專利名稱：篩查荷斯坦奶牛blad攜帶者的方法及其專用引物與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用PCR-RFLP技術(shù)篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的方法及其專用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
牛白細(xì)胞粘附缺陷病(Bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD)是荷斯坦奶牛的一種常染色體上由單基因控制的隱性遺傳疾病，是由編碼嗜中性粒細(xì)胞表面糖蛋白的CD18基因的一個點突變引起的(Shuster D.E.，Bosworth B.T.，Kehrli M.E.Jr.Sequence of the bovine CD18-encoding cDNAcomparison with the human andmurine glycoproteins.Gene.1992，114(2)267-271.)。CD18基因已經(jīng)被定位在1號染色體上。Shuster等對1頭患BLAD的荷斯坦牛的CD18基因cDNA序列進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自5’端第383位堿基由A突變?yōu)镚，該突變是錯義突變，導(dǎo)致128位的天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼?D128G)，致使白細(xì)胞表面的β2整合素表達(dá)明顯減少或缺乏而引起臨床發(fā)病。BLAD的生理基礎(chǔ)是白細(xì)胞粘附及相關(guān)功能(包括吞噬和趨化作用)的缺陷。BLAD多發(fā)生于1-14月齡的荷斯坦奶牛，當(dāng)隱性突變CD18基因純合時奶牛表現(xiàn)為發(fā)病，當(dāng)隱性突變基因雜合時奶牛表現(xiàn)為正常，但該牛是BLAD的攜帶者。
BLAD患病牛以重復(fù)性感染為典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為食欲下降，鼻鏡腫脹，有脫斑，頜下淋巴結(jié)腫大，體重明顯下降。BLAD患病牛常發(fā)生口腔粘膜、牙齦和舌粘膜潰瘍，牙齦萎縮等癥狀，病程長者還會發(fā)生前臼齒脫落，粘膜和腸道等軟組織發(fā)生重復(fù)性感染和泛發(fā)性淋巴樣增生。患病牛還易感染肺炎，需要頻繁或長期使用抗生素治療才能維持生存(Ackermann M.R.，Kehrli M.E..Jr.and Morfitt D.C.Ventraldermatitis and vasculitis in a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency.J.Am.Vet.Med.Assoc.1993，202413-415.)。雄性犢牛還會出現(xiàn)陰囊血腫，5天后復(fù)發(fā)，持續(xù)注射抗生素10天才可以暫時恢復(fù)(Andrews A.H.，F(xiàn)ishwicK J.and WatersR.J.Bovine leukocyte adhesion deficirncy(BLAD)in a one year and HolsteinFriesian bull-the first report in the united kingdom.Br.Vet.J.1996，152347-351.)。BLAD患牛出生后，生長發(fā)育極差，其中絕大多數(shù)將會在1年內(nèi)死亡，只有極少數(shù)能存活2年左右，而且這些患病牛不具繁殖和哺育能力，因而給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
經(jīng)系譜分析發(fā)現(xiàn)，已報道的BLAD患病牛犢都來自一個共同的祖先OsborndaleIvanhoe(生于1952年)(Kehrli M.E.Jr.，Schimalistieg F.C.，Anderson D.C.，VanDer Maaten M.J.，Hughes B.J.，Ackermann M.R.，Wilhelmsen C.L.，Brown G.B.，Stevens M.G.and Whetstone C.A.Molecular definition of the bovinegranulocytopathy syndromeidentification of deficiency of the Mac-1(CD11b/CD18)glycoprotein.Am.J.Vet.Res.1990，511826-1836.)，這頭荷斯坦牛的生產(chǎn)性能記錄十分優(yōu)秀，在人工授精體系中使用頻率極高，而且OsborndaleIvanhoe，Pennstate Ivanhoe Star，Carlin-M Ivanhoe Bell三者之間是祖父、父親和兒子的關(guān)系，它們都是BLAD攜帶者，這三頭優(yōu)秀種公牛的使用頻率都很高，因此對荷斯坦牛群做大規(guī)模的BLAD普查是極其必要的。目前還沒有在其它品種牛中發(fā)現(xiàn)該病的報道。
