專利名稱：：花生轉(zhuǎn)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，該方法適用于所有的花生品種、品系或種質(zhì)資源材料。
背景技術(shù)：
：植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過各種不同的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，把從動(dòng)物、微生物、病毒或植物等中分離到的目的基因(外源基因)，通過各種方法轉(zhuǎn)移到受體植物的基因組上，使得外源基因在受體植物中穩(wěn)定遺傳，并賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等?；ㄉ俏覈?guó)主要的油料作物，富含油脂和蛋白。利用生物工程和轉(zhuǎn)基因的手段進(jìn)行品種改良和遺傳學(xué)研究是花生基因工程的重要內(nèi)容。自1993年獲得第一例轉(zhuǎn)基因花生以來(Ozias-AkinsP,SchrmllJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)，花生的基因轉(zhuǎn)化方法得到很多改進(jìn)(許澤永，花生轉(zhuǎn)化和再生研究進(jìn)展。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(2):107-111)?；ㄉ霓D(zhuǎn)化方法可以分為基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化和非組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化。基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化是以外植體和源于之的培養(yǎng)物為轉(zhuǎn)基因受體。這些外植體包括成熟胚或無菌苗的胚軸、子葉、幼葉，未成熟胚及其胚軸、子葉等，源于之的培養(yǎng)物主要分為不定芽發(fā)生培養(yǎng)物和體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物。這些受體接受外源DNA的主要方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后都要經(jīng)過組織培養(yǎng)篩選抗性的轉(zhuǎn)化系和再生抗性轉(zhuǎn)化植株過程。此過程需要無菌環(huán)境、人工光照和控制溫/濕度等培養(yǎng)條件，一般受到基因型、外植體類型、受體狀態(tài)、培養(yǎng)篩選和再生植株方法和條件等很多因素的影響，因此高效組培植株再生技術(shù)是基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化必要的前提條件之一。以上述不同花生器官、組織為外植體，通過器官發(fā)生和/或體胚發(fā)生途徑再生植株均獲得成功，隨著再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)的進(jìn)步，目前形成兩種主要花生基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化以花生幼苗嫩葉、種子子葉為外植體誘導(dǎo)的不定芽發(fā)生培養(yǎng)物，通過卡那霉素篩選、器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)化植株；基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化以未成熟胚(子葉)和成熟種胚、胚小葉為外植體誘導(dǎo)的胚性愈傷，通過潮霉素篩選獲得抗性轉(zhuǎn)化體胚，再生轉(zhuǎn)化植株。這均建立在比較成熟的器官和體胚發(fā)生再生植株研究的基礎(chǔ)上。以幼葉、胚小葉和子葉為外植體的器官發(fā)生植株再生技術(shù)研究。在80年代獲得成功的基礎(chǔ)上，致力于提高植株再生效率。Mckently等(McKentlyAH，MooreGA.GardnerFP.Regenerationofpeanutandperennialpeanutfromculturedleaftissue.CropScience,1991，31(3):833-83)以花生品種Florigiant8d齡苗幼葉為外植體，比較不同BA濃度，以5mg/LBA(芐氨基嘌呤)和lmg/LNAA(a-萘乙酸)MS培養(yǎng)基最優(yōu)，90%以上外植體長(zhǎng)出愈傷，其中38%長(zhǎng)出芽點(diǎn)。轉(zhuǎn)至5mg/LBAMS培養(yǎng)基，84%長(zhǎng)出枝條，平均每個(gè)外植體1-3個(gè)枝條。Eapen等(EapenS，GeorgeLPlantregenerationfromleafdiscsofpeanutandpigeo叩ea:influenceofbenzyladenine，indoleaceticacidandindoleaceticacid_aminoacidconjugates.PlantCellTissueandOrganCulture,1993，35(3):223-27)以花生10-12d苗齡幼葉為外植體，在含10MMBA和0.5MMIAA(口引哚乙酸)MS培養(yǎng)基中，約1/3外植體長(zhǎng)出枝條，平均每個(gè)外植體長(zhǎng)出枝條7個(gè)。