專(zhuān)利名稱(chēng)：：利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒別食用菌的方法，確切地說(shuō)是一種利用分子標(biāo)記技術(shù)快速區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法。
背景技術(shù)：
：鳳尾燕(plcuroluspulmonarius(Fr，)Sing.)是熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種食用菌。又稱(chēng)印度鮑魚(yú)菇、環(huán)柄側(cè)耳等。鳳尾菇栽培粗放，生產(chǎn)周期短，出菇溫度范圍廣。1974年印度首先開(kāi)始人工栽培鳳尾菇。1980年鳳尾菇人工栽培技術(shù)引入我國(guó)，現(xiàn)分布各省栽培。在不少有關(guān)食用菌產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)或栽培技術(shù)介紹的文章和書(shū)籍中，常見(jiàn)鳳尾菇與糙皮側(cè)耳歸在一起。鳳尾菇和糙皮側(cè)耳在子實(shí)體的形態(tài)上難以區(qū)分，雖然兩者在菌蓋顏色深淺、厚度，擔(dān)孢子大小有細(xì)微的差別，鳳尾菇的生長(zhǎng)速度比糙皮側(cè)耳的快些，但僅憑這些特點(diǎn)仍然很難區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳；鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的一個(gè)較顯著的差別是兩者在野外發(fā)生的季節(jié)不同，在歐洲和北美糙皮側(cè)耳通常出現(xiàn)在深秋和冬季，而鳳尾菇的子實(shí)體則出現(xiàn)在仲夏和早秋。所以在生產(chǎn)上僅靠子實(shí)體形態(tài)判別它們，就可能引起菌種的混淆。由于鳳尾菇和糙皮側(cè)耳在子實(shí)體的形態(tài)上難以區(qū)分，因此，探索快速鑒別鳳尾菇真?zhèn)蔚姆椒?，主要是探索快速有效地鑒別鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用分子標(biāo)記技術(shù)快速區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，以免在科研和生產(chǎn)上引起混亂，造成不必要的損失。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；其特征在于1、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生:在48plPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入lplHaeIII酶的酶切Buffer,0.31filHaeIII酶，2.2~2.8[ilddH20，37。C水浴410h;所述Haein酶的酶切Buffer成份為100mmoL/LTris-HCl,pH7.5，100mmoL/LMgCl2，10mmoL/LDithiothreitol和500mmoL/LNaCl;2、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取HaeIII酶的酶切產(chǎn)物lOuL，與2"L上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上，于0.5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經(jīng)電泳檢測(cè)，分子量為425435bp和175185bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾燕菌株的標(biāo)志；分子量為235245bp和175200bp的DNA標(biāo)記條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志。所述上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán)，40%蔗糖。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，該方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高、容易判斷、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。1、檢測(cè)時(shí)間短該檢測(cè)所需時(shí)間短，一般只需要23天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少2個(gè)月的時(shí)間，形態(tài)學(xué)檢測(cè)需要綜合分析菌絲體階段與子實(shí)體階段的微觀與宏觀的特征，所需時(shí)間與出菇試驗(yàn)相當(dāng)。2、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好本發(fā)明以基因組DNA為材料，DNA是穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，是區(qū)分物種的本質(zhì)表現(xiàn)所在，而DNA序列中的保守序列更是穩(wěn)定，是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的分子標(biāo)記，不易受外界因素等的影響，因此以保守序列開(kāi)發(fā)的鑒定技術(shù)準(zhǔn)確性高，有很強(qiáng)的重復(fù)性；然而常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)容易受到環(huán)境條件、鑒定者的知識(shí)水平等因素影響，已經(jīng)造成判斷上的混亂。3、容易判斷本發(fā)明的判斷依據(jù)是在瓊脂糖電泳上出現(xiàn)的DNA標(biāo)記條帶，DNA標(biāo)記條帶少、清晰，一目了然，不會(huì)出現(xiàn)像常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)上模棱兩可的現(xiàn)象，而給判斷造成誤差。圖1為HaeIII酶的酶切電泳圖；1M為泳道編兮；右側(cè)的數(shù)字表示DNA片段的分子量。圖中，15泳道和78泳道所示的分子量為430bp和182bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾菇菌株的標(biāo)志；6和9泳道所示的分子量為243bp和190bp的DNA標(biāo)記條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志。