專利名稱：“細(xì)胞-組織”的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是“細(xì)胞-組織”的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)是在植物組織培養(yǎng)快速繁殖的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。具體的做法就是把植物細(xì)胞從試管或三角瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移到微生物發(fā)酵的大型發(fā)酵罐里，給予適當(dāng)?shù)臈l件進(jìn)行培養(yǎng)，使植物細(xì)胞像微生物一樣在發(fā)酵罐里大量繁殖，然后從大量增殖的植物細(xì)胞內(nèi)直接提取有用的物質(zhì)。
目前，世界各國如美國、日本、德國、俄羅斯、英國等國的科學(xué)家、企業(yè)界都在加緊研究，密切注視著植物細(xì)胞大量培養(yǎng)工作。
我國在植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)研究上也取得了很好的成績，在人參、黃連、西洋參、三七等藥用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)方面取得了不少科研成果。例如，用細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)從人參細(xì)胞提取的培養(yǎng)物，主要有效成分的含量達(dá)70％左右，比人工栽培的人參的有效成分高得多。
植物組織培養(yǎng)，就是分離植物體的一部分組織，如根、莖段、葉、花、幼胚等，在無菌試管中，配合一定的營養(yǎng)、激素、溫度、光照等條件，使其產(chǎn)生完整植株。由于其條件可以嚴(yán)格控制，生長迅速，1個(gè)月左右即為一個(gè)周期，因此在植物的生產(chǎn)上有重要應(yīng)用價(jià)值。
生物技術(shù)是我國、也是世界21世紀(jì)重點(diǎn)發(fā)展的技術(shù)領(lǐng)域。植物細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)雖然自1970年以來取得了不少成果，尤其是細(xì)胞繁殖速度快，污染率低，引人矚目。但是無論在細(xì)胞的培養(yǎng)成本上，還是工藝的改進(jìn)上，都存在著很多問題。而組培雖然被稱為快速繁殖，但是它的繁殖速度離我們的理論值和期望值就顯的太慢，而且污染率高，所以大多數(shù)組培室無論是數(shù)量還是成本都與我們社會(huì)要求有很大的差距。為解決細(xì)胞培養(yǎng)成本高，組織培養(yǎng)速度慢的問題，是否能找到一種既有細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又能克服細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)缺點(diǎn)的方法，就成為該發(fā)明所要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能增加繁殖速度、降低成本的“細(xì)胞-組織”的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為先將培養(yǎng)的植物組織在研缽體中加少許液體培養(yǎng)基研磨后接種，進(jìn)入旋轉(zhuǎn)式搖床，培養(yǎng)溫度25±1℃，黑暗條件下進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，將增殖的植物細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長測(cè)定，選取細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期的細(xì)胞再接入固體培養(yǎng)基進(jìn)行叢芽增殖培養(yǎng)，選擇生長良好的芽接入生根培養(yǎng)，最后出苗。
以上所述的細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基的配制方法是用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加BA0.3～0.6mg/L、NAA 1～5mg/L、LH 0.5～1.5mg/L、蔗糖19～22g/L混合配制而成。
固體培養(yǎng)基的配制方法是用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加6BA和NAA分別為0.2～2mg/L、0.1～0.9mg/L。
本發(fā)明的“細(xì)胞-組織”的培養(yǎng)方法，能把過去組織培養(yǎng)方法增殖植物的速度提高20倍以上，成本下降50％。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中藥的80％來源于植物，而絕大多數(shù)藥用植物是采摘野生的，這就意味著總有一天會(huì)把野生的藥用植物采光?，F(xiàn)在已有上百種藥用植物緊缺或處于瀕危狀態(tài)，即使用種子人工栽培的方法生產(chǎn)藥用植物，繁殖數(shù)量也是有限的。因此，使用植物“細(xì)胞-組織”培養(yǎng)技術(shù)，可以使培養(yǎng)的植物種苗生產(chǎn)速度比傳統(tǒng)的組培速度快20倍。
