專利名稱：表達(dá)sod的全蠶粉及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程生產(chǎn)SOD的技術(shù)和方法。具體地講，本發(fā)明涉及含有SOD基因的重組桿狀病毒穿梭載體系統(tǒng)感染家蠶幼蟲及表達(dá)的方法，以及用表達(dá)SOD的家蠶制備的全蠶粉及其制備方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(SOD)清除超氧化物自由基。超氧化物自由基對人體可造成直接的或間接的損傷作用，如引發(fā)脂質(zhì)過氧化、損傷DNA，使線粒體中的NADH脫氫酶、NADH氧化酶與三磷酸腺苷酶(ATpase)失活；間接的損傷作用有超氧化物自由基可使H2O2分解為·OH與-OH，O2-個與NO發(fā)生自由基-自由基反應(yīng)，生成ONOO-，·OH與ONOO-是化學(xué)活性很強(qiáng)的氧自由基，損傷重要的生物分子。(《自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用》pp178-180)超氧化物歧化酶(SOD)清除超氧化物自由基，防止對機(jī)體直接或間接的損傷作用；SOD使O2·-成為細(xì)胞內(nèi)自由基的排污漕；調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)O2·-的水平；調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)NO的水平；催化反應(yīng)產(chǎn)物H2O2的作用(《自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用》pp178-180)。
現(xiàn)在市售SOD多數(shù)為從哺乳動物牛、豬等的肝臟中提取，隨著瘋牛病、口蹄疫、禽流感等流行，安全性有很大問題，家蠶重組病毒穿梭載體表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac BaculovirusExpression System)是真核表達(dá)系統(tǒng)，該技術(shù)自1983年Smith等首創(chuàng)以來，已有千種外源基因在該系統(tǒng)表達(dá)(《昆蟲病毒分子生物學(xué)》，1998，pp547-178)，由于有家蠶淋巴本身的大量蛋白的保護(hù)作用和一些未知機(jī)理的作用，家蠶表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)后修飾加工的方式與哺乳動物接近，能識別并正確地進(jìn)行信號肽切除及磷酸化、糖基化、?；茸饔?，表達(dá)產(chǎn)物具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均與天然蛋白相似。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用家蠶幼蟲制備的SOD及其制作的方法。相對于已有技術(shù)從哺乳動物組織中提取的SOD來說安全、衛(wèi)生，可以低成本規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明提供了一種表達(dá)SOD的家蠶幼蟲全蟲凍干粉。
本發(fā)明表達(dá)SOD的家蠶幼蟲全蟲凍干粉的制備方法為以下步驟(1)通過基因工程方法獲得帶SOD基因的家蠶重組病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含多角體蛋白的重組病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蠶重組病毒針刺接種家蠶幼蟲，或用含多角體蛋白的重組病毒添食接種家蠶幼蟲；(3)接種后的家蠶幼蟲經(jīng)96小時飼養(yǎng)后收集，冷凍干燥后制成粉末。
本發(fā)明對SOD基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了生物活性的鑒定。用重組病毒感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞，于感染后不同時間測定培養(yǎng)上清中的SOD活性，在感染的第4天達(dá)到1×104IU/ml。用重組病毒穿刺接種或添食接種五齡家蠶幼蟲，于感染后不同時間收集蠶血淋巴，高速離心后測血淋巴中的SOD的活性。在感染的120小時血淋巴中SOD活性達(dá)到5.0×1O5IU/ml。
為驗(yàn)證本發(fā)明表達(dá)SOD的家蠶幼蟲全蟲凍干粉的實(shí)際應(yīng)用效果，本發(fā)明人在研制過程中采用家蠶桿狀病毒穿梭載體表達(dá)系統(tǒng)，分別在家蠶細(xì)胞、家蠶幼蟲中表達(dá)具有極高應(yīng)用價值的超氧化物歧化酶(SOD)，制成膠囊，并進(jìn)行了動物試驗(yàn)，即抗氧化，降血糖和增強(qiáng)免疫力實(shí)驗(yàn)。通過動物試驗(yàn)和人體試食，對糖尿病有顯著的改善作用，并能顯著提高細(xì)胞的免疫力活性，說明其在治療糖尿病、提高免疫力藥物的實(shí)際應(yīng)用方面有很好的前景。
以上本發(fā)明方案中制備方法的步驟(1)可以具體分述如下提取接種后飼養(yǎng)家蠶幼蟲的總RNA，再經(jīng)RT-PCR獲得SOD基因，經(jīng)測序證明其核苷酸序列完全符合基因庫中提供的SOD基因序列。
利用桿狀病毒穿梭載體Bacmid，將SOD基因片段的克隆到供體質(zhì)粒中，構(gòu)成含SOD基因的桿狀病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)。
