專利名稱：：通過伴隨有沉淀的發(fā)酵生產(chǎn)l-谷氨酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種通過伴隨有沉淀的發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被廣泛地用作調味品等的材料。技術背景L-谷氨酸主要是采用所謂的生產(chǎn)L-谷氨酸的并且屬于短桿菌屬、棒桿菌屬或微桿菌屬的棒狀細菌或其突變林通過發(fā)酵方法生產(chǎn)的(《氨基酸發(fā)酵》第195-215頁，GakkaiShuppan中心，1986)。作為采用其它的細菌菌林通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，現(xiàn)有公知的采用屬于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、青霉屬等的微生物的方法(美國專利3,220,929)，采用屬于假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、沙雷氏菌屬、念珠菌屬等的微生物的方法(美國專利3,563,857)，采用屬于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、產(chǎn)氣氣桿菌(目前稱作產(chǎn)氣腸桿菌)等的微生物的方法(日本專利出版物(kokoku)32-9393)，采用大腸桿菌突變林的方法(日本專利申請延遲公開(kokai)5-244970)等等。另外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)提出了一種通過采用屬于克雷伯氏菌屬、歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物生產(chǎn)L-谷氨酸的方法(日本專利申請延遲公開2000-106869)。此外，已經(jīng)公開了通過采用重組DM技術增強L-谷氨酸生物合成酶的活性來改善L-谷氨酸生產(chǎn)能力的多種技術。例如，據(jù)報道引入編碼來源于大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌的檸檬酸合酶的基因對于增強棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中的L-谷氨酸生產(chǎn)能力是有效的(日本專利出版物7-121228)。另外，日本專利申請延遲公開61-268185公開了一種攜帶重組DNA的細胞，所述的重組DNA含有來源于棒桿菌屬細菌的谷氨酸脫氫酶基因。再者，日本專利申請延遲公開63-214189公開了一種改善L-谷氨酸生產(chǎn)能力的技術，是通過擴增谷氨酸脫氫酶基因、異檸檬酸脫氫酶基因、烏頭酸水合酶基因以及檸檬酸合酶基因來實現(xiàn)的。盡管通過培育前面提到的微生物或者改進生產(chǎn)方法已經(jīng)大大地提高了L-谷氨酸的生產(chǎn)能力，但是仍需要在更低成本下開發(fā)更為有效地生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，以便適應未來不斷增長的需要。目前已知有一種方法，其中進行發(fā)酵時結晶L-氨基酸在培養(yǎng)基中累積(日本專利申請延遲公開62-288)。在該方法中，通過使培養(yǎng)物中積累的L-氨基酸沉淀來維持培養(yǎng)中L-氨基酸的濃度低于某一水平。具體地講，在發(fā)酵的過程中通過調節(jié)培養(yǎng)物的溫度和pH或者向培養(yǎng)基中加入表面活性劑來使L-色氨酸、L-酪氨酸或L-亮氨酸沉淀。當如上所述已知伴隨有使L-氨基酸沉淀的發(fā)酵方法的同時，適合于該方法的氨基酸為那些具有相對低的水溶性的氨基酸，并且已知沒有將該方法應用到具有高水溶性的氨基酸(如L-谷氨酸)的例子。另外，培養(yǎng)基必須具有低的pH以沉淀L-谷氨酸。但是，L-谷氨酸產(chǎn)生菌(如上面提到的那些細菌)不能在酸性條件下生長，因而L-谷氨酸的發(fā)酵是在中性條件下進行的(美國專利3，220，929和3，032，474;ChaoK.C.&FosterJ.W.《細菌學雜志》77,第715-725頁(1959))。于是，通過伴隨著沉淀的發(fā)酵來生產(chǎn)L-谷氨酸是未知的。此外，已知最嗜酸的細菌的生長受到有機酸(如醋酸、乳酸和琥珀酸)的抑制(Yasuro0shima編輯《極端環(huán)境微生物手冊》第231頁，科學論壇；BorichewskiR.M.《細菌學雜志》93，笫597-599頁(1967)等)。因此，據(jù)認為許多微生物在酸性條件下對同樣是有機酸的L-谷氨酸都是易感的，并且也沒有報道嘗試過對在酸性條件下顯示L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物的研究。
發(fā)明內容在以上提到的現(xiàn)有的情況下，本發(fā)明的一個目的在于搜尋和培育在低pH的條件下產(chǎn)生L-谷氨酸的微生物，以及提供一種采用得到的微生物通過伴隨著使L-谷氨酸沉淀的發(fā)酵來生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。本發(fā)明的發(fā)明人在研究通過發(fā)酵提高L-谷氨酸生產(chǎn)能力的過程中認識到由培養(yǎng)基中積累的高濃度L-谷氨酸對生產(chǎn)的抑制是提高生產(chǎn)能力的障礙之一。例如，細胞具有L-谷氨酸的分泌系統(tǒng)和吸收系統(tǒng)。但是，如果一旦分泌到培養(yǎng)基中的L-谷氨酸被再次摻入到細胞中的話，結果不僅是生產(chǎn)率下降，而且L-谷氨酸的生物合成反應也受到抑制。為了避免由所述的高濃度L-谷氨酸積累導致的生產(chǎn)抑制，本發(fā)明的發(fā)明人篩選出了可以在酸性條件下并且在高濃度L-谷氨酸存在的情況下增殖的微生物。結果，他們成功地從土壤中分離出具有所述特性的微生物，并從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了如下的內容。(1)一種微生物，所述的微生物可以在含有飽和濃度的L-谷氨酸和碳源的液體培養(yǎng)基中在特定的pH下代謝碳源，并且該微生物在所述pH下在所述液體培養(yǎng)基中具有以超過對應于所述飽和濃度的量積累L-谷氨酸的能力。(2)根據(jù)(l)的微生物，所述的微生物可以在所述液體培養(yǎng)基中生長。(3)根據(jù)(1)或(2)的微生物，其中所述的pH不高于5.0。(4)根據(jù)(l)-(3)之任一的微生物，所述的微生物至少具有下列特征之一(a)所述微生物在催化L-谷氨酸生物合成反應的酶活性方面有所增強；以及(b)所述微生物在催化由L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生除L-谷氨酸之外化合物的酶活性方面有所降低或缺陷。(5)根據(jù)(4)的微生物，其中所述催化L-谷氨酸生物合成反應的酶至少為一種選自檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶和谷氨酸脫氬酶的酶。(6)根據(jù)(4)或(5)的微生物，其中所述催化由L-谷氨酸生物合成途徑的分支反應并產(chǎn)生除L-谷氨酸之外化合物的酶為a-酮戊二酸脫氫酶。(7)根據(jù)(l)-(6)之任一的微生物，其中所述的微生物屬于腸桿菌屬。(8)根據(jù)(7)的微生物，所述的微生物為成團腸桿菌。(9)根據(jù)(8)的微生物，所述的微生物當在含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時與野生菌林相比具有導致更少地向胞外分泌粘性物質的突變。(10)—種用于通過發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，所述方法包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)如(1)-(9)之任一定義的微生物，其中將所述培養(yǎng)基的PH調節(jié)到使L-谷氨酸沉淀的pH下，以便在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L—谷氨酸并使L-谷氨酸沉淀。