8)，已于2008年1月25日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2365。保藏單位的地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的菌體呈桿狀，大小為0.8μm×1.5μm，革蘭氏染色陰性，偏端叢生鞭毛，運(yùn)動(dòng)。
工程菌AMP8(CGMCC No.2365)是應(yīng)用DNA重組技術(shù)將含tac強(qiáng)啟動(dòng)子的pK18載體整合到睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroniATCC11996，簡稱C.test)的teiR基因上游表達(dá)調(diào)控區(qū)，篩選獲得的高效表達(dá)3α-HSD酶的菌株。
本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)，其特征在于 ①基因組DNA中具有tac啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQ ID NO1中所示的堿基序列； ②基因組DNA中具有pK18序列，該序列為序列表中SEQ ID NO2中所示的堿基序列。
③具有卡那霉素抗性。
所述的tac啟動(dòng)子指Amann et al.構(gòu)建的啟動(dòng)子，pK18質(zhì)粒指Pridmore構(gòu)建的質(zhì)粒載體，均由市場購得。
本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的構(gòu)建方法如下 ①C.test teiR基因的克??； ②含有tac強(qiáng)啟動(dòng)子的同源重組基因打靶載體pKtac2-teiR的構(gòu)建； ③同源重組基因打靶載體電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌C.test； ④工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot篩選驗(yàn)證； ⑤不同培養(yǎng)條件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表達(dá)； ⑥工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表達(dá)穩(wěn)定性檢測。
本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的培養(yǎng)方法如下將工程菌AMP8(CGMCC No.2365)接種于添加了60μg/mL氨芐青霉素和30μg/mL卡那霉素的LB或M8培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)8～12小時(shí)。
所述LB培養(yǎng)基為常用培養(yǎng)基，可在市場購得。
所述的M8無機(jī)鹽培養(yǎng)基的配制方法如下取12.8g Na2HPO4.7H2O，3g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl，2mL 1M MgSO4，0.1mL 1M CaCl2，0.2g Yeast Extact，加蒸餾水至1L，用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0，120℃條件下滅菌18分鐘，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)在不同培養(yǎng)條件下均能提高3a-HSD酶的表達(dá)量。如表1所示，工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3a-HSD酶表達(dá)量最高可達(dá)野生型菌株3a-HSD酶表達(dá)量的20倍，最低可達(dá)1.2倍，增加的幅度在1.2-20倍之間。本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)可作為天然3a-HSD酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種，可以解決3α-HSD酶得率低下的問題，對(duì)降低醫(yī)療成本，解決3α-HSD酶依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。
表1 工程菌AMP8與野生型菌株不同培養(yǎng)條件下3a-HSD酶表達(dá)量檢測



圖1.pKtac2-teiR的Xba I和Kpn I酶切驗(yàn)證圖譜。其中M為DNA marker，1為pKtac2-teiR雙酶切電泳條帶。
圖2.AMP8(CGMCC No.2365)的southern blot檢測。其中1為野生型睪丸酮叢毛單胞菌C.test，2為睪丸酮叢毛單胞菌工程菌AMP8(CGMCCNo.2365)，3為陽性對(duì)照pKtac2，4為ddH2O。
圖3.AMP8(CGMCC No.2365)與野生型菌株C.test在不同培養(yǎng)條件下3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量檢測。其中橫坐標(biāo)1為LB培養(yǎng)基，2為含0.27mg/L睪丸酮的LB培養(yǎng)基，3為含0.2mg/L膽固醇的LB培養(yǎng)基，4為含5g/L醋酸鹽的M8培養(yǎng)基，5為含0.27mg/L睪丸酮的M8培養(yǎng)基，6為含0.2mg/L膽固醇的M8培養(yǎng)基?？v坐標(biāo)為3α-HSD酶蛋白在細(xì)菌總蛋白中的含量(單位μg·mg-1)。
圖4.AMP8的穩(wěn)定性檢測。其中縱坐標(biāo)為3α-HSD酶蛋白在細(xì)菌總蛋白中的含量(單位μg·mg-1)，橫坐標(biāo)數(shù)值為培養(yǎng)的天數(shù)。
具體實(shí)施例 為了充分公開本發(fā)明的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，以下結(jié)合實(shí)施例加以說明。
