專利名稱：：原代細胞繁殖的制作方法原代細胞繁殖
背景技術：
：轉移是診斷具有原發(fā)性腫瘤的患者中的死亡主因。當細胞由原發(fā)性肺瘤脫落且通過外周血流或淋巴引流散布至身體的遙遠部分時，癌癥轉移發(fā)生。外周血中的CTCs的存在已顯示與對于轉移性乳腺癌治療的患者中減少的無進展存活和減少的總體存活相關。盡管機械力或個體的免疫應答殺死進入血流的這些肺瘤細胞中的許多，但已知一定百分比的胂瘤細胞存活且可以進行分析。全血中這些稀少的上皮細胞的存在、計數和表征可以提供有價值的診斷和臨床信息。約70-80%的所有實體瘤源于上皮細胞，這通常在循環(huán)中未發(fā)現(xiàn)。外周血中循環(huán)上皮細胞的mRNA的全面分析可以提供關于腫瘤負荷預后和治療功效的有價值的信息。例如Her-2受體在僅30%的乳腺癌患者中超表達，這暗示赫賽汀(Herceptin)將是關于所有患者的無效療法。因此，CTCs的分子概況分析應導致CTCs改善的表征且最終發(fā)展更有效的、個人化的新治療策略。癌癥及其轉移狀態(tài)的早期檢觀'J對于癌癥的有效治療是關鍵的，導致總體存活率和改善的生活質量。轉移起因于由初生組織脫落的腫瘤細胞通過外周血傳播到達不同組織，通常稱為循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)。如通過CellSearchTM技術檢測的這些CTCs在血液中的存在已顯示與減少的存活率相關，因此充當關于癌癥進展(轉移)可預測的"標記"。這些CTCs潛在地可以用于藥物基因組學(pharmacogenomic)研究(例如，化學敏感性)。此外，分子概況分析研究可以在CTCs上進行，這將進一步引導我們更好地理解轉移潛能/進展、預后和甚至治療效用的潛在機制。挑戰(zhàn)是幾重的來自CTCs的質量核酸的回收；其以非常有限量的可用性；現(xiàn)有測定的敏感性限制；用于CTCs的現(xiàn)有標記組的應用/驗證。此外，由于捕獲的CTCs被白細胞污染，分子概況分析可能并非總是導致精確結果，所述白細胞的表達概況可能干擾結果。使CTCs適應體外生長可以導致細胞繁殖至足夠水平且減輕前述挑戰(zhàn)。因此繁殖的細胞可以用于各種應用，包括評估不同細胞群體的克隆形成能力、標簽的發(fā)現(xiàn)、使用此種標簽開發(fā)測定、熒光原位雜交(FISH)和免疫組織化學(IHC)。5癌癥及其轉移狀態(tài)的早期檢測對于癌癥的有效治療是關鍵的，導致顯著增加的存活率和改善的生活質量。轉移起因于由初生組織脫落的腫瘤細胞通過外周血傳播到達不同組織，通常稱為循環(huán)腫瘤細胞(CTCS)。如通過CellSearchTM技術才企測的這些CTCs在血液中的存在已顯示與減少的存活率相關，因此充當關于癌癥進展(轉移)可預測的"標記"。這些CTCs潛在地可以用于藥物基因組學研究(例如，化學敏感性)?；?達的可i傳狀態(tài)?？谌嘶蚪M的主要夕^遺傳修飾是cpG二、核苷酸的背景內的胞嘧啶殘基的曱基化。DNA甲基化從診斷觀點看來是有意思的，因為它可以在由致瘤性和癌變前病灶釋放到血清、尿或痰內的細胞中容易地檢測。并且從治療觀點來看，因為外遺傳沉默的基因可以通過DNA甲基化和/或組蛋白脫乙酰酶的抑制劑進行再活化。近來，涉及CTCs的分子表征的研究已公開，其利用經由GeneChip分析和定量逆轉錄-PCR的表達概況分析。在這個研究中使用的樣品具有〉100個CTCs,這比在早期篩選中一般可見的(<10個CTCs)高得多。我們繼續(xù)4吏用QuantitativeMultiplexMethylationSpecificPCR(QMSP)技術以進行預擴增(嵌套式PCR),以由捕獲的CTCs(<5細胞)的小量DNA獲得足夠的耙DNA。發(fā)明概述本發(fā)明提供了方法、裝置和試劑盒，用于外周血內的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的樣品加工，且評估其基因表達概況，同時提供用于CellSearchTM平臺的支持用于疾病復發(fā)測試。CellSearchProfileKit預期與CellSearchAutoPrepSystem結合用于分離全血中上皮起源的CTCs。CellSearchProfileKit包含基于磁性流體(ferrofluid)的捕獲試劑，其由具有由多聚層包圍的磁芯的納米顆粒組成，所述多聚層被靶向上皮細胞粘著分子(EpithelialCellAdhesionMolecule)(EpCAM)抗原用于捕獲CTCs的抗體包被。CellTracksAutoPrepSystem通過精確分配試劑和定時磁性溫育步驟而自動操作且標準化加工，為科學家提供先進的工具以可重現(xiàn)和有效地分離CTCs用于各種癌中的重要研究。大量白細胞和其他血液組分從富集樣品中除盡，從而使背景最小化。進一步的分析使用確立的分子生物學技術包括RT-PCR和多重RT-PCR來進行。分子表征測定是預期在CTC富集后使用的分子診斷測定。這種測定摻入上皮和組織起源的標記，以證實先前診斷且對于乳腺癌治療的患者中的循環(huán)細胞事實上是乳腺起源的。附圖簡述圖1是描述隨著時間過去的RNA穩(wěn)定性的曲線圖。圖2是描述得自循環(huán)腫瘤細胞的前列腺特異性mRNA的曲線圖。圖3是描述得自循環(huán)腫瘤細胞的前列腺特異性mRNA的曲線圖。圖4描述來自A)100ngPBLDNA摻加；或B)500ngPBLDNA摻加的結果。詳述生物標記是指出的標記核酸/蛋白質的任何標記。核酸可以是本領域已知的任何一種，包括但不限于，核、線粒體(同型異源性、異質性)、病毒、細菌、真菌、支原體等。標記可以是直接或間接的，且測量給定生理學參數且與內部對照、安慰劑、正常組織或另一種癌比較的基因的超表達或表達不足。生物標記包括但不限于，核酸和蛋白質(兩者都是超表達和表達不足的以及直接和間接的)。-使用核酸作為生物標記可以包括本領域已知的任何方法，包括但不限于測量DNA擴增、缺失、插入、重復、RNA、微小RNA(miRNA)、雜合性丟失(LOH)、單核廿；tti^去.t丄/otvtt~—T~i____1___Z1rvrvrv、"\士4:計m//n丄一丄A丄厶貫日i5C7'^ijn、o丄Nrs,ru(j(JKes、乂乂、且0"玄^Ai4^丞A且4乂》百/口w、j仍貝數多態(tài)性(CNPs)、微衛(wèi)星DNA、外遺傳變化例如DNA甲基化不足或過度甲基化和FISH。使用蛋白質作為生物標記包括本領域已知的任何方法，包括但不限于，測量量，活性，修飾例如糖基化、磷酸化、ADP-核糖基化、遍在蛋白化等，或免疫組織化學(IHC)和周轉。其他生物標記包括成像、分子概況分析、細胞計數和凋亡標記。"起源"當提及'組織起源，時依賴具體醫(yī)學環(huán)境意指組織類型(肺、結腸等)或組織學類型(腺癌、鱗狀細胞癌等)，且將由本領域技術人員理解。標記基因對應由SEQIDNO指定的序列，當它包含那種序列時。