專利名稱：一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液固雙相發(fā)酵生 產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法。
背景技術(shù)：
小克銀漢霉(Cww!';]g力細e71aceae)是一類絲狀真菌，小克銀漢霉因具 有與哺乳動物相似的細胞色素P450酶系，因此小克銀漢霉在藥物發(fā)酵轉(zhuǎn)化 和藥物代謝研究和應(yīng)用中具有十分廣泛的用途。此外，小克銀漢霉還被用 來作為生產(chǎn)Y-亞麻酸的菌種，在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中用途也很廣泛。應(yīng)用小克 銀漢霉孢子作為發(fā)酵的初始種子可以提高發(fā)酵的產(chǎn)率和效率，便于控制菌 體生長的周期，但一般獲得小克銀漢霉孢子都是以固體發(fā)酵生產(chǎn)方式進行 的，這種方法需要較大的生產(chǎn)面積，生產(chǎn)周期也較長，孢子產(chǎn)量也很低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種適用性好，工藝簡單，可以規(guī)?；a(chǎn)的液 固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為
液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法將活化后的小克銀漢霉的 種子按質(zhì)量百分比為10 ~ 30%接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中在25 ~ 3(TC下振動 發(fā)酵2 3天，再將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體分離，小 克銀漢霉菌絲體洗滌2~4次，而后將其粉碎，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵 培養(yǎng)基按重量比為1: 6~10混合，在30 35。C、濕度60~80%條件下進 行固相發(fā)酵3 ~ 5天以產(chǎn)生孢子;所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯150 ~ 200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1 2克，硫酸鎂O. 5~1克， 酵母膏0~0. 5g，蛋白胨0~0. 5g,氯化鈉0 0.5g，水1000mL， pH6. 0 ~ 7.5;固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉10% ~30%，玉米粉5%~20%，麩皮 5% ~ 10°/。，磷酸二氫鉀0. 01% ~ 0. 2%，硫酸鎂0. 01% ~ 0. 2%,水40% ~ 60%;
將小克銀漢霉活化釆用PDA斜面培養(yǎng)基或玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基進行 活化，活化時間為5~7天；所述液體發(fā)酵振動發(fā)酵的速度為150~ 200r/ min。所述在將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體釆用離心或過 濾收集菌絲體，其離心速度為2000 - 3000轉(zhuǎn)/分，時間為10 20分鐘。所 述小克銀漢霉菌絲體用無菌水或無菌生理鹽水洗滌；所述小克銀漢霉菌絲 體粉碎釆用電磨機將菌絲體粉碎成長度在500um- 800um。所述粉碎好的菌 絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合后，攤開高度為1 3cm;所述固相發(fā)酵時培養(yǎng)基 上覆蓋無菌濾紙或無菌玻璃紙。所述無菌濾紙的厚度為0.20-2. 30腿，含水 量為10%~70%，無菌玻璃紙的厚度為0. 03-0. 60 mm，含水量為10%~70%。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為5. 5 ~ 7. 5。 本發(fā)明的優(yōu)點在于1. 本發(fā)明將液固雙相用來發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子，液相發(fā)酵菌絲體 生長速度快，固相發(fā)酵時培養(yǎng)基質(zhì)疏松度良好，易于傳熱傳質(zhì)，有利于固 相發(fā)酵中過程控制和孢子的產(chǎn)生。2. 本發(fā)明可以規(guī)模化生產(chǎn)小克銀漢霉孢子，生產(chǎn)出的孢子易與菌絲體 和培養(yǎng)料分離，生產(chǎn)出的孢子可以直接用于工業(yè)化規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)和研究。3. 本發(fā)明適用性好，生產(chǎn)工藝簡單,設(shè)備條件要求不高，易于掌握。4. 本發(fā)明發(fā)酵方法可以大量生產(chǎn)小克銀漢霉孢子，產(chǎn)量達到2 ~ 6 x 109 個/100克培養(yǎng)料。
具體實施方式
實施例1刺孢小克銀漢霉菌種的活化將刺孢小克銀漢霉(Omni'ng/ia/wena eci2f卯"M)接入PDA斜面培養(yǎng)基，置于28。C恒溫培養(yǎng)5 6天，用10 ml無菌生理鹽水反復(fù)沖洗活化好的菌株斜面，使小克銀漢霉孢子充分地散落 在生理鹽水中；PDA斜面培養(yǎng)基組成為土豆200克，切成小塊加水1000 ml 煮沸20分鐘，紗布過濾，加入葡萄糖20克，瓊脂20克，定容至1000 ml。液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)刺孢小克銀漢霉(C畫一,！h ec/3油Wa)孢 子取5ml活化好的孢子懸液接入到液體培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量50ml/250ml， 在28'C下轉(zhuǎn)速170r/min振動發(fā)酵3天，再將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小 克銀漢霉菌絲體用紗布過濾液體培養(yǎng)基，使其分離得到的菌絲體，小克銀 漢霉菌絲體用無菌生理鹽水洗滌2~3次，而后通過電磨機將洗滌好的菌絲 體粉碎成長度在600um~ 700 um的片段，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng) 基按重量比為1: IO混合，在發(fā)酵容器中攤開，高度為3cm。