將SOD基因片段的克隆到含家蠶多角體蛋白的供體質(zhì)粒中，構(gòu)成含家蠶多角體蛋白的重組病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；以上本發(fā)明方案中制備方法的步驟(2)可以具體分述如下本發(fā)明公開了SOD基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)方法。將重組的桿狀病毒rBacmid/BmNPV/SOD或rBmPhBacmid/BmNPV/SOD感染BmN細(xì)胞系進(jìn)行病毒擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增后的重組桿狀病毒注射至5齡家蠶幼蟲體內(nèi)或添食5齡家蠶幼蟲，分別取感染后24、48、72、96和120小時的家蠶血淋巴，經(jīng)5000rpm5分鐘離心取上清，稀釋10倍后加等體積的蛋白上樣緩沖液，取200ul進(jìn)行瓊脂糖凝膠濃度12％的SDS-PAGE分析，用考馬斯亮藍(lán)R250染色。結(jié)果見圖2。
以上本發(fā)明方案中制備方法的步驟(3)可以具體分述如下本發(fā)明提供了含SOD基因表達(dá)產(chǎn)物的制作方法，接種含SOD基因重組的家蠶幼蟲，感染96小時后收集，-20℃冷藏，在冷凍干燥機(jī)中干燥，完全干燥后制粉，裝入膠囊中。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下，與哺乳動物組織提取的SOD在臨床應(yīng)用中有種種不足(例如排異，瘋牛病等，交叉感染)相比，在家蠶幼蟲的SOD更具有臨床價值；家蠶是可以無菌大規(guī)模生產(chǎn)的昆蟲，可以低成本大規(guī)模的飼養(yǎng)。蠶體中有多種天然蛋白質(zhì)保護(hù)劑，對表達(dá)產(chǎn)物有保護(hù)作用，使基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，家蠶生產(chǎn)的蛋白可以制成膠囊，為患者解除了注射的痛苦和被感染的威脅。


附圖1SOD的供體質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
附圖2家蠶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE和western blot分析圖譜說明重組病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)接種于5齡幼蟲第一天，接種后96小時收集家蠶血液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色。再以6×His-抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔IgG抗體進(jìn)行western blot分析。
附圖3家蠶表達(dá)的SOD活性圖譜說明重組病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)接種于5齡幼蟲第一天，接種后每隔24小時收集家蠶血液，3000×g，4℃.離心10分鐘。取上清液以氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測定SOD活力。SOD活性單位定義為抑制NBT光還原相對百分率為50％時的酶量作為一個酶活力單位(U)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1、SOD基因的PCR擴(kuò)增合成以家蠶N4蠶品種為材料，取5齡第3天幼蟲以RNA抽提試劑盒(TRIzol RNA extractionreagent kit)提取總RNA，經(jīng)電泳檢測。
設(shè)計SOD引物。正向引物5’-atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3’，反向引物5’-gatggtaccgcCTTGAGCGCTTTTTCATATCTCTG-3’.為便于克隆正反向引物5’端分別引進(jìn)EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)。
以總RNA為模板，在通用引物oligo-dT18和反向轉(zhuǎn)錄酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成單鏈cDNA，再以此為模板在SOD正反向引物下合成SOD基因，PCR合成的條件為94℃預(yù)變性5分鐘，再以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延長10分鐘。合成的SOD基因經(jīng)乙醇沉淀和EcoRI和KpnI雙酶切，電泳并切膠回收。
實(shí)施例2、含SOD基因的家蠶桿狀病毒供體質(zhì)粒構(gòu)建將SOD基因與pFastBacHTa以連接試劑盒連接并轉(zhuǎn)化XL-Blue細(xì)胞，挑斑在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)繁殖，提取重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa-SOD并經(jīng)ABI PRISM 310GeneticAnalyzer測序儀測序確認(rèn)。
實(shí)施例3、含SOD基因的重組桿狀病毒的獲得將重組供體質(zhì)粒pFastBacHTa-SOD轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac/BmNPV，并在含抗生素平板(50ug/ml kanamycin，7ug/ml gentamicin and 10ug/ml tetracycline，100ug/ml X-gal andthe inducer，40ug/ml IPTG)培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白篩選，獲得重組桿狀病毒rBacmid/BmNPV/SOD。
將上述重組桿狀病毒rBacmid/BmNPV/SOD DNA在脂質(zhì)體FuGENE 6介導(dǎo)下導(dǎo)入轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞(BmN)，獲得重組病毒，避光保存于-4℃?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4、SOD基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)5齡第1天幼蟲注射病毒液約5μl(計每頭幼蟲2×105病毒粒子)，繼續(xù)飼養(yǎng)96小時，收集血液，進(jìn)行SDS-PAGE，WESTERN BLOTTING和SOD活性測定。其余蠶96小時收集保存于-20℃，以制作全蠶粉。