(11)一種用于篩選適合于在液體培養(yǎng)基中通過伴隨有使L-谷氨酸沉淀的發(fā)酵來生產(chǎn)L-谷氨酸的微生物的方法，所述方法包括將含有微生物的樣品接種到含有飽和濃度的L-谷氨酸和碳源的酸性培養(yǎng)基中，并選出可以代謝所述碳源的菌林。(12)根據(jù)(ll)的方法，其中將可以在所述培養(yǎng)基中生長的菌林選為可以代謝所述碳源的菌林。(13)根據(jù)(11)或(12)的方法，其中所述培養(yǎng)基的pH不高于5.0。根據(jù)本發(fā)明的方法，L-谷氨酸可以通過伴隨有使L-谷氨酸沉淀的發(fā)酵來生產(chǎn)。結果，培養(yǎng)基中的L-谷氨酸維持在低于某一濃度下，并且可以生產(chǎn)出來L-谷氨酸而不遭受高濃度L-谷氨酸的產(chǎn)物抑制。圖1顯示出來源于成團腸桿菌pTWVEK101的DNA片段的限制圖。圖2顯示出由來源于成團腸桿菌和來源于大腸桿菌的sucA基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比較，上面的序列成團腸桿菌；下面的序列大腸桿菌(下文中將采用相同的定義)。圖3顯示出由來源于成團腸桿菌和來源于大腸桿菌的sucB基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比較。圖4顯示出由來源于成團腸桿菌和來源于大腸桿菌的sdhB基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比較。圖5顯示出由來源于成團腸桿菌和來源于大腸桿菌的sucC基因的核苦酸序列推定的氨基酸序列的比較。圖6顯示出具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的質粒pMWCPG的構建。圖7顯示出具有廣宿主譜質粒RSF1010的復制起點和四環(huán)素抗性基因的質粒RSF-Tet的構建。圖8顯示出具有廣宿主譜質粒RSF1010的復制起點、四環(huán)素抗性基因、gltA基因、ppc基因和gdhA基因的質粒RSFCPG的構建。圖9顯示出具有gltA基因的質粒pSTVCB的構建。具體實施方式下面將詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明的微生物是這樣的一種微生物(l)它可以在含有飽和濃度的L-谷氨酸和碳源的液體培養(yǎng)基中在特定的pH下代謝碳源，并且(2)該微生物在所述pH下在所述液體培養(yǎng)基中具有以超過對應于所述飽和濃度的量積累L-谷氨酸的能力。術語"飽和濃度，，意指當培養(yǎng)基被L-谷氨酸飽和時溶解在液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酸的濃度。下面將要描述一種用于篩選可以在特定的pH下在含有飽和濃度的L-谷氨酸和碳源的液體培養(yǎng)基中代謝碳源的微生物的方法。將含有微生物的樣品接種到具有特定pH的含有飽和濃度的L-谷氨酸和碳源的液體培養(yǎng)基中，并且選出可以代謝所述碳源的菌林。對特定的pH并不作特別的限制，但其通常不高于約5.0、優(yōu)選不高于約4.5、更優(yōu)選不高于約4.3。通過伴隨著使L-谷氨酸沉淀的發(fā)酵，使用本發(fā)明的微生物來生產(chǎn)L-谷氨酸。如果pH太高的話，那么使微生物生產(chǎn)出足以沉淀的L-谷氨酸就變得困難起來。因此，pH優(yōu)選在上面提到的范圍內。如果降低了含L-谷氨酸的水溶液的pH的話，那么在y-羧基的pKa附近(4.25，25TC)L-谷氨酸的溶解度明顯下降。溶解度在等電點(pH3.2)時變得最低，并且沉淀出超過對應于飽和濃度量的L-谷氨酸。在取決于培養(yǎng)基組成的同時，在大約30TC下，L-谷氨酸在pH3.2下通常以10-20g/L的量溶解，在pH4.0下以30-40g/L的量溶解，在pH4.7下以50-60g/L的量溶解。通常不必使pH低于3.0，這是因為當pH開始低于某一數(shù)值時L-谷氨酸的沉淀作用出現(xiàn)平穩(wěn)段。但是，pH可以低于3.0。另外，"可以代謝碳源，，的微生物的說法意指它可以增殖或者即使它不能增殖但仍可以消耗碳源，即表示它代謝諸如糖或有機酸這樣的碳源。具體地講，例如當在合適的溫度下(例如28匸、37t:或50t))在pH5.0-4.0下(優(yōu)選pH4.5-4.0，更優(yōu)選pH4.3-4.0，仍然更優(yōu)選pH4.0)在含有飽和濃度的L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天時如果微生物增殖的話，那么該微生物可以代謝培養(yǎng)基中的碳源。此外，例如當在合適的溫度下(例如28X:、37匸或50*C)在pH5.0-4.0下(優(yōu)選pH4.5-4.0，更優(yōu)選pH4.3-4.0，仍然更優(yōu)選pH4.0)在含有飽和濃度的L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天時即使微生物不增殖的話，那么消耗培養(yǎng)基中碳源的微生物為可以代謝培養(yǎng)基中的碳源的微生物?？梢源x碳源的微生物包括可以在所述液體培養(yǎng)基中生長的微生物。微生物"可以生長"的說法意指它可以增殖或者即使它不能增殖但仍可以生產(chǎn)出L-谷氨酸。具體地講，例如當在合適的溫度下(例如28"C、37TC或50"C)在pH5.0-4.0下(優(yōu)選pH4.5-4.0，更優(yōu)選pH4.3-4.0，仍然更優(yōu)選pH4.O)在含有飽和濃度的L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天時如果微生物增殖的話，那么該微生物可以在培養(yǎng)基中生長。此外，例如當在合適的溫度下(例如28TC、37TC或501C)在pH5.0-4.0下(優(yōu)選pH4.5-4.0，更優(yōu)選pH4.3-4.0，仍然更優(yōu)選pH4.0)在含有飽和濃度的L-谷氨酸的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4天時即使微生物不增殖的話，那么在培養(yǎng)基中增加了L-谷氨酸的量的微生物為可以在所述培養(yǎng)基中生長的微生物。上述的選擇可以在相同的條件下或者在改變pH或L-谷氨酸濃度的條件下重復兩次或多次。最初的選擇可以在含有低于飽和濃度的L-谷氨酸的培養(yǎng)基中進行，此后接下來的選擇可以在含有飽和濃度的L-谷氨酸的培養(yǎng)基中進行。此外，可以選出具有有利特性(諸如突出的增殖率)的菌林。除了上述特性之外，本發(fā)明的微生物還具有在液體培養(yǎng)基中以超過對應于L-谷氨酸飽和濃度的量積累L-谷氨酸的能力。前面提到的液體培養(yǎng)基的PH優(yōu)選與用于篩選具有前述特性(1)的微生物的培養(yǎng)基是相同的或接近的。通常當pH變低時，微生物變得對高濃度的L-谷氨酸易感。因此，從對L-谷氨酸的抗性的觀點來看優(yōu)選pH是不低的，但從伴隨著使之沉淀的L-谷氨酸的生產(chǎn)來看低的pH則是優(yōu)選的。為了滿足這些條件，pH可以在3-5的范圍內，優(yōu)選4-5，更優(yōu)選4.0-4.7，仍然更優(yōu)選4.0-4.5,特別優(yōu)選4.0-4.3。作為本發(fā)明的微生物或者其所用的培育材料，可以提到的例如有屬于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、泛菌屬、歐文氏菌屬、埃希氏菌屬、棒桿菌屬、脂環(huán)酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、糖酵母屬等的微生物。在這些微生物中，屬于腸桿菌屬的微生物是優(yōu)選的。以下將主要針對屬于腸桿菌屬的微生物來說明本發(fā)明的微生物，但本發(fā)明可以應用到屬于其它屬的微生物中并且不限于腸桿菌屬。作為屬于腸桿菌屬的微生物，可以具體提到的有成團腸桿菌，優(yōu)選成團腸桿菌AJ13355菌林。作為一種可以在低pH下在含有L-谷氨酸和碳源的培養(yǎng)基中增殖的菌林，該菌林是從位于日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤中分離出來的。