專利名稱：：利用金屬膜和三氯化鐵生產l-半胱氨酸的新工藝的制作方法利用金屬膜和三氯化鐵4^L-半胱氨酸的新工藝fe7(t領域本發(fā)明屬于氨基酸的生產
技術領域：
，涉及一種在酶轉化法生產L半胱氨酸的過程中使用金屬0菌體和除菌體的方法。并在產物的提M程中涉及一種將L-半胱氨酸氧化成L胱氨酸的方法。背景S^L-半胱氨酸(^cysteine)是一種M的含硫氨基酸，為谷胱甘月太的組分之一。L"半胱氨酸分子中含有活性的巰基，因此其具有許多重要的生理功能，如可以增強肝功能、解除苯中毒、化痰止咳、艦毛發(fā)生長和防止食品氧化等。L-半胱氨mn預于醫(yī)藥、化妝品、食品等行業(yè)。L-半胱氨酸是非發(fā)酔法^的氨基酸，，方法有化學合淑去、毛勤K解后還原法和酶轉化法三類。微生物酶法轉化生產L-半胱氨酸具有特異性強，生產工藝簡單，副反應和副,少，對環(huán)境污染的禾號低靴點，比化學合成法和毛絲解后還原法具有很大的鵬性。以DL-ATC為前^H法轉化^L-半胱氨酸的工藝主要由三部分細龍酶源細胞的培養(yǎng)、前體物質的轉化和產物的提取。在前體物質的轉^t前，要將酶源細胞的培^M1亍M，在產物的提^31程中，還要將酶源細胞除掉，常規(guī)處艦用的離心、股激幾壓濾等方法，工人的勞動弓艘大，操作時間長。在產物的提取過程中，由于反應液的組合物錢，特別是含有由微生物弓胞的雜質，并且L-半胱氨酸在7K中的溶解度很高，所以目前的提取方法是，先將最初得到的L"半胱氨酸與強酸如鹽酸或對甲苯磺酸反應，而M相應的鹽。這些方法一股凝呈都錢，得到的L"半胱氨酸的產率很低。
發(fā)明內容本發(fā)明目的是解決由酶轉化fe^成L半胱氨酸現有技術中存玍的^l酶源細胞和除掉酶源細胞的勞動5驢大、操作時間長等問題，Jli共一種在酶轉化法生產L-半胱氨酸的過程中使用金屬膜的方法。包括用金屬M縮菌體和除菌體的方法，并在產物的提取過程中提供一種將L半胱氨酸氧化成L-胱氨酸的方法。A.金屬^jl嫩禮縮含酶源細胞的培養(yǎng)液將培養(yǎng)好的酶源細胞的培養(yǎng)液3(M00L調節(jié)pH&8，加入微濾設備料罐中，1^慮膜為金屬膜。冷凝管中fflA)t4卩7Kffl行冷卻，控挪ag^36。C，防止酶原細胞失活。調節(jié)膜進出口壓差為0.1~1.0kg/cm2，、搶液流速為5(K300ml-min—1。過濾1~3小時可將酶源細胞培l(xiāng)^t鄉(xiāng)為54L，倍數為520倍。.B.前體物質的轉化將步驟A制備的酶原細胞繊液，加入到底物溶液中，進行斷足反應。其中底物PL-2-MS-A2噻PM"4羧酸(DL-2-Amino-A2lhiazdine-4-CarboxylicAcid，DL-ATC)]溶液的濃度為0.05%~5.0%，在0^小B寸加入，反應a^為36M2'C，反應時間為212小時。C.金屬膜過濾除去B步驟中斷足反應液中的酶源細胞:金屬麟用不鏃閃管鄉(xiāng)分離系統，其L徑為50nm100nm，截留分子量2000~50000MW，pH范圍1~14,操作aS為^40"C，M壓力與出膜壓力差0.11.0kg/cm2，濾鵬制在50~3001111-111]11-1。取濾出液，細酸式茚三酮法測定L"半胱氨齢量。D.L半胱氨酸氧化成U光氨酸向歩驟C得到的L"半胱氨酸滄液中加AH氯化鐵做為氧化劑，半胱氨酸與三氯化鐵的摩爾比為1:1~1:2.5，溶液pH為0.5~2.0，10^60。C進fim化反應，反應時間為2~30她E.將步5節(jié)得到的L-胱氨酸結晶析出，用電解還原法還原l半胱氨酸。在電解還原過程中陰極液為0.66mol/L的胱氨酸溶液，陽極液為5%硫酸溶液。陽極液容量為70ml，兩間距離為15cm.電流密度為34A/dm2。以飽和甘汞電極在室溫下柳，用直流數字電壓表觀懂電位，雜制在-0.62V以下。本發(fā)明的優(yōu)點和積極:本發(fā)明禾擁金屬膜過搶法在前體物質的轉4fci前，將酶源細胞的培養(yǎng)液進療濃縮，在前微質的轉fct后將酶源細胞除掉，改變了常規(guī)處棘用的離心、壓^aE麟方法，附氐了維修費用，降低了工人的勞動強度，除去菌體徹底，節(jié)省操作時間；且金屬膜ffiil壽命長，耐高溫、耐酸堿、易于清'M^置維護方便。本發(fā)明艦添加氧化齊啲方法，使濾液中的L半胱氨酸氧化為L胱氨酸。利用L"胱氨酸婦k中溶解度小的特點，使L"胱氨酸容易結晶析出，從而獲得L-胱氨酸結晶粗品。再將L胱氨M原成L-半胱氨酸，可以大大提高L半胱氨酸的收率，縮短操作周期，斷氐提取財。