專利名稱：：來自巴西鳶尾的富含類黃酮的組織及其培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及巴西秀尾(Neomaricagracilis)的富含類黃酮的離體根莖組織，其通過使用能夠增殖的巴西秀尾(N.gracilis)組織的組織培養(yǎng)法獲得，所述能夠增殖的巴西秀尾組織的例子如根、葉、葉的基部和/或根莖。巴西豸尾富含類黃酮的根莖組織含有秀尾黃素酮，其明顯不同于野生的不含有糞尾黃素酮的巴西鴛尾根莖。本發(fā)明還提供一種用于培養(yǎng)富含類黃酮的離體根莖組織的方法、一種由富含類黃酮的根莖組織提取秀尾黃素酮的方法以及用于確定富含類黃酮的根莖組織中駑尾黃素酮數(shù)量的定量方法。
背景技術(shù)：
：植物化學(xué)成分是植物天然形成的用來保護(hù)自身對(duì)抗細(xì)菌、病毒和真菌的物質(zhì)。由于多數(shù)的植物化學(xué)成分表現(xiàn)出延緩衰老過程并降低癌癥、心臟病及其他慢性健康狀況風(fēng)險(xiǎn)的作用，因此近年來植物化學(xué)成分受到較多的關(guān)注。已經(jīng)在植物食品中發(fā)現(xiàn)超過900種不同的植物化學(xué)成分，但其中仍然有其他的成分有待發(fā)現(xiàn)。水果、蔬菜、全谷食品(wholegrains)、大豆和堅(jiān)果是這些抗擊疾病的物質(zhì)的所有來源。植物化學(xué)成分通常涉及植物色素，因此具有鮮艷色彩(黃色、橙色、紅色、藍(lán)色、紫色、綠色)的水果和蔬菜含有的植物化學(xué)成分最多。類黃酮是一類植物化學(xué)成分，很長時(shí)間以來已經(jīng)被公認(rèn)具有抗炎、抗氧化、抗變應(yīng)性、肝臟保護(hù)、抗血栓、抗病毒和抗癌活性。類黃酮是典型的酚類化合物，因此可作為有效的金屬螯合劑和自由基清除劑起作用。它們均為強(qiáng)效的斷鏈抗氧化劑。類黃酮顯示出強(qiáng)大的生物化學(xué)和藥理學(xué)作用陣容，其中的某些作用表明此類化合物中的某些成員可以顯著地影響各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的功能。近年來的報(bào)道指出植物類黃酮引起參與控制固氮作用的細(xì)菌(根瘤菌(i/2/zO&WW))調(diào)節(jié)基因的活化，其表明特定的類黃酮與哺乳動(dòng)物基因的活化和表達(dá)之間存在重要的相關(guān)性(參見如Midddledton等人，PharmacologicalReviews,2000,52:673-751)。豸尾黃素酮屬于黃酮類化合物。近年來，對(duì)于豸尾黃素酮潛在效應(yīng)的開發(fā)取得了一定進(jìn)展，豸尾黃素酮已經(jīng)表現(xiàn)出抗菌、抗炎和預(yù)防癌癥的活性。此外，已經(jīng)證明秀尾黃素酮刺激前列腺素的生成、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的增殖、選"f奪性地調(diào)節(jié)雌激素受體的活性并且控制平滑^L的收縮。秀尾黃素酮通常由糞尾科植物提取，豸尾科植物的例子如德國:t尾(IrisgermanicaL.)、香才艮秀尾(IrispallidaLam)、全唇秀尾(Irisnigricans)、花菖蒲(Irisensata)、溪蓀(Irissanguinea)、山鶩尾(Irissetosa)和射干(Belamacandachinensis)(B.chinensis)。根莖中的糞尾黃素酮含量受生長條件的影響，比如溫度和濕度。至于射干，在能夠收割其根莖用于提取鶩尾黃素酮之前，通常需要生長2-3年。因此，仍然存在對(duì)能夠使得具有高駑尾黃素酮含量的植物有效生長的方法的需求。巴西鶩尾(Neomaricagracilis)(N.gmcilis)是很常見的園藝植物，其屬于秀尾科。巴西秀尾可以較低的成本大規(guī)模地進(jìn)行栽培。然而，天然生長的巴西秀尾的根莖不含有鴛尾黃素酮。在本發(fā)明隨后部分提出的，巴西豸尾的離體根莖由組織培養(yǎng)法獲得，可以在大約1或2個(gè)月后進(jìn)行收割。巴西糞尾的離體根莖富含類黃酮并且含有高濃度的駑尾黃素酮，這種根莖可以作為禽尾黃素酮的來源使用
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供巴西鳶尾富含類黃酮的離體組織，其在組織培養(yǎng)環(huán)境下制備，所述組織培養(yǎng)環(huán)境可改變野生巴西秀尾的類黃酮含量。特別地，本發(fā)明富含類黃酮的組織含有大量的鳶尾黃素酮。巴西鴛尾富含類黃酮的離體組織優(yōu)選為根莖組織，其通過將能夠增殖的巴西秀尾組織進(jìn)行培養(yǎng)獲得。能夠增殖的巴西秀尾組織的例子包括巴西糞尾的根、根莖、葉和葉的基部。在制備富含類黃酮的巴西鳶尾組織的組織培養(yǎng)中使用了培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基包括(l)植物生長調(diào)節(jié)劑，(2)鹽培養(yǎng)基和(3)碳水化合物。植物生長調(diào)節(jié)劑(PGR)包括細(xì)胞分裂素或生長素。PGR的例子包括但不限于吲哚-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、a-萘乙酸、6-苯曱基-氨基嘌呤、激動(dòng)素和/或其混合物。植物生長調(diào)節(jié)劑優(yōu)選濃度約0.01-2.0mg/L。優(yōu)選的鹽培養(yǎng)基為Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(即MS培養(yǎng)基)，其包括但不限于下述的鹽鈉、鉀、硝酸鹽、銨、鎂、硫酸鹽、鈣、鐵、氯化物、磷酸鹽、錳、碘、硼酸鹽、鋅、銅、鉬、鈷或其混合物。碳水化合物的例子包括肌醇、蔗糖或其混合物。任選地，培養(yǎng)基可以含有維生素，所述維生素的例子如鹽酸硫胺素、吡P多醇鹽酸鹽和煙酸以及嘧啶醇。培養(yǎng)基具有約5-7的pH。組織培養(yǎng)法包括優(yōu)選在震搖條件下的瓶培養(yǎng)、間歇浸沒系統(tǒng)(TIS)或其組合。來自巴西秀尾的富含類黃酮的組織含有豸尾黃素酮的含量為每Kg重量干燥組織約2.5-65mg。8周后，MS0(即沒有加入植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基)中固體組織培養(yǎng)物的類黃酮總量為每g干重的富含類黃酮的組織約含10.74mg(基于使用viz-^尾黃素酮作為標(biāo)準(zhǔn)物的測(cè)量值)。本發(fā)明還提供一種由巴西鳶尾獲得富含類黃酮的離體組織的方法。所述方法包括(l)將巴西豸尾組織接種于組織培養(yǎng)物的培養(yǎng)基；和(2)使組織培養(yǎng)物中的巴西秀尾組織生長足夠長的時(shí)間以允許根莖組織形成。巴西鳶尾組織能夠進(jìn)行下述部位的細(xì)胞復(fù)制，如根、葉、葉的基部或根莖。優(yōu)選將培養(yǎng)基保持在約20°C-30°C。組織培養(yǎng)為瓶培養(yǎng)、間歇浸沒系統(tǒng)(TIS)或其組合。用于形成巴西秀尾富含類黃酮的根莖組織的足夠長時(shí)間約為4-8周。TIS允許巴西糞尾組織有待每隔2-4小時(shí)浸入培養(yǎng)基中約1-3分鐘。