AJ13355的生理特性如下(1)革蘭氏染色陰性(2)抵抗氧的行為兼性厭氧(3)過氧化氫酶陽性(4)氧化酶陰性(5)硝酸鹽還原能力陰性(6)伏-波試驗陽性(7)曱基紅試驗陰性(8)脲酶陰性(9)丐l哚的產(chǎn)生陽性(10)游動性游動的(11)在TSI培養(yǎng)基中H2S的產(chǎn)生弱的活性(12)P-半乳糖苷酶陽性(13)同化糖的性質阿拉伯糖陽性蔗糖陽性乳糖陽性木糖陽性山梨醇陽性肌醇陽性海藻糖陽性麥芽糖陽性葡萄糖陽性側金盞糖醇陰性棉子糖陽性水楊苦陰性蜜二糖陽性(14)同化甘油的性質陽性(15)同化有機酸的性質檸檬酸陽性酒石酸陰性葡糖酸陽性醋酸陽性丙二酸陰性(16)精氨酸脫水酶陰性(17)鳥氨酸脫羧酶陰性(18)賴氨酸脫羧酶陰性(19)苯丙氨酸脫氨酶陰性(20)色素的形成黃色(21)明膠液化能力陽性(22)生長的pH:在pH4.0下有可能生長，在pH4.5-7時生長良好(23)生長溫度在25'C下生長良好，在30匸下生長良好，在37'C下生長良好，在42'C下有可能生長，在45"C下不可能生長?；谶@些細菌學的特性，將AJ13355確定為成團腸桿菌。將成團腸4干菌AJ13355(EnterobacteragglomeransAJ13355)于1998年2月19曰保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術生命工學工業(yè)技水研究所(郵政編碼305-8566，1-3，Higashil-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki，日本),并得到了射6入冊號為FERMP-16644。然后遵照布達佩斯條約的條款于1999年l月U日將其轉為國際保藏，并得到了射己入冊號為FERMBP-6614。本發(fā)明的微生物可以是最初就具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物，或者為通過采用突變處理、重組DNA技術等的培育賦予了或增強了L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物。例如通過提高催化L-谷氨酸生物合成反應的酶活性，可以賦予或增強L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。通過降低催化由L-谷氨酸生物合成途徑分支的并產(chǎn)生除L-谷氨酸之外化合物的反應的酶活性或者使該活性缺陷，也可以增強L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。作為催化L-谷氨酸生物合成反應的酶，可以提到的有谷氨酸脫氬酶(下文中又稱作"GDH")、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶(下文中又稱作"CS")、砩酸烯醇丙酮酸羧化酶(下文中又稱作"PEPC，，)、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油搭-3-磷酸脫氬酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶、葡糖磷酸異構酶等。在這些酶當中，CS、PEPC和GDH的一種、兩種或三種是優(yōu)選的。此外，優(yōu)選的是在本發(fā)明的微生物中所有三種酶，即CS、PEPC和GDH的活性均增加。特別地乳發(fā)酵短桿菌的CS是優(yōu)選的，這是因為它不受a-酮戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。為了增強CS、PEPC或GDH的活性，例如可以將編碼CS、PEPC或GDH的基因克隆在合適的質粒上并且用得到的質粒轉化宿主微生物。在轉化的菌林細胞中編碼CS、PEPC或GDH的基因(下文中分別簡寫為"gltA基因"、"ppc基因，，和"gdh基因，，)的拷貝數(shù)增加，從而導致CS、PEPC或GDH活性的增加。將克隆的gltA基因、ppc基因和gdhA基因單獨地或其任意兩種或三種組合引入到前面提到的起始親代菌林中。當引入兩種或三種所述基因時，可以把兩種或三種基因克隆在一種質粒上并引入宿主中，或者分別克隆在可以共存的兩種或三種質粒上并引入宿主中。可以將編碼同種酶的、但來源于不同微生物的兩種或多種基因引入到同一宿主中。對上述的質粒并沒有特別的限制，只要它們在屬于例如腸桿菌屬等的微生物細胞中可以自主復制，但是例如可以提到的有pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218，pACYC177，pACYC184等。除這些之外，也可以使用噬菌體DNA的栽體。轉化可以通過例如下列方法進行D.M.Morrison的方法(《酶學中的方法》68，326(1979));其中通過用氯化鈣處理受體細菌細胞來增加DNA通透性的方法(MandelM.與HigaA.《分子生物學雜志》53，159(1970));電穿孔(MillerJ.H."細菌遺傳學中的短過程，，冷泉港實驗室出版社，美國，1992)等。通過使gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多拷貝存在于前面提到的作為宿主的起始親代菌林的染色體DNA上，也可以增加CS、PEPC或GDH的活性。為了在屬于腸桿菌屬等微生物的染色體DNA上引入gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多個拷貝，可以使用其多拷貝存在于染色體DM上的序列(如存在于轉座因子末端上的重復DNA和反向重復序列)。另一方面，可以通過利用含gUA基因、ppc基因或gdhA基因的轉座子的轉移將所述基因的多拷貝引入到染色體DNA上。結果，增加了轉化的菌林細胞中gltA基因、ppc基因或gdhA基因的拷貝數(shù)，從而增加了CS、PEPC或GDH的活性。作為增加了拷貝數(shù)的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的來源的微生物，可以使用任何生物體，只要它具有CS、PEPC或GDH活性。其中作為原核生物的細菌，例如那些屬于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、沙雷氏菌屬、埃希氏菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬和芽孢桿菌屬的細菌是優(yōu)選的。作為具體的例子，可以提到的有大腸桿菌、乳發(fā)酵短桿菌等。gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以從上述微生物的染色體DNA中得到。通過使用在CS、PEPC或GDH活性方面缺陷的突變林，可以獲得gltA基因、ppc基因和gdhA基因，從而從前述微生物的染色體DNA中分離出補充了輔源營養(yǎng)的DNA片段。由于已經(jīng)闡述了這些埃希氏菌屬和棒桿菌屬細菌基因的核苷酸序列(《生物化學》22，第5243-5249頁(1983);《生物化學雜志》95，第909-916頁(1984);《基因》27，第193—199頁(1984);《微生物學》140，第1817-1828頁(1994);《分子基因遺傳學》218，第330-339頁(1989);《分子生物學》6，第317-326頁(1992))，因此它們也可以通過PCR利用基于各核苷酸序列合成的引物并以染色體DNA為模板來得到。除了前面提到的擴增基因之外，也可以通過增強gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表達來提高CS、PEPC或GDH的活性。例如，可以通過用其它更強的啟動子置換gltA基因、ppc基因或gdhA基因的啟動子來增強表達。例如，lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、X噬菌體的PK啟動子和Pl啟動子等已知為強啟動子。把啟動子被置換的gltA基因、ppc基因和gdhA基因克隆到質粒上并引入到宿主生物體中，或者通過采用重復DM、反向重復序列、轉座子等引入到宿主生物體的染色體DM上。通過用其它更強的啟動子置換染色體上gUA基因、ppc基因或gdhA基因的啟動子(參見WO87/03006和日本專利申請延遲公開61-268183)或者在各基因編碼序列的上游插入一個強啟動子(參見《基因》29，第231-241頁(1984))，也可以增強CS、PEPC或GDH的活性。