具體實船式實施例l:金屬膜過濾M含酶源細胞的培養(yǎng)液將培養(yǎng)好的酶源細胞的培養(yǎng)液30L加入微濾設備料罐中，微濾膜為金屬膜。冷凝管中i!A冷卻7爐行冷卻，控制》顯度35'C，調節(jié)膜進出口JEM為1.0kg/cm2，濾液、為130mLmin-1。過濾1小時可得濃縮的酶原細胞培養(yǎng)液6L。其它^f牛不變，改變表l中的參數，得到的結果如表l所示。表l過濾割牛對過濾效果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>實施例2:金屬膜過濾除去,反應液中的酶源細胞取實施例l的目的酶原細胞培^S5L，加入到含有0.6。/。的DL-ATC溶液(含有0.6%DLATC，0.6%K2HPO4，pH7,5至8.0)10L的30L自動控制發(fā)酵罐中，混勻。42。C恒溫，反應2.5小時后，得到L-半胱氨W^反應液。取L-半胱氨酸,反應液15L加入微濾設備料罐，微濾膜為金屬膜，系統的截留分子量為200(K50000MW，冷凝管中通入冷卻水進行冷卻，控制溫度35°C，調節(jié)膜進出口壓差為0.5kg/cm2,禾擁微濾^(寸不同針量物Jli^流率的不同，使酶原細胞截留在搶渣內，當進出MJ1^明顯降低時，補Aii量去離子水；過濾完后得到L-半胱氨酸濾液16L，濾出液菌體去除率為95%以上。實施例3:L-半胱氨麟化亂-胱氨酸取實施例2的L-半胱氨酸濾液20mL，度為5.6g/L，按摩爾比為1:1.5的量加A^氯化鐵(三氯化鐵配置鵬液加入)，室溫下反應10併中，取反應液20nL，衍頓艦氨基酸分析儀測定，87.5%的L-半胱氨酸被氧化成為L-胱氨酸。用電解還原法將L-胱氨酸還原成L"半胱氨酸，由L-胱氨,原成L-半胱氨酸的得率為90.50/0。其它條件不變，改變表2中的參數，得到的結果如表2所示。表2反應斜牛對Lj光氨酸轉化率和L-半胱氨酸收率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權利要求1、本發(fā)明提供一種在酶轉化法生產L-半胱氨酸的過程中使用金屬膜的方法。包括用金屬膜過濾濃縮含酶源細胞的培養(yǎng)液，用金屬膜過濾除去酶促反應液中的酶源細胞，并在產物的提取過程中提供一種將L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸的方法。2、根據權利要求1的方法,其特征在于金屬膜過濾濃縮含酶源細胞的培養(yǎng)液時控制溫度4~36。C，調節(jié)pH68，調節(jié)膜進出口壓差為0.1-1.0kg/cm2，濾液流速為50~300ml'min-1。過濾1~3小時可將酶源細胞培養(yǎng)液濃縮為5~6L，濃縮倍數為5~20倍。3、根據權利要求l的方法，其特征在于金屬膜過濾除去酶促反應液中的酶源細胞時，金屬膜采用不銹鋼管式膜分離系統，其孔徑為50nni100nm，截留分子量2000~50000麗，pH范圍1~14，操作溫度為4~40°C，進膜壓力與出膜壓力差0.1~1.0kg/cm2，濾速控制在50300mhnin"。4、根據權利要求1的方法，其特征在于L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸時使用三氯化鐵做為氧化齊IJ，半胱氨酸與三氯化鐵的摩爾比為1:11:2.5，溶液pH為0.52.0，1060'C進行氧化反應，反應時間為230分鐘。全文摘要本發(fā)明公開了一種在酶轉化法生產L-半胱氨酸的過程中使用金屬膜和氧化劑的新工藝，利用金屬膜過濾法在前體物質的轉化之前，將酶源細胞的培養(yǎng)液進行濃縮，在前體物質的轉化之后將酶源細胞除掉。在用金屬膜過濾濃縮含酶源細胞的培養(yǎng)液時控制溫度4～36℃，調節(jié)pH6～8，調節(jié)膜進出口壓差為0.1～1.0kg/cm²，過濾1～3小時可得濃縮酶原細胞5～6L，濃縮倍數為5～20倍。在用金屬膜過濾除去酶促反應液中的酶源細胞時，操作溫度為4～40℃，進出膜壓力差0.1～1.0kg/cm²。使用三氯化鐵做為氧化劑將L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，半胱氨酸與三氯化鐵的摩爾比為1∶1～1∶2.5，溶液pH為0.5～2.0，10～60℃進行氧化反應，反應時間為2～30分鐘。文檔編號C12P13/00GK101363035SQ20071005859公開日2009年2月11日申請日期2007年8月6日優(yōu)先權日2007年8月6日發(fā)明者劉淑云,徐慶陽,懷麗華,寧陳,雷馬申請人:天津科技大學