基因區(qū)段或片段對應此種基因的序列，當它包含足以區(qū)分其為該基因的序列的參考序列或其互補體的部分時?；虮磉_產物對應此種序列，當它的RNA、mRNA或cDNA與具有此種序列(例如，探針)的組合物雜交時，或在肽或蛋白質的情況下，它由此種mRNA編碼。基因表達產物的區(qū)段或片段對應此種基因或基因表達產物的序列，當它包含足以區(qū)分其為該基因或基因表達產物的序列的參考基因表達產物或其互補體的部分時。在本說明書中描述和要求保護的本發(fā)明方法、組合物、物品和試劑盒包括一種或多種標記基因。"標記"或"標記基因"在本說明書自始至終用于指與任何基因一致的基因和基因表達產物，所述基因的超表達或表達不足與適應癥或組織類型相關。用于確立基因表達概況的優(yōu)選方法包括測定由基因產生的RNA的量，所述基因可以編碼蛋白質或肽。這通過逆轉錄酶PCR(RT-PCR)、竟爭性RT-PCR、實時RT-PCR、差別顯示RT-PCR、RNA印跡分析和其他相關測試來完成。盡管可能使用個別PCR反應來實施這些技術，但擴增由mRNA產生的互補DNA(cDNA)或互補RNA(cRNA)且經由微陣列分析其是最佳的。用于其生產的許多不同陣列構型和方法是本領域才支術人員已知的，并且在例如下述專利中得到描述5445934;5532128;5556752;5242974;5384261;5405783;5412087;5424186;5429807;5436327;5472672;5527681;5529756;5545531;5554501;5561071;5571639;5593839;5599695;5624711;5658734;和5700637。微陣列技術允許同時測量數以千計的基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平，從而呈現(xiàn)用于鑒定諸如不受控制的細胞增殖的發(fā)作、停滯或調節(jié)的作用的有力工具。2種微陣列技術是目前廣泛使用的。第一種是cDNA陣列，且笫二種是寡核苷酸陣列。盡管在這些芯片的構建中存在差異，但基本上所有下游數據分析和輸出都是相同的。這些分析的產物一般是由用于檢測來自樣品的cDNA序列的標記探針接受到的信號強度的量度，所述標記探針與微陣列上的已知位置處的核酸序列雜交。一般地，信號強度與樣品細胞中表達的cDNA和因此的mRNA的量成比例。大量此種技術是可用和有用的。用于測定基因表達的優(yōu)選方法可以在6271002;6218122;6218114;和6004755中找到。表達水平的分析通過比較此種信號強度來進行。這最佳地通過產生測試樣品中的基因表達強度與對照樣品中的那些相對的比率矩陣完成。例如，來自患病組織的基因表達強度可以與由相同類型的良性或正常組織產生的表達強度進行比較。這些表達強度的比指出測試和對照樣品之間的基因表達中的倍數變化。選擇可以基于統(tǒng)計學檢驗，其產生與腫瘤的原始起源部位相關的因子之間的每個基因的差別表達的顯著性證據相關的排序列表。此種檢驗的例子包括ANOVA和Kruskal-Wallis。排序可以用作模型中的權重，所述模型設計用于將此種權重的總和，最高至截止值解釋為有利于一個類別的證據超過另一個類別。如文獻中描述的先前證據也可以用于調整權重。優(yōu)選實施方案是通過鑒定穩(wěn)定的對照組且使這個組在所有樣品中標定至零方差而使每個測量標準化。這個對照組定義為任何單個內源轉錄物或內源轉錄物組，其受測定中的系統(tǒng)誤差影響且不清楚其獨立于這種誤差而改變。所有標記通過樣品特異性因子進行調整，所述因子對于對照組的任何描述性統(tǒng)計量例如平均值或中值，或對于直接測量產生零方差。可替代地，如果僅與系統(tǒng)誤差相關的對照的變異的前提不是真實的，且當進行標準化時，所得到的分類誤差較小，則對照組將仍如所述的使用。非內源性摻加對照也可以是有用的，但不是優(yōu)選的?；虮磉_概況可以以多種方式顯示。最常見的是將原始熒光強度或比率矩陣排列為樹形圖(dendogram),其中列指示測試樣品和行指示基因。數據這樣排列，從而使得具有類似表達概況的基因彼此接近。關于每種基因的表達比顯現(xiàn)為顏色。例如，小于l的比(下調)出現(xiàn)在譜的藍色部分中，而大于l的比(上調)出現(xiàn)在譜的紅色部分中。商購可得的計算機軟件程序可用于顯示此種數據，包括"Genespring"(SiliconGenetics,Inc.)以、及"Discovery"禾口"Infer"(Partek,Inc.)。在測量蛋白質水平以確定基因表達的情況下，本領域已知的任何方法都是合適的，前提是它導致足夠的特異性和靈敏性。例如，蛋白質水平可以通過與對蛋白質特異的抗體或抗體片段結合且測量抗體-結合的蛋白質的量進行測量?？贵w可以通過放射性、熒光或其他可檢測的試劑進行標記以促進一企測。；險測方法包括^旦不限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或免疫印跡技術。在本發(fā)明的方法中使用的調節(jié)的基因在實施例中得到描述。相對于具有來自不同起源的癌的那些，差別表達的基因在具有特定起源的癌的患者中是上調或下調的。上調和下調是相對術語，意指可檢測的差異(超過用于測量其的系統(tǒng)中的噪聲的貢獻)以相對于某一基線的基因表達的量發(fā)現(xiàn)。在這種情況下，基線基于算法進行測定?；疾〖毎械哪康幕螂S后相對于使用相同測量法的基線水平是上調或下調的。在這種背景中，患病的指身體的狀態(tài)的改變，如不受控制的細胞增殖發(fā)生的，其中斷或擾亂身體功能的正確性能，或具有擾亂身體功能的正確性能的潛力。當一個人的基因型或表型的某一方面與疾病的存在一致時，其被診斷具有疾病。然而，進4亍診斷或預后的行為可以包括疾病/狀態(tài)問題的確定，例如確定復發(fā)的可能性、治療的類型和治療監(jiān)控。在治療監(jiān)控中，通過比較隨著時間過去的基因表達，以確定基因表達概況是否已改變或正變成與正常組織更一致的模式，來作出關于給定治療過程的效果的臨床判斷?；蚩梢赃@樣分組，從而使得關于組中的基因的組獲得的信息提供用于進行臨床相關判斷(例如診斷、預后或治療選擇)的可靠基礎。這些基因的組構成本發(fā)明的組合(portfolio)。與大多數診斷標記一樣，通常需要使用足以進行正確醫(yī)學判斷的最少數目的標記。這防止在進一步分析期間的治療延遲以及時間和資源的無價值的使用。確立基因表達組合的一種方法是通過使用最優(yōu)化算法，例如在確立股票組合中廣泛-使用的均值方差算法。這種方法在20030194734中詳細描述。實質上，該方法要求確立輸入值組(金融應用中的股票，這里指通過強度測量的表達)，所述輸入值將最優(yōu)化人們使用其接受的返回值(例如形成的信號)，同時使返回值的變異性降到最低。許多商業(yè)軟件程序可用于進行此種操作。本說明書自始至終稱為"WagnerSoftware"的Wagner耳關合均4直-方差最優(yōu)應用("WagnerAssociatesMean-VarianceOptimizationApplication)，，是4尤選的。