具體地講，在含有啟動子被更強的啟動子或其部分置換的gUA基因、ppc基因或gdhA基因的DNA和染色體上相應基因之間可以進行同源重組。催化由L-谷氨酸生物合成途徑分支的并產(chǎn)生除L-谷氨酸之外化合物的反應的酶的例子包括ot-酮戊二酸脫氳酶(下文中又稱作"ocKGDH")、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉移酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合成酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉移酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。在這些酶當中，otKGDH是優(yōu)選的。為了獲得在屬于腸桿菌屬等的微生物中前述酶活性的降低或缺陷，通過普通的誘變或者遺傳工程方法，可以將導致所述酶的胞內活性降低或缺陷的突變引入前述酶的基因中。誘變方法的例子包括例如采用X光或紫外光照射的方法、用諸如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍之類的誘變劑處理的方法等。向該基因中引入突變的位點可以在編碼酶蛋白的編碼區(qū)中或者在用于調節(jié)表達的區(qū)域(如啟動子)中。遺傳工程方法的例子包括例如采用基因重組、轉導、細胞融合的方法等。例如，把抗藥基因插入克隆的靶基因中，以制備出已經(jīng)喪失了其功能的基因(缺陷基因)。隨后，將該缺陷基因引入宿主微生物的細胞中，并且通過采用同源重組以前面提到的缺陷基因置換染色體上的靶基因(基因破壞)。通過測量從候選菌林得到的細胞提取物或其純化部分的酶活性并且與野生菌林相比較，可以確定目標酶的胞內活性的降低或缺陷以及所述活性下降的程度。例如，otKGDH的活性可以由Reed等人的方法來測量(ReedL.J.與MukherjeeB.B.《酶學中的方法》13，第55-61頁(1969))。取決于目標酶，目標突變林可以基于突變抹的表型來選擇。例如，在有氧條件下在含葡萄糖的基本培養(yǎng)基或含醋酸或L-谷氨酸作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基中，缺陷ocKGDH活性或aKGDH活性降低的突變林不能增殖或者表現(xiàn)出顯著下降的增殖率。但是，通過向含有葡萄糖的基本培養(yǎng)基中添加琥珀酸或賴氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸，即使在相同的條件下仍可以進行正常的增殖。通過利用這些現(xiàn)象作為指示，可以選出具有降低了otKGDH活性或缺陷該活性的突變林。在W095/34672中詳細地描述了一種通過采用同源重組來制備乳發(fā)酵短桿菌的aKGDH基因缺陷林的方法。類似的方法可以應用于其它的微生物。此外，在《分子克隆第2版》(冷7^出版社，1989)等文獻中詳細地描述了一些技術，諸如基因的克隆以及DM的切割和連接、轉化等等。突變林的一個具體:子，可以提到的有成一團腸^菌AJ13356。將成團腸桿菌AJ13356(EnterobacteragglomeransAJ13356)于1998年2月19曰保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術生命工學工業(yè)技^M9f究所(郵政編碼305-8566,1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，曰本)，并得到了登記入冊號為FERMP-16645。然后遵照布達佩斯條約的條款于1999年1月11日將其轉為國際保藏，并得到了登記入冊號為FERMBP-6615。由于aKGDH-El亞單位基因(sucA)破壞的結果，成團腸桿菌AJ13356缺陷otKGDH活性。當在含糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)成團腸桿菌(本發(fā)明所采用的微生物的一個例子)時，有粘性物質向胞外分泌，從而造成了低的操作效率。因此，當使用具有這種分泌粘性物質特性的成團腸桿菌時，優(yōu)選使用與野生菌林相比分泌較少粘性物質的突變林。誘變方法的例子包括例如采用X光或紫外光照射的方法、用諸如N-甲基-N，-硝基-N-亞硝基胍之類的誘變劑處理的方法等。通過在含糖的培養(yǎng)基(例如含5g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基平板)中接種經(jīng)誘變的細菌細胞，在把平板傾斜大約45度的情況下培養(yǎng)它們并且選出沒有顯現(xiàn)出液體向下流動的菌落，可以選出粘性物質的分泌有所減少的突變林。在本發(fā)明中，可以以任意的順序賦予或增強L-谷氨酸的生產(chǎn)能力和賦予其它有利的特性(如上迷更少地分泌粘性物質的突變)。通過在將pH調節(jié)到使L-谷氨酸沉淀的pH下的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的微生物，伴隨著L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的沉淀可以生產(chǎn)并積累L-谷氨酸。通過在中性pH下開始培養(yǎng)、然后在使L-谷氨酸沉淀的pH下結束培養(yǎng)，也可以沉淀出L-谷氨酸。使L-谷氨酸沉淀的pH意指當微生物生產(chǎn)并積累L-谷氨酸時使L-谷氨酸沉淀的pH值。作為以上提到的培養(yǎng)基，可以使用含有碳源、氮源、無機鹽和有機痕量營養(yǎng)物(如視需要有氨基酸和維生素)的常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基，只要其pH被調節(jié)到使L-谷氨酸沉淀的pH?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中所用的碳源和氮源可以是任意的此類物質，只要它們可以被培養(yǎng)的菌林所利用。作為碳源，使用糖，比如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。另外，可以各自單獨地或與另一種碳源混合使用有機酸(如醋酸和檸檬酸)。作為氮源，使用氨、銨鹽(如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和醋酸銨)、硝酸鹽等等。作為有機痕量營養(yǎng)物，使用氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸、那些含有這些物質的物質(如胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白降解產(chǎn)物)。當使用對代謝或生長而言需要氨基酸等的營養(yǎng)缺陷型突變林時，必須補充所需的營養(yǎng)物。作為無機鹽，使用磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、錳鹽等。對于培養(yǎng)方法來說，在控制發(fā)酵溫度為20-421C以及pH為3-5(優(yōu)選4-5，更優(yōu)選4-4.7，特別優(yōu)選4-4.5)的情況下通常進行通氣培養(yǎng)。于是在經(jīng)過大約10小時至4天的培養(yǎng)后，在培養(yǎng)物中積累了大量的L-谷氨酸。在培養(yǎng)基中沉淀出超過對應于飽和濃度的量的積累的L-谷氨酸。在培養(yǎng)完成后，可以通過離心、過濾等手段收集培養(yǎng)物中沉淀的L-谷氨酸?？梢愿鶕?jù)已知的方法收集培養(yǎng)基中溶解的L-谷氨酸。例如，可以通過濃縮培養(yǎng)肉湯以使L-谷氨酸結晶來分離L-谷氨酸或者通過離子交換層析等加以分離。在結晶后，在培養(yǎng)肉湯中沉淀出來的L-谷氨酸可以與已溶于培養(yǎng)基中的L-谷氨酸一同分離出來。根據(jù)本發(fā)明的方法，沉淀出超過對應于飽和濃度的量的L-谷氨酸，并且培養(yǎng)基中溶解的L-谷氨酸的濃度維持在一個恒定的水平。因此，可以減少高濃度的L-谷氨酸對微生物的影響。