專利名稱：一種構建pROKⅡ植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物的制作方法
一種構建pROK II植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物 轉(zhuǎn)術領域本發(fā)明涉及一種植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物。
技術背景基因工程是定向改造植物的一個有效手段，隨著基因工程的發(fā)展，人們發(fā) 現(xiàn)單價基因的遺傳轉(zhuǎn)化，往往達不到預期改造植物的目標，通過同時轉(zhuǎn)化兩個 或多個具有協(xié)同作用的基因，可明顯提高轉(zhuǎn)基因的效果，因此雙價基因或多價 基因的遺傳轉(zhuǎn)化己經(jīng)成為目前基因工程發(fā)展的一個趨勢。pROKlI是植物基因工程中使用頻率較高的植物表達載體，因其具有組成 型35S啟動子和常用的多克隆位點，被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因領域。目前構建pROK II雙價載體的方法需要通過中間載體更換酶切位點才能實現(xiàn)，因此存在步驟繁 瑣、構建周期長的問題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決目前構建pROKlI雙價載體的方法需要通過中 間載體更換酶切位點才能實現(xiàn)，步驟繁瑣、構建周期長的問題，而提供的一種 構建pROKII植物雙價表達載體的方法。構建pROKlI植物雙價表達載體的方法按以下步驟實現(xiàn) 一、分別構建單 價載體A/pROKII和B/pROK II; 二、以單價A/pROKII質(zhì)粒為模板、以P35S-S1 和Tnos-Al為引物進行PCR， PCR產(chǎn)物再用I酶切，得到兩邊帶有五co及 I粘末端的35S-A-Tnos片段；三、Eco及I酶切單價載體B/pROKl1 ，得到兩 邊帶有五co及I粘末端的開環(huán)B/pROKlI;四、將步驟二和步驟三得到的基因 片段進行酶連接，即得到pROKlI植物雙價表達載體；步驟二中引物P35S-S1 序列為5，-GGCOMHQCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3，，引物Tnos-Al序 列為5， -GGCOMEIQCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3，。構建pROKlI植物雙價表達載體所使用的通用引物為P35S-S1和 Tnos-Al ， 通 用 引 物 P35S-S1 序 列 為 5， -GGC^MIIQCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3，， 通用引物Tnos-Al序列 為5，-GGC^MII￡CCGATCTAGTAACATAGATGAC-3，。本發(fā)明方法與目前構建pROK II雙價載體的方法相比較，減少了連接和轉(zhuǎn)
化的次數(shù)具有步驟少、操作簡單、構建周期短和不必更換酶切位點的優(yōu)點，能
夠明顯地提高工作效率。
本發(fā)明方法構建的pROKlI植物雙價載體經(jīng)PCR檢測和五coi I酶切鑒定
均為陽性；對本發(fā)明方法構建的pROKlI植物雙價載體中的A和B基因完整 表達框測序證明，連接入載體的外源DNA序列準確，無堿基突變現(xiàn)象發(fā)生。 將本發(fā)明方法構建的pROK II植物雙價載體與EHA105農(nóng)桿菌菌株配伍轉(zhuǎn)化煙 草，分子檢測表明雙價基因能夠隨機插入煙草基因組，且能夠在轉(zhuǎn)錄水平表達。 說明用本發(fā)明方法構建的pROKlI植物雙價載體能夠應用于轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`，從而 快速有效地實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入兩個基因的目標。


圖1是具體實施方式
七轉(zhuǎn)雙價基因煙草基因組水平PCR檢測凝膠電泳結(jié) 果圖，圖2是具體實施方式
七雙價基因煙草轉(zhuǎn)錄水平RT-PCR檢測凝膠電泳結(jié) 果圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式構建pROKlI植物雙價表達載體的方法按以 下步驟實現(xiàn) 一、分別構建單價載體A/pROKII和B/pROKlI; 二、以單價 A/pROKlI質(zhì)粒為模板、以P35S-S1禾Q Tnos-Al為引物進行PCR， PCR產(chǎn)物 再用I酶切，得到兩邊帶有I粘末端的35S-A-Tnos片段；三、五co及 I酶切單價載體B/pROK11 ，得到兩邊帶有&oi I粘末端的開環(huán)B/pROKlI; 四、將步驟二和步驟三得到的基因片段進行酶連接，即得到pROKlI植物雙價 表達載體；步驟二中引物 P35S-S1 序列為 5，-GGCeMEI￡CTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3，，引物Tnos-Al序列為5，-GGC0MEIQCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3， o