本發(fā)明還提供一種由巴西秀尾富含類黃酮的組織提取鳶尾黃素酮的方法。所述方法包括(l)干燥來自巴西秀尾的富含類黃酮的離體組織以便獲得干燥的富含類黃酮的組織；(2)將醇加至干燥的富含類黃酮的組織以形成懸浮液；(3)加熱所述懸浮液至形成熱懸浮液；和(4)在所述熱懸浮液冷卻后過濾所述熱懸浮液以便收集含有鶩尾黃素酮的濾液。干燥富含類黃酮的離體組織的優(yōu)選方法為冷凍干燥法。加熱懸浮液的優(yōu)選方式是使用超聲波振動(dòng)，同時(shí)將該懸浮液在約50-70。C加熱約1小時(shí)?？梢约又粮稍锏?、富含類黃酮的離體組織的醇的例子為曱醇或乙醇。任選地，在加入醇之前可以將干燥的富含類黃酮的離體組織磨細(xì)。優(yōu)選通過使熱懸浮液經(jīng)過Whatman1號(hào)濾紙來收集濾液。通過高效液相色譜(HPLC)測(cè)定由巴西秀尾富含類黃酮的組織提取的^尾黃素酮總量。優(yōu)選的用于HPLC的柱子為Cosmosil5C18-AR-II柱。優(yōu)選的洗脫液為含有體積比55:45的曱醇與水(含有0.1%的乙酸)的溶液。使用viz-鴛尾黃素酮(Sigma⑧T-9165)作為標(biāo)準(zhǔn)物在大約265nm處測(cè)量鳶尾黃素酮的含量。困1為顯示間歇浸沒系統(tǒng)的圖，該間歇浸沒系統(tǒng)是本發(fā)明中使用的兩個(gè)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的一個(gè)(另一個(gè)組織培養(yǎng)系統(tǒng)是瓶培養(yǎng)系統(tǒng))。困2為顯示瓶培養(yǎng)中巴西鴛尾富含類黃酮的離體根莖組織的接種重量比對(duì)生長速率的影響圖。對(duì)MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的根莖組織進(jìn)行為期3周的數(shù)據(jù)采集，其中所述MS培養(yǎng)基含有0.5mg/L的6-苯曱基-氨基嘌呤(BA)、0.1mg/L的2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)和0.84mg/L的a-萘乙酸(NAA)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差范圍(errorbars)代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。困3是顯示。引咪-3-乙酸(IAA)和激動(dòng)素對(duì)巴西秀尾富含類黃酮的離體根莖組織中生物量增長的影響圖，其中根莖組織由瓶培養(yǎng)獲得。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差范圍代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。增長的生物量=目前的鮮重-2周以前的鮮重。困4是顯示在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周的巴西駑尾的生長曲線圖，所述MS培養(yǎng)基含有0.1mg/L(令)的a-萘乙酸(NAA)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)(ata)表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差范圍代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。圖5是顯示在0.1mg/L(o)的MS+NAA或lmg/L的NAA以及0.1mg/L的2,4-D(國)中培養(yǎng)8周的富含類黃酮的根莖中豸尾黃素酮的含量圖。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差范圍代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。圍6是顯示在嘧咬醇存在的條件下，巴西^尾根莖組織的幼芽形成的合成圖像。在培養(yǎng)三周后進(jìn)行拍攝。標(biāo)尺-lcm。板(a):于第7天加入0.5mg/L的嘧咬醇；板(b):于第7天加入2.0mg/L的嘧啶醇；板(c):于第14天加入2.0mg/L的嘧咬醇，以及板(d)無任何嘧啶醇的對(duì)照培養(yǎng)。困7顯示接種物重量和植物生長調(diào)節(jié)劑(PGR)對(duì)巴西豸尾根莖組織生長速度的影響圖。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值并且誤差范圍代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。生長速度=(最后的F.W,最初的F.W.)/最初的F.W.發(fā)明詳述本發(fā)明一方面涉及巴西秀尾富含類黃酮的組織，其由能夠增殖和進(jìn)行細(xì)胞復(fù)制的巴西秀尾組織的組織培養(yǎng)獲得，所述能夠增殖和進(jìn)行細(xì)胞復(fù)制的巴西糞尾組織的例子如根、葉、葉的基部和根莖。所述富含類黃酮的組織為離體的根莖組織，其由于含有秀尾黃素酮而明顯不同于野生巴西秀尾的根莖。近年來的研究已經(jīng)證明秀尾黃素酮具有消除自由基、攔截腫瘤進(jìn)程以及抑制致病菌和真菌，如幽門螺桿菌(h.pylori)和霉菌等的藥物療效。豸尾黃素酮具有如下所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)式豸尾黃素酮廣泛地存在于多種秀尾科和豆科植物的根莖或根中，所述秀尾科和豆科植物的例子如鹽沼秀尾(Irisspuria)、Iriscarthaliniae和德國秀尾(Irisgermanica)以及葛藤(puerariathunbergiana)。然而，這些植物中的秀尾黃素酮含量太低以致于不能作為秀尾黃素酮的來源使用。秀尾黃素酮的主要來源來自于天然生長的射干的根莖。然而，射干具有約2-3年的緩慢的生長速度(即從播種到收獲)，這使得秀尾黃素酮的釆集難以實(shí)現(xiàn)。與射干相反，巴西豸尾是一種容易生長和繁殖的受歡迎的半戶外植物。但是，巴西鴛尾卻不含秀尾黃素酮。巴西秀尾屬于駑尾科馬蝶花屬，馬蝶花屬包括16個(gè)種藍(lán)花睡蓮(N.caerulea)、N.capitellata、N.caulosa、紫露草(N.fluminensis)、巴西鶩尾(N.gracilis)、N.imbricata、黃巴西駑尾(N.longifolia)、N.nitida、馬蝶花(N.northiana)、N.paradoxa、N.portosecurensis、N.rotundata、N.rupestris、N.sabini、N.silvestris和N.variegata。巴西豸尾原產(chǎn)于非洲西部的熱帶區(qū)域和美洲的中部及南部，其中大部分產(chǎn)于巴西。巴西秀尾是多年生草本植物，其經(jīng)由粗根莖和幼芽繁殖，這些幼芽從曾經(jīng)開過花的莖長出。本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，所述方法通過相對(duì)短的、通常在4-8周之間的時(shí)間周期的組織培養(yǎng)技術(shù)使具有高濃度秀尾黃素酮的巴西秀尾的離體根莖組織生長，從而提供了秀尾黃素酮的新來源。