于是，就有可能培育出具有進一步改善L-谷氨酸生產(chǎn)能力的微生物。此外，由于L-谷氨酸作為晶體而沉淀出來，因此抑制了由L-谷氨酸的積累導致的培育肉湯的酸化，并從而可以顯著地減少用于維持培養(yǎng)pH所用的堿的數(shù)量。下面，參照下列實施例將更加具體地說明本發(fā)明。<1>篩選在酸性環(huán)境下具有L-谷氨酸抗性的微生物如下進行在酸性環(huán)境中具有L-谷氨酸抗性的微生物的篩選。把從自然界(包括土壤、水果、植物體、河水)中獲得的大約500個樣品的每個樣品均以1g的量懸浮在5mL的無菌水中，把其中的200jliL涂覆在用鹽酸調節(jié)其pH至4.0的20mL固體培養(yǎng)基上。所述培養(yǎng)基的組成如下3g/L葡萄糖、lg/L(NH4)2S04、0.2g/LMgS04.7H20、0.5g/LKH2P04、0.2g/LNaCl、0.1g/LCaCl2.7H20、0.01g/LFeS04.7H20、0.01g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4邁g/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、50|ng/L生物素、50iug/L泛酸鈣、50pg/L葉酸、50iug/L肌醇、50pg/L煙酸、50jug/L對氨基苯甲酸、50ng/L鹽酸吡哆醇、50pg/L核黃素、50網(wǎng)/L鹽酸硫胺素、50mg/L放線菌酮、20g/L瓊脂。將在其上平鋪了上述樣品的鋪制的培養(yǎng)基在28X:、371C或50TC下培養(yǎng)2-4天，并且獲得了各自形成菌落的378個菌林。接下來，把如上所述得到的各菌林都接種到長16.5cm、直徑為14隨的試管中，該試管含有包含飽和濃度的L-谷氨酸的3mL液體培養(yǎng)基(用鹽酸調節(jié)至pH4.0)，并在振蕩下在281C、371C或50TC下培養(yǎng)24小時-3天。然后選出生長的菌林。前面提到的培養(yǎng)基的組成如下40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物。于是，成功地得到了在酸性環(huán)境中具有L-谷氨酸抗性的78個微生物菌林。<2>從具有L-谷氨酸抗性的微生物中選出在酸性環(huán)境中具有突出的生長速率的菌林把如上所述獲得的在酸性環(huán)境中具有L-谷氨酸抗性的各種微生物各自接種到長16.5cm、直徑為14mm的含有3mL培養(yǎng)基(用鹽酸調節(jié)至pH4.0)的試管中，該培養(yǎng)基是通過向M9培養(yǎng)基(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.與Maniatis，T.《分子克隆》冷泉港實驗室出版社，1989)中添加20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖得到的，并且隨時間的遷移測量培養(yǎng)基的濁度以選出具有有利生長速率的菌林。結果，作為呈現(xiàn)出有利生長的菌林，從位于日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤中得到了AJ13355菌林?；谄渖鲜黾毦鷮W特性，該菌林被確定為成團腸桿菌。<3>從成團腸桿菌AJ13355菌林中獲得較少分泌粘性物質的菌林由于當在含有糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時成團腸桿菌AJ13355菌林向胞外分泌粘性物質，因此操作效率是不利的。因而，通過紫外線照射的方法獲得較少分泌粘性物質的菌抹(Miller,J.H.等人《細菌遺傳學中的短過程實驗指南》笫150頁，冷泉港實驗室出版社，1992)。在距離60瓦紫外光燈60cm遠的位置處用紫外線照射成團腸桿菌AJ13355菌林2分鐘，并且在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜以鞏固突變。稀釋誘變的菌林，并將其接種在含有5g/L葡萄糖和20g/L瓊脂的LB培養(yǎng)基中，從而每個平板中大約有IOO個菌落出現(xiàn)，在將平板傾斜大約45度的情況下在30"C下培養(yǎng)過夜，然后選出沒有顯現(xiàn)出粘性物質向下流動的20個菌落。作為滿足下列條件的菌林，所述的條件為即使在含5g/L葡萄糖和20g/L瓊脂的LB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)5次之后仍沒有出現(xiàn)回復突變林，并且應當觀察到其生長等同于親代菌林在LB培養(yǎng)基中、在含有5g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中以及在向其中添加了20g/LL-谷氨酸和2g/L葡萄糖并用鹽酸調節(jié)其pH至4.5的M9培養(yǎng)基(Sambrook，J.等人《分子克隆第2版》冷泉港出版社，1989)中的生長，從以上選出的菌林中選出SC17菌林。<4>從成團腸桿菌SC17菌林構建谷氨酸產(chǎn)生菌(1)從成團腸桿菌SC17菌林制備aKGDH缺陷林從成團腸桿菌SC17菌林制備出缺陷aKGDH并具有增強了L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)的菌株。(i)克隆成團腸桿菌AJ13355菌林的aKGDH基因(下文中稱作"sucAB，，)通過從成團腸桿菌AJ13355菌林的染色體DM中選出補充了大腸桿菌aKGDH-El亞單位基因(下文中稱作"sucA，，)缺陷林之不同化醋酸特性的DNA片段來克隆成團腸桿菌AJ13355菌林的sucAB基因。通過采用當從大腸桿菌中提取染色體DNA時常用的方法分離出成團腸桿菌AJ13355菌林的染色體DM(《生物工程實驗教材》由日本生物科學與生物工程協(xié)會編寫，第97-98頁，Baifukan，1992)。用作載體的pTWV228(抗氨爺青霉素)是由TakaraShuzo有限公司商購的載體。通過使用T4連接酶連接用EcoT221消化的AJ13355菌林的染色體DNA和用Pstl消化的PTWV228，并將其用于轉化sucA缺陷的大腸桿菌JRG465菌林(Herbert,J.等人《分子基因遺傳學》105，182(1969))。從以上獲得的轉化菌林中選出在醋酸基本培養(yǎng)基中生長的菌林，從中提取出質粒并命名為pTWVEK101。除了同化醋酸的特性之外，攜帶有pTWVEK101的大腸桿菌JRG465菌抹還恢復了對琥珀酸或L-賴氨酸和L-曱硫氨酸的輔源營養(yǎng)。這表明pTWVEK101含有成團腸桿菌的sucA基因。圖1顯示出pTWVEK101中來源于成團腸桿菌的DNA片段的限制圖。圖1中畫有陰影線部分的測定的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在該序列中，發(fā)現(xiàn)了被認為是兩個全長0RFs的核苷酸序列以及被認為是0RFs的部分序列的兩個核苷酸序列。SEQIDN0S:2-5顯示出可以從5，端的順序由這些0RFs或部分序列編碼的氨基酸序列。對這些序列進行同源性檢索的結果表明測定了核苷酸序列的部分含有琥珀酸脫氫酶鐵-硫蛋白基因(sdhB)、全長sucA和aKGDH-E2亞單位基因(sucB)的3，-端部分序列，以及琥珀酰CoA合成酶p亞單位基因(sucC)的5，-端部分序列。由這些核苷酸序列推定的氨基酸序列與那些來源于大腸桿菌的序列(《歐洲生物化學雜志》141，第351-359頁(1984);《歐洲生物化學雜志》》141，第361-374頁(1984);《生物化學》24，第6245-6252頁(1985))比較的結果示于圖2-圖5中。因此，氨基酸序列各自顯示出非常高的同源性。另據(jù)發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌中的一樣(《歐洲生物化學雜志》141，第351-359頁(1984);《歐洲生物化學雜志》141，第361-374頁(1984);《生物化學》24，第6245-6252頁(1985))，sdhB-sucA-sucB-sucC的蔟構建在成團腸桿菌的染色體上。(ii)從成團腸桿菌SC17菌林中獲得aKGDH缺陷林通過采用如上所述獲得的成團腸桿菌的sucAB基因進行同源重組，以獲得成團腸桿菌的aKGDH缺陷林。