Livingstone禾口Birch(LivingstoneDM,BirchRG.Plantreganerafionandmicroprojectile-mediatedgenetansferinembryonicleafletsofpeanut.Clrac/人s1/yp。卵esL.)AustralianJournalofPlantPhysiology,1995，22:585-591)以成熟種子胚小葉為外植體，在3mg/L,BA和lmg/LNAAMS培養(yǎng)基培養(yǎng)6周。參試兩品種分別有50%和66%外植體長(zhǎng)出愈傷和芽點(diǎn)，平均芽點(diǎn)數(shù)分別為9.4和13個(gè)；轉(zhuǎn)移到5mg/LBAMS培養(yǎng)基有助于枝條長(zhǎng)出，平均每個(gè)外植體5個(gè)枝條。國(guó)內(nèi)，方小平等(方小平，許澤永，張宗義等.花生小葉外植體植株再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因遺傳轉(zhuǎn)化。中國(guó)油料，1996，18(4):52-5)以鄂花4號(hào)等3個(gè)品種4d齡苗幼葉為外植體，應(yīng)用Livingstone方法。外植體愈傷誘導(dǎo)率提高到86-100%，平均再生植株達(dá)到了5個(gè)。Sharma(SharmaKK.AnefficientmethodfortheproductionoftransgenicplantsOirac/L/s/j^pogaesL.)through4§roZacterii//z7z^/we/aciennnediatedgenetictransformation.PlantScience,2000，159(1):7-19)以成熟種子子葉為外植體，在含20,BA和10HM2，4-D(2,4-二氯苯乙酸)MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上從子葉節(jié)傷口處誘導(dǎo)出大量芽點(diǎn)。隨后通過含2南BA枝條伸長(zhǎng)培養(yǎng)基獲得枝條。90%以上外植體長(zhǎng)出芽點(diǎn)。平均每個(gè)外植體獲得4-8個(gè)枝條。以未成熟胚(子葉)和成熟種胚、胚小葉為外植體的體胚發(fā)生再生植株技術(shù)。0zias—Akins(Ozias-AkinsP.Plantregenerationfromimmatureembryosofpeanut.PlantCellR印orts，1989,8:217-218)以未成熟胚為外植體，在含0.5-2.0mg/LPiclor柳(4-氨基-3,5,6-三氯吡啶-2-甲酸，毒莠定)的培養(yǎng)基中。50-60%的外植體誘導(dǎo)形成體胚，并獲再生植株。進(jìn)一步研究表明在含0.5mg/LPicloramMS培養(yǎng)基中，未成熟子葉比胚軸誘導(dǎo)形成的體胚易于再生；胚性愈傷轉(zhuǎn)到含3mg/Lpicloram的培養(yǎng)基可以長(zhǎng)期保存即獲得重復(fù)體胚發(fā)生培養(yǎng)物。體胚再生植株，先后通過含lmg/LNAAMS培養(yǎng)基以及含0.1mg/LBA和0.lmg/LNAAMS培養(yǎng)基培育。再轉(zhuǎn)到含3mg/LBA和1mg/LGA(赤霉素)培養(yǎng)基促使莖伸長(zhǎng)，一次實(shí)驗(yàn)獲得913個(gè)枝條(0zias-AkinsP,SchrrallJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)。Hazara等(HazraS，etal.Directsomaticembryogenesisinpeanut(yirac力is1/y73。gea)Biotechnology.1989，7:949-95)以含3mg/L2,4-DMS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)未成熟種胚直接形成體胚，每個(gè)外植體產(chǎn)生8-15個(gè)體胚。Baker等(BakerCM,BurnsJA，WetzsteinHY.Influenceofphotoperiodandmediumformulationonpeanutsomaticembryogenesis.PlantCellReports,1994，13(3-4):159-163)，Baker禾卩Wetzstein(BakerCM,WetzsteinHY.Repetitivesomaticembryogenesisinpeanutcotyledonculturesbycontinualexposureto2,4-D.PlantCellTissueOrgCult,1995，40:249-254)以20mg/L2，4-D誘導(dǎo)未成熟胚子葉形成體胚效果最好并可獲得重復(fù)體胚發(fā)生培養(yǎng)物；光強(qiáng)度和暗培養(yǎng)對(duì)體胚形成效率沒有影響，但對(duì)體胚形狀影響很大。光培養(yǎng)條件下形成的體胚粗糙、木質(zhì)化，難于分離；而暗培養(yǎng)形成的體胚，光滑、易于分離。由于末成熟種胚的取材受到限制，從土中取出的莢果和胚極易污染等缺點(diǎn)。因此，各國(guó)科學(xué)家分別以成熟種子為材料開展研究。