所述方法包括下述步驟將巴西豸尾組織接種于培養(yǎng)基中，并使巴西秀尾組織生長足夠長的時(shí)間直到根莖組織發(fā)育。巴西駑尾組織可以是由天然生長的巴西^尾或培養(yǎng)的、能夠增殖的巴西秀尾獲得的任何組織。優(yōu)選地，巴西鳶尾組織是采自巴西鳶尾根、根莖、葉或葉的基部的組織。所述培養(yǎng)基包括至少一種植物生長調(diào)節(jié)劑(PGR)、一種鹽和一種碳水化合物。PGR造成或促進(jìn)正在培養(yǎng)室中繁殖的外植組織的分化或脫分化。PGR的例子包括但不限于生長素和細(xì)胞分裂素。生長素是大部分生根混合物(rootingmixtures)中的活性成分。生長素有助于植物的無性繁殖。生長素在細(xì)胞水平影響細(xì)胞延長、細(xì)胞分裂和不定根的形成。某些生長素在極低的濃度即具有活性。生長素可以在0.0001-20mg/L,優(yōu)選在0.01-10mg/L,更優(yōu)選在0.01-2.0mg/L的濃度范圍使用。生長素的例子包括但不限于4-聯(lián)苯乙酸、3-氯-4-羥苯乙酸、4-羥苯乙酸、吲咮-3-乙酸(IAA)、。引咮-3-丙酸、吲咮-3-丁酸、吲哚-3-乙酰基-L-丙氨酸、吲咮-3-乙?；?DL-門冬氨酸、巧l咮-3-乙?；?DL-色氨酸、吲哚-3-乙?；鶃A-纈氨酸、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和a-萘乙酸(NAA)。通常，細(xì)胞分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂、刺激莖芽增殖、激活基因表達(dá)和代謝活性。同時(shí)，細(xì)胞分裂素抑制根部形成。這使得細(xì)胞分裂素有益于植物細(xì)胞組織的培養(yǎng)中期望植物細(xì)胞組織能夠茁壯地生長卻無根部形成的情況。此外，細(xì)胞分裂素延緩植物的衰老過程。細(xì)胞分裂素可以在0.0001-20mg/L,優(yōu)選在0.01-10mg/L,更優(yōu)選在0.01-2.0mg/L的濃度范圍使用。細(xì)胞分裂素的例子包括但不限于N-(3-曱基-2-丁烯)-lH-嘌呤-6-胺、6-苯曱基-氨基嘌呤(BA)、激動(dòng)素和玉米素。鹽的例子包括無機(jī)酸鹽、有機(jī)酸鹽，所述無機(jī)酸鹽的例子如硝酸、鹽酸、磷酸、硫酸、硼酸、碘酸(iodionacid);所述有機(jī)酸鹽的例子如乙酸、丙二酸、扁桃酸、草酸、乳酸、乳糖酸、富馬酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸。所述鹽可以是鈉、鉀、鈣、銨、鐵、鎂、錳、鋅、銅或鈷鹽。培養(yǎng)基可以含有多種鹽的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括促進(jìn)外植的植物組織生長的營養(yǎng)素，所述營養(yǎng)素的例子如Murashige&Skoog,Phvsiol.Plant"15,473-497(1962)中所提出的大量營養(yǎng)素和微量營養(yǎng)素，在下文中將這些營養(yǎng)素稱為"MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基"。MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有的鹽稱為"MS鹽"。本發(fā)明上下文中使用的MS鹽包括適當(dāng)濃度的硝酸銨、硼酸、氯化釣、氯化鈷、硫酸銅、Na2-EDTA、硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、鉬酸、碘化鉀、硝酸鉀、磷酸二氬鉀、硝酸鈉、磷酸二氬鈉和辟u酸鋅。碳?xì)浠衔锟梢允菍?duì)植物培養(yǎng)具有營養(yǎng)價(jià)值的任何碳?xì)浠衔?。?yōu)選地，碳?xì)浠衔餅樘穷悺８鼉?yōu)選地，碳?xì)寤衔餅榧〈?、蔗糖或其混合物。培養(yǎng)基可以另外包括其他的組分，如氨基酸、維生素或其混合物。優(yōu)選的維生素包括但不限于維生素Bl(鹽酸^5克胺素)、維生素B6(吡哆醇鹽酸鹽)和維生素B3(煙酸)。將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至適于巴西鳶尾生長的pH范圍。該pH范圍優(yōu)選在4和8之間，并且更優(yōu)選在5和7之間。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括用于將pH保持在期望水平的適宜的緩沖劑。這些藥劑通常具有約4.5和約5.5之間的pKa,并且包括但不限于檸檬酸、N-嗎啉代-乙磺酸(ethansulfonicacid)、鄰苯二曱酸氫鉀和苯曱酸。培養(yǎng)物的溫度通常保持在約30。C或低于約30。C,優(yōu)選在約20-30。C的范圍內(nèi)。期望的生長周期為2-16周，優(yōu)選4-8周。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包括MS鹽、蔗糖(30g/L)、肌醇(IOOmg/L)、6-苯曱基-氨基噤呤(BA)(0.5mg/L)、2,4-二氯苯氧基乙酸(dichrophenoxyaceticacid)(2,4-D)(0.1mg/L)和a-萘乙酸(NAA)(0.84mg/L)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在持續(xù)攪拌狀態(tài)下進(jìn)行巴西鳶尾組織的培養(yǎng)。在另外的實(shí)施方案中，將巴西鳶尾組織在間歇浸沒系統(tǒng)(TIS)中培養(yǎng)。如圖1所示，通過將植物組織間歇性地浸入培養(yǎng)基中來以TIS滋養(yǎng)和用氧飽和植物。簡(jiǎn)要地，室IO將培養(yǎng)物12保持在'歸網(wǎng)14上或保持在籃中。將低壓空氣泵入室10，迫使液體培養(yǎng)基16上升并浸泡培養(yǎng)物12。空氣流還氧化并攪動(dòng)培養(yǎng)基16。當(dāng)空氣流被中斷時(shí)，壓力停止，并且培養(yǎng)基16返回室10的底部。典型地，TIS的所有組分均可高壓滅菌并且可以重復(fù)使用。該系統(tǒng)可以使大規(guī)模的植物組織培養(yǎng)自動(dòng)化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，巴西豸尾組織每隔2-4個(gè)小時(shí)被培養(yǎng)基浸沒1-3分鐘。本發(fā)明的另一方面提供具有高濃度駑尾黃素酮的、培養(yǎng)的巴西鳶尾組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織每kg重量的干燥根莖具有鳶尾黃素酮的含量為2.5-65mg/kg。使用\|/-鳶尾黃素酮作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行測(cè)量，在含有不加入PGR的MS培養(yǎng)基(MSO)的固體培養(yǎng)物中，培養(yǎng)的巴西鴛尾根莖組織每g重量的干燥根莖具有的類黃酮總含量為10.741±0.311(平均值士S.E.)mg。本發(fā)明的另一方面涉及由巴西鴛尾組織提取類黃酮的方法。