這種庫欠^f牛^f吏用來自"Wagner耳關合均^f直-方差最優(yōu)4ti文庫(WagnerAssociatesMean-VarianceOptimizationLibrary)"的函數以測定有效邊界，且在Markowitz意義上的最佳組合是優(yōu)選的。Markowitz(1952)。這種類型的軟件的使用要求微陣列數據如此轉化，從而使得當軟件用于其預期的金融分析目的時，它可以以使用股票返回值和風險測量值的方式作為輸入值進行處理。選4,組合的方法還可以包括啟發(fā)式規(guī)則的應用。優(yōu)選地，此種^見則基于生物學和用于產生臨床結果的技術的理解來制定。更優(yōu)選地，它們10應用于來自最佳化方法的輸出。例如，組合選擇的均值方差法可以應用于微陣列數據，用于在患有癌癥的受試者中差別表達的許多基因。來自該方法的輸出將是最優(yōu)化的基因的組，其可以包括在外周血以及患病組織中表達的一些基因。如果在測試法中使用的樣品得自外周血，且在癌癥情況下差別表達的某些基因在外周血中也可以是差別表達的，那么可以應用啟發(fā)式規(guī)則，其中組合選自排除在外周血中差別表達的那些的有效邊界。當然，通過例如在數據預選擇過程中應用該規(guī)則，該規(guī)則可以在有效邊界形成前應用。可以應用與正被討論的生物學不一定相關的其他啟發(fā)式規(guī)則。例如，人們可以應用僅指定百分比的組合可以由特定基因或基因的組代表的規(guī)則。商購可得的軟件例如WagnerSoftware容易地適應這些類型的啟發(fā)式法。例如當除準確度和精確度以外的因素(例如，預期的許可費)對包括一種或多種基因的希求具有影響時，這可以是有用的。本發(fā)明的基因表達概況也可以與在癌癥診斷、預后或治療監(jiān)控中有用的其他非遺傳診斷法結合使用。例如，在一些情況下，使上述基于基因表達的方法的診斷能力與來自常規(guī)標記例如血清蛋白質標記(例如，癌抗原27.29("CA27.29"))的數據組合是有利的。存在一系列此種標記，包括此種分析物如CA27.29。在一種此種方法中，血液/人治療患者中定期獲取且隨后實施酶免疫測定以用于上述血清標記之一。當標記的濃度暗示腫瘤復發(fā)或治療失敗時，采取順應基因表達分析的樣品來源。當存在可疑塊時，獲取細針抽吸物(FNA)且隨后如上所述分析得自塊的細胞的基因表達概況?？商娲兀M織樣品可以得自與先前取出腫瘤的組織相鄰的區(qū)域。當其他測試產生不明確結果時，這種方法可以是特別有用的。本發(fā)明提供了繁殖得自生物樣品的目的細胞的方法，其通過a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖細胞實現(xiàn)。生物樣品可以是本領域已知的任何一種，包括但不限于，尿、血液、血清、血漿、淋巴、痰、津青液、唾液、眼淚、胸膜液、肺液、支氣管灌洗、滑液、腹膜液、腹水、羊水、骨髓、骨髓抽吸物、腦脊髓液、組織裂解物或勻漿或細l包沉淀。參見，例如20030219842。ii本領域已知的任何一種，包括但不限于，癌癥、遺傳的基因素因的危險評估、癌細胞例如CTC60/887,625的組織起源的鑒定、鑒定遺傳性疾病中的突變、疾病狀態(tài)(分期)、預后、診斷、監(jiān)控、對治療的應答、治療(藥理學)選擇、感染(病毒、細菌、支原體、真菌)、化學敏感性7112415、藥物敏感性、轉移潛能或鑒定遺傳性疾病中的突變。細胞富集可以通過本領域已知的任何方法實現(xiàn)，包括但不限于，通過抗體/磁性分離，(Immunicon,Miltenyi,Dynal)6602422,5200048,焚光激活細力包分選術，(FACs)7018804,過濾或手工。手工富集可以例如經由前列腺按摩實現(xiàn)。Goessl等人(2001)Urol58:335-338。繁殖可以通過本領域已知的任何方法實現(xiàn)，例如經由體外、先體外后體內或體內培養(yǎng)。設備和條件在本領域中得到描述。20070026519;和http:〃www.miltenyibiotec.com/en/NN—24—MACS—Cell—Culture.aspx。增殖是至少一次細胞倍增。完整性通過目的細胞對污染細胞的增殖進行測定。本發(fā)明請求保護的細胞可以用于例如測定來自生物樣品的細胞的轉移潛能，這通過從細胞中分離核酸和/或蛋白質；和分析核酸和/或蛋白質，以測定對轉移潛能特異的生物標記的存在、表達水平或狀態(tài)實現(xiàn)。本發(fā)明請求保護的細胞可以用于例如鑒定來自生物樣品的遺傳'性疾病細胞中的突變，這通過從細胞中分離核酸和/或蛋白質；和分析核酸和/或蛋白質，以測定對遺傳性疾病特異的生物標記的存在、表達水平或狀態(tài)實現(xiàn)。本發(fā)明請求保護的細胞可以用于例如獲得且保存細胞材料及其組成成分部分例如核酸和/或蛋白質。組成成分部分可以用于例如制備腫瘤細月包疫苗或免疫細胞治療。20060093612,20050249711本發(fā)明的細胞可以進行繁殖，以提供細胞系和克隆細胞群體。細胞可以用于例如篩選化學藥品的藥學功效和產生細胞產物例如抗體和細胞因子。7015313;685544;和6413744根據本發(fā)明制備的試劑盒包括用于測定基因表達概況的格式化的測定。這些可以包括執(zhí)行測定所需的所有或一些材料，例如試劑和說明書和生物標記通過其測定的介質。本發(fā)明的物品包括用于治療、i貪斷、預后和以其他方式評估疾病的基因表達扭無況的表示(representation)。這些纟既況表示處理為可以由沖幾12器自動化閱讀的介質例如計算機可讀介質(磁性、光學等)。物品還可以包括用于評估此種介質中的基因表達概況的指令。例如，物品可以包含具有計算機指令的CDROM,所述計算機指令用于比較上述基因組合的基因表達概況。物品還可以具有在其中數字記錄的基因表達概況，從而使得它們可以與來自患者樣品的基因表達數據相比較?？商娲?，組合可以以不同表示形式進行記錄。圖解記錄是一種此種形式。聚類算法例如整合入上文才是及的來自Partek,Inc.的"DISCOVERY"和"INFER"軟件中的那些可以最佳幫助此種數據的顯現(xiàn)。根據本發(fā)明的不同類型的制品是用于揭示基因表達概況的介質或格式化的測定。這些可以包含例如其中序列互補體或探針與矩陣附著的微陣列，所述矩陣與指示目的基因的序列組合產生其存在的可讀測定。可替代地，根據本發(fā)明的物品可以制成試劑盒用于進行指示用于檢測癌癥的目的基因表達水平的雜交、擴增和信號產生。本發(fā)明定義了特定標記組合，其已進行表征以檢測外周血背景中的單個循環(huán)乳腺肺瘤細胞。分子表征多重測定組合已進行最優(yōu)化用于用作QRT-PCR多重測定，其中分子表征多重包含2種組織起源標記，1種上皮標記和持家標記。QRT-PCR將在SmartcyclerII上進行用于分子表征多重測定。