Chengalrayan等(ChengalrayanK，SathayeSS，HazraS.Somaticembryogenesisfrommatureembryo-derivedleafletsofpeanutGirac力i51/yp0卵e3U.PlantCellReports,1994，13(10):578-581)以胚小葉為外植體，在含20mg/L2,4-DMS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷，轉(zhuǎn)到含3mg/L2,4-D的培養(yǎng)基上20d內(nèi)有90%的愈傷產(chǎn)生體胚。Baker等(BakerCM,DurhamRE，BumsJA，etal.Highfrequencysomaticerabryogenesisinpeanut(Arac/w'sL)usingmature,dryseed.PlantCellReport,1995，15:38-42)用源于成熟種胚的外植體誘導(dǎo)胚性愈傷和體胚，以20mg/L2,4--D暗培養(yǎng)最優(yōu)，96%外植體產(chǎn)生體胚，平均每個(gè)外植體產(chǎn)胚7.6個(gè)，而品種間體胚誘導(dǎo)量有明顯差異。Livingstone等(LivingstoneDM,BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(ylrac/i51/"osesL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)進(jìn)一步完善誘導(dǎo)條件，在含5mg/LpicloramMS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)6周，珍珠豆型品種Gajah每個(gè)種胚平均產(chǎn)生6.3體胚，普通型品種NC-7平均產(chǎn)生14.3個(gè)體胚。并應(yīng)用滲透劑干燥處理，使得體胚再生植株率提高到60%。Chengalrayan等(ChengalrayanK，MhaskeVB，HazraS.High—frequencyconversionofabnormalpeanutsomaticembryos.PlantCellReports,1997，16:783-786)通過含8.9幽BA和14幽KT(激動(dòng)素)MS培養(yǎng)基，或含22.7MMTDZ(噻二唑苯基)MS培養(yǎng)基培育，使體胚再生植株效率分別提高到86%和92%。國(guó)內(nèi)，鄧向陽和衛(wèi)志明(鄧向陽，衛(wèi)志明.幼胚長(zhǎng)度、2，4-D濃度、光強(qiáng)度等對(duì)花生體細(xì)胞胚發(fā)生的影響及高效再生系統(tǒng)的建立。植物生理學(xué)報(bào)，2000，26(6):525-531)以我國(guó)花生品種粵油116、魯花9號(hào)幼胚為材料通過含5-40mg/L2，4-D培養(yǎng)基上胚性愈傷率達(dá)75%以上，平均產(chǎn)胚量3個(gè)以上，并易再生植株。晏立英等(晏立英，陳坤榮，羅莉霞，許澤永，張宗義，方小平，陳金香。BirchRG，DieztgenRG.花生體胚誘導(dǎo)和植株再生研究。中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2000，22(3):9-12)以我國(guó)花生品種鄂花4號(hào)為材料，成熟種胚為外植體，無論是20mg/L2，4-D或5mg/LpicloramMS培養(yǎng)基上胚性愈傷率達(dá)55-78%。平均產(chǎn)胚量4個(gè)。13個(gè)品種體胚誘導(dǎo)率6.0-83.3%。產(chǎn)胚量1.2-4.5個(gè)，差異顯著。8個(gè)品種體胚技條再生率達(dá)36.3-77.8%。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)化植株研究。巴西Lacorte等(LacorteC,MansurE，TimmermanB,etal.Genetransferintopeanut(Arac/w'51力j7o卵eaL)by4§ro^3cte/\z'"yz7t〃膨/acie/AS1.PlantCellReports,1991，10:354-357)，我國(guó)萊陽農(nóng)學(xué)院分別報(bào)道農(nóng)桿菌對(duì)花生有侵染力(DongJ，BiY,XiaL，etal.TeratomainductionandnopalinesynthasegenetransferinPeanut.ActaGeneticaSinica,1990,17(1):13-16)。前者測(cè)定4個(gè)農(nóng)桿菌菌株，依據(jù)莖傷口接種致瘤數(shù)量和大小。以A281菌株致病力最強(qiáng)，Bo542和A208菌株次之，T37最差。后者僅用T37菌株接種41個(gè)花生品種和材料，僅6個(gè)產(chǎn)生腫瘤，也證實(shí)了T37菌株致病力弱。Mckently等(McKentlyAH，MooreGA，DoostarH，NiedzRP.Agrobacterium~mediatedtransformationofpeanutdac/w's/"o卵esL.)Embryoaxesandthedevelopmemoftransgenicplants.PlantCellR印ots，1995，14:699-703)測(cè)定5個(gè)菌株對(duì)花生致病力，以A281菌株最強(qiáng)，C58、A518和B6之，T37最弱。Mansur等(MansurEA，LacortC，F(xiàn)reitasGetal.Regulationoftransformationefficiencyofpeanut(/irac/is力/P。