實(shí)施例一、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的構(gòu)建方法 睪丸酮叢毛單胞菌工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的構(gòu)建方法，包括以下步驟 1、C.test teiR基因的克隆 參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法從過夜培養(yǎng)的C.test中提取菌體的總DNA，做為PCR擴(kuò)增模板。以C.test的染色體DNA為模板，根據(jù)teiR基因序列設(shè)計(jì)引物(兩端引物中分別添加了Xba I和Kpn I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基)，引物由上海生物工程有限公司合成。用大連TaKaRa公司的Ex Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增teiR基因。
Primer1(+)(正向引物)5’-GCTCTAGAATGTGCCCATATTTCGACACC-3’； Primer2(-)(反向引物)5’-TCGGGGTACCTCACTTGTTCCCCAGCCA-3’。
PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，用TaKaRa公司的PCR FragmentRecovery Kit回收目的片斷。
2、含有tac強(qiáng)啟動(dòng)子的同源重組基因打靶載體pKtac2-teiR的構(gòu)建 將質(zhì)粒pBBtac12以Xba I和Sma I進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳回收tac啟動(dòng)子，然后與Xba I、Sma I酶切后的pK18在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，獲得pKtac2質(zhì)粒。所述tac啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQ ID NO1中所示的堿基序列；所述pK18，其序列為序列表中SEQID NO2中所示的堿基序列。
將質(zhì)粒pKtac2和teiR基因的PCR回收產(chǎn)物分別以Xba I和Kpn I酶進(jìn)行雙酶切后，T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(由市場購得)，轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，挑選單克隆進(jìn)行液體擴(kuò)大繁殖。用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，Xba I和Kpn I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。如圖1所示，重組質(zhì)粒酶切后有兩條條帶，說明同源重組基因打靶載體pKtac2-teiR構(gòu)建正確。
3、同源重組基因打靶載體電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌C.test 將培養(yǎng)的C.test細(xì)菌細(xì)胞沉淀下來，用10％冰冷的甘油制備感受態(tài)細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μL pKtac2-teiR質(zhì)粒，加入190μL H2O，10μL 5M NaCl和450μL無水乙醇，13,000r/min離心10min；去除上清，加入450μL70％酒精，13,000r/min離心5min，去除上清液；加入450μL 70％酒精，13,000r/min離心5min，去除上清液；將Eppendorf管倒扣在濾紙上干燥。
取100μL感受態(tài)細(xì)胞加入到干燥的質(zhì)粒pKtac2-teiR中，混合；將Eppendorf管放在冰上5min；然后將感受態(tài)細(xì)胞倒入電擊杯中(1mm寬)；將電擊杯放入冰上預(yù)冷5min；然后放入電融合儀的狹縫中，500V，5次；取出電擊杯，加入1mL LB培養(yǎng)基，30℃，110r/min振蕩培養(yǎng)1小時(shí)；將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布在含抗生素(Amp 60μg/mL，Kan 30μg/mL)的固體培養(yǎng)基上，在30℃的生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。
4、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot篩選驗(yàn)證 以限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切質(zhì)粒pK18作為探針，提取PCR檢測陽性的細(xì)菌染色體DNA，用EcoR I進(jìn)行酶切，酶切的產(chǎn)物進(jìn)行1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，電壓60V。以pKtac2的EcoR I酶切產(chǎn)物作為陽性對(duì)照，ddH2O作為陰性對(duì)照進(jìn)行Southern blot檢測(試劑盒為Roche公司產(chǎn)品)。如圖2所示，陽性對(duì)照及工程菌AMP8(CGMCC No.2365)有陽性條帶，其余沒有條帶，說明已經(jīng)成功地將tac啟動(dòng)子整合到teiR基因上游。
5、不同培養(yǎng)條件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表達(dá) 工程菌AMP8(CGMCC No.2365)分別接種于LB培養(yǎng)基、含0.27mg/L睪丸酮的LB培養(yǎng)基、含0.2mg/L膽固醇的LB培養(yǎng)基、含0.27mg/L睪丸酮的M8培養(yǎng)基、含0.2mg/L膽固醇的M8培養(yǎng)基、含5g/L醋酸鹽的M8培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min。提取細(xì)菌過夜培養(yǎng)物的總蛋白，ELISA檢測1mg/mL總蛋白中的3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量。如圖3所示，不同培養(yǎng)條件下的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量均比相應(yīng)條件下的野生型菌株C.test的表達(dá)量高。