1990年，Kehrli et al經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病是由一種與白細(xì)胞粘附有關(guān)的細(xì)胞表面糖蛋白—整合素(CD11/CD18)表達(dá)缺陷所(Kehrli M.E.Jr.，Schimalistieg F.C.，Anderson D.C.，Van Der Maaten M.J.，Hughes B.J.，Ackermann M.R.，WilhelmsenC.L.，Brown G.B.，Stevens M.G.and Whetstone C.A.Molecular definition of thebovine granulocytopathy syndromeidentification of deficiency of the Mac-1(CD11b/CD18)glycoprotein.Am.J.Vet.Res.1990，511826-1836.)。整合素β2亞單位為CD18，分子質(zhì)量為95kDa。CD18可分別與CD11a～CD11d(αL、αM、αX、αD)組成不同的整合素二聚體LFA-1(Lymphocyte Function-associated antigen-1，αLβ2，CD11a/CD18)、Mac-1(αMβ2，CD11b/CD18)、p150，95(αXβ2，CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)。這些蛋白都是由其中的一種α亞單位(CD11)和共同的β亞單位構(gòu)成的。CD18表達(dá)于所有的白細(xì)胞中。CD18胞漿區(qū)可與多種細(xì)胞骨架相互作用。整合素在中性粒細(xì)胞上起作用需要Ca2+離子以細(xì)胞第二信使的形式參與。當(dāng)用化學(xué)物質(zhì)刺激時，BLAD牛中性粒細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度會發(fā)生異常變化。如Nagahata et al用酵母聚糖和伴刀豆球蛋白刺激白細(xì)胞時，會使健康嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高，有短暫增高階段和穩(wěn)定增高階段，而BLAD牛中性粒細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度只有短暫增高階段，缺乏穩(wěn)定增高階段(Nagahata H.，Higuchi H.，Noda H.and Tamoto K.Adhesiveness for extracellular matricex and Lysosomal Enzyme release fromnormal andβ2 integrin-deficient bovine neutrophils.J.Vet.Med.Sci.1996，40(10)783-786.)。正常的暫短增高階段是細(xì)胞受到刺激時，細(xì)胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放所致，穩(wěn)定增高階段是由Mac-1(CD11b/CD18)與iC3b結(jié)合，激活Ca2+進入胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生的，進而胞外的Ca2+進入胞內(nèi)。由于BLAD牛的中性粒細(xì)胞的CD18功能發(fā)生變異，使Ca2+進入胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑被削弱而缺乏穩(wěn)定增高階段。1992年，Shusteret al對患有BLAD的荷斯坦牛的CD18基因cDNA序列進行了克隆測序，并將其與人類和大鼠的CD18序列進行了序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BLAD牛的CD18基因第383位的堿基發(fā)生點突變，腺嘌呤被鳥嘌呤所取代(A383G)，從而導(dǎo)致胞外的高度保守區(qū)糖蛋白128位天門冬氨酸被甘氨酸所取代(D128G)，致使白細(xì)胞表面的整合素表達(dá)明顯減少或缺乏，引起臨床發(fā)病。
但是，僅僅根據(jù)系譜分析無法準(zhǔn)確定位奶牛個體是否為BLAD攜帶者，而只是群體水平上的推斷，只有將系譜分析與分子檢測相結(jié)合才能夠徹底排除BLAD可疑攜帶者。為準(zhǔn)確診斷患病牛(BLAD)和攜帶者(BL)，減少其為奶牛育種造成的經(jīng)濟損失，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、有效地篩查BLAD攜帶者的方法。
限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是最早發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指用限制性內(nèi)切酶酶切不同個體的基因組DNA后，產(chǎn)生大小不同的DNA片段，通過電泳和Southern印跡轉(zhuǎn)移到支持膜上，利用克隆或已標(biāo)記的序列(探針)進行分子雜交，從而顯示與探針同源順序的酶切片段在長度上的差異。RFLP標(biāo)記有如下特點(1)它是一種共顯性標(biāo)記，對基因型直接分型，能夠提供單個位點上較完整的信息；(2)無表型效應(yīng)，不受基因與環(huán)境互作的影響；(3)穩(wěn)定性及重復(fù)性好。但早期的RFLP技術(shù)信息含量低、操作過程復(fù)雜，而且一般需要放射性同位素來檢查，因而此技術(shù)受到了限制。
PCR技術(shù)產(chǎn)生之后，新的PCR-RFLP技術(shù)應(yīng)運而生。它是將PCR技術(shù)與RFLP分析聯(lián)合應(yīng)用，快速檢測DNA多態(tài)性和變異的方法。PCR-RFLP方法先采用PCR技術(shù)，再將致病基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生與正?；虻臄U增片段長度不同的片段，通過電泳區(qū)分基因型，可以提示這種差異，據(jù)此判斷是否存在致病基因。
