專利名稱：鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法。
技術(shù)背景石斛屬(Dendrobium)為蘭科(Orchidaceae)的一個大屬，包括1600多種植物，我國約 有63種，其中供藥用的有30多種，主要有環(huán)草石斛(D. loddigesii)、馬鞭石斛(D. fimbriatum)、鐵皮石斛(D. candidum)、黃草石斛(D. chrysanthum)和金釵石斛(D. nobile)，鐵皮石斛為其中最為珍貴者。中醫(yī)認為石斛具有養(yǎng)陰清毒、生津止渴、明目強身的作用， 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)石斛含有多種生物堿、多糖和氨基酸，具有增強免疫功能、抑制血栓形 成、抗腫瘤和抗衰老的多種功效。因此在國內(nèi)中醫(yī)臨床配方和出口外銷中成藥工業(yè)原料中 需求量不斷增加，國內(nèi)、國際市場的售價一路飚升，使石斛日趨顯得珍稀名貴。但野生石 斛的自然繁殖率低、生長緩慢、收獲產(chǎn)量低，遠遠滿足不了市場的需要，加之人們長期無 節(jié)制的濫采濫挖，造成野生資源的嚴重破壞。目前雖有石斛屬植物組織培養(yǎng)和人工栽培石 斛技術(shù)的研究，但均存在種苗生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本高、繁殖系數(shù)低、質(zhì)量參差不齊等問 題，而滿足于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法沒有報道。目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的外植體多采用野生植株的蕨果內(nèi)種子，經(jīng)消毒接種至 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成原球莖，以建立無菌體系，該方法存在種子獲取難、母本來源受限制、 性狀表現(xiàn)不一致、種苗品質(zhì)退化快、經(jīng)幾次繼代增殖后老化現(xiàn)象嚴重、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)難以保存 等問題。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種短時間獲得大規(guī)模鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗的快速繁殖方法，該 方法種苗外植體消毒效率高、培養(yǎng)基成分獨特且成本低、繁殖周期短，生產(chǎn)出的種苗品質(zhì) 優(yōu)良、整齊，應(yīng)用價值高。本發(fā)明通過從性狀表現(xiàn)優(yōu)異的野生或人工栽培的鐵皮石斛植株中采取未展葉的新芽 作為外植體，可在組培初期獲得足夠的外植體數(shù)量，保證后期規(guī)模化生產(chǎn)的成功率。即通 過原球莖誘導(dǎo)——原球莖的繼代增殖——成苗分化培養(yǎng)——壯苗生根培養(yǎng)——試管苗移 栽一系列環(huán)節(jié)，可在6個月內(nèi)建立起一整套工廠化無菌優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)體系。本發(fā)明對數(shù)株采自廣西省、云南省廣南縣與西雙版納州的野生或人工栽培的鐵皮石斛 植株的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)、組培苗煉苗技術(shù)進行了系統(tǒng)研究，在大規(guī)模工廠化生產(chǎn) 的角度對培養(yǎng)基配方、工藝流程、煉苗基質(zhì)等方面有較大的創(chuàng)新，提供了一套鐵皮石斛優(yōu) 質(zhì)種苗快速繁殖方法和相關(guān)培養(yǎng)基配方、煉苗基質(zhì)配方。具體包括如下步驟1. 材料取野生或人工栽培的鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)。2. 外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在2—4月上旬，切取野生或人工栽培的鐵皮石斛未 展葉新芽，流水沖洗10分鐘，將外植體在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡45秒后，再用 質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2 3滴吐溫-80浸泡8分鐘，無菌水沖洗3遍， 用解剖刀剝除外部葉片，再放入質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2 3滴吐溫80 中浸泡5分鐘，無菌水沖洗3遍，逐層剝?nèi)ト~片直至露出生長點，接種到1/2MS固體培養(yǎng) 基上萌發(fā)植株，建立無菌體系。3. 原球莖誘導(dǎo)切取無菌體系幼苗莖段或基部小組織塊接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基 1/2MS+6-BA2.0—5.0毫克/升+NAA0.2—1.0毫克/升+馬鈴薯汁200克/升，馬鈴薯汁采用清 湯法煮制經(jīng)過濾而來，加入馬鈴薯汁能明顯提高原球莖的誘導(dǎo)率。4. 繼代增殖培養(yǎng)30天左右，將原球莖轉(zhuǎn)移到繼代增殖培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)與液體培 養(yǎng)交替進行可顯著提高原球莖的增殖率。固體培養(yǎng)基為l/2MS+6-BA1.0_3.0毫克/升 十NAA0.1—0.5毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.2—0.5克/升+瓊脂7克/升；液體培 養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.0—3,0毫克/升+NAA0.1—0.5毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.2 ~0.5克/升。液體培養(yǎng)基的搖床轉(zhuǎn)速為50—80r/min，培養(yǎng)溫度25±2°C，光強度1500— 25001x，光照10小時/天。本培養(yǎng)階段添加少量活性炭可以減少原球莖團褐化，降低6-BA 與NAA的激素濃度可保證一定增殖率下發(fā)生變異的可能性。5. 成苗培養(yǎng)將原球莖團接種到成苗培養(yǎng)基培養(yǎng)3—4周形成無根小苗。成苗培養(yǎng)基 1/2MS+6-BA0.1—0.5毫克/升+ NAA1.0~2.0毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.2~0.5 克/升。6. 壯苗生根培養(yǎng)當無根苗高2—3厘米時，轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。