將細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)有機(jī)的結(jié)合，充分發(fā)揮細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合成為“細(xì)胞-組織”培養(yǎng)就顯出它強(qiáng)大的生命力，也就是本發(fā)明的最大創(chuàng)新點(diǎn)，并可以發(fā)展成為一個(gè)新興的技術(shù)領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1燈盞花(Erigeron breviscapus)的培養(yǎng)1、燈盞花外植體的選擇及培養(yǎng)由高產(chǎn)的親本植株建立的培養(yǎng)物，其后代產(chǎn)量高于由低產(chǎn)的植株所建立的培養(yǎng)物。
A、選擇通過隨機(jī)選取燈盞花野生植株20株，測(cè)定燈盞乙素含量，如下表(表1)所示
表1 20株燈盞花中燈盞乙素的含量Tab1 The scutellarin content in 20 individual Erigreron breviscapus(mg/g)

選擇燈盞乙素含量最高株(D8＝6.53mg/g)和最低株(D15＝3.15mg/g)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，建立無性系，分別標(biāo)記為Dmax和Dmin。
b、培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織及燈盞乙素含量測(cè)定取燈盞花葉片，用洗潔凈水清洗干凈后，在流水下沖洗10min，然后轉(zhuǎn)到潔凈工作臺(tái)上，吸干水分，先用70％酒精滅菌30s，再轉(zhuǎn)入0.1％的HgCl2溶液中滅菌6min，無菌蒸餾水沖洗5次，葉柄剪成0.4cm長的小段，葉片剪成0.5×0.5cm2的小塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA0.2mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的瓊脂固化，高溫滅菌前pH調(diào)為5.8，培養(yǎng)溫度25±1℃。外植體接種后一周左右即可見明顯膨大，20d左右形成直徑約1cm左右的愈傷組織。將愈傷組織切割后轉(zhuǎn)到同樣培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。F1代時(shí)，每瓶接種1.0g(DW)愈傷組織(干重0.12g，折干率為88％)，每種愈傷組織各接種10瓶，共1.2g(DW)。以后將增殖的愈傷組織全部接種作為下一次增殖的起始材料，增殖周期為18d。繼代3代后，各取50g(鮮重)，測(cè)定燈盞乙素的含量。
表2不同細(xì)胞系愈傷組織中燈盞乙素含量DmaxDminF1 F2 F3 F1 F2 F3愈傷組織收獲量(FW)(g/瓶) 29.54 63.34 207.06 24.38 61.12 190.66愈傷組織收獲量(DW)(g/瓶) 3.230 7.724 20.364 2.942 7.113 20.816愈傷組織生長率(干重)(％) 169.28 138.82 163.65 145.36 141.77 192.64燈盞乙素含量(mg/g)0.040 0.015
結(jié)果表明，來源于兩株燈盞花的愈傷組織生長并無顯著差異，愈傷組織中燈盞乙素的含量明顯低于原植株，而且來源于不同植株的愈傷組織，其燈盞乙素的含量不同。燈盞乙素在來源于高含量植株的愈傷組織(Dmax)中的含量明顯高于來源于低含量植株的愈傷組織(Dmin)。
2、進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，內(nèi)盛25ml液體培養(yǎng)基MS+BA 0.4mg/L+NAA 3mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。對(duì)較大的愈傷組織塊，先在研缽中加少許液體培養(yǎng)基研磨后接種。旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速125r/min，培養(yǎng)溫度25±1℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。將已可收獲的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，再抽干備用。
3、叢芽增殖培養(yǎng)選取上述生長進(jìn)入靜止期的備用細(xì)胞再接入固體培養(yǎng)基進(jìn)行叢芽增殖培養(yǎng)，6BA和NAA的最適濃度分別為0.5mg/L、0.1mg/L。
4、根的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)時(shí)，選擇生長良好的芽接入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，生根用IBA0.01mg/L+MS培養(yǎng)基，經(jīng)14天生根。
5、出瓶、煉苗移栽當(dāng)根長0.5cm，葉生長到3-5片時(shí)，無須在培養(yǎng)瓶中練苗，直接把生根的燈盞花苗從培養(yǎng)瓶中取出，移入珍珠巖基質(zhì)中，保持一定空氣濕度、溫度，經(jīng)2周后，移至大田中栽培。