本實施方式構建pROK II植物雙價表達載體被命名為 "P35S-B-Tnos-P35S-A-Tnos/pROKII，，載體。
根據(jù)植物常用表達載體pROK2 、 pBI-121 、 PCAMBIA-1301和 PCAMBIA-2300的基因序列比對結(jié)果可知各表達載體間35S啟動子及Tnos(轉(zhuǎn) 錄終止子)序列的一致性很高，因此本實施方式設計一致性引物P35S-S1和 Tnos-Al 。本實施方式步驟二中引物(P35S-S1和Tnos-Al)的下劃線部分為EcoR I內(nèi)切酶位點。
本實施方式步驟二中以單價A/pROKH質(zhì)粒為模板的PCR體系為2(^L， 由2pL 10 xTaqBuffer、0.5jiL濃度為10mmol/L的dNTP、l^L濃度為10mmol/L 的引物P35S-S1、 lpL濃度為1Ommol/L的引物Tnos-Al、 0.5pL的A/pR0Kl1 、 0.5pL濃度為2.5U/nL的TaqDNA聚合酶(高保真)和余量重蒸餾水的組成； PCR反應條件預變性94°C 5min，變性94°C 30s,退火57°C 30s，延伸72 °C 2min，共35個循環(huán)，延伸72°C 8min。
本實施方式中獲得的DNA片段用Promega公司生產(chǎn)的DNA膠回收試劑 盒進行純化、回收。
本實施方式中使用的藥品、試劑、酶、感受態(tài)細胞和質(zhì)粒等均容易購得， 若無特殊要求則濃度為產(chǎn)品標注濃度。本實施方式中的操作步驟參見試劑盒使 用操作手冊。
用本實施方式步驟一中得到的單價載體A/pROKII和B/pROKII分別轉(zhuǎn)化 E.coliTOPlO感受態(tài)細胞，并可進行單克隆擴大培養(yǎng)。
具體實施方式
二本實施方式與具體實施方式
一的不同點是單價載體 A/pROKlI中A基因為不帶有五coR I的基因片段。其它步驟及參數(shù)與實施方 式一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點是單價載體 B/pROKlI中B基因為不帶有五"及I的基因片段。其它步驟及參數(shù)與實施方 式一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中用 限制性內(nèi)切酶I和&c I對質(zhì)粒載體pROK II及C4iW9[紅蓼 (C72ewo_po(^ww (3附"rawdco/or Coste & Reyn)幾丁質(zhì)醇基因，GeneBank登陸號 D451.83]分別進行雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行連接，即得到單價載體 A/pROKlI;步驟一中用限制性內(nèi)切酶Xbal和Kpnl對質(zhì)粒載體pROKlI及 AGSrW (西伯利亞寥谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，GeneBank登陸號EU597480) 分別進行雙酶切，再用T4DNA連接酶進行酶連接，即得到單價載體B/pROK II 。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
本實施方式中質(zhì)粒載體pROKlI從大腸桿菌Co/Z-pROKlI中提取得到。本實施方式中的操作步驟參見試劑盒使用操作手冊。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟四中用 T4 DNA連接酶進行酶連接。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
本實施方式步驟四連接體系為20pL，由2pL 10 xT4 DNA連接酶Buffer、
400ng兩邊帶有￡co/ I粘末端的35S-A-Tnos片段、lOOng兩邊帶有5coR I粘 末端的開環(huán)B/pROKlI 、 lpL濃度為2.5U/^iL的T4 DNA連接酶和余量重蒸餾 水的組成。
兩邊帶有五coi I粘末端的35S-A-Tnos片段和兩邊帶有I粘末端的 開環(huán)B/pROKlI的濃度最好不低于50ng/pL。
具體實施方式
六本實施方式構建pROKlI植物雙價表達載體所使用的通 用引物為P35S-S1禾卩Tnos-Al ，通用引物P35S-S1序列為5' -GGCGAATTCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3'， 通用引物Tnos-Al序列 為5' -GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3'。