所述方法包括下述步驟干燥組織，粉碎干燥的組織，將研細(xì)的組織懸浮于醇中，加熱懸浮液并過濾所述懸浮液獲得類黃酮的提取物?？梢酝ㄟ^任何方法來干燥植物組織，優(yōu)選通過使用冷凍真空干燥器的冷凍干燥來干燥植物組織。醇可以是任何醇，優(yōu)選曱醇或乙醇。優(yōu)選將醇加熱至50。C-70。C的溫度范圍，并且更優(yōu)選帶有搖動(dòng)、振動(dòng)或聲處理的加熱。優(yōu)選的振動(dòng)方法是超聲波振動(dòng)。以下的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果是示例性的，不限制本發(fā)明的范圍。此處可以作出合理的變動(dòng)而不脫離本發(fā)明的范圍，所述合理的變動(dòng)如由適宜的技術(shù)人員所想到的那些。此外，在本發(fā)明的描述中，為了清楚說明而采用了專業(yè)術(shù)語。然而，本發(fā)明不預(yù)期受限于所選擇的專業(yè)術(shù)語。有待理解的是每種特異性的要素包括所有以相似方式操作來達(dá)到相似目的的技術(shù)改造(technicalequivalents)。實(shí)施例實(shí)施例1:材料和方法巴西秀尾富含類黃酮的離體根莖組織由大同大學(xué)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室(TatungUniversityPlantTissueCultureLab)培養(yǎng)。每月將根莖組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其中MS基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基添加有30g/L蔗糖、100mg/L肌醇、0.5mg/LBA、0.1mg/L2,4-D和0.84mg/LNAA。絲差液體培養(yǎng)基包括MS基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(Murashige和Skoog,l962)(表1),所述MS基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基添加有30g/L蔗糖、100mg/L肌醇和根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)而不同的植物生長因子。通過將8g/L瓊脂加至液體培養(yǎng)基來制備固體培養(yǎng)基。在8xl.5xl.5cm培養(yǎng)管(IOml培養(yǎng)基/管)或燒瓶(30ml培養(yǎng)基/燒并瓦)中進(jìn)行固體培養(yǎng)。在分別具有10ml、50ml或100ml培養(yǎng)基的50ml、100ml或250ml燒瓶中進(jìn)行液體培養(yǎng)。使用鋁箔遮蓋培養(yǎng)管或燒瓶的開口。TIS培養(yǎng)使用了由A-TechBioscientificCo.Ltd.獲得的Plantima系統(tǒng)。向各個(gè)培養(yǎng)室中加入約200ml的培養(yǎng)基。如所教導(dǎo)的，將塑料導(dǎo)管和無菌濾膜放置在氣體入口和氣體出口處。使用棉花和鋁箔覆蓋濾膜，并且使用夾鉗固定塑料導(dǎo)管以防止水蒸汽進(jìn)入濾膜中。使用鋁箔遮蓋培養(yǎng)室。所有的培養(yǎng)基均具有5.70±0.05的pH值，并且在1.1-1.2kg/cm2的壓力下，于121°C高壓滅菌15分鐘。表1.MS的基礎(chǔ)鹽組合物(Murashige和Skoog,1962)化學(xué)物質(zhì)_mg/1大量營養(yǎng)素KN031900NH4N031650MgS04.7H20370CaCl2.2H20440KH2P04170微量營養(yǎng)素MnS04.4H2022.3KI0.83H3B030.2ZnS04,7H208.6CuS04.5H200.025Na2Mo04.2H200.25CoCl2.6H200.025FeS04.7H2027.8Na2EDTA37.3(1)為了確定接種重量的作用(以接種體鮮重/100ml培養(yǎng)基的克百分?jǐn)?shù)表示)，將液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織以0.5、1、1.5、2、3、4、5、10或15%(g鮮重(F.W.)/100ml培養(yǎng)基)的接種重量比接種于繼代培養(yǎng)基中，所述繼代培養(yǎng)基含有MS基礎(chǔ)鹽、0.5mg/LBA、0.1mg/L2,4-D和0.84mg/LNAA。在接種三周后將培養(yǎng)的組織進(jìn)行稱重。(2)為了確定植物生長調(diào)節(jié)劑(PGR)的作用，使用手術(shù)刀將來自液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織的幼芽切除。該根莖組織以3%(gF.W./50ml)的接種重量接種于含有MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，所述MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加有如表2所示的PGR。每隔兩周更換一次培養(yǎng)基。在全部的八周中，于每次更換培養(yǎng)基時(shí)將培養(yǎng)的組織進(jìn)行稱重。(3)為了測(cè)量巴西秀尾根莖組織的生長曲線和鶩尾黃素酮的含量，使用手術(shù)刀將液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織的幼芽切除。該根莖組織以(gRW./50ml)接種重量接種于含有MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，所述MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加有0.1mg/LNAA或1mg/LNAA與1.0mg/L2,4-D的混合物。在連續(xù)的八周中，每隔一周將該組織進(jìn)行稱重并分析禽尾黃素酮的含量。(4)為了確定嘧啶醇對(duì)幼芽形成和鴛尾黃素酮含量的影響，將液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織以3%(gRW./100ml)的接種重量接種于繼代培養(yǎng)基中，所述繼代培養(yǎng)基含有MS、0.5mg/LBA、0.1mg/L2，4-D和0.84mg/LNAA。在培養(yǎng)的第7天和第14天，將無菌過濾的(0.2um)嘧啶醇加至培養(yǎng)基中直至達(dá)到0.5、1.0或2.0mg/L的終濃度。監(jiān)控組織的生長并分析秀尾黃素酮的含量。表2.燒瓶培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)巴西^尾組織生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>rzs潛^TISPlantima⑧培養(yǎng)系統(tǒng)從臺(tái)灣臺(tái)北的A-TectBioscientificCo.,Ltd.購買。(1)為了確定接種重量對(duì)組織生長的影響，將TIS培養(yǎng)室分成四個(gè)區(qū)域。