具體實(shí)施方法為了充分公開(kāi)本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾燕與糙皮側(cè)耳的方法，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。實(shí)施例一利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，具體包括以下步驟一、菌絲培養(yǎng)與收集(一)若測(cè)試菌株保藏時(shí)間小于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)按如下方法進(jìn)行1、用接種耙耙碎含鳳尾菇菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250ml三角瓶，含100mlPDA液體培養(yǎng)基中；2、放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速90130r/min培養(yǎng)710d;3、用紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；4、稱(chēng)取0.51.3g菌絲,用濾紙包好，保存于-2(TC備用。(二)若測(cè)試菌株保藏時(shí)間大于6個(gè)月，則菌絲培養(yǎng)采用如下方法1、取鳳尾菇菌種豆塊大小轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，25"培養(yǎng)710天；2、用接種耙耙碎含菌絲的PDA培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接入250ml三角瓶，含100mlPDA液體培養(yǎng)基中；3、放置在25。C搖床上，轉(zhuǎn)速卯130r/min培養(yǎng)710d;4、用紗布過(guò)濾培養(yǎng)好的菌絲，蒸餾水沖洗，濾紙吸干；5、稱(chēng)取0.51.3g菌絲,用濾紙包好，保存于-2(TC備用。二、基因組DNA的提取，所述基因組DNA可以從菌株的菌絲體或子實(shí)體中提取。1、取保存?zhèn)溆玫木zl包或0.51.3g的子實(shí)體，放入研缽，加入液氮迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入7ml的離心管；2、加2.5mL65。C預(yù)熱的抽提液，同時(shí)加入50pl巰基乙醇，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀；3、65。C水浴lh，每隔10min振蕩1次；4、加入2.5ml的氯仿異戊醇混勻，除去蛋白質(zhì)；5、8000r/min，4。C離心10min，取上清到7ml管；6、加1/5體積65。C預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入2.5ml的氯仿異戊醇混勻；7、10000r/min，4。C離心10min，取上清；8、加入2.5ml65。C預(yù)熱的CTAB沉淀液，顛倒混勻，65。C水浴lh至沉淀可見(jiàn)或可過(guò)夜；9、12000r/min，4。C離心10min后，小心去除上清液；10、用0.5mlTE溶液或無(wú)菌水溶解沉淀10min;11、加入0.25ml飽和酚和0.25mL氯仿異戊醇，混勻；12、12000r/min，4。C離心10min，取上清，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻；13、放置-2(TC冰箱lh或過(guò)夜；14、12000r/min，4。C離心10min，棄上清；15、可選做步驟加O.51mL70%乙醇洗滌，12000r/min，4°C離心8min，棄上清；重復(fù)一次16、自然風(fēng)干沉淀，用30^TE溶液或無(wú)菌去離子水溶解沉淀，-2CTC保存?zhèn)溆?。三、ITS-PCR擴(kuò)增ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系1fil含量1(K40ng的DNA，2.5pi10XPCRbuffer,2pl濃度為2.5mmol/L的dNTP，1)il濃度為10Umol/L的ITS1,1jil濃度為10mol/L的ITS4，0.3pl酶活為5U/ul的TaqDNAPolymerase,17.2jilddH20。ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序94。C預(yù)變性5min;94。C變性45s，55。C退火45s，72。C延伸1min，35個(gè)循環(huán);72。C延伸10min。四、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生6pi擴(kuò)增產(chǎn)物，1[ilHaeIII酶的酶切Buffer,0.31plHaeHI酶，2.22.8ddH20，37。C水浴4h。五、酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取HaeIII酶的酶切產(chǎn)物lO(il，與2pl上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2%的瓊脂糖凝膠上，同時(shí)使用DL2000的DNAMARK作為片段大小的參照，于0.5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳4560min，電泳結(jié)束后，用EB染色，然后在凝膠成像儀上照相。電泳圖上顯示15泳道和78泳道所示的分子量為430bp和182bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾菇菌株的標(biāo)志；6和9泳道所示的分子量為243bp和190bp的DNA標(biāo)記條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志。本發(fā)明的利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，選用的HaeIII酶，是應(yīng)用DNAMAN軟件庫(kù)中的180種酶，對(duì)食用菌側(cè)耳屬基因組的保守序列進(jìn)行軟件酶切分析后，獲得的可用于準(zhǔn)確區(qū)分鳳尾菇菌種和糙皮側(cè)耳菌種的酶。本發(fā)明所使用的主要試劑如下(所有化學(xué)試劑均為分析純)1、CTAB抽提液100mmol/LTris-HCl，2.0%CTAB，20咖ol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，pH8.0;2、CTAB沉淀液50咖ol/LTris-HC1，1.0。/。