實(shí)施例5、用表達(dá)SOD基因的全蠶粉的動物試驗(yàn)A，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個劑量組和一個陰性對照組，以人體推薦量的10倍，400mg/kg作為高劑量組；另設(shè)200mg/kg、100mg/kg兩個劑量組，以溶劑蒸餾水作為陰性對照；每組12只，受試樣品配成懸浮液，以灌胃形式給予小鼠0.5ml，每天一次，連續(xù)給予45天。
B，經(jīng)四氧嘧啶造模成功后的小鼠，灌胃經(jīng)冷凍干燥制得的SOD全蠶粉，設(shè)三個劑量組和陰性對照組給小鼠灌胃30天；并設(shè)立同品種同時制作的正常全蠶粉，結(jié)果均能增加小鼠的糖耐量水平，并且抑制小鼠的空腹血糖值的升高，與對照相比達(dá)到顯著水平；C，在家蠶體內(nèi)表達(dá)SOD基因后，經(jīng)冷凍干燥制得SOD全蠶粉，設(shè)三個劑量組和陰性、陽性對照組給小鼠灌胃30天；經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天，能增加小鼠血和肝臟中的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低小鼠肝臟中丙二醛含量。經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，其脾臟/體重比值在低、中、高劑量組與對照組間比較均無顯著性差異(P＞0.05)，其胸腺/體重比值在低、中、高劑量組與對照組間比較均有顯著性差異(P＜0.05)，SOD全蠶粉能提高小鼠的胸腺/體重比值，并提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的能力。
D，在家蠶體內(nèi)表達(dá)SOD基因后，經(jīng)冷凍干燥制得SOD全蠶粉，根據(jù)保健品的安全性要求，對SOD全蠶粉進(jìn)行急性毒性檢驗(yàn)和長期性毒性檢驗(yàn)。經(jīng)對小鼠進(jìn)行人體推薦量360倍的急性毒性檢驗(yàn)，和90天的長期性毒性檢驗(yàn)，小鼠生長正常，各器官無異?，F(xiàn)象發(fā)生，經(jīng)人體試食，無異常情況發(fā)生，因此認(rèn)定SOD全蠶粉對于人是安全的。
E，在家蠶體內(nèi)表達(dá)SOD基因后，經(jīng)冷凍干燥制得SOD全蠶粉，設(shè)三個劑量組和陰性對照組給小鼠灌胃30天；經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天，能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力，在高劑量組達(dá)到顯著水平，但與陽性對照(黃芪組)有較明顯的差距。在家蠶體內(nèi)表達(dá)SOD基因后，經(jīng)冷凍干燥制得SOD全蠶粉，設(shè)三個劑量組和陰性對照組給小鼠灌胃30天；經(jīng)口給予小鼠不同劑量的SOD全蠶粉30天，能提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力，在高劑量組達(dá)到顯著水平。
F，SOD全蠶粉能明顯增加小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；與陰性對照組比較，低劑量組的SI增加最大，但高劑量組作用也明顯(P＜0.05)，SI平均值由2.33升至2.99，說明SOD全蠶粉有增加小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫功能的作用。
G，SOD全蠶粉灌胃各劑量組NK細(xì)胞殺傷活性與蒸餾水對照組比較有非常顯著性增高P＜0.01)，SOD全蠶粉灌胃后能顯著提高NK細(xì)胞殺傷活性，100mg/kg劑量組NK細(xì)胞殺傷活性比蒸餾水對照組增長38.91％，200mg/kg劑量組NK細(xì)胞殺傷活性比蒸餾水對照組增長45.57％，400mg/kg劑量組NK細(xì)胞殺傷活性比蒸餾水對照組增長48.55％，黃芪陽性對照組NK細(xì)胞殺傷活性比蒸餾水對照組增長39.44％。
權(quán)利要求
1.表達(dá)SOD的全蠶粉，其特征在于一種表達(dá)SOD的家蠶幼蟲全蟲凍干粉。
2.表達(dá)SOD的全蠶粉的制備方法，其特征在于以下步驟(1)通過基因工程方法獲得帶SOD基因的家蠶重組病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含家蠶多角體蛋白的重組病毒(rBmPh/Bacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蠶重組病毒穿梭載體系統(tǒng)針刺接種家蠶幼蟲，或用含多角體蛋白的重組病毒添食接種家蠶幼蟲；(3)接種后的家蠶幼蟲經(jīng)96小時飼養(yǎng)后收集，冷凍干燥后制成粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)SOD的家蠶幼蟲全蟲凍干粉以及這種SOD家蠶幼蟲全蟲凍干粉的制備方法。主要步驟包括(1)用基因工程方法獲得帶SOD基因的家蠶重組病毒(rBacmid/BmNPV/SOD)或含多角體蛋白的重組病毒(rBmPhBacmid/BmNPV/SOD)；(2)用家蠶重組病毒針刺接種家蠶幼蟲，或用含多角體蛋白的重組病毒添食接種家蠶幼蟲；(3)接種后的家蠶幼蟲經(jīng)96小時飼養(yǎng)后收集，冷凍干燥后制成粉末。用本發(fā)明的凍干粉對小鼠進(jìn)行輔助降血糖和增加免疫細(xì)胞活性試驗(yàn)獲得成功。相對于從哺乳動物組織中提取的SOD來說，本發(fā)明的產(chǎn)品安全、衛(wèi)生，可以低成本規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/02GK101015569SQ20071006666
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月10日
發(fā)明者繆云根, 岳萬福, 劉劍梅 申請人:浙江大學(xué)