PCR-RFLP的優(yōu)點在于克服了標(biāo)準(zhǔn)RFLP分析需要大量DNA的缺陷，可對微量的DNA樣品進行研究，而且經(jīng)PCR擴增的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，可直接用EB染色法檢測，快速簡便，唯一的缺點是需要事先選擇并設(shè)計擴增序列的引物。對于擴增片段比較長，只有一個或不超過2個切點的片段可以使用這種方法。PCR-RFLP技術(shù)在遺傳病檢測中應(yīng)用較為廣泛，例如陳等等人曾用PCR-RFLP方法分析了中國漢族人群中多發(fā)性癡呆病患者和正常人群的載脂蛋白基因態(tài)性分布的差異(陳等，張俊武，張振馨，趙華路，李曉青，吳亞寧，屈秋明.載脂蛋白E基因多態(tài)性與阿爾茨海默病.遺傳學(xué)報.2003，30(12)1167-1170)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一對利用CD18基因的限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者方法及其專用引物。
本發(fā)明所提供的用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。
將由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對命名為F/R，序列表中的序列1由18個堿基組成，序列表中的序列2由19個堿基組成。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的方法。本發(fā)明所提供的篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的方法，是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，回收PCR擴增片段，然后對其用限制性內(nèi)切酶Taq I進行酶切，對酶切片段進行檢測，經(jīng)酶切獲得大小為193bp和131bp DNA片段的待測牛為正常牛，經(jīng)酶切獲得大小為324bp、193bp和131bp DNA片段的待測牛為BLAD攜帶者，經(jīng)酶切獲得大小為324bp DNA片段的待測牛為BLAD病牛。
在上述篩查方法中，所述待測牛的基因組DNA的來源是廣泛的，可以從血液(新鮮或冷凍)、精液(新鮮或冷凍)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品等中提取。
其中，以25μl總體積為例，PCR擴增的反應(yīng)體系包括模板DNA(100ng/μl)1μl，上、下游引物(25pmol/L)各0.5μl，10×PCR擴增緩沖液2.5μl，4種dNTP混合物(dNTPs，2.5mmol/L)0.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/uL)0.5μl，用重蒸水補充反應(yīng)體系至25μl。10×PCR擴增緩沖液的組成是Tris·HCl(pH8.0)100mM，KCl 500mM，MgCl220mM，0.1％明膠。PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；最后72℃7min，4℃保溫。
以10μl總體積為例，Taq I酶切反應(yīng)體系包括PCR擴增產(chǎn)物8.5μl，Taq I內(nèi)切酶緩沖液1μl，Taq I內(nèi)切酶(10U/μl)0.5μl。酶切反應(yīng)條件可為在60-70℃(優(yōu)選為65℃)下消化2-3小時?？捎?.0-4.0％(優(yōu)選為3.5％)瓊脂糖凝膠電泳對酶切片段進行檢測。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的試劑盒。
本發(fā)明所提供的試劑盒，包括上述用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的專用引物。
根據(jù)實際情況，所述試劑盒還可包括Taq DNA聚合酶、10×PCR擴增緩沖液(含Mg2+)、dNTPs、Taq I酶、Taq I內(nèi)切酶緩沖液、重蒸水、50×TAE、溴化乙啶貯存液和6×凝膠加樣緩沖液等中的一種或幾種試劑；所述各種溶液的溶劑均為水。
本發(fā)明提供了一種篩查荷斯坦奶牛白細(xì)胞粘附缺陷病(BLAD)攜帶者的方法及其專用引物。該方法是根據(jù)BLAD患病牛CD18基因編碼區(qū)序列第383位點的A/G突變，從而使Taq I限制性酶切位點消失的原理，建立的一種檢測奶牛BLAD的PCR-RFLP方法。通過針對A383G突變位點設(shè)計的一對引物，可特異性擴增出長度為324bp的奶牛CD18基因的含有上述點突變的片段，再經(jīng)限制性內(nèi)切酶TaqI酶切后，正常個體可產(chǎn)生193bp和131bp的DNA條帶，而BLAD攜帶者則產(chǎn)生193bp、131bp和324bp的DNA條帶，純合隱性個體仍為324bp。本發(fā)明的篩選方法操作簡單，快捷，費用低廉，準(zhǔn)確度高(可達(dá)100％)，并可實現(xiàn)自動化的直接檢測。此外，可根據(jù)本方明的方法開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，用于篩選健康個體，剔除BLAD攜帶者，該試劑盒具有使用方法簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，不需要特殊的儀器，適合常規(guī)實驗室檢測的需要，且檢測結(jié)果可靠、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，為種牛的育種工作提供了便利。本發(fā)明將在BLAD有害基因的檢測及優(yōu)良種牛的分子選育中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。