卵eaL.)explantsbyAgrobacteriumtumefaciensPlantScience,1993，89:93-99)以A281菌株優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，共培以固體培養(yǎng)基好于液體，嫩葉外植體好于帶胚或不帶胚子葉，7-10d苗齡好于苗齡低的嫩葉，嫩葉前端外植體好于基端，接種菌合適濃度為l-5xl09,接種前丁香酮(AS)處理沒有提高致病力的作用。印度Eapen禾口George(EapenS，GeorgeL.y^ro力acteri"歷t"/77e/acj'e/76"mediatedgenetransferinpeanutC4^a(^力J^s■/7j70^aeaL.).Plantcellr印orts,1994，13:582-586)首次報(bào)道通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因花生植株。他們以9-10d苗齡嫩葉為外植體與含雙元質(zhì)粒pBI121的農(nóng)桿菌LBA4404菌株共培3d，50-100mg/L卡那霉素篩選，獲得抗卡那霉素、0-葡糖苷酸酶(GUS)活性陽性的轉(zhuǎn)基因花生。在溫室內(nèi)20株轉(zhuǎn)基因花生植株均能開花，但僅3株結(jié)實(shí)，所結(jié)種子皺縮，末充分成熟。分子檢測(cè)證實(shí)外源基因已整合到花生基因組。美國(guó)ChengMing等(ChengM，JarretRL,LiZ，XingA，DemskiJW-ProductionoffertiletransgenicpeanutCirac/w'51力y/o卵eaL)plantsusing4§^o6scferiifflt"歷e/^cie"s.PlantCellReports,1996，15:653-657;ChengM，JarretRL,LiZ,DemskiJW.Expressionandinheritaneofforeigngenesintransgenicpeanutplantsgeneratedby4§ro63"eri"/zrmediatedtransformation.PlantCellReports,1997，16:541-544)報(bào)道通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化系，共52株轉(zhuǎn)基因植株，并首次得到成熟T,代種子及后代。他們以花生10d齡苗嫩葉為外植體，與含PBI121雙元質(zhì)粒的EHA101菌株共培2d，150mg/L卡那霉素篩選。用煙草葉片提取液處理農(nóng)桿菌后接種，提高了GUS活性瞬間表達(dá)。轉(zhuǎn)化效率達(dá)0.2-0.3%。在T2代轉(zhuǎn)基因花生植株中，GUS基因或百分之百表達(dá)，或3:1的比例分離，證實(shí)外源基因巳整合進(jìn)基因組并在后代穩(wěn)定表達(dá)。同一實(shí)驗(yàn)室的LiZhi-jian等(LiZJ,JanetRL,DemskiJ.EngineeredresistancetotomatosporedwiltvirusintransgenicpeanutexpressingtheviralnucleocapsidganeTransgenicResearch,1997,6:297-305)改進(jìn)上述方法用繁殖中期(O.D,=0.8-l.O)的農(nóng)桿菌接種。隨后頭孢霉素從300mg/L降到100mg/L，卡那霉素降到IOOmg/L，結(jié)果縮短了獲得枝條所需時(shí)間，轉(zhuǎn)化效率提高到1.5%。他們獲得轉(zhuǎn)番茄斑萎病毒殼蛋白編碼基因N(TS群一N)基因花生植株，Southern分子雜交證實(shí)/57^-/\^基因己整合進(jìn)花生基因組，在花生植株內(nèi)的表達(dá)。對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因花生抗性鑒定，轉(zhuǎn)基因花生植株接種葉癥狀比對(duì)照推遲約一周，褪綠斑明顯減少。接種30d后，所有對(duì)照花生均出現(xiàn)典型TSWV病害癥狀，而轉(zhuǎn)基因花生植株未出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀，長(zhǎng)勢(shì)同花生健株相似。國(guó)際半干旱熱帶地區(qū)作物所Sharma禾口Anjaiah(SharmaKK.Anefficientmethodfortheproductionoftransgenicplants(AracjWs/^po卵朋L.)through4^ro63cte/"/鵬t"膨/acie"nnediatedgenetictransformation.PlantScience,2000,159(1):7-19)用農(nóng)桿菌C58(disarmed)菌株轉(zhuǎn)化成熟種子子葉外植體，通過125mg/L卡那霉素篩選，產(chǎn)生55%轉(zhuǎn)基因植株，移栽到溫室內(nèi)獲得75個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化系。Southernblot雜交證實(shí)外源基因已整合進(jìn)基因組。國(guó)內(nèi)方小平等(方小平，許澤永，張宗義等.花生小葉外植體植株再生及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因遺傳轉(zhuǎn)化。