然后在培養(yǎng)基 上面覆蓋一層厚度為0. 05隱，含水量為40%無菌濾紙進行固相發(fā)酵。在溫 度為3(TC，濕度為60%的條件下培養(yǎng)4天即得到大量刺孢小克銀漢霉孢子。所述，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，磷酸二 氫鉀2克，硫酸鎂O. 8克，蛋白胨O. 5g，水1000mL, pH6. 5，液體發(fā)酵培 養(yǎng)基起始pH為5. 5 ~7. 5，培養(yǎng)基于12rC， 1. 05MPa滅菌30min后使用；固 體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉30%,玉米粉20%,麩皮10%,磷酸二氫鉀 0. 05%，硫酸鎂0. 05%,其余為水。固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合后于121°C, 1. 05MPa 滅菌30rain后使用。實施例2布氏小克銀漢霉菌種的活化將布氏小克銀漢霉(Cum7kg/2afflena Wdes7e犯a)接入玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基，置于28。C恒溫培養(yǎng)6~7天。 用10ml無菌生理鹽水反復(fù)沖洗活化好的菌株斜面，使小克銀漢霉孢子充分 地散落在生理鹽水中；玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng)基組成為玉米粉60克，加水 1000 ml文火煮沸l(wèi)小時，紗布過濾，加入瓊脂20克，定容至IOOO ml。液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)布氏小克銀漢霉(Q'nm'ng/]afflena Wato/ea朋) 孢子取布氏小克銀漢霉的孢子懸液按質(zhì)量百分比為10%接入到液體發(fā)酵 培養(yǎng)基中，搖瓶裝液量70ml/250ml,轉(zhuǎn)速150 ~ 180r/min， 3(TC恒溫培養(yǎng)2 天。在將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體在3000轉(zhuǎn)/分條件 下用離心機離心10分鐘，沉淀即為菌絲體，小克銀漢霉菌絲體用無菌生理 鹽水洗滌3 4次，而后通過電磨機將洗滌好的菌絲體粉碎成長度在500um 800 um的片段，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為1:7混合在 發(fā)酵容器中攤開，高度為2cm。然后在培養(yǎng)基上面覆蓋一層厚度為0.25醒, 含水量為50%無菌玻璃紙進行固相發(fā)酵。在溫度為32°C，濕度為65%的條 件下培養(yǎng)4天即得到大量刺孢小克銀漢霉孢子。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯150克，蔗糖15克，磷酸二氫鉀 l克，硫酸鎂O. 5克，酵母膏O. 2g,水1000mL，液體發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為 5. 5~7. 5，培養(yǎng)基于121°C， 1. 05MPa滅菌20min后使用。固體發(fā)酵培養(yǎng)基 的組成為紅薯粉10%,玉米粉5°/。，麩皮5%,磷酸二氫鉀0. 01%，硫酸鎂0. 01%, 其余為水。固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合后于12rC, 1.05MPa滅菌30min后使用。實施例3雅致小克銀漢霉菌種的活化將雅致小克銀漢霉(Cum3ii!g^/"ena e化g犯s)接入PDA斜面培養(yǎng)基，置于28。C恒溫培養(yǎng)5~7天。用10 ml無菌生理鹽水反復(fù)沖洗活化好的菌株斜面，使小克銀漢霉孢子充分地散落在 生理鹽水中。液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)雅致小克銀漢霉(CM/7i;]g/M鵬]2a "ega"s)孢子 取雅致小克銀漢霉的孢子懸液按質(zhì)量百分比為15%接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中，搖瓶裝液量30ml/ 250ml，轉(zhuǎn)速180 ~ 200r/min， 25。C恒溫培養(yǎng)3天。 再將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體在2000轉(zhuǎn)/分條件下用 離心機離心15分鐘，沉淀即為菌絲體，小克銀漢霉菌絲體用無菌生理鹽水 洗滌1 ~ 3次，而后通過電磨機將洗滌好的菌絲體粉碎成長度在500um ~ 600 um的片段，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為l:8混合在發(fā)酵 容器中攤開，高度為lcm。然后在培養(yǎng)基上面覆蓋一層厚度為0. 3mm,含水 量為30%無菌濾紙進行固相發(fā)酵。在溫度為33°C,濕度為55%的條件下培 養(yǎng)5天即得到大量刺孢小克銀漢霉孢子。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯180克，葡萄糖18克，磷酸二氫 鉀l. 5克，硫酸鎂l克，酵母膏O. 5g，蛋白胨O. 2g，水1000mL，液體發(fā)酵 培養(yǎng)基起始pH為5. 5 ~ 7. 5，培養(yǎng)基于121°C ， 1. 05MPa滅菌20min后使用。 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉20%，玉米粉15%，麩皮10%,磷酸二氫鉀 0. 03%,硫酸鎂0. 02%,其余為水。固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合后于12rC， 1. 