在每個(gè)區(qū)域中分別接種1.5、3、6和9g的液體培養(yǎng)的巴西豸尾根莖組織。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，所述MS培養(yǎng)基添加有如表3的樣品T12、T17和T18中所描述的PGR。在Plantima⑧用戶手冊(cè)詳細(xì)描述的條件下培養(yǎng)組織并且每三個(gè)小時(shí)將組織浸沒2分鐘。每隔十天將培養(yǎng)的組織稱重并更換培養(yǎng)基。(2)為了確定PLR對(duì)巴西禽尾生長的作用和對(duì)秀尾黃素酮含量的影響，將十段液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織接種于培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有表3樣品MSO、TI3、TI4、TI5和TI6中所描述的MS和PGR。在第2周更換培養(yǎng)基以及在第4周收割組織并用于分析豸尾黃素酮的含量。表3.TIS培養(yǎng)中植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)巴西秀尾組織生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>賴#麟微巴西豸尾的根莖組織在冷凍真空干燥器(VirTisFreezemobile12XL)中于-8(TC冷凍IO小時(shí)，干燥過夜并研細(xì)。將0.5g干燥并研細(xì)的組織懸浮于10ml燒瓶中的足量曱醇，將孵育過的研細(xì)的組織懸浮于10ml燒瓶中的足量甲醇，使用超聲振動(dòng)在60。C孵育1小時(shí)并冷卻。然后將曱醇加至該懸浮液中至10ml的終體積。使用Whatman1號(hào)濾紙過濾懸浮液。過濾的溶液密封于棕色的樣品瓶并放置在冷凍室中以便用于以后的實(shí)驗(yàn)。在測(cè)量豸尾黃素酮的含量之前，將鴛尾黃素酮標(biāo)準(zhǔn)物(SigamaT-9165,\|/-秀尾黃素酮)溶液和樣品溶液通過0.45um的濾器過濾。過濾的樣品密封于2ml棕色的HPLC瓶用于作進(jìn)一步的分析。類斧銜,惑量的豸量根據(jù)Lee等人，J.Agric.FoodChem.(2003)51:7292-7295測(cè)量類黃酮的總量。簡(jiǎn)要地，將4ml去離子水和0.3ml5。/。的NaNO2加至大約0.5ml的巴西駑尾提取物以形成樣品混合物并允許反應(yīng)約5分鐘。隨后向反應(yīng)的樣品混合物中加入約0.3ml的10%AlCl3并允許在充分振搖的條件下進(jìn)一步反應(yīng)另外5分鐘。繼之加入2mlINNaOH和2.9ml去離子水以使樣品混合物進(jìn)一步反應(yīng)。然后通過使用UV分光光度計(jì)(Ultrospec2000，PharmaciaBiotech)測(cè)量510nm波長處的吸光度來確定所得的反應(yīng)樣品混合物中類黃酮的總量，并且將數(shù)據(jù)與使用，:^尾黃素酮作為標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較。通過HPLC分析測(cè)定組織提取物的秀尾黃素酮含量，所述HPLC分析使用了Cosmosil5C18-AR-II4主(5pm,4.6x250mm)、Lichrospher100RP-18e保護(hù)柱(45x4.6mm，5pm，Merck)、脫氣(ERC-3415a)泵、Waters600E自動(dòng)采樣和注射器(SchambeckSGDGmbHS5200)、WatersTM486UV/VIS檢測(cè)器和積分儀(SISCXunhuaLtd.)。使用55:45比例的曱醇:1120(0.1%的乙酸)、0.8ml/min的流速和265nm的檢測(cè)波長施行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)物的^尾黃素酮峰在大約13min出現(xiàn)。鍵##所有的測(cè)量均重復(fù)三次。使用具有5%顯著性水平的Duncan多范圍枱r-驗(yàn)(Duncan'smultiplerangetest)分析實(shí)-瞼H據(jù)(DuncanD.B.1955，Biometrics,11:1-42)。教悉夢(mèng)魔,械源在立體顯微鏡(OlympusSZ-ET)下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。使用數(shù)碼照相機(jī)(Nikoncoolpix8700)進(jìn)行才聶1象記錄。實(shí)施例2:燒瓶培養(yǎng)中接種重量對(duì)組織生長的影響將液體培養(yǎng)的巴西豸尾根莖組織以0.5、1、1.5、2、3、4、5、10或15%(g鮮重(F.W.)/100ml培養(yǎng)基)的接種重量接種于繼代培養(yǎng)基中，所述繼代培養(yǎng)基含有MS、0.5mg/LBA、0.1mg/12,4-D和0.84mg/LNAA。如圖2所示，3%(g鮮重(F.W.)/100ml培養(yǎng)基)的接種重量產(chǎn)生了最高的生長速度，即大約四倍的鮮重增長((鮮重的增長倍數(shù)=最終的鮮重-最初的鮮重)/最初的鮮重)。當(dāng)接種重量大于4%時(shí)重量增益減少，可能是由于受到了燒瓶中空間和供應(yīng)營養(yǎng)的限制。實(shí)施例3:燒瓶培養(yǎng)中PGR對(duì)組織生長和秀尾黃素稱含量的影響將巴西秀尾根莖組織以3%(gRW./100ml)的接種重量接種于培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有添加不同數(shù)量PGR(表2)的MS。每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基并測(cè)量組織的鮮重。在培養(yǎng)的6-8周期間觀察到鮮重顯著增加(圖3)。在表2中所列出的15種激動(dòng)素/IAA組合中，僅有4種組合(即Bl、Cl、C2和Dl)使得鴛尾黃素酮含量顯著增力n。在導(dǎo)致豸尾黃素酮含量增加的4種組合中，0.5mg/LIAA/0mg/L激動(dòng)素的組合獲得了最高的秀尾黃素酮含量37.6±4.9mg/kgD.W.(表4)。似乎將激動(dòng)素加入培養(yǎng)基中并沒有引起豸尾黃素酮含量的任何增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>1.在培養(yǎng)8周后采集數(shù)據(jù)，并且數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值士S.E。2,通過Duncan多范圍檢驗(yàn)，在每欄中繼之以相同字母(a-d)的平均值無顯著性差異(P>0.05)。在2，4-D和NAA存在條件下培養(yǎng)的所有組織中和在某些僅僅使用NAA培養(yǎng)的組織中也發(fā)現(xiàn)了駑尾黃素酮含量的增力口(表5)。在1.0mg/LNAA與0.1mg/L2，4-D(60.9±0.67mg/kgD.W.)存在的條件下、在僅0.5mg/LNAA(58.9±0.23mg/kgD.W.)和僅0.1mg/LNAA(55.5±0.67mg/kgD.W.)存在的條件下培養(yǎng)的組織中發(fā)現(xiàn)了最高的鴛尾黃素酮含量。