中國(guó)油料，1996,18(4):52-5;方小平，許澤永，張宗義，晏立英，陳坤榮，羅莉霞，陳金香，BirchRG，DieztgenRG.GUS基因和NPTII基固在轉(zhuǎn)基因花生后代的遺傳研究.花生科技，1999，(增刊)241-245)花生品種鄂花4號(hào)4d齡苗嫩葉作外植體，與AGL1菌株共培，經(jīng)卡那霉素篩選獲得轉(zhuǎn)基因花生。轉(zhuǎn)基因花生在溫室內(nèi)開花結(jié)實(shí).獲得L代種子。外源基因表達(dá)通過卡那霉素抗性和GUS活性組織化學(xué)檢測(cè)得到證實(shí)。對(duì)轉(zhuǎn)基因TrT3后代分析表明GUS基因以1:1和3:1比例分離，隨代數(shù)增加，3:1分離比例增加。T3代可選擇到GUS基因純合單株?；驑尳閷?dǎo)轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織或幼胚，通過體胚再生轉(zhuǎn)化株研究。美國(guó)0zias_Akins等(Ozias-AkinsP,SchrmllJA,AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)首次報(bào)道用基因槍轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織，經(jīng)過潮霉素(固體-液體培養(yǎng)基)篩選，得到轉(zhuǎn)化植株。他們以未成熟種子子葉和胚作外植體。在含0.5mg/Lpicloram的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚和胚性愈傷，再轉(zhuǎn)移到含3mg/LpicloramMS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)長(zhǎng)期保存。保存1-2年的胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化對(duì)象，通過基因槍轟擊，將含潮霉素抗性基因和&s基因的質(zhì)粒導(dǎo)入。5周后，在含5-10mg/L潮霉素固體培養(yǎng)基上篩選2輪4w，再通過20mg/L潮霉素液體培養(yǎng)基2w連續(xù)篩選，每次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)獲得2個(gè)轉(zhuǎn)基因的胚性愈傷細(xì)胞系，約1%的愈傷組織經(jīng)轉(zhuǎn)化后獲得一個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞系再生獲得100株花生植株。PCR擴(kuò)增和Southern分子雜交證實(shí)外源基因已整合進(jìn)花生基因組。在同一實(shí)驗(yàn)中，采取固體連續(xù)篩選中可獲得抗性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，但未獲得再生植株，并認(rèn)為液體篩選更快、有效。該實(shí)驗(yàn)室采用類似改進(jìn)的轉(zhuǎn)化(全液體培養(yǎng)基)篩選系統(tǒng)有多個(gè)報(bào)道Wang等(WangAM，F(xiàn)anHL，SingsitC，0zias-AkinsP.TransformationofpeanutwithasoybeanvspBpromoter-uidAchimericgeneI.OptimizationofatransformationsystemandanalysisofGUSexpressioninprimarytransgenictissuesandplants.PhysiolPlant,1998,102:38-48)用3個(gè)花生品種為材料，每次基因槍轟擊4.9cm2大小愈傷，轟擊后1-4d含10mg/L潮霉素液體培養(yǎng)基篩選lw，再20mg/L潮霉素液體培養(yǎng)基篩選6w,共獲得160個(gè)抗潮霉素細(xì)胞系，其中從38個(gè)細(xì)胞系中獲得200株轉(zhuǎn)基因植株，但19個(gè)細(xì)胞系79株植株開花、結(jié)實(shí)，他們認(rèn)為可能是胚性憊傷保存過久引起染色體異常的緣故。Singsit等(SingsitC，AdangMJ",LynchRE,AndersonWF,WangAM,CardineauG,Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997，6:169-176)報(bào)道通過基因槍轉(zhuǎn)化，將基因?qū)牖ㄉ咝杂鷤?。每次基因槍轟擊平均獲得0.5個(gè)抗潮霉素轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,8次實(shí)驗(yàn)平均每次獲得4.8個(gè)潮霉素抗性細(xì)胞系，再生獲得119株轉(zhuǎn)基因植株。PCR和Southern分子雜交證實(shí)^TCrj^M基因和力p力基因巳整合進(jìn)花生基因組。通過酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)證實(shí)Gr/i^^;基因在花生植株內(nèi)表達(dá)，CryIA(c)蛋白占整個(gè)可溶性蛋白的0.18%。非洲蔗螟(j57a幼7叩a7/wsh'"卵se77"sZe77e力詞養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)基因花生具有抗蟲性，飼喂轉(zhuǎn)基因花生非洲蔗螟幼蟲由完全致死到減重66%。