圖1為退火溫度為60℃的PCR擴增產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖2為正常個體、BLAD攜帶者和BLAD患病個體的CD18基因的等位基因圖譜及Taq I酶切位點示意3為116頭中國荷斯坦奶牛的CD18基因324bp PCR擴增片段的PCR-RFLP分析結(jié)果圖4為BLAD攜帶者和GenBank中的CD18基因的核苷酸序列比對結(jié)果圖5為BLAD攜帶者的CD18基因324bp PCR擴增片段的測序結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所用引物合成及測序工作均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。
實施例1、篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者及其專用試劑盒的制備一、用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的引物設(shè)計BLAD患病?；驍y帶者的CD18基因自5’端第1200位堿基A突變?yōu)镚，Taq I限制性內(nèi)切酶特異性識別T*CGA，當(dāng)該位點發(fā)生突變時，序列由T*CGA變?yōu)門CGG，Taq I識別位點消失，根據(jù)此原理，參照Kriegesmann，B.發(fā)表的奶牛CD18基因的部分基因組序列(Kriegesmann B.，Jansen S.，Baumgartner B.G.and Brenig B.Partialgenomic structure of the bovine CD18 gene and the refinement of test of bovineleukocyte adhesion deficiency[J].J.Dairy.Sci.1997，802547-2549.)，采用Oligo6.0軟件在其第1200位的A/G點突變位點的上下游設(shè)計了一對PCR擴增包含該引起B(yǎng)LAD的突變位點的核苷酸片段的引物，預(yù)期擴增片段長度為324bp，引物序列如下
F(上游引物)5’-CCTGCATCATATCCACAG-3’(序列表中序列1)R(下游引物)5’-GTTTCAGGGGAAGATGGAG-3’(序列表中序列2)新合成的引物呈固體粉末狀，在溶解前先離心1分鐘使其集中在離心管底，再用雙蒸水稀釋到25umol/L。
二、PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化對PCR影響較大的因素包括退火溫度、10×擴增緩沖液中的鎂離子濃度和模板DNA的質(zhì)量等。優(yōu)化PCR反應(yīng)的目的在于找到可使擴增效率最高的退火溫度和鎂離子濃度，并在保證擴增效率的前提下盡量降低PCR反應(yīng)體系中其它成分的用量。在確定具體的退火溫度和鎂離子濃度時，分別對二者設(shè)定一系列梯度，最終得到最優(yōu)化的組合。其中，退火溫度的優(yōu)化方法如下選擇北京市種公牛站的荷斯坦公牛為實驗材料，按照文獻(陳慧勇.利用中國荷斯坦定位BTA6上影響產(chǎn)奶性狀的QTLs[D].北京中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005)中第27頁描述的DNA提取方法提取精液(新鮮或冷凍)的基因組DNA(基因組DNA可以從血液(新鮮或冷凍)、組織樣品(如耳組織等)或含有毛囊的牛毛樣品中提取)，然后以此為模板，在引物對F/R的引導(dǎo)下利用梯度PCR儀進行PCR擴增，25μl PCR反應(yīng)體系為模板DNA(100ng/μl)1μl，上、下游引物(25pmol/L)各0.5μl，10×PCR擴增緩沖液(Tris·HCl(pH8.0)100mM，KCl 500mM，MgCl220mM，0.1％明膠)2.5μl，4種dNTP混合物(dNTPs，2.5mmol/L)0.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/ul，天根生化科技(北京)有限公司)0.5μl，ddH2O 20μl；PCR反應(yīng)條件初步設(shè)定為先94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55±10℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃7min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后，對不同退火溫度的PCR擴增產(chǎn)物各取3ul進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中退火溫度為60℃的PCR擴增產(chǎn)物的2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示(泳道1-6PCR擴增產(chǎn)物，泳道M100bp ladder Marker DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))，PCR擴增產(chǎn)物長度為324bp，與預(yù)期結(jié)果一致，且擴增條帶單一，濃度較高，可用于PCR-RFLP檢測，因此，將優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件定為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。