壯苗生 根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5—1.5毫克/升+香蕉勻漿100克/升+白糖30克/升+活性炭0.2— 0.5克/升，加入香蕉勻漿與白糖可明顯提高生根率，且種苗粗壯、整齊。以上固體培養(yǎng)基均含蔗糖20克/升(除壯苗生根培養(yǎng)基外)，PH5.4—5.8，瓊脂7克/ 升；培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28士2。C，光強度1500—25001x，光照12小時/天。7.試管苗移栽當壯苗培養(yǎng)6周左右，試管苗能長至8—IO厘米高，轉(zhuǎn)移到自然光下 煉苗7天后，將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入刨花+豬糞共同發(fā)酵后的混 合基質(zhì)中，保持適當?shù)耐L(fēng)和足夠的濕度(相對濕度80%_90%)， 2周試管苗可恢復(fù)生長， 移栽的成活率均可達95%_100%。本發(fā)明所提供的方法具有外植體來源廣及滅菌成功率高、增殖系數(shù)高、變異率低、種 苗粗壯整齊、品質(zhì)好、移栽成活率高、生長勢強等優(yōu)勢。其外植體消毒效率高、培養(yǎng)基成 分獨特且成本低，大規(guī)模工廠化生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)出的種苗品質(zhì)一流、應(yīng)用價值高。
具體實施方式
實施例1:1. 取材云南省西雙版納州人工栽培的鐵皮石斛未展葉新芽。2. 外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法用新的手術(shù)刀片自基部切取溫室中栽培的鐵皮石斛新 芽，自來水沖洗10分鐘。將外植體放在超凈工作臺上，用75%的酒精浸泡45秒后，再用質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2 3滴吐溫-80浸泡8分鐘，無菌水沖洗3遍， 用解剖刀剝除外部葉片，再放入質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2 3滴吐溫-80 中浸泡5分鐘，無菌水沖洗3遍，逐層剝?nèi)ト~片直至露出生長點，接種至1/2MS固體培養(yǎng) 基上。3. 原球莖誘導(dǎo)切取無菌體系幼苗的莖段或基部小組織塊接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2毫克/升+NAA0.5毫克/升+馬鈴薯汁200克/升，培養(yǎng)30天左右有原球莖形成。4. 繼代增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)30天左右將原球莖轉(zhuǎn)移到1/2MS+6-BA2.0毫克/升+NAA0.2 毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.5克/升+瓊脂7克/升的固體培養(yǎng)基與 1/2MS+6-BA1.0毫克/升+ NAAO.l毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.2克/升的液體培 養(yǎng)基上交替培養(yǎng)增殖， 一般30天左右為一個繼代周期。5. 成苗培養(yǎng)增殖至一定代數(shù)后接種到成苗培養(yǎng)基1/2MS+6-BA0.2毫克/升+NAA1.5 毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.5克/升。 一周后即可見原球莖形成苗端，4周左右即 可長成2—3厘米高的無根小苗。6. 壯苗生根培養(yǎng)將在成苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周左右，形成約2—3厘米高的無根小苗 轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA1.0毫克/升+香蕉勻漿100克/升+白糖30克/升+活性 炭0.5克/升；每瓶接種15株。接種6周后植株平均根數(shù)5.2條，平均株高9.5厘米，平均 鮮重3.0克。7.試管苗移栽將壯苗培養(yǎng)6周的瓶苗轉(zhuǎn)移到溫室栽培條件下煉苗7天。將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入刨花+豬糞共伺發(fā)酵后的混合基質(zhì)中，保持適當?shù)耐L(fēng)和足夠的濕度(相對濕度80%—90%)，移栽成活率可達95%以上。以上固體培養(yǎng)基均含蔗糖20克/升(除壯苗生根培養(yǎng)基外)，PH5.4—5.8，瓊脂7克/ 升，培養(yǎng)溫度28土2。C，光強度1500—25001x，光照12小時/天。馬鈴薯汁采用清湯法煮 制經(jīng)過濾而來。上述繼代增殖的液體培養(yǎng)基不加瓊脂，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8;搖床轉(zhuǎn)速為 60r/min，培養(yǎng)溫度25士2'C，光強度1500—20001x，光照10小時/天。 實施例2:取廣西省野生石斛的新芽作為外植體。基本操作方法同實施例1一致。但其原球莖誘 導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA5.0毫克/升+ NAA1.0毫克/升+馬鈴薯汁200克/升；原球莖繼代 增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA3毫克/升+ NAA0.5毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.5 克/升+瓊脂7克/升的固體培養(yǎng)基與1/2MS+6-BA3.0毫克/升+ NAA0.5毫克/升+馬鈴薯汁 200克/升+活性炭0.5克/升的液體培養(yǎng)基；成苗培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.5毫克/升+NAA2.0 毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+活性炭0.2克/升；壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.5毫克/ 升+香蕉勻漿100克/升+白糖30克/升+活性炭0.2克/升。壯苗生根培養(yǎng)40天后統(tǒng)計平均根 數(shù)4.8條，平均植株高9.2厘米，平均鮮重達2.8克。試管苗移栽的成活率可達98%。以上固體培養(yǎng)基均含蔗糖20克/升(除壯苗生根培養(yǎng)基外)，PH5.4—5.8，瓊脂7克/升， 培養(yǎng)溫度28土2'C，光強度1500—25001x，光照12小時/天。馬鈴薯汁采用清湯法煮制經(jīng) 過濾而來。上述繼代增殖的液體培養(yǎng)基不加瓊脂，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8;搖床轉(zhuǎn)速為 60r/min，培養(yǎng)溫度25士2。C，光強度1500~20001x，光照10小時/天。