本實施方式通用引物(P35S-S1和Tnos-Al)的下劃線部分為EcoR I內(nèi) 切酶位點。
具體實施方式
七本實施方式構建pROKlI植物雙價表達載體的方法按以 下步驟實現(xiàn) 一、分別構建單價載體A/pROKlI和B/pROKlI; 二、以單價 A/pROKlI質(zhì)粒為模板、以P35S-S1和Tnos-Al為引物進行PCR， PCR產(chǎn)物 再用￡coR I酶切，得到兩邊帶有￡co/ I粘末端的35S-A-Tnos片段；三、 I酶i刀單價載體B/pROKlI ，得到兩邊帶有五coi I粘末端的開環(huán)B/pROKlI; 四、將步驟二和步驟三得到的基因片段進行酶連接，即得到pROKlI植物雙價 表達載體；步驟二中引物 P35S-S1 序列為 5，-GGC^MEIQCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3'， 引物Tnos-Al序列為5，畫 GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3 ，; 步驟一 中用限制性內(nèi)切 酶^YZ^ I和&c I對質(zhì)粒載體pROKlI及西伯利亞寥幾丁質(zhì)酶基因C4Af" (A 基因，基因長度約為810bp)分別進行雙酶切，再用T4DNA連接酶進行連接， 即得到單價載體A/pROKH ;步驟一中用限制性內(nèi)切酶J^a I和I對質(zhì)粒 載體pROKlI及西伯利亞蓼葡聚糖苷酶基因(B基因，基因長度約為 700bp)分別進行雙酶切，再用T4DNA連接酶進行酶連接，即得到單價載體 B/pROKlI;步驟四中用T4 dna連接酶進行酶連接，連接體系為20pL，由2mL10 xT4 DNA連接酶Buffer、 400ng兩邊帶有￡coA I粘末端的35S-A-Tnos片 段、iOOng兩邊帶有I粘末端的開環(huán)B/pROKlI 、 lpL濃度為2.5U/pL的 T4 DNA連接酶和余量重蒸餾水的組成。
用本實施方式方法構建的pROKlI植物雙價表達載體轉(zhuǎn)化￡.co/i TOP10 受態(tài)細胞，并Kan+抗性篩選挑取陽性克隆。用B基因的正向特異性引物和A 基因的反向特異性引物進行PCR檢測，PCR檢測35S-A-Tnos正向插入，電泳 檢測目的條帶長度應為B+260bp+800bp+A;用B基因的正向特異性引物和A 基因的正向特異性引物進行PCR檢測，PCR檢測35S-A-Tnos反向插入，電泳 檢測目的條帶長度應為B+260bp+800bp。 PCR檢測為陽性的克隆進一步提取 質(zhì)粒進行5co/ I酶切鑒定，酶切鑒定得到與35S-A-Tnos片段長度一致的條帶。 說明本實施方式方法構建的pROKlI植物雙價表達載體在宿主細胞內(nèi)成功表 達。
本實施方式方法構建的pROKII植物雙價載體經(jīng)PCR檢測和I酶切 鑒定均為陽性；對本發(fā)明方法構建的pROKlI植物雙價載體中的A和B基因 完整表達框測序證明，連接入載體的外源DNA序列準確，無堿基突變現(xiàn)象發(fā) 生。將本發(fā)明方法構建的pROKlI植物雙價載體與EHA105農(nóng)桿菌菌株配伍轉(zhuǎn) 化煙草，分子檢測表明雙價基因能夠隨機插入煙草基因組，并通過反轉(zhuǎn)錄PCR 證明兩個外源基因能夠在轉(zhuǎn)錄水平表達。說明用本發(fā)明方法構建的pROKlI植 物雙價載體能夠應用于轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`，從而快速有效地實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入兩個基 因的目標。
速擇6株轉(zhuǎn)雙價基因煙草植株(用本實施方式構建的pROKlI植物雙價表 達載體轉(zhuǎn)化的煙草)進行基因組水平PCR檢測和轉(zhuǎn)錄水平RT-PCR檢測。
DNA凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，圖1中"M"泳道標樣為Marker, "1 6"(包括a和b泳道)的泳道標樣為轉(zhuǎn)基因植株，"7"泳道標樣為陽性對照， "8"泳道標樣為水對照，"9"泳道標樣為陰性對照，"la 6a"泳道中是A基 因引物擴增產(chǎn)物條帶，"lb 6b"泳道中是B基因引物擴增產(chǎn)物條帶。6株轉(zhuǎn) 基因植株都在相應的位置得到了特異性擴增條帶，證明了外源基因(A基因和 B基因)已經(jīng)整合到煙草基因組中。
RNA凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示，圖1中"M"泳道標樣為Marker, "1 6"(包括a和b泳道)的泳道標樣為轉(zhuǎn)基因植株，"7"泳道標樣為陽性對照，"8"泳道標樣為水對照，"9"泳道標樣為陰性對照，"la 6a"泳道中是A基 因引物擴增產(chǎn)物條帶，"lb 6b"泳道中是B基因引物擴增產(chǎn)物條帶。外源基 因(A基因和B基因)在非轉(zhuǎn)基因煙草植株中沒有檢測到，而在6株轉(zhuǎn)基因 煙草植株中都得到表達。