在用Sphl消化pTWVEK101以切下含sucA的片段后，用克列諾片段(TakaraShuzo有限公司)使該片段的末端成為平端，并且通過采用T4DM連接酶(TakaraShuzo有限公司)將其與用EcoRI消化并用克列諾片段使末端成為平端的pBR322相連。通過采用該酶在基本上位于sucA中心處的限制酶BglII識別位點上消化得到的質粒，用克列諾片段使末端成為平端，然后通過采用T4DNA連接酶再次連接。據(jù)認為sucA基因不起作用，這是因為通過上述過程移碼突變被引入到新構建的質粒的sucA之中。用限制酶ApaLI消化如上所述構建的質粒，并進行瓊脂糖凝膠電泳以回收含有向其中引入了移碼突變的sucA和來源于pBR322的四環(huán)素抗性基因的DNA片段。通過采用T4DM連接酶再次連接回收的DNA片段，以構建出用于破壞otKGDH基因的質粒。通過電穿孔(Miller,J.H.《細菌遺傳學中的短過程；手冊》第279頁，冷泉港實驗室出版社，美國，1992)將如上所述得到的用于破壞ocKGDH基因的質粒用來轉化成團腸桿菌SC17菌林，并且通過采用四環(huán)素抗性作為指示獲得了這樣一種菌林，其中通過質粒的同源重組位于染色體上的sucA被突變型的sucA置換。將得到的菌林命名為SC17sucA菌抹。為了證實SC17sucA菌林aKGDH活性的缺陷，通過Reed等人的方法(Reed，L.J.與Mukherjee，B.B.《酶學中的方法》13，第55-61頁(1969))經(jīng)過使用在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至對數(shù)生長期的菌林細胞來測量酶活性。結果，由SC17菌林中測得aKGDH的活性為0.073(AABS/min/mg蛋白)，而從SC17sucA菌林中檢測不到aKGDH的活性，從而證實如預期的那樣缺陷了sucA。(2)增強成團腸桿菌SC17sucA菌林的L-谷氨酸生物合成系統(tǒng)接下來，將來源于大腸桿菌的檸檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脫氫酶基因引入SC17sucA菌林中。(i)制備攜帶有來源于大腸桿菌的gUA基因、ppc基因和gdhA基因的質粒通過參照圖6和圖7將說明制備攜帶有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的質粒的步驟。用HindIII和Sphl消化攜帶有來源于大腸桿菌的gdhA基因的質粒pBRGDH(日本專利申請延遲公開7-203980)，并通過T4DNA聚合酶處理使兩個末端都成為平端，然后純化并回收攜帶有gdhA基因的DNA片段。單獨地用Xbal消化攜帶有來源于大腸桿菌的gltA基因和ppc基因的質粒pMWCP(W097/08294)，然后通過采用T4DNA聚合酶使兩個末端都成為平端。將該片段與以上純化的攜帶gdhA基因的DNA片段混合，并通過采用T4連接酶連接以得到質粒p匿CPG，它對應于還含有gdhA基因的pMWCP(圖6)。與此同時，用Notl消化具有廣宿主譜質粒RSF1010的復制起點的質粒pVIC40(日本專利申請延遲公開8-047397)，用T4DM聚合酶處理并用Pstl消化。用EcoT141消化pBR322，用T4DNA聚合酶處理并用Pstl消化?；旌线@兩種產(chǎn)物，并通過采用T4連接酶連接以獲得攜帶有RSF1010的復制起點和四環(huán)素抗性基因的質粒RSF-Tet(圖7)。隨后，用EcoRI和PstI消化pMWCPG，并且純化和回收攜帶有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片段。類似地用EcoRI和Pstl消化RSF-Tet，并且純化和回收攜帶有RSF1010的復制起點的DNA片段。混合這兩種產(chǎn)物，并通過采用T4連接酶連接以獲得質粒RSFCPG，該質粒對應于含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(圖8)。通過補充來源于大腸桿菌的gltA、ppc或gdhA基因缺陷林的輔源營養(yǎng)并測量各種酶的活性，經(jīng)證實得到的質粒RSFCPG表達gltA基因、ppc基因和gdhA基因。(ii)制備攜帶有來源于乳發(fā)酵短桿菌的gltA基因的質粒如下構建出攜帶有來源于乳發(fā)酵短桿菌的gltA基因的質粒。通過采用攜帶有SEQIDN0S:6和7所示核苷酸序列的引物DM并以乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA為模板進行PCR以獲得約3kb的gltA基因片段，其中所述的引物DNA是基于谷氨酸棒桿菌gltA基因的核苷酸序列(《微生物學》140，笫1817-1828頁(1994))制備的。將該片段插入到用Smal消化的質粒pHSG399(購自TakaraShuzo有限公司)以得到質粒pHSGCB(圖9)。隨后，用HindIII消化pHSGCB，并將切下的約3kb的gltA基因片段插入到用HindIII消化的質粒pSTV29(購自TakaraShuzo有限公司)以得到質粒pSTVCB(圖9)。通過測量成團腸桿菌AJ13355菌林中的酶活性，經(jīng)證實得到的質粒pSTVCB表達glU基因。(iii)將RSFCPG和pSTVCB引入SC17sucA菌林中通過電穿孔用RSFCPG轉化成團腸桿菌SC17sucA菌林，以便得到具有四環(huán)素抗性的轉化SC17sucA/RSFCPG菌林。進一步通過電穿孔用pSTVCB轉化SC17sucA/RSFCPG菌林，以便得到具有氯霉素抗性的轉化<4>獲得在低pH的環(huán)境下對L-谷氨酸具有改善的抗性的菌林從成團腸桿菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌林中分離出在低pH的環(huán)境下對高濃度L-谷氨酸具有改善的抗性的菌林(下文中又稱作"低pH下高濃度谷氨酸抗性菌林")。在30'C下在LBG培養(yǎng)基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖)中培養(yǎng)SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌林過夜，適當?shù)叵♂層名}水洗滌的細胞并將其平鋪在M9-E培養(yǎng)基(4g/L葡萄糖、17g/LNa2HP04-12H20、3g/LKH艮0.5g/LNaCl、1g/LNH4C1、10mMMgSOo10一CaCl2、50mg/LL-賴氨酸、50mg/LL-甲硫氨酸、50mg/LDL-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素、25mg/L氯霉素、30g/LL-谷氨酸，用氨水調節(jié)至pH4.5)平板上。得到在32'C下培養(yǎng)2天后出現(xiàn)的菌落作為在低pH下高濃度谷氨酸的抗性菌抹。對得到的菌林來說，測量在M9-B液體培養(yǎng)基中的生長水平，并且在體積為50ml的含有5mlL-谷氨酸生產(chǎn)測試培養(yǎng)基(40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P0,、0.5g/LNaCl、0,25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS(V2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0,72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2MoO"2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、200mg/LL-甲硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽、25mg/L氯霉素)的大試管中測試L-谷氨酸的生產(chǎn)能力。