分子表征單重測定組合已進行最優(yōu)化用于用作QRT-PCR測定，其中每種標記在利用3種癌癥狀態(tài)標記、1種上皮標記和持家標記的單次反應中運行。與RPA多重測定不同，分子表征單重測定將在分子表征多重測定和單重測定組合精確一地檢測單個循環(huán)上皮細胞、，從而使得臨床醫(yī)生能夠預測復發(fā)。分子表征多重測定利用嗜熱棲熱菌(Z7zermz^f/z^7^/7/n7i)(TTH)DNA聚合酶，這是由于其在單次反應中執(zhí)行逆轉錄酶和聚合酶鏈反應的能力。相比之下，分子表征單重測定利用AppliedBiosystemsOne-StepMasterMix,其是4參入MMLV用于逆轉錄和Taq聚合酶用于PCR的2種酶反應。測定設計通過纟參入外顯子-內含子接界對RNA特異，從而使得基因組DNA無法有效擴增和檢測。本發(fā)明證實捕獲CTCs和在體外培養(yǎng)其的方法。實驗和結果在下文描述。存在本發(fā)明的幾個新方面。首先，本發(fā)明首次證實多重qRTPCR測定和CellSearch技術用于富集循環(huán)上皮細胞的組合。我們提供關于開發(fā)13用于在富集后分離RNA的新方法和在qRTPCR測定中使用RNA的詳細描述。其次，本發(fā)明可以用作細胞其自身的替代物。即，在其中發(fā)現(xiàn)極少數目循環(huán)細胞的臨床情況下或在其中發(fā)現(xiàn)極少完整的循環(huán)細胞的情況下(因為損害細胞不由CellSearch計數算法識別)，qRTPCR測定的使用可以提供循環(huán)肺瘤細胞的更靈敏計數，因為RNA將從完整和損害的循環(huán)腫瘤細胞中分離，從而增加檢測的靈敏性，并且高度靈敏的qRTPCR測定可以進一步增加靈敏性。本發(fā)明的最后一個關鍵方面是通過使用定量多重測定，人們可能產生基于2種或更多基因的算法以產生關于已從其中分離循環(huán)腫瘤細胞的患者的預后信息。重要的是，當與循環(huán)上皮細胞的計數組合時，分子信息可以提供另外或甚至新的預后信自在一個實施方案中，分子表征單重測定基于定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應(QRT-PCR),其中每種標記在個別反應中運行。本發(fā)明描述了3種組織起源標記、用于證實存在來自乳腺癌的循環(huán)胂瘤細胞的l種上皮標記、和用于^驗證樣品質量的對照標記的使用。設計用于每種標記的特異性引物/探針組合，以導致高特異性和靈敏性分析用于預測乳腺癌患者中的復發(fā)。用于特異性標記的這些引物/探針組合對于AppliedBiosystems(ABI)7900HT平臺進行最優(yōu)化，以檢測外周血背景中的單個循環(huán)乳腺腫瘤細胞。來自這個測定的結果顯示它可以與CellSearchCTCKit計數試劑盒平行使用，且因此對于臨床醫(yī)生和患者用于預測復發(fā)是有利的。在第二個實施方案中，分子表征乳腺多重測定也基于QRT-PCR，然而，與上文呈現(xiàn)的單重測定形成對比，患者樣品在單次反應中用3種診斷標記進行分析，從而使得能夠進行更高百分比的檢測。本發(fā)明描述了2種組織起源標記、用于證實存在來自乳腺癌的循環(huán)腫瘤細胞的l種上皮標記、和用于-驗證樣品質量的對照標記的4吏用。-沒計用于每種標記的特異性引物/探針組合，以導致在外周血白細胞PBLs的背景中的高靈敏性同時非常特異性。這些應用的可行性通過這種測定檢測摻加入7.5ml外周血內的<5個SKBR3細胞的能力得到證實。用于特異性標記的這些《I物/探針組合對于SmartcyclerII平臺進行最優(yōu)化。由于該測定法的靈敏性和4種基因的同時使用，來自這種測定的結果呈現(xiàn)了當與目前可用方法比較時無比的用于一企測乳腺循環(huán)肺瘤細胞的方法。本發(fā)明將使得這種測定可與CellSearchCTC計數試劑盒結合用于商業(yè)用途。在第三個實施方案中，分子表征測定基于qRTPCR用于表征循環(huán)前列腺細胞。在這個例子中，非常靈敏的多重測定摻入1種上皮標記(CK19)、1種前列腺組織起源標記(PSA,也稱為激肽釋放酶3),和1種對照基因(PBGD)。這種測定還可以用于前列腺細月包的高靈智:性才全測。本發(fā)明提供了培養(yǎng)來自血液的CTCs的方法。該方法涉及CellSearchTM技術及其相關的CellTracksAutoPr印系統(tǒng)和CellSearchProfileKit的使用。這些繁殖的細胞可以在藥物基因組學研究中使用，并且還提取足夠量的核酸用于在分子概況分析研究中使用。最后，這種測定還可以與CTCs的計數結果組合用作證實工具。本發(fā)明提供了在亞硫酸氫鈉轉化后檢測來自<5個細胞等價物(在本研究中3個細胞)的DNA中的曱基化標記的方法。該方法涉及把區(qū)的預擴增隨后為多重QMSP。存在本發(fā)明的幾個新方面。首先，本發(fā)明首次證實多重QMSP(涉及嵌套式PCR)測定及其延伸至富集循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的CdlSearchTM技術的組合。其次，QMSP測定可以提供關于幾種分子標記的有用信息，從而使得當它與CellSearchTM技術組合時更靈敏。第三，多重QMSP測定可能提供用于多種胂瘤細胞檢測例如前列腺和乳腺癌的新預后方法。最后，這種測定還可以與CTCs的計數結果組合用作證實工具。本發(fā)明定義了甲基化特異性標記組合，其已進行表征以在與10,000-100,000個PBL等價的外周血白細胞(PBL)背景中，在與3個循環(huán)腫瘤細胞等價的亞硫酸氫鈉轉化后檢測〈20pgDNA。目前，分子表征多重包含1種DNA曱基化特異性標記和持家標記(不久將添加另外2種DNA甲基化特異性標記)。將對基因組DNA實施亞硫酸氬鈉轉化和使用ZymoResearchKit的純化。耙區(qū)使用嵌套式引物組(外引物)的預擴增將在熱循環(huán)儀上進行。在后續(xù)QMSP反應中，焚光信號將通過使用伴隨Scorpion探針設計的內引物在Cepheid'sSmartcycler⑧或等價平臺上來產生。表I.PCR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表III.用于預擴增的循環(huán)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>來自上文按現(xiàn)狀無進一步純化的6-10%第一次PCR產物將轉移至新管，通過添加下述試劑(表IV)且實施表V中的循環(huán)條件用于第2次PCR。第二次PCR反應試劑制劑和循環(huán)條件如下表IV.用于第2次PCR的試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表V.