CTAB，10咖ol/LEDTA，pH8.0;3、CTAB/NaCl:0.7mol/LNaCl，10%CTAB;4、TE緩沖液10畫(huà)1/LTrisHC1，1聽(tīng)1/LEDTA;5、0.5XTBE:44.5畫(huà)1/LTris，50畫(huà)1/LHB03、1咖ol/LEDTA;6、上樣緩沖液0.1%溴酚藍(lán),40%蔗糖；7、EB:10mg/ml溴化乙錠;8、ITS1:5,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，；9、ITS4:5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；10、PCR擴(kuò)增試劑及酶均購(gòu)自大連寶生物公司。本發(fā)明所使用的主要儀器如下SW-CJ-1FB型單人水平垂直兩用凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司手提式滅菌鍋上海三申HYG-A全溫?fù)u瓶柜太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)室冷凍離心機(jī)Sigma3K30PCR擴(kuò)增儀EppendorfAG22331Hamburg掌型離心機(jī)江蘇海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠Lx-100手掌型離心機(jī)凝膠成像系統(tǒng)TANON-2008表一9個(gè)鳳尾菇菌株信息<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例一的取樣來(lái)自全國(guó)鳳尾菇的主栽品種，共收集9個(gè)原生產(chǎn)使用的鳳尾菇菌株，詳見(jiàn)菌株信息見(jiàn)表一。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)所述9個(gè)菌株進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)，結(jié)果如下采用1對(duì)ITS引物對(duì)鳳尾菇菌株進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增后加入HaeIII酶酶切，經(jīng)電泳檢測(cè)，如圖1所示，15泳道和78泳道所示的分子量為430bp和182bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾菇菌株的標(biāo)志；對(duì)應(yīng)表一所列的菌株中，序號(hào)15的菌株鳳杰1號(hào)、鳳尾菇、鳳831、鳳尾PF1、鳳尾5號(hào)，為鳳尾菇菌株；序號(hào)7和8的菌株高溫鳳尾菇、327，為鳳尾菇菌株。然而，6和9泳道所示的分子量為243bp和190bp的DNA標(biāo)記條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志；其所對(duì)應(yīng)的序號(hào)6和9的菌株巴西鳳平和鳳尾菇，實(shí)際為糙皮側(cè)耳，并不是鳳尾菇，只是在生產(chǎn)上被誤當(dāng)作鳳尾菇使用，必須給予糾正。目前，利用本發(fā)明的方法已對(duì)285個(gè)收集自全國(guó)各地的糙皮側(cè)耳生產(chǎn)用菌種及科研用菌種進(jìn)行鑒定，檢測(cè)出20個(gè)鳳尾菇菌株，糾正了生產(chǎn)和科研用的糙皮側(cè)耳菌株與鳳尾菇菌株相互混淆現(xiàn)象。權(quán)利要求1、一種利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；其特征在于(1)特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生在4～8μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1μlHaeIII酶的酶切Buffer，0.3～1μlHaeIII酶，2.2～2.8μlddH2O，37℃水浴4～10h；(2)酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取HaeIII酶的酶切產(chǎn)物10μL，與2μL上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2％的瓊脂糖凝膠上，于0.5XTBE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳；經(jīng)電泳檢測(cè)，分子量為425～435bp和175～185bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾菇菌株的標(biāo)志；分子量為235～245bp和175～200bp的DNA標(biāo)記條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分鳳尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，其特征在于(1)特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生6pl擴(kuò)增產(chǎn)物，1plHaein酶的酶切Buffer,0.7plHaeIII酶，2.6ddH20，37°C水浴4h;(2)酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)經(jīng)電泳檢測(cè)，分子量為430bp和182bp的DNA標(biāo)記條帶，是鳳尾燕菌株的標(biāo)志；分子量為243bp和190bp的2個(gè)條帶，是糙皮側(cè)耳菌株的標(biāo)志。全文摘要利用分子標(biāo)記技術(shù)區(qū)分風(fēng)尾菇與糙皮側(cè)耳的方法，包括菌絲的培養(yǎng)與收集、基因組DNA的提取、ITS-PCR擴(kuò)增、特異酶切片段標(biāo)記的產(chǎn)生和酶切產(chǎn)物的電泳檢測(cè)。本發(fā)明的方法與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，只需2-3天時(shí)間；以基因組DNA為材料，準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好；檢測(cè)結(jié)果一目了然，容易判斷等優(yōu)點(diǎn)，有效糾正了生產(chǎn)和科研用的糙皮側(cè)耳菌株與鳳尾菇菌株相互混淆現(xiàn)象。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101392288SQ20081007213公開(kāi)日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年11月18日優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日發(fā)明者劉新銳,吳小平,堅(jiān)朱,謝寶貴,鄧優(yōu)錦申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)