05MPa 滅菌30min后使用。實施例4與實施例1不同之處在于所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯170克，葡萄糖或蔗糖19克，磷酸二氫鉀1. 6克，硫酸鎂0. 7克，酵母膏0. 35g， 蛋白胨0.4g,氯化鈉0.5g，水1000mL;固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉15 %，玉米粉10%，麩皮8%,磷酸二氫鉀O. 2%,硫酸鎂O. 05%，余量為水。 實施例5與實施例1不同之處在于:所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯190 克，葡萄糖或蔗糖16克，磷酸二氫鉀1. 8克，硫酸鎂0. 6克，蛋白胨0. 3g， 氯化鈉0. 2g,水1000mL;固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉25 % ，玉米粉15%, 麩皮6%，磷酸二氫鉀O. 08%，硫酸鎂O. 15%,余量為水。
權(quán)利要求
1.一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其特征在于將活化后的小克銀漢霉的種子按質(zhì)量百分比為10～30％接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中在25～30℃下振動發(fā)酵2～3天，再將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體分離，小克銀漢霉菌絲體洗滌2～4次，而后將其粉碎，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為1∶6～10混合，在30～35℃、濕度60～80％條件下進行固相發(fā)酵3～5天以產(chǎn)生孢子；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為馬鈴薯150～200克，葡萄糖或蔗糖15～20克，磷酸二氫鉀1～2克，硫酸鎂0.5～1克，酵母膏0～0.5g，蛋白胨0～0.5g，氯化鈉0～0.5g，水1000mL，pH6.0～7.5；固體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為紅薯粉10％～30％，玉米粉5％～20％，麩皮5％～10％，磷酸二氫鉀0.01％～0.2％，硫酸鎂0.01％～0.2％，水40％～60％。
2. 按權(quán)利要求1所述的液固雙相發(fā)酵。生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于將小克銀漢霉活化釆用PDA斜面培養(yǎng)基或玉米粉瓊脂斜面培養(yǎng) 基進行活化，活化時間為5~7天；所述液體發(fā)酵振動發(fā)酵的速度為150 ~ 200r /min。
3. 按權(quán)利要求1所述的液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于所述在將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體釆用離 心或過濾收集菌絲體，其離心速度為2000 - 3000轉(zhuǎn)/分，時間為10~20分 鐘。
4. 按權(quán)利要求1所述的液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于所述小克銀漢霉菌絲體用無菌水或無菌生理鹽水洗滌;所述小克 銀漢霉菌絲體粉碎釆用電磨機將菌絲體粉碎成長度在500um 800um。
5. 按權(quán)利要求1所述的液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于所述粉碎好的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基混合后，攤開高度為1~ 3cm;所述固相發(fā)酵時培養(yǎng)基上覆蓋無菌濾紙或無菌玻璃紙。
6. 按權(quán)利要求5所述的液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于所述無菌濾紙的厚度為0. 20-2. 30mm,含水量為10%~70%，無 菌玻璃紙的厚度為0.03-0.60 mm，含水量為10%~70%。
7. 按權(quán)利要求1所述的液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法，其 特征在于所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為5. 5 ~ 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液固雙相發(fā)酵生產(chǎn)小克銀漢霉孢子的方法。具體為將活化后的小克銀漢霉的種子按質(zhì)量百分比為10～30％接入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25～30℃下振動發(fā)酵2～3天，在將液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的小克銀漢霉菌絲體分離，小克銀漢霉菌絲體洗滌2～4次，而后將其粉碎，粉碎后的菌絲體與固體發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為1∶6～10混合，在30～35℃、濕度60～80％條件下進行固相發(fā)酵3～5天以產(chǎn)生孢子。采用本發(fā)明方法可以大量生產(chǎn)小克銀漢霉孢子，產(chǎn)量達到2～6×10⁹個/100克培養(yǎng)料，且孢子易與菌絲體和培養(yǎng)料分離，生產(chǎn)出的孢子可以直接用于發(fā)酵生產(chǎn)和研究。
文檔編號C12N3/00GK101565687SQ20081001118
公開日2009年10月28日 申請日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者張惠文, 旭 李, 羅永平, 蘇振成, 阮曉東 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所