用于第2次PCR的循環(huán)條件溫度(°c)時間循環(huán)9560秒19530秒405530秒725分鐘1下述DNA樣品在本研究中使用在來自外周血淋巴細胞(PBL)的摻加的DNA(100ng或500ng)背景中的CpGenome通用甲基化DNA(CpGM)、前列腺腺癌DNA(PC)或前列腺正常DNA(PN)。QMSP反應在亞石危酸氬鈉轉化后進行。下述實施例意名l舉例:說明而不是限制本發(fā)明。實施例#1摻加入白細胞RNA背景內的連續(xù)稀釋的乳腺RNA的基因表達分析來自分子表征單重(Singlex)測定組合的測定包括消除基因組DNA擴增的接頭特異性PCR探針。對于這種樣品測試的引物和雙重標記的水解探針序列在下文顯示RPA單重測定I測定序列SEQIDNO:B305D-RPAU22B305D-RPAL21B305D-RPAFAMP30^ATGGCCAAAGCACTGCTCTTAACTTGCTGIIIIIGCTCATGTFAM-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA-BHQ1-TT91011CK19-RPAU22CK19-RPAL20CK19-RPAFAMP24CACCCTTCAGGGTCTTGAGATTTCCGTTTCTGCCAGTGTGTCFAM-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ1-TT121314PBGD-RPAU22PBGD-RPAL21PBGORPAP27FAMCCACACACAGCCTACTTTCCAATACCCACGCGMTCACTCTCAFAM-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ1-TT151617MG-RPAU21MG-RPAL24MG-RPAP23FAMAGTTGCTGATGGTCCTCATGCCACTTGTGGATTGATTGTCTTGGAFAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT181920P1B289U21P1B360L21P1B311FAMP25GAGTACGTGGGCCTGTCTGCATTGCACTCCTTGGGGGTGACAFAM-ACCAGTGTGCCGTGCCAGCCMGGA-BHQ1-TT21222318每個單重反應使用下述循環(huán)條件和如下的試劑配方在AppliedBiosystems7900HT上進行循環(huán)條件48°Cx30分鐘95°Cx10分鐘40個循環(huán)的95°C15秒60°C1分鐘試劑FCXI(10(til)RT-PCRMaster混合物lx5.00Multiscribe酶.25U/)li10.25引物/探針混合物0.6|uM/0.251.00樣品3.75總計10.00SKBR3和MCF7乳腺癌細胞系的RNA分離后，總RNA進行連續(xù)稀釋以表示1-400個細胞等價物(CE)。連續(xù)稀釋的RNA隨后摻加入與50,000CE等價的背景白細胞總RNA內。應用定量實時PCR并且支持本發(fā)明的最佳測定的結果顯示于下文。測定細月包系RNA稀釋摻力口入20nggDNALeukNT系列2ng0.2ngPBL200ng20ng水20ng0.02ngB305D-RPAMCF723.6427.6431.3635.8440.0038.4040.00SKBR324.6528.7833.3736.65CK-19-RPAMCF716,9520.9725.3329.6640.0034.1940.00SKBR317.542U825.4729.64PIB-RP八MCF722.6926.3830.6434.5040.0039.0940.00SKBR325.1828.8732.7836.59PBGD-RPAMCF722.7326.5730.5534.7340.0025-5440.00SKBR323.5927.0331.0135.49MG-RPAMCF731.9136.5840.0039.0240.0040.0040.00SKBR323.0727.3431.3435.5819實施例#2可替代標記的基因表達分析或測定測試的另外設計包括消除基因組DNA擴增的接頭特異性PCR探針。對于這種樣品測試的引物和雙重標記的水解探針序列在下文顯示RPA多重測定<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>樣品制備和轉錄物擴增以與實施例#1描述的相同方式進行。支持本發(fā)明的這些可替代測定的結果顯示于下文。當與實施例#1中的標記性能比較時，下述結果證實具有較次性能的測定主要有利于標記特異性和/或靈敏性的缺乏和弱引物或引物設計。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例#3富集的SKBR3和MCF7細胞的QRT-PCR分析組合。CellSearch測定的靈敏性可以通過使用分子檢測技術得到改善，所述分子檢測技術能夠檢測一般由CellSearch測定不認為陽性的完整細胞和細胞片段中的標記表達。使用摻加入健康供體血液內的免疫磁性富集的SKBR3和MCF7細胞的RNA分離如下文所述來進行，所述血液抽取到EDTA抗凝劑血液管內。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>分子表征單重測定的可行性已通過當由7.5ml健康供體血液富集時，<5個SKBR3細胞中的特異性mRNA轉錄物的靈敏性和再現(xiàn)性檢測得到證實。實施例4摻加入白細胞RNA背景內的連續(xù)稀釋的乳腺RNA的分子表征多重測定分析來自RPA多重測定組合的測定包括消除基因組DNA擴增的接頭特異性PCR探針。對于這種樣品測試的引物和雙重標記的水解探針序列在下文顯示RPA多重測定序列NO:B305D-RPAU22AATGGCC織GCACTGCTC丌A42B305D-RPAL21ACTTGCTGIIIIIGCTCATGT43B305D-TR-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA-RPATRP30BHQ2-TT44CK19-RPAU22CACCC丌CAGGGTCTTGAGA丌45CK19-RPAL20TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC46CK19-CY3-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCC丌-BHQ2-TT47RPACY3P24PBGD-RPAU22CCACACACAGCCTACTTTCCAA48PBGD-RPAL21TACCCACGCGAATCACTCTCA49PBGD-CY5-AACGGCAATGCGGCTGCMCGGCGGAA-50RPACY5P27BHQ2-TTMG-RPAU21AGTTGCTGATGGTCCTCATGC51MG-RPAL24CACTTGTGGATTGATTGTCTTGGA52MG-FAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1-TT53RPAP23FAM每個多重反應卩吏用下述循環(huán)條件和如下的試劑配方在SmartcyclerII上進行l(wèi)循環(huán)條件l95CX3秒59CX12分鐘70Cx90秒40個循環(huán)的95C進行20秒62C進行30秒22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例弁5富集的SKBR3細胞的RPA多重QRT-PCR分析分子表征多重測定將使CellSearch技術的細胞捕獲部分與分子檢測測定組合。