以上檢測結(jié)果證明本實施方式方法構建的pROKlI植物雙價載體能夠應 用于轉(zhuǎn)基因?qū)嵺`、能快速有效地實現(xiàn)一次轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入兩個基因的目標。序列表
〈110〉東北林業(yè)大學
〈120> —種構建pROKII植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物
〈160〉. 2
<210〉 1 〈211〉 30 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈223〉根據(jù)植物常用表達載體35S啟動子設計的一致性通用引物P35S-S1。 〈400> 1
ggcgaattcc tgcaggtccc cagattagcc 30
〈210〉 2 〈211〉' 31 〈212〉腿 〈213〉人工序列
<220〉
〈223〉根據(jù)植物常用表達載體Tnos序列設計的一致性通用引物Tnos-Al。 〈400〉 2
ggcgaattcc cgatctagta acatagatga c 3權利要求
1、一種構建pROK II植物雙價表達載體的方法，其特征在于構建pROKII植物雙價表達載體的方法按以下步驟實現(xiàn)一、分別構建單價載體A/pROKII和B/pROK II；二、以單價A/pROK II質(zhì)粒為模板、以P35S-S1和Tnos-A1為引物進行PCR，PCR產(chǎn)物再用EcoR I酶切，得到兩邊帶有EcoR I粘末端的35S-A-Tnos片段；三、EcoR I酶切單價載體B/pROK II，得到兩邊帶有EcoRI粘末端的開環(huán)B/pROK II；四、將步驟二和步驟三得到的基因片段進行酶連接，即得到pROK II植物雙價表達載體；步驟二中通用引物P35S-S1序列為5’-GGCGAATTCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3’，通用引物Tnos-A1序列為5’GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3’。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種構建pROKlI植物雙價表達載體的方法， 其特征在于單價載體A/pROK11中A基因為不帶有I的基因片段。
3、 根據(jù)權利要求1所述的一種構建pROKlI植物雙價表達載體的方法， 其特征在于單價載體B/pROKlI中B基因為不帶有￡ 及I的基因片段。
4、 根據(jù)權利要求1所述的一種構建pROKlI植物雙價表達載體的方法， 其特征在于步驟一中用限制性內(nèi)切酶I和&c I對質(zhì)粒載體pROKlI及分別進行雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行連接，即得到單價載體 A/pROKlI;步驟一中用限制性內(nèi)切酶効"I和《戸I對質(zhì)粒載體pROKlI及 i^GS7I/7分別進行雙酶切，再用T4 DNA連接酶進行酶連接，即得到單價載 體B/pROKH。
5、 構建pROKlI植物雙價表達載體所使用的通用引物，其特征在于構建 pROKlI植物雙價表達載體所使用的通用引物為P35S-S1和Tnos-Al，通用引 物P35S-S1序列為5，-GGCGAATTCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCC-3，，通用 引物Tnos-Al序列為5，-GGCGAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3，。
全文摘要
一種構建pROK II植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物，它涉及一種植物雙價表達載體的方法及其使用的通用引物。它解決了目前構建pROKII雙價載體的方法需要通過中間載體更換酶切位點才能實現(xiàn)，步驟繁瑣、構建周期長的問題。方法一、構建單價載體；二、制備兩邊帶有EcoR I粘末端的35S-A-Tnos片段；三、制備兩邊帶有EcoR I粘末端的開環(huán)B/pROK II；四、將步驟二和三得到的基因片段進行酶連接。通用引物為P35S-S1和Tnos-A1。本發(fā)明方法與目前構建pROKII雙價載體的方法相比較，減少了連接和轉(zhuǎn)化的次數(shù)具有步驟少、操作簡單、構建周期短和不必更換酶切位點的優(yōu)點，能夠明顯地提高工作效率。
文檔編號C12N15/82GK101294165SQ200810064790
公開日2008年10月29日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權日2008年6月23日
發(fā)明者劉關君, 劉昌財, 劉明坤, 劉桂豐, 楊傳平, 王柏臣, 許志茹, 魏志剛 申請人:東北林業(yè)大學