當(dāng)NAA單獨(dú)使用時(shí)，NAA濃度的增加導(dǎo)致干重的減少。使用0.1mg/L濃度的NAA獲得了最大的干重(表5)。表5.NAA和2,4-D對(duì)巴西秀尾根莖組織的干重和駑尾黃素酮含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>1.在培養(yǎng)8周后采集數(shù)據(jù)，并且數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值土S.E。2.通過Duncan多范圍檢驗(yàn)，在每欄中繼之以相同字母(a-e)的平均值無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)施例4:在生長期間巴西秀尾的生長il;變和秀尾黃素稱的含量將根莖組織以3%(gF.W./50ml)的接種重量接種于含有MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，所述MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加有0.1mg/LNAA或1mg/LNAA與1.0mg/12,4-D的混合物。在連續(xù)的八周中，每周將組織稱重并分析豸尾黃素酮的含量。如圖4所示，在添加有0.1mg/LNAA的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的根莖組織在第3-4周和第6-7周的時(shí)間周期中快速地生長。在第5周和第8周存在很少的生長。在添加有1mg/1NAA和1.0mg/12,4-D的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的根莖組織顯示出相似的生長曲線。至于生長期間的秀尾黃素酮含量，在兩種培養(yǎng)條件下檢測(cè)到了最高的含量(對(duì)于0.1mg/LNAA與1mg/LNAA/1.0mg/L2,4-D分別為56±2.82mg/kgD.W.與43±2.15mg/kgD.W.)。豸尾黃素酮的含量在第2周明顯降低，達(dá)到最低點(diǎn)7±0.42mg/kgD.W.,并在3-4周以后逐漸地增加。豸尾黃素酮的含量在第5周顯示出另一次明顯減少并且在第6-8周期間再次增加(圖5)。在培養(yǎng)的相同時(shí)間，于MS0(即無PGR的MS培養(yǎng)基)中進(jìn)行固體培養(yǎng)的組織里類黃酮的總含量通常高于在液體培養(yǎng)基和TIS中培養(yǎng)的組織里類黃酮的總含量。在包括MS0的、培養(yǎng)約8周的固體組織中類黃酮的總含量相當(dāng)于每g干重約10.74±0.31mg的xi;-糞尾黃素酮，其與由射干全草提取的類黃酮總含量相似，其中射干以其高的類黃酮濃度而著稱?；诖颂幩玫南嗤瑴y(cè)量方法，射干中的類黃酮總含量約為每g干重11.50±0.1mg\(/-鶩尾黃素酮。實(shí)施例5:嘧啶醇對(duì)培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織的幼芽形成和秀尾黃素嗣含量的影響將液體培養(yǎng)的巴西駑尾根莖組織以3%(gF.W./100ml)的接種重量接種于繼代培養(yǎng)基中，所述繼代培養(yǎng)基含有MS、0.5mg/LBA、0.1mg/L2,4-D和0.84mg/LNAA。在培養(yǎng)的第7天和第14天，將無菌過濾的(0.2um)嘧啶醇加至培養(yǎng)基中直至達(dá)到0.5、1.0或2.0mg/L的終濃度。監(jiān)控組織的生長并分析秀尾黃素酮的含量。如表6所示，于第14天將0.5或2.0mg/L的嘧啶醇加至組織培養(yǎng)物中導(dǎo)致鴛尾黃素酮含量的降低。于第7天將嘧啶醇加至組織培養(yǎng)物中并沒有影響秀尾黃素酮的含量。但是，在形態(tài)學(xué)上，于第7天將嘧啶醇加至組織培養(yǎng)物中導(dǎo)致幼芽形成的顯著減少(圖6)。表6.嘧啶醇對(duì)巴西^尾根莖組織的秀尾黃素酮含量的影響嘧啶醇(mg/L)加入時(shí)間(day)秀尾黃素酮、mg/kgD.W.)對(duì)照—32.81±0.72ab20.5728.31±0.11b1.0727.74±0.08b2.0735.65±0.18a0.51418.59±0.07c1.01430.81±0.35a2.01413.36±0.13d1.在培養(yǎng)3周后采集數(shù)據(jù)，并且數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值土S.E。2.通過Duncan多范圍檢驗(yàn)，在每欄中繼之以相同字母(a-d)的平均值無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)施例6:接種對(duì)巴西秀尾生物量增長的影響將TIS培養(yǎng)室分成四個(gè)區(qū)域并將液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織以1.5、3、6和9g的接種重量接種到每個(gè)區(qū)域中。培養(yǎng)基為添加有PGR的MS培養(yǎng)基，所述PGR如表3樣品TI2、TI7和TI8所描述。每隔十天將培養(yǎng)的組織稱重一次。如圖7所示，在添加有1mg/L激動(dòng)素的MS培養(yǎng)基中的1.5g接種量提供了最佳的組織生長一在30天后達(dá)到4.5倍于接種重量的鮮重(6.76士0.33g)。其他的所有接種重量/PGR組合使得生長較緩慢(圖7)。為了測(cè)定PGR對(duì)秀尾黃素酮含量的影響，將十段液體培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織(每段1.5g)接種于含有MS和PGR的培養(yǎng)基中，所述MS和PGR在表3的樣品MSO、TI3、TI4、TI5和TI6中描述。在第4周收獲該組織并分析秀尾黃素酮含量。如表7所示，使用添加有0.1mg/L2，4-D和1.0mg/LNAA的MS培養(yǎng)基獲得了最高的豸尾黃素酮含量(48士0.22mg/kgD.W.)。表7.TIS培養(yǎng)中PRG對(duì)巴西豸尾根莖組織的生長和^尾黃素酮含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值士S.E1.生長速度=(最終的F.W,最初的F.W.)/最初的F.W.實(shí)施例7:燒M養(yǎng)和TIS培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織中秀尾黃素稱含量的比較基于實(shí)施例2的結(jié)果，2,4-D和NAA的組合提供了高于IAA和激動(dòng)素組合的秀尾黃素酮含量。通過MS培養(yǎng)基獲得了最高的鶩尾黃素酮含量，所述MS培養(yǎng)基添加有0.1mg/LNAA(^尾黃素酮55.5±0.67mg/kgD.W.)、0.5mg/LNAA(^尾黃素酮59.9±0.23mg/kgD.W.)或0.1mg/LNAA和1mg/L2,4-D(鴛尾黃素酮60.9±0.67mg/kgD.W.)。還測(cè)定了這些培養(yǎng)條件下的類黃酮總含量。實(shí)施例8:培養(yǎng)的和野生的巴西秀尾根莖組織中秀尾黃素酮含量的比較表8顯示培養(yǎng)的和野生的巴西鶩尾根莖組織中秀尾黃素酮的含量。