CellSearch測定的靈敏性可以通過使用分子4企測技術得到改善，所述分子檢測技術能夠檢測一般由CellSearch測定不認為陽性的完整細胞和細胞片段中的標記表達。使用摻加入健康供體血液內的免疫磁性富集的4又轉錄CK19的SKBR3細胞的RNA分離如下文所述來進行，所述血液抽取到EDTA抗凝劑血液管內。與其中患者樣品已在所有反應之間分開的分子表征單重測定形成對比，分子表征多重測定通過使得用戶能夠在單次反應中分析完整樣品的分子概況來提供增加的靈敏性。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例#6富集的SKBR3細胞的RNA穩(wěn)定性分析細胞內RNA的RNA穩(wěn)定性通過QRT-PCR使用分子表征多重測定經過48小時的時間過程進行評估。將200個SKBR3細胞摻加入7.5ml健康供體血液的多個管內。在每個時間點結束時，樣品使用CellSearch技術的細胞捕獲部分和CellSearchProfileKit進行加工。RNA分離后，分析樣品且結果顯示于下表和圖1中。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本發(fā)明提供了方法、裝置和試劑盒，其用于外周血內的循環(huán)肺瘤細胞(CTC)的樣品加工，且評估其基因表達概況同時提供用于疾病復發(fā)測試的細胞搜索平臺的支持。實施例顯示使用新多重測定檢測外周血背景中的單個循環(huán)腫瘤細胞的能力，所述新多重測定提供超過傳統(tǒng)單重RT-PCR測定的增加的優(yōu)點。實施例#7:前列腺循環(huán)細胞將前列腺RNA摻加入來自白細胞的RNA內，且在多重測定中在CepheidSmartcyclerII上進4亍測試。一戈表性^t據顯示于下文和圖2中。平均Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>實施例#7使用乳腺RPA嵌套式QRT-PCR多重測定用于基因表達分析的增加的靈敏性。單輪實時逆轉錄(RT)-PCR檢測一般是不一致的，因為由循環(huán)腫瘤細胞提取的RNA的濃度通常^[艮低。使用嵌套式引物的兩輪QRT-PCR增強測定的特異性和靈敏性，特別是使用低或弱質量靶或罕見信使的那些。這種方法摻入2對引物，所述引物用于首先擴增較大模板核酸分子，和隨后包含在擴增的模板分子中的靶核酸序列。因此通過使用兩輪QRT-PCR,關于乳腺RPA分子比較測定的靈敏性和特異性得到增加。圖3。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>嵌套式多重擴增反應使用下述循環(huán)條件和如下的試劑配方在SmartcyclerII上進行如上所述，摻加入白細胞總RNA背景內的連續(xù)稀釋的SKBR3RNA在下述實施例中使用<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>第一輪擴增后，旋轉管且從第一個管中抽取3微升等分試樣且排出到包含下述引物、探針和試劑的第二個管內。RPA多重測定測定序列B305D-RPAU22B305D-RPAL21已305D-RPATRP30AATGGCCAAAGCACTGCTCTTAACTTGCTGTTTTTGCTCATGTTR-ATCGAATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACA-已HQ2-TTCK19-RPAU22CK19-RPAL20CK19-RPACY3P24CACCCTTCAGGGTCTTGAGATTTCCGTTTCTGCCAGTGTGTCCY3-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ2-TTPBGD-RPAU22PBGD-RPAL21PBGD-RPACY5P27CCACACACAGCCTACTTTCCAATACCCACGCGAATCACTCTCACY5-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGAA-BHQ2-TTMG-RPAU21MG-RPAL24MG-RPAP23FAMAGTTGCTGATGGTCCTCATGCCACTTGTGGATTGATTGTCTTGGAFAM-CCCTCTCCCAGCACTGCTACGCA-BHQ1隱TT又,定量實時PCR使用下述參數來應用且支持本發(fā)明的結果顯示于下時間l95C3秒59C12分夸'70C90秒40循環(huán)95C20秒62C30秒實施例#8FCX1(25u，)BLN酶混合物1X2.5Tth聚合酶6.5UTP6-25AB0.052mg/ml2.5xBLNMaster混合物1X107.5mMMnS043mM3.125mMMgCI0,5mMdNTP25X引物混合物1X10.2/0.刷".25uMF&尺/5uM戶CW90.45/0.2uM".25UM/=&f/,P咖5￡>0.45/0.2uM7,5UMF&R/5"A/fP0.3/0.2uM37SmM(NH4)2S0415mM1#品10.5總計2514.40CK19-PCRB305DPBGD200pg18.3023.8524.4521.8520pg19.9526.2526.1022,00Leuk34.9035.7528,5521,85NT40.0038.1038.2040.00富集的SKBR3細胞的兩輪乳腺RPA嵌套式QRT-PCR分析乳腺RPA嵌套式QRT-PCR多重測定將與CellSearch富集結合使用以改善分子檢測技術，所述分子檢測技術能夠檢測一般由CellSearchCTC測定不認為陽性的完整細胞和細胞片段中的標記表達。使用摻加入26健康供體血液內的免疫磁性富集的SKBR3纟田胞的RNA分離如下文所述來進行，所述血液抽取到EDTA抗凝劑血液管內。與其中靈敏性和特異性低的一輪RPAQRT-PCR測定形成對比，兩輪乳腺RPA嵌套式QRT-PCR通過使得用戶能夠具有接近單拷貝靈敏性而提供增加的靈敏性和特異性。HHH乳腺RPA摻加到麗鵬IDSKBR3MGB305DPBGD1無細胞0.0039.1023.202無細月包37.6036.6024.2035細胞26.0027.2022.8045細胞25.