細(xì)菌總蛋白的提取方法如下(1)取3mL過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，13,000r/min，離心沉淀細(xì)菌，去掉上清液；(2)用PBS洗三遍，最后加入200μL的PBS溶液重懸沉淀；(3)加入1μL的溶菌酶(溶菌酶的濃度為5mg/mL)；(4)該溶液經(jīng)過3次(每次30min以上)反復(fù)凍融；(5)經(jīng)反復(fù)凍融的溶液在13,000r/min，20min，取上清夜進(jìn)行蛋白定量。
6、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表達(dá)穩(wěn)定性檢測 工程菌AMP8(CGMCC No.2365)每天傳代培養(yǎng)一次，連續(xù)傳代培養(yǎng)50d，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min。每隔5d，取3mL傳代培養(yǎng)的工程菌，提取細(xì)菌的總蛋白ELISA檢測1mg/mL總蛋白中的3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量。如圖4所示，工程菌AMP8(CGMCC No.2365)每毫克蛋白中3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量均穩(wěn)定在25μg左右，說明工程菌AMP8(CGMCC No.2365)是可以穩(wěn)定遺傳的，可作為3a-HSD酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種。
二、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶的發(fā)酵培養(yǎng) 將-80℃保存的工程菌AMP8接種于LB固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h。將菌落轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)12h。以0.1％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(20mL裝液量/100mL錐形瓶)，30℃、200r/min培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期。發(fā)酵液離心收集菌體，菌體沉淀復(fù)溶于1M Tris-Cl中超聲波裂解細(xì)菌，利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定3α-HSD酶蛋白的表達(dá)量。按照此發(fā)酵條件，經(jīng)檢測3α-HSD酶蛋白的產(chǎn)量可以達(dá)到25μg/mg，產(chǎn)量比野生型菌株提高了10倍。
LB培養(yǎng)基為常用培養(yǎng)基，可在市場購得。
種子培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，12.8g/L Na2HPO4.7H2O，3g/L KH2PO4，pH 7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，12.8g/L Na2HPO4.7H2O，3g/L KH2PO4，2.5g/L steroid。
Untitled2.ST25
SEQUENCE LISTING
<110>福建農(nóng)林大學(xué)
<120>一種睪丸酮從毛單胞菌工程菌
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>244
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>1
<210>2
<211>2661
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>權(quán)利要求
1、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于該菌為睪丸酮叢毛單胞菌工程菌(Comamonas testosteroni AMP8)CGMCC No.2365。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于
①基因組DNA中具有tac啟動(dòng)子，其序列為序列表中SEQ ID NO1中所示的堿基序列；
②基因組DNA中具有pK18序列，該序列為序列表中SEQ ID NO2中所示的堿基序列。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌，其特征在于具有卡那霉素抗性。
4、一種睪丸酮叢毛單胞菌工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建步驟如下
①C.test teiR基因的克??；
②含有tac強(qiáng)啟動(dòng)子的同源重組基因打靶載體pKtac2-teiR的構(gòu)建；
③同源重組基因打靶載體電穿孔轉(zhuǎn)化細(xì)菌C.test；
④工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot篩選驗(yàn)證；
⑤不同培養(yǎng)條件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3 α-HSD酶表達(dá)；
⑥工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3 α-HSD酶表達(dá)穩(wěn)定性檢測。
全文摘要
本發(fā)明通過DNA重組技術(shù)對(duì)睪丸酮叢毛單胞菌進(jìn)行定向調(diào)控，從而獲得高表達(dá)3α-HSD酶的睪丸酮叢毛單胞菌工程菌AMP8(CGMCCNo.2365)，本發(fā)明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)可作為天然3a-HSD酶發(fā)酵生產(chǎn)的菌種，在不同培養(yǎng)條件下均能提高3a-HSD酶的表達(dá)量，可以解決3α-HSD酶得率低下的問題，對(duì)降低醫(yī)療成本，解決3α-HSD酶依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101434929SQ200810072459
公開日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日
發(fā)明者潘大仁, 陳建秋, 周以飛 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)