該實(shí)驗(yàn)室同時(shí)獲轉(zhuǎn)Tswv核表殼蛋白N基因花生(YangH，SingsitC，WangA，GonsalvesD，0zias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998,17(9):693-699)。美國(guó)另一實(shí)驗(yàn)室(MagbanuaZV，DaytonWildeH,RobertsJK，ChowdhuryK，AbadJ,MoyerJW,WetzsteinHY，ParrottWA(2000)FieldresistancetoTomatospottedwiltvirusintransgenicpeanut(ArachishypogaeaL.)expressinganantisensenucleocapsidgenesequence.MolBreeding6:227-236)以源于成熟種胚的外植體2，4-D誘導(dǎo)重復(fù)體胚發(fā)生培養(yǎng)物(液體)，基因槍轟擊后8d開始液體培養(yǎng)基篩選獲轉(zhuǎn)Tswv核表殼蛋白N基因花生，大田實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)Tswv抗性。澳大利亞Livingstone禾卩Birch(XivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(Arac力is力"o3ev3L.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)以源于成熟種胚的外植體picloram誘導(dǎo)體胚和胚性愈傷。用分別含報(bào)告基因w'W和篩選基因(力/力)的質(zhì)粒包裹鎢粉，每次基因槍轟擊10cm2大小胚性愈傷，轟擊后2周后開始20mg/L潮霉素(固體培養(yǎng)基)篩選可獲得轉(zhuǎn)化體胚。每次轟擊獲得3-6個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化系。轟擊后6個(gè)月，獲得再生轉(zhuǎn)化植株。約有50%的轉(zhuǎn)化系同時(shí)獲得報(bào)告基因和篩選基因表達(dá)。Southern分子雜交證實(shí)外源基因已整合進(jìn)T,代轉(zhuǎn)基因花生基因組。國(guó)內(nèi)，許澤永等(許澤永，陳坤榮，晏立英，羅莉霞.張宗義，方小平，陳金香，DietzgenRG，BirchRG.花生體胚誘導(dǎo)、植株再生和基因槍介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化?！抖皇兰o(jì)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)展望論壇》論文摘要集，1999:58-59)以我國(guó)花生品種"中花3號(hào)"為材料，采用上述轉(zhuǎn)化技術(shù)，獲得16個(gè)獨(dú)立的抗潮霉素體胚，并再生植株。PCR擴(kuò)增和生物學(xué)測(cè)定表明，其中9個(gè)已導(dǎo)入抗潮霉素基因，5個(gè)同時(shí)導(dǎo)入花生條紋病毒CP基因。DengXiang-Yang等(DengXY，WeiZM，AnHL(2001)Transgenicpeanutplantsobtainedbyparticlebombardmentviasomaticembryogenesisregenerationsystem.CellRes,11(2):156-160)以我國(guó)花生品種粵油116、魯花9號(hào)幼胚為靶材料通過基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化含潮霉素抗性基因和GUS基因的質(zhì)粒pCAMBIA1301后，于含2,4-D培養(yǎng)基中恢復(fù)誘導(dǎo)胚性愈傷10d后，在含10-20mg/L潮霉素固體培養(yǎng)基篩選4w，再經(jīng)20mg/L潮霉素液體培養(yǎng)基篩選6w，得到抗潮霉素體胚并再生植株。PCR和Southern分子雜交證實(shí)外源基因已整合進(jìn)花生基因組。綜合上述，國(guó)外美國(guó)、澳大利亞、印度及國(guó)際半干旱熱帶地區(qū)作物研究所相關(guān)實(shí)驗(yàn)室已分別建立花生轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)。美國(guó)率先獲得轉(zhuǎn)基因抗病、抗蟲花生。國(guó)內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)室也已初步建立起花生轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)，分別通過農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因花生。但是，目前無論是農(nóng)桿菌還是基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化均存在轉(zhuǎn)化和再生效率低、基因型限制、嵌合體和逃逸的問題。就農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)來說。轉(zhuǎn)化和再生效率受花