權(quán)利要求
1. 一種鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于具體步驟如下1)外植體誘導(dǎo)材料消毒的方法在2-4月上旬，切取野生或人工栽培的鐵皮石斛未展葉新芽，流水沖洗10～15分鐘，將外植體在超凈工作臺上用75％的酒精浸泡45±5秒后，再用質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2～3滴吐溫-80浸泡8分鐘，無菌水沖洗3遍，用解剖刀剝除外部葉片，再放入質(zhì)量百分比濃度為1克/升的氯化汞溶液、2～3滴吐溫80中浸泡5分鐘，無菌水沖洗3遍，逐層剝?nèi)ト~片直至露出生長點，接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上萌發(fā)植株，建立無菌體系；2)原球莖誘導(dǎo)切取無菌體系幼苗的莖段或基部小組織塊接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基；3)繼代增殖將誘導(dǎo)出的原球莖接種到液體和固體增殖培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)30天為一個繼代周期；4)成苗培養(yǎng)將原球莖團轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-3周，形成小苗；5)壯苗生根培養(yǎng)當無根苗高2-3厘米時，轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)；6)試管苗移栽當壯苗培養(yǎng)6周，試管苗能長至8-10厘米高，轉(zhuǎn)移到自然光下煉苗7天后，將其從玻璃瓶中取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入刨花+豬糞共同發(fā)酵后的混合基質(zhì)中，保持適當?shù)耐L(fēng)和足夠的濕度，2周試管苗可恢復(fù)生長。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于步驟2)中原 球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA2.0—5.0毫克/升+NAA0.2—1.0毫克/升+馬鈴薯汁200克/ 升，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8，瓊脂7克/升。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于步驟3)中 繼代增殖固體培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.0—3.0毫克/升+NAA0.1—0.5毫克/升+馬鈴薯汁200 克/升+活性炭0.2—0.5克/升+瓊脂7克/升，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于步驟3)中 繼代增殖液體培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1.0—3.0毫克/升+NAA0.1—0.5毫克/升+馬鈴薯汁 200克/升+活性炭0.2—0.5克/升，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于繼代增殖液 體培養(yǎng)基培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速為50—80r/min，培養(yǎng)溫度25±2°C，光強度1500—20001x，光照 10小時/天。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于步驟4)中成苗培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.1—0.5毫克/升+ NAA1.0—2.0毫克/升+馬鈴薯汁200克/升+ 活性炭0.2—0.5克/升，含蔗糖20克/升，PH5.4—5.8,瓊脂7克/升。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于步驟5)中 壯苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+ NAA0.5—1.5毫克/升+香蕉勻漿100克/升+白糖30克/升+活 性炭0.2_0.5克/升，PH5.4—5.8，含瓊脂7克/升。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于以上原球莖 誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代增殖固體培養(yǎng)基、成苗培養(yǎng)基、壯苗生根培養(yǎng)基均為培養(yǎng)溫度28±2 °C，光強度1500—25001x，光照12小時/天。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2或3或5中所述的鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法，其特征在于 所述馬鈴薯汁采用清湯法煮制經(jīng)過濾而得。
全文摘要
本發(fā)明是鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖方法。其方法為(1)取鐵皮石斛未展葉新芽，經(jīng)滅菌將莖尖接種到固體培養(yǎng)基，建立無菌體系；(2)切取無菌體系幼苗的莖段或基部小組織塊，在適宜的激素組合和培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)出原球莖；(3)原球莖在液體和固體繼代增殖培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，快速增殖形成原球莖團；(4)將原球莖團切開，轉(zhuǎn)接到固體成苗培養(yǎng)基上分化植株，形成小苗；(5)將小苗轉(zhuǎn)接到固體壯苗培養(yǎng)基上壯苗、生根，培育出完整的植株；(6)將無菌壯苗定植至適宜的煉苗基質(zhì)中，獲得優(yōu)質(zhì)種苗。本發(fā)明可用于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，具有外植體去污率高、增殖率高、變異率低、種苗粗壯、品質(zhì)好、移栽后成活率高、生長勢強等優(yōu)勢。
文檔編號C12N5/04GK101258835SQ20081005831
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者孔祥瑩, 戈振揚, 王麗斌 申請人:昆明理工大學(xué)