結(jié)果表明野生的巴西秀尾根莖組織不含有秀尾黃素酮而培養(yǎng)的巴西鶩尾根莖組織具有的秀尾黃素酮含量為55.5±0.67mg/kgD.W.。表8.培養(yǎng)的和野生的巴西秀尾根莖組織的豸尾黃素酮含量駑尾黃素酮(mg/kgD.W.)2燒瓶培養(yǎng)的根莖155.5±0.67野生4艮莖ND31.根莖培養(yǎng)基為具有0.1mg/lNAA的MS。2.數(shù)值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值土S.E3.ND=不可檢測(cè)實(shí)施例9:由培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織獲得的提取物抑制腫瘤細(xì)胞的生長在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中對(duì)培養(yǎng)的巴西秀尾根莖組織的提取物進(jìn)行了體外測(cè)試，所述提取物通過材料和方法中描述的步驟獲得。提取物在0.1%-20%的濃度范圍顯示對(duì)人類正常的腸細(xì)胞無毒性。然而，提取物在3.13%、25。/。和50。/。的濃度抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F0)的生長。還在急性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞系PLB985和人類乳腺癌細(xì)胞系MCF7上使用光澤精分析對(duì)提取物進(jìn)行了檢測(cè)，以便監(jiān)控過氧化物的形成，隨后通過抗氧化劑分析儀分析自由基。結(jié)果表明提取物抑制兩種腫瘤細(xì)胞系的生長。在本說明書中闡述和討論的實(shí)施方案僅預(yù)期將發(fā)明人已知的最佳方式教導(dǎo)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員，以便制備并使用本發(fā)明。不應(yīng)認(rèn)為本說明書限制本發(fā)明的范圍。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員按照以上教導(dǎo)所理解的，本發(fā)明上述實(shí)施方案可以進(jìn)行修改或變動(dòng)，并且可添加或省略各種要素而不脫離本發(fā)明的范圍。因此有待理解的是除了具體描述的之外，可以在權(quán)利要求及其等價(jià)的范圍內(nèi)以其他的方式實(shí)施本發(fā)明。權(quán)利要求1.一種來自巴西鳶尾的離體的富含類黃酮的組織，其由改變所述巴西鳶尾類黃酮含量的組織培養(yǎng)法獲得，其中所述富含類黃酮的組織包括鳶尾黃素酮。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自巴西^尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述離體的富含類黃酮的組織是由能夠增殖的巴西鴛尾組織培養(yǎng)的根莖組織。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的來自巴西^尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述巴西秀尾組織包括根、根莖、葉和葉的基部。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自巴西豸尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述組織培養(yǎng)法包括含有植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西禽尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞分裂素或生長素。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的來自巴西豸尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑為選自下述組的至少一種吲咮-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、a-萘乙酸、6-苯曱基-氨基嘌呤和激動(dòng)素。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西秀尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度為約0.01-2.0mg/L。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西豸尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述培養(yǎng)基還包括Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的來自巴西駑尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述MS培養(yǎng)基包括鈉、鉀、硝酸鹽、銨、鎂、硫酸鹽、鈣、鐵、氯化物、磷酸鹽、錳、碘、硼酸鹽、鋅、銅、鉬、鈷、或其混合物。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西駑尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述培養(yǎng)基還包括碳水化合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的來自巴西秀尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述^炭水化合物為肌醇或蔗糖或其混合物。12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西豸尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述培養(yǎng)基還包括維生素。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的來自巴西秀尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述維生素為選自下述組的至少一種鹽S吏石克胺素、吡哆醇鹽酸鹽和煙酸。14.才艮據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西鶩尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述培養(yǎng)基還包括嘧啶醇。15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的來自巴西駑尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述培養(yǎng)基具有約5-7的pH。