三、用PCR-RFLP方法篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者1、PCR擴增及PCR產(chǎn)物的濃縮根據(jù)系譜，采集中國荷斯坦奶牛樣品共116份，其中68份公牛凍精，分別來自北京奶牛中心(38頭)、天津奶牛發(fā)展中心(18頭)、河北省畜牧良種工作站(12頭)，保存于-80℃?zhèn)溆?；以?8份母牛血樣，分別來自北郊三場、西郊一場、西郊二場、西郊四場、東郊辛卜、朝陽南場和南口二場，采集后保存于-80℃?zhèn)溆?。提取上述公牛凍精及母牛血液的基因組DNA并以此為模板，在步驟一獲得的特異性引物對F/R的引導(dǎo)下進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系與實施例1相同，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)；72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果均得到324bp大小的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，對PCR擴增產(chǎn)物進行濃縮，具體方法包括以下步驟1)將2管25μl PCR產(chǎn)物置于同一0.5mL離心管中；2)加入5μl NaAc(3M，pH 5.2)和2倍體積的無水乙醇；3)冰浴10分鐘；4)12000rpm離心2分鐘；5)棄去無水乙醇，真空抽干；6)將DNA沉淀溶于10μl滅菌水。
2、RFLP分析用TaqI對步驟1獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行單酶切，10μl酶切反應(yīng)體系為PCR擴增產(chǎn)物8.5μl，Taq I內(nèi)切酶緩沖液1μl，Taq I內(nèi)切酶(10U/μl)0.5μl，在總反應(yīng)體系中加入一滴礦物油，防止揮發(fā)。酶切反應(yīng)條件為65℃消化2-3小時。酶切反應(yīng)結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行3.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，方法為取經(jīng)酶切的PCR擴增產(chǎn)物6μl，加1μl 6×凝膠上樣緩沖液(0.25溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青，40％(W/V)蔗糖水溶液)，上樣于3.5％瓊脂糖凝膠(含EB染色液)上，同時在一點樣孔中加5μl DNA 100ladder Marker作參照，恒壓(8-10V/cm)電泳20-30min，在紫外透射儀上觀察，用Alpha Innotech公司的凝膠成像系統(tǒng)照相。
根據(jù)CD18基因的PCR擴增產(chǎn)物長度和A/G點突變的位置，TaqI限制性內(nèi)切酶消化后，結(jié)果應(yīng)表現(xiàn)出三種基因型(帶型)1)193bp，131bp(正常個體)；2)324bp，193bp，131bp(BLAD攜帶者)；3)324bp(BLAD患病個體)，分別命名為AA、AB和BB。正常個體、BLAD攜帶者和BLAD患病個體的CD18基因的等位基因圖譜及Taq I酶切位點示意圖如圖2所示((1)為正常個體，(2)為BLAD攜帶者，(3)為BLAD患病個體)。對上述68頭中國荷斯坦公牛和48頭母牛共計116頭中國荷斯坦奶牛的CD18基因PCR擴增產(chǎn)物的Taq I酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示(泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp ladder Marker)；泳道1為空白對照；泳道2為作為陽性對照的未經(jīng)酶切的PCR擴增產(chǎn)物；泳道3-4為AB基因型(BLAD雜合子)；泳道5-7為AA基因型(正?；蚣兒献?，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)了AA和AB兩種基因型，即顯性純合子(106頭正常個體)和雜合子(10頭BLAD攜帶者)，沒有檢測到隱性純合子(BLAD患病牛)，即BB基因型。計算群體基因型頻率與基因頻率公式見式1，基因頻率和基因型頻率統(tǒng)計結(jié)果見表1。

基因頻率p＝P+R/2q＝Q+R/2(其中，pBLADN基因頻率；qBLADn基因頻率；PBLADNN頻率；RBLADNn頻率；QBLADnn頻率；N表示正?；颍琻表示隱性突變基因，NN表示正?；蚣兒献樱琋n表示雜合子，nn表示隱性突變基因純合子)表1 BLAD雜合子的基因型頻率和BLAD基因頻率

四、測序鑒定將步驟三測定的10頭BLAD可疑荷斯坦奶公牛的324bp的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，然后利用DNAMAN3.0軟件將得到的CD18基因片段的DNA序列與NCBI公布的牛CD18基因的核苷酸序列(GenBank登錄號為Y12672，該CD18基因序列為正常個體序列)進行同源性比對，結(jié)果如圖4所示(上行為擴增序列，下行為NCBI公布序列，箭頭所指為突變堿基)，同源性達(dá)98.33％，再用CHROMAS軟件進行序列分析，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)擴增片段自5’端第193位堿基發(fā)生點突變(箭頭所指堿基N)，出現(xiàn)雙峰，從峰圖顏色判斷為A/G雜合子。該測序結(jié)果與步驟三的PCR-RFLP檢測結(jié)果一致，說明結(jié)果準(zhǔn)確。對所有公牛個體重復(fù)進行PCR-RFLP分析，兩次實驗結(jié)果完全一致，證明本發(fā)明的BLAD攜帶者的檢測方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠，將本發(fā)明的分子檢測方法與系譜分析結(jié)合，能夠徹底排除BLAD可疑攜帶者。
五、制備篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的試劑盒本發(fā)明用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的試劑盒包括以下試劑(1)2.5U/ul Taq DNA聚合酶；(2)10×PCR擴增緩沖液；(3)2.5mmol/L dNTPs；(4)Taq I內(nèi)切酶緩沖液；(5)10U/μl Taq I內(nèi)切酶；