把呈現(xiàn)出最佳生長水平的并且與其親代菌林SCU/RSFCPG+pSTVCB具有相同L-谷氨酸生產(chǎn)能力的菌林命名為成團腸桿菌AJ13601,把AJ13601菌株(EnterobacteragglomeransAJ13601)于1999年8月18日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術生命工學工業(yè)技木研究所(郵政編碼305—8566，1—3，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，并得到了登記入冊號為FERMP-17516。然后遵照布達佩斯條約的條款于2000年7月6日將其轉為國際保藏，并得到了登記入冊號為FERMBP-7207<5>培養(yǎng)成團腸桿菌AJ13601菌抹用來生產(chǎn)L-谷氨酸(1)把成團腸桿菌AJ13601菌林接種到含有300ml培養(yǎng)基的1升發(fā)酵罐中，所述培養(yǎng)基含有40g/L葡萄糖、20g/L(mU2S0o0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、200mg/LL-曱硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素，并且在341C和pH6.0下培養(yǎng)14小時。通過向培養(yǎng)基中通入氨氣來控制培養(yǎng)的pH。把如上所述得到的培養(yǎng)物在5000rpm下離心10分鐘，并且把收集的細胞接種到含有300ml培養(yǎng)基的1升發(fā)酵罐中，所述的培養(yǎng)基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、600mg/LL-甲硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素，在34"C和pH4.5下進行培養(yǎng)來生產(chǎn)L-谷氨酸。通過向培養(yǎng)基中通入氨氣來控制培養(yǎng)的pH。當最初加入的葡萄糖被耗盡時，繼續(xù)添加600g/L的葡萄糖。通過如上所述進行了50個小時的用于生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸結晶。表1顯示出當時溶解在培養(yǎng)肉湯中的L-谷氨酸的濃度以及通過把結晶溶解在2M氫氧化鉀中測得的L-谷氨酸的濃度。在使培養(yǎng)物保持靜置后，通過傾析從培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸結晶。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><6>培養(yǎng)成團腸桿菌AJ13601菌林用來生產(chǎn)L-谷氨酸(2)為了驗證即使在L-谷氨酸結晶存在的條件下成團腸桿菌AJ13601菌林仍然具有L-谷氨酸生產(chǎn)能力，從而進行下列實驗。把成團腸桿菌AJ13601菌林接種到含有300ml培養(yǎng)基的1升發(fā)酵罐中，所述培養(yǎng)基含有40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、200mg/LL-曱硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素，并且在34TC和pH6.0下培養(yǎng)14小時。通過給培養(yǎng)基鼓入氨氣來控制培養(yǎng)物的pH。把如上所述得到的培養(yǎng)物在5000rpm下離心10分鐘，然后在其中L-谷氨酸以結晶存在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)收集的細胞。所用的培養(yǎng)基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、600mg/LL-曱硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素，并且添加L-谷^氨酸結晶至40g/L。把細胞接種到含有300ml所述培養(yǎng)基的l升發(fā)酵罐中，并且在341C和pH4.3下進行培養(yǎng)來生產(chǎn)L-谷氨酸。通過向培養(yǎng)基中通入氨氣來控制培養(yǎng)的pH。當最初加入的葡萄糖被耗盡時，繼續(xù)添加600g/L的葡萄糖。在該培養(yǎng)基中，僅有39g/L添加的L-谷氨酸在pH4.3下溶解，而剩余的1g/L仍以結晶存在。通過如上所述進行了53個小時的用于生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸結晶。表2顯示出溶解在培養(yǎng)肉湯中的L-谷氨酸的濃度、當時以結晶存在的L-谷氨酸的量以及通過把結晶溶解在2M氫氧化鉀溶液中測得的L-谷氨酸的濃度。在使培養(yǎng)物保持靜置后，通過傾析從培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸結晶。結果表明即使在L-谷氨酸結晶存在的條件下，成團腸桿菌AJ13601菌林仍然積累L-谷氨酸并且沉淀出其結晶。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><7>培養(yǎng)成團腸桿菌AJ13601菌林用來生產(chǎn)L-谷氨酸(3)成團腸桿菌AJ13601菌林不僅可以在酸性pH下生長，而且可以在中性pH下生長。因此，通過在中性pH下開始培養(yǎng)并使得在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生L-谷氨酸，從而應當自發(fā)地降低培養(yǎng)物的pH，如下證實了也可以沉淀出L-谷氨酸結晶。把在30X:下在含25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素的LBG瓊脂培養(yǎng)基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖、15g/L瓊脂)上培養(yǎng)了14個小時的一平板(直徑為8.5cm)成團腸桿菌AJ13601菌林的細胞接種到含有300ml培養(yǎng)基的1升發(fā)酵罐中，所述的培養(yǎng)基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-賴氨酸鹽酸鹽、600mg/LL-曱硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四環(huán)素鹽酸鹽和25mg/L氯霉素，并且在34TC和pH7.0下開始培養(yǎng)。通過向培養(yǎng)基中通入氨氣來控制培養(yǎng)物的pH。當最初加入的葡萄糖被耗盡時，繼續(xù)添加600g/L的葡萄糖。當積累L-谷氨酸時，pH自發(fā)地降低。調節(jié)通入的氨氣的量，以便在培養(yǎng)開始后的15小時-24小時之間時pH應當逐步地由7.0降至4.5，而在培養(yǎng)開始后的24小時時pH變?yōu)?.5。之后，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。通過如上所述進行了36個小時的用于生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸結晶。表3顯示出溶解在培養(yǎng)肉湯中的L-谷氨酸的濃度、當時以結晶存在的L-谷氨酸的量以及通過把結晶溶解在2M氫氧化鉀溶液中測得的L-谷氨酸的濃度。在使培養(yǎng)物保持靜置后，通過傾析從培養(yǎng)物中收集L-谷氨酸結晶。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>序列表<110>AjinomotoCo.，Inc.<120>通過伴隨有沉淀的發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的方法<130><150>JP11-234806<151>1999-08-20<150>JP2000-78771<151>2000-03-21<160>7<170>PatentIn2.0版<210>1<211>4556<212>DNA<213>成團腸桿菌<220><221>CDS<222>(2)..(121)<220><221>CDS<222>(322)..(3129)<220><221>CDS<222>(3145)..(4368)<220><221>CDS<222>(4437)..