實(shí)施例2鐵皮石斛(Dendrobium candidum)的培養(yǎng)1、鐵皮石斛外植體的選擇及培養(yǎng)選擇鐵皮石斛莖段，用洗潔凈清洗干凈后，在流水下沖洗2小時(shí)，然后轉(zhuǎn)到潔凈工作臺(tái)上，吸干水分，先用70％酒精滅菌30s，再轉(zhuǎn)入0.1％的HgCl2溶液中滅菌6min，無菌蒸餾水沖洗5次，莖段剪成1cm長的小段，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3mg/L+NAA2mg/L+蔗糖30g/L，用0.7％的瓊脂固化，高溫滅菌前pH調(diào)為5.8，培養(yǎng)溫度25℃。外植體接種后20天后可見明顯芽。
2、鐵皮石斛細(xì)胞懸浮培養(yǎng)
取上述培養(yǎng)的芽，先在研缽中加少許液體培養(yǎng)基研磨后接種。用100ml三角瓶(其他容器也可以，大小不限)，內(nèi)盛25ml液體培養(yǎng)基MS+BA0.5mg/L+NAA 1mg/L+LH 1.0g/L+蔗糖20g/L。進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速125r/min，培養(yǎng)溫度25℃，完全黑暗條件下培養(yǎng)。將已可收獲的細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，再抽干，備用。
3、芽增殖培養(yǎng)及根的誘導(dǎo)選取細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期的鐵皮石斛細(xì)胞再接入固體培養(yǎng)基進(jìn)行叢芽增殖培養(yǎng)，6BA和NAA的最適濃度分別為1mg/L，0.5mg/L。在芽生長過程中，植株生長到2cm左右在該培養(yǎng)基中可接著生根。
4、出瓶、煉苗移栽當(dāng)根長1cm，無須在培養(yǎng)瓶中練苗，直接把生根的鐵皮石斛苗從培養(yǎng)瓶中取出，移入珍珠巖基質(zhì)中，保持一定空氣濕度、溫度，經(jīng)2周后，移至栽培基質(zhì)(如樹干上等)栽培。
權(quán)利要求
1.一種“細(xì)胞-組織”的培養(yǎng)方法，其特征在于先將植物組織在研缽體中加少許液體培養(yǎng)基研磨后接種，進(jìn)入旋轉(zhuǎn)式搖床，培養(yǎng)溫度25±1℃，黑暗條件下進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，將增殖的植物細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長測(cè)定，選取細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期的細(xì)胞再接入固體培養(yǎng)基進(jìn)行叢芽增殖培養(yǎng)，選擇生長良好的芽接入生根培養(yǎng)，最后出苗。
2.權(quán)利要求1所述的細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基，其特征在于按以下方法配制用MS+BA 0.3～0.6mg/L，NAA 1～5mg/L，LH 0.5～1.5mg/L，蔗糖19～22g/L混合配制成細(xì)胞懸浮液體培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于按以下方法配制用MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加6BA和NAA分別為0.2～2mg/L、0.1～0.9mg/L制成。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其目的在于提供一種細(xì)胞－組織培養(yǎng)方法。其特征在于先將植物組織在研缽體中加少許液體培養(yǎng)基研磨后接種，進(jìn)入旋轉(zhuǎn)式搖床，培養(yǎng)溫度25±1℃，黑暗條件下進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，將增殖的植物細(xì)胞懸浮液倒入有濾紙的布氏漏斗，抽去培養(yǎng)液，再用蒸餾水洗滌若干次，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生長測(cè)定，選取細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期的細(xì)胞再接入固體培養(yǎng)基進(jìn)行叢芽增殖培養(yǎng)，選擇生長良好的芽接入生根培養(yǎng)，最后出苗。該方法解決了傳統(tǒng)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)某些植物困難，尤其是一些藥用植物、木本植物因其含有特殊代謝產(chǎn)物而導(dǎo)致培養(yǎng)困難、增殖率低的問題，同時(shí)無性系后代保持與母本優(yōu)良特性的高度一致性，并大幅度提高增殖率，降低培養(yǎng)成本，實(shí)現(xiàn)了“細(xì)胞－組織”培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1490402SQ0313561
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2003年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月16日
發(fā)明者陳銳平 申請(qǐng)人:陳銳平