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自巴西駑尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述組織培養(yǎng)法為燒瓶培養(yǎng)、間歇浸沒系統(tǒng)(TIS)或其組合。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自巴西鶩尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述秀尾黃素酮的含量為每Kg干重組織約2.5-65mg。18.—種獲得根據(jù)權(quán)利要求1所述的來自巴西鳶尾的離體的富含類黃酮的組織的方法，包括下述步驟將巴西秀尾組織接種于組織培養(yǎng)法的培養(yǎng)基中；其中所述巴西鳶尾組織能夠增殖；和使所述巴西鴛尾組織在所述組織培養(yǎng)法中生長足夠長的時(shí)間以允許根莖組織形成。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中將所述培養(yǎng)基保持在約20。C-30。C。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述巴西秀尾組織包括根、葉、葉的基部或根莖。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組織培養(yǎng)法為燒瓶培養(yǎng)、間歇浸沒系統(tǒng)(TIS)或其組合。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中足夠長的時(shí)間為約4-8周。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述TIS允許所述巴西鳶尾組織每隔約2-4小時(shí)浸沒在所述培養(yǎng)基中約1-3分鐘。24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包括植物生長調(diào)節(jié)劑、鹽培養(yǎng)基和碳水化合物。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞分裂素或生長素。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑為選自下述組的至少一種卩引咪-3-乙酸、2-4-二氯苯氧基乙酸、a-萘乙酸、6-苯甲基-氨基嘌呤和激動(dòng)素。27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度約為0.01-2.0mg/L。28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述鹽培養(yǎng)基為Murashige和Skoog基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)，其包括鈉、鉀、硝酸鹽、銨、鎂、硫酸鹽、釣、鐵、氯化物、磷酸鹽、錳、碘、硼酸鹽、鋅、銅、鉬、鈷、或其混合物。29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述碳水化合物為肌醇或蔗糖或其混合物。30.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包括維生素。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的來自巴西鴛尾的離體的富含類黃酮的組織，其中所述維生素為選自下述組的至少一種鹽酸碌u胺素、吡-多醇鹽酸鹽和煙酸。32.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有約5-7的pH。33.—種由如權(quán)利要求1所述的來自巴西:t尾的離體的富含類黃酮的組織提取鴛尾黃素酮的方法，其包括下述步驟干燥所述巴西駑尾的離體的富含類黃酮的組織以獲得干燥的富含類黃酮的組織；將醇加至所述干燥的離體的富含類黃酮的組織以形成懸浮液；加熱所述懸浮液以形成熱的懸浮液；和在所述熱的懸浮液已經(jīng)冷卻后過濾所述熱的懸浮液以收集含有所述秀尾黃素酮的濾液。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中通過使所述離體的富含類黃酮的組織經(jīng)受冷凍干燥而獲得所迷千燥的離體的富含類黃酮的組織。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述懸浮液在約50-70。C下加熱。36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述懸浮液在振動(dòng)下加熱。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述振動(dòng)通過超聲波產(chǎn)生。38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述醇為甲醇或乙醇。39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述濾液通過將所述熱的懸浮液經(jīng)過Whatman1號(hào)濾紙收集。40.—種用于測(cè)定根據(jù)權(quán)利要求33所述的巴西豸尾的離體的富含類黃酮的組織中所述秀尾黃素酮含量的方法，其包括下述步驟通過高效液相色鐠(HPLC)測(cè)定所述秀尾黃素酮的含量。41.才艮據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述HPLC包括Cosmosi1⑧5C18-AR-II柱。42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述秀尾黃素酮使用含有55:45體積比的曱醇和水(具有0.1%的乙酸)的洗脫溶液進(jìn)行洗脫。43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述^尾黃素酮的含量使用糞尾黃素酮作為標(biāo)準(zhǔn)物在約265nm波長處進(jìn)行測(cè)定。44.一種如權(quán)利要求33所述的巴西秀尾的離體的富含類黃酮的組織提取物，其中所述提取物具有抗腫瘤活性。全文摘要本發(fā)明提供了巴西鳶尾(Neomaricagracilis)的富含類黃酮的離體根莖組織，其由能夠增殖的巴西鳶尾(N.gracilis)組織的組織培養(yǎng)法(preparation)獲得，所述能夠增殖的巴西鳶尾組織的例子如根、葉、葉的基部和/或根莖。巴西鳶尾富含類黃酮的離體根莖組織含有鳶尾黃素酮，其明顯不同于天然生長的不合有鳶尾黃素酮的巴西鳶尾根莖。本發(fā)明還提供一種用于培養(yǎng)富含類黃酮的離體根莖組織的方法、一種由富含類黃酮的組織提取鳶尾黃素酮的方法以及用于確定富含類黃酮的離體根莖組織中鳶尾黃素酮數(shù)量的定量方法。文檔編號(hào)C12N5/04GK101418279SQ200710167340公開日2009年4月29日申請(qǐng)日期2007年10月25日優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日發(fā)明者何錦玟,朱庭慧申請(qǐng)人:大同股份有限公司;大同大學(xué)