(4556)<400>1tgcattcagegttUccgctgtescageateatgaactgtgtaagtgtt49AlaPheSerValPheArgCysHisSerlieMetAsnCysValSerVal151015tgtcctgggetasacccgacgcgcgetateggccacattaagteg97CysProLysGlyLeuAsnProThrArgAlalieGlyHislieLysSer202530atgctgctgcaacgcagegcgtagttataccaccgggaacc.tcaggttccc148MetLeuLeuGinArgSerAla35ggtattttacggaagcctctgtaaacgcggtcccaaccacgtttacaaaggttcccttac208gggccgggcgcgcgctgcgcacagtgctcgtatcgctgaactcactacggcaaaccgcga268aagcggcaacaaatgaaacctcaaaaaagcataacattgcttaagggatcacaatg324Met1cag33Cagegcgatgaagccctggctggactectectggctggccggc372GinAsnSerAla5MetLysProT「pLeu10AspSerSerT卬Leu15AlaGlygcgcsgtcttacatagagcaaetctatgaggatttcctg3CCgart420AlaAsnGin20SerTyrlieGluGin25l_euTyrGluAspPhe30LeuThrAspcctgactctgtggatgesgtgtggcgctcg3tgttccaacsgttaCC3468ProAsp35SerValAspAlaVal40TrpA「gSerMetPheGin45GinLeuProggcacgggagtgcctgagcagttcC3Ctecgcaactcgcgaatat516GlyThrGlyValLysProGluGinPheHisSerAlaThrArgGluTyr50556065ttccgtcgcctggcggacgestctcgttacacctecgtt3CC564PheArgArgLeuAla70LysAspAlaSerArg75TyrTh「SerSerVal80Thrgatccggcasice幼ctecC33gtggtgctgcagctgatt612AspProAlaThr85AsnSerLysGinVal90LysValLeuGinLeu95lieAsngcgtttcgtttccgcggacatcaggaagessaitetcgatccgcttggc660AlaPheArg100PheArgGlyHisGin105GluAlaAsnl_euAsp"0ProGlyctgtgg的3csggsccgcgttgccgatetcgatcctgcctttC3Cgat708LeuTrp115LysGinAspArgVal120AlaAspLeuAspProAla125PheHisAspctg3CCgccgatUtcaggasagetttaacgtaggttcttttgcc756LeuThrAspAlaAspPheGinGluSerPheAsnValGlySerPheAla130135140U5attggc333g333CCatg33gctggccgatctgttcgacgcgctgaag804lieGlyLysGluThr150MetLysLeuAlaAsp155l_euPheAspAlaLeu160Lyscag3CCtgtggctcgattggtgcagagtatatg■cacateaat犯c852GinThrTyrCys165GlySerlieGlyAla170GluTyrMetHislie175AsnAsnaccg幼gsgaaacgctggstccagcagcgtategaatecggtgcgage900ThrGluGluLysArgTrplieGinGinArglieGluSerGlyAlaSe「180185190cagacgteattcagtggcgaagagggtttcctggagctg948GinThrSerPheSerGlyGluGluLysl_ysGlyPheLeuLysGluLeu195200205gcggaagggctggaaaaatatctgggcgcgaaattcccgggt996ThrAlaAlaGluGlyLeuGluLysTyrl_euGlyAlaLysPheProGly210215220225gca幼3cgtttctcgctgg站ggcggtgatgcgctggtgccgatgctg驅AlaLysArgPheSerLeuGluGlyGlyAspAlal_euValPro他tLeu230235240cgcgagatgattcgtcatgcgggc咖的cggcacscgtgsagtggt3證ArgGluMetlieArgHisAlaGlyLysSerGlyThrArgGluValVal245250255選用杜仲、人參、首烏、鹿茸、大棗、枸杞、百合、龍眼肉、山楂、蜂蜜。白酒為原料;通過以下生產(chǎn)工藝組配成1、篩選按照工藝要求凈選，采用挑選、風選、剪、切、刮、削、剔除、刷、擦及泡洗方法，清除原料中的雜質或分離去除非原料部分，使原料和輔料都達到質量要求。2、清洗。對各種原料分別用水清洗淘洗、漂洗、噴淋洗滌等方法，將藥物清洗干凈。清洗后根據(jù)工藝要求及時干燥。3、切制、粉碎根據(jù)藥材性質，采用直接碎切，沖擊粉碎，冷凍后粉碎等方法，將原料切成片、段、塊等。切制后根據(jù)工藝要求及時干燥。4、炮炙各類藥材根據(jù)《中華藥典》規(guī)定的方法進行炮炙。5、干燥根據(jù)工藝要求選用不同的干燥方法和干燥設備。溫度一般不超過80'C，含揮發(fā)性物質的不超過60'C。6、粉碎、過篩粒度應掌握在3—5毫米左右。7、配料根據(jù)配伍，分別稱量，裝入特制的網(wǎng)狀不銹鋼容器(150cmX150cmX100cm)中。8、浸提應用傳統(tǒng)的浸漬法。酒基選用60°以上蒸餾原酒。采用"冷浸提法"提取。浸泡時間夏天5——7天，冬天7——10天。用原酒分3次浸提(實踐中用兩次浸提即可)。浸提液合并，藥渣用純凈水沖洗。沖洗水待調酒用。本發(fā)明的有益效果是其有效成分含量高，雜質少，苦澀味??；不僅吸收快，而且釋放度高，可直接被腸壁吸收，通過血液循環(huán)流遍全身，盡快到達病灶區(qū)，提高治療效果，比其他劑型的藥物更便于服用，且劑量小，成本低。下面結合附圖和具體實施方式，對本發(fā)明作詳細說明。圖l是本發(fā)明的工藝流程圖。實施例1:杜仲3g人參3g首烏9g鹿茸1g大棗10g枸杞3g百合8g龍眼肉8g山楂2g蜂蜜30g白酒1000ral。實施例2:杜仲6g人參6g首烏llg鹿茸3g大棗20g枸杞7g百合12g龍眼肉12g山楂6g蜂蜜70g白酒1000ml。實施例3:杜仲5g人參5g首烏10g鹿茸2g大棗15g枸杞5g百合10g龍眼肉10g山楂5g蜂蜜60g白酒1000ml。實施例4:本發(fā)明的生產(chǎn)方法是l、篩選按照工藝要求凈選，采用挑選、風選、剪、切、刮、肖IJ、剔除、刷、擦及泡洗方法，清除原料中的雜質或分離去除非原料部分，使原料和輔料都達到質量要求。2、清洗。對各種原料分別用水清洗淘洗、漂洗、噴淋洗滌等方法，將藥物清洗干凈。清洗后根據(jù)工藝要求及時干燥。3、切制、粉碎根據(jù)藥材性質，采用直接碎切，沖擊粉碎，冷凍后粉碎等方法，將原料切成片、段、塊等。.切制后根據(jù)工藝要求及時干燥。ccttatccggcacaggttgacatg333cgcctgaaggaactggcaUg2004ProTyrProAlaGinValAspMetLysArgLeuLysGluLeuAlaLeu550555560cgtateagecsggtccctgagcagattgaagtgcagtcgcgcgtggcc2052ArglieSerGinValProGluGinlieGluValGinSerArgValAla565570575aagatetat紛cgatcgcaagctgatggccgaaggcgag幼agcgttc2100LyslieTyrAsnAspArg匕ysLeuMetAlaGluGlyGluLys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20日發(fā)明者伊藤久生,原吉彥,守屋美加,平野圣子,松井和彥,泉井裕申請人:味之素株式會社