鄰29.3025.80550細胞37,4029.7022.50650纟田月包23.7028.2022.207500細胞18.6024.3020.308500纟田胞21.6025.5022.3010PC:2ng20.0026.3024,1011NT35.300.0037.50實施例#9使用前列腺MCA嵌套式QRT-PCR多重測定用于基因表達分析的增加的靈敏性。本發(fā)明解決了關于設計為擴增循環(huán)前列腺腫瘤細胞中的罕見序列的PCR反應中改善的靈敏性和特異性的需要。在乳腺RPA嵌套式QRT-PCR多重測定中使用的技術進行交疊，以產生前列腺嵌套式QRT-PCR分子比較測定(MCA)。前列腺MCA嵌套式引物I測定序列KLK3;189U20KLK3;294L24TGCGGCGGTGTTCTGGTGCAGACCTGAAATACCTGGCCTGTGTCCK19901U21GK191094L23AGATGAGCAGGTCCGAGGTTACCTGATTCTGCCGCTCACTATCAPBGD107U21PBGD240L22GGACCTTAGCGGCACCCACACCTGTCCGTCTGTATGCGAGCAA嵌套式多重擴增反應使用下述循環(huán)條件和如下的試劑配方在SmartcyclerII上進行如上所述，摻加入白細胞總RNA背景內的連續(xù)稀釋的LNCAPRNA在下述實施例中使用27PHH試劑HHVFCX1(25ul)BLN酶混合物1X2.5Tth聚合酶6.5UTP6-25AB0.052mg/ml2.5xBLNMaster混合物1X107.5mMMnS043mM3.125mMMgCI1.25mM0.5mMdNTP0.2mM25X引物混合物1X10.1uM0.45uM7.5tv/WF<&fP8G00.3uM375mM(NH4)2S0415mM1樣品10.5總計2595C3秒59C12分鐘70C90秒15循環(huán)95C20秒62C30秒第一輪擴增后，旋轉管且從第一個管中抽取3微升等分試樣且排出到包含下述引物、探針和試劑的笫二個管內。前列腺MCA多重測定測定序列KLK3;209U19KLK3;269L22KLK3;242P26FAMCCCCCAGTGGGTCCTCACAAGGATGAAACAAGCTGTGCCGAFAM-CAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGG-BHQ1-TTCK19-RPAU22CK19-RPAL20CK19-RPAFAMP24CACCCTTCAGGGTCTTGAGAT丁TCCGTTTCTGCCAGTGTGTCFAM-ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCTT-BHQ1-TTPBGD-RPAU22PBGD-RPAL21PBGD-RPAP27FAMCCACACACAGCCTACTTTCCMTACCCACGCGAATCACTCTCAFAM-AACGGCAATGCGGCTGCAACGGCGGM-BHQ1-TT定量實時PCR使用下述參數來應用且支持本發(fā)明的結果顯示于下又'2895C3秒59C12分鐘70C90秒40循環(huán)95C20秒58C30秒試劑HBHFCX1(25ul)BLN酶混合物1X2.5Tth聚合酶6.5UTP6-25AB0.052mg/ml2.5xBLNMaster混合物1X107.5mMMnS043mM3.125mMMgCI1.25mM0.5mMd評0.2mM25X引物混合物1X10.1/0.涵".25t/MF&R/5uiWPC/c790.45/0.2UM7.5F&R/5tWWPP8GD0息2uM375mM(NH4)2S0415rrM1樣品10.5總i十25KLK3RT-PCRCK19PBGD20000pg9.8016.2020.10200pg17.5023.3521.6020pg20.1025.3021.80t_euk28.500.0020.20NT0.0038.900.00實施例#10富集的LNCAP細胞的前列腺MCA多重QRT-PCR分析前列腺MCA嵌套式QRT-PCR多重測定將與CellSearch富集結合使用以改善分子檢測技術，所述分子檢測技術能夠檢測一般由CellSearchCTC測定不認為陽性的完整細胞和細胞片段中的標記表達。使用摻加入健康供體血液內的免疫磁性富集的LNCAP細胞的RNA分離如下文所述來進行，所述血液抽取到EDTA抗凝劑血液管內。與其中靈敏性和特異性低的一輪前列腺QRT-PCR測定形成對比，兩輪前列腺MCA嵌套式QRT-PCR通過使得用戶能夠具有接近單拷貝靈敏性而提供增加的靈敏性和特異性。實施例11:SKBR3的摻加入隨后為通過CellSearchTM系統(tǒng)的捕獲如表I中所示將SKRB3細胞以1000個細胞摻加入7.5mL供體血液29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>CTCs通過EpCAM綴合的免疫磁性珠使用CellSearchProfile試劑盒和CellTracksAutoPrep系統(tǒng)進行捕獲。包含捕獲的CTCs的管從系統(tǒng)中取出且置于Magcellect⑧磁體中，溫育IO分鐘。取出上清液，而管仍在Magcellect⑧中。將沉淀懸浮于200^L磷酸緩沖鹽水(PBS)中。將細胞懸浮液鋪平板到包含1.0mL/孔含10%胎牛血清(FBS)的完全Eagle氏極限必需培養(yǎng)基的48孔板內。細胞在生長期間定性評估最高達14天，且觀察結果概括于表II中。在培養(yǎng)時間段(5天和14天)結束時，細胞用PBS洗滌2次且使用RLT緩沖液(Qiagen)在孔中直接裂解。來自裂解物的總RNA通過^吏用RNeasyMicro試劑盒(Qiagen)進行分離。這些RNA樣品將用于進一步分析，包括全局基因表達。結果使用CellTracksAutoPrep系統(tǒng)捕獲的CTCs看起來是存活的，盡管觀察到與親本細胞比較倍增速率中的降低白細月包在培養(yǎng)2天內相繼死亡因而不干護LCTC生長CTCs看起來分裂，盡管如預期的比對照親本細胞更慢與親本細胞比4支，關于CTCs的生長倍增時間為約〉2x在2次重復之間觀察到生長性質(質量和生存力)中的差異，從而暗示來自供體血液的可能作用30<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表VII.關于直接或預擴增;漢板DNA的Ct值(前列腺腺癌或正常)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>結果使用含或不含預擴增的QMSP檢測到在100ng或500ngPBL(分別與10,000或70,000個細胞等價)背景中的50pgCpGMDNA(與7個細胞等價)。對于預擴增和直接擴增反應產生良好的線性應答曲線。