(6)6×凝膠上樣緩沖液；(7)步驟一獲得的用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的專用引物，25umol/L；(8)3M NaAc(pH 5.2)；(9)ddH2O。
試劑盒的規(guī)格為100次/盒，每盒中各組分的量為2.5U/ul Taq DNA聚合酶1瓶(100ul/瓶)，10×PCR擴增緩沖液1瓶(500ul/瓶)，2.5mmol/L dNTPs 1瓶(100ul/瓶)，Taq I內(nèi)切酶緩沖液1瓶(200ul/瓶)，6×凝膠上樣緩沖液1瓶(200ul/管)，上、下游引物各1瓶(100ul/瓶)，3M NaAc(pH 5.2)1瓶(1000ul/瓶)和ddH2O 1瓶(1000ul/瓶)。按上述劑量對試劑盒中的各組分進行分裝，包裝后得到用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的試劑盒。
序列表<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1cctgcatcat atccacag 18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2gtttcagggg aagatggag 19
權(quán)利要求
1.用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。
2.一種篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的方法，是以待測牛的基因組DNA為模板，在由權(quán)利要求1所述的引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，回收PCR擴增片段，然后對其用限制性內(nèi)切酶Taq I進行酶切，對酶切片段進行檢測，經(jīng)酶切獲得大小為193bp和131bp DNA片段的待測牛為正常牛，經(jīng)酶切獲得大小為324bp、193bp和131bp DNA片段的待測牛為BLAD攜帶者，經(jīng)酶切獲得大小為324bp DNA片段的待測牛為BLAD病牛。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩查方法，其特征在于所述25μl PCR擴增反應(yīng)體系為模板DNA 1μl，上、下游引物各0.5μl，10×PCR擴增緩沖液2.5μl，4種dNTP混合物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用重蒸水補充反應(yīng)體系至25μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩查方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先94℃5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；最后72℃7min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩查方法，其特征在于所述10μl Taq I酶切反應(yīng)體系為PCR擴增產(chǎn)物8.5μl，Taq I內(nèi)切酶緩沖液1μl，Taq I內(nèi)切酶0.5μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩查方法，其特征在于所述酶切反應(yīng)條件為在60-70℃下消化2-3小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的篩查方法，其特征在于所述對酶切片段進行檢測的方法為3.0-4.0％瓊脂糖凝膠電泳。
8.一種篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的用于篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括Taq DNA聚合酶、10×PCR擴增緩沖液、dNTPs、Taq I酶、Taq I內(nèi)切酶緩沖液、重蒸水、50×TAE、溴化乙啶貯存液和6×凝膠加樣緩沖液中的一種或幾種試劑；所述各種溶液的溶劑均為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查荷斯坦奶牛BLAD攜帶者的方法及其專用引物與試劑盒。該引物是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。該篩查方法是以待測牛的基因組DNA為模板，在上述引物對的引導(dǎo)下進行PCR擴增，擴增結(jié)束后，回收PCR擴增片段，然后對其用限制性內(nèi)切酶Taq I進行酶切，對酶切片段進行檢測，經(jīng)酶切獲得大小為193bp和131bp DNA片段的待測牛為正常牛，經(jīng)酶切獲得大小為324bp、193bp和131bp DNA片段的待測牛為BLAD攜帶者，經(jīng)酶切獲得大小為324bp DNA片段的待測牛為BLAD病牛。本發(fā)明將在BLAD有害基因的檢測及優(yōu)良種牛的分子選育中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK101041862SQ20071006526
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日
發(fā)明者張沅, 孫東曉, 孫藝 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)