在初始研究中，與3個循環(huán)腫瘤細胞等價的來自前列腺腺癌的<20pgDNA產生對曱基化GS7P/區(qū)域特異的信號，且在70，000個PBL細胞的背景中檢測到。另一方面，未觀察到來自正常前列腺(PN)或血液(PBL)DNA的可檢測的信號，從而暗示曱基化的GS7P/的不存在。觀察到檢測在2.5xl0"拷貝的背景中的1個拷貝的嵌套式QMSP靈敏性(在500ng未曱基化的DNA中的20pg曱基化的DNA)。使用嵌套式QMSP法未檢測到顯著非特異性產物，且在凝膠上觀察到正確大小的最終PCR片段(數據未顯示)。進行進一步的測定最優(yōu)化實驗以增加檢測靈敏性和減少關于<3個細力包的Ct值。實施例14通過將前列腺癌細胞系(LnCAP和DU-145)摻加入供體血液內證實該測定對血液中的循環(huán)肺瘤細胞(CTCs)的效用在培養(yǎng)物中生長的前列腺胂瘤細胞系(LnCAP和DU-145)以30、100、300和500個細胞摻加入7.5ml供體血液內，隨后為通過CellSearchTM平臺的CellTracksAutoPrep系統(tǒng)使用ProfileKit捕獲CTCs。來自這些細胞的脫氧核糖核酸使用Qiagen樣i柱進行分離且實施亞硫酸氬鹽轉化反應。來自最后1個步驟的經修飾的DNA用于使用表III(22個循環(huán))和表V中的條件的2輪q-MSP反應。來自該實驗的結果顯示于表VIII和IX中。表預.來自CTCs(摻力口的細胞，LnCAP)的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>一式兩份反應的差異小于0.7Ct,除了其為1.5-1.7Ct的30個細胞。線性方程Y=-1.0x+22.83Y=-1.95x+26.73R2=0.98R2=0.99表IX.來自CTCs(摻加的細胞,Du-145)的Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>這些結果明確證實q-MSP可以成功地應用于來自具有前列腺癌的患者的CTCs。權利要求1.一種繁殖得自生物樣品的目的細胞的方法，其包括下述步驟a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集所述細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖所述細胞。2.根據權利要求1的方法，其中所述生物樣品選自尿、血液、血清、血漿、'淋巴、痰、精液、唾液、眼淚、胸膜液、肺液、支氣管灌洗、滑液、腹膜液、腹水、羊水、骨髓、骨髓抽吸物、腦脊髓液、組織裂解物或勻漿或細月包沉淀。3.根據權利要求1的方法，其中所述細胞用于測定適應癥的存在或不存在。4.根據權利要求3的方法，其中所述適應癥是癌癥、遺傳的基因素因的危險評估、癌細胞例如CTC的組織起源的鑒定、鑒定遺傳性疾病中的突變、疾病狀態(tài)(分期)、預后、診斷、監(jiān)控、對治療的應答、治療(藥理學)選擇、感染(病毒、細菌、支原體、真菌)、化學敏感性、藥物敏感性、轉移潛能或鑒定遺傳性疾病中的突變。5.根據權利要求1的方法，其中所述細胞通過抗體/磁性分離、熒光激活細胞分選術(FACs)、過濾或手工進行富集。6.根據權利要求5的方法，其中所述手工富集經由前列腺按摩。7.根據權利要求1的方法，其中所述繁殖經由體外、先體外后體內或體內i告養(yǎng)。8.根據權利要求l的方法，其中增殖是至少一次細胞倍增。9.根據權利要求1的方法，其中所述完整性通過目的細胞對污染細胞的增殖進行測定。10.—種測定來自生物樣品的細胞的轉移潛能的方法，其包括下述步驟a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集所述細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖所述細胞；c)從所述細胞中分離核酸和/或蛋白質；和d)分析所述核酸和/或蛋白質，以測定對轉移潛能特異的生物標記的存在、表達水平或狀態(tài)。11.一種由來自生物樣品的細胞鑒定遺傳性疾病中的突變的方法，其包括下述步驟a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集所述細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖所述細胞；c)/人所述細胞中分離核酸和/或蛋白質；和d)分析所述核酸和/或蛋白質，以測定對遺傳性疾病特異的生物標記的存在、表達水平或狀態(tài)。12.—種保存來自細胞的遺傳材料的方法，所述細胞來自生物樣品，所述方法包括下述步驟a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集所述細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖所述細胞；b)從所述細胞中分離核酸和/或蛋白質；和c)保存所述核酸和/或蛋白質。13.—種制備腫瘤細胞疫苗的方法，其包括下述步驟a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集所述細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖所述細胞；c)從所述細胞中分離核酸和/或蛋白質；和d)使用所述核酸和/或蛋白質以配制所述疫苗。14.一種組合物，其包含通過權利要求1的方法獲得的細胞。15.權利要求14的組合物，其中所述細胞是克隆群體。16.—種試劑盒，其包含用于執(zhí)行根據權利要求1的方法的生物標記斗企測試劑。17.—種物品，其包含用于執(zhí)行根據權利要求1的方法的生物標記才企測試劑。18.—種制備細胞產物的方法，其包括根據權利要求1繁殖細胞和收獲由所述細胞生產的產物。19.根據權利要求18的方法，其中所述產物是蛋白質。20.根據權利要求19的方法，其中所述蛋白質是抗體、細胞因子、細胞表面蛋白或重組蛋白質。21.—種篩選化學藥品的藥學功效的方法，其包括下述步驟根據權利要求l繁殖細胞、和對所述細胞實施所述化學藥品、和測量所述細胞對所述化學藥品的應答。22.—種制備原代細胞系的方法，其包括根據權利要求1繁殖細胞，和持續(xù)繁殖直至所述細胞形成細胞系的步驟。23.—種制備克隆細胞群體的方法，其包括下述步驟根據權利要求1繁殖細胞，和持續(xù)選擇克隆群體且繁殖直至所述細胞形成克隆細胞群體。全文摘要本發(fā)明提供了繁殖得自生物樣品的目的細胞的方法，其通過a)在維持足夠的細胞生存力的條件下富集細胞；和b)在有效允許細胞生存力、增殖和完整性的條件下繁殖細胞。文檔編號C12N5/00GK101466826SQ200780017308公開日2009年6月24日申請日期2007年3月13日優(yōu)先權日2006年3月13日發(fā)明者A·馬宗德,C·A·伯內特,C·H·蔡,D·喬達里,H·王,J·F·巴登,J·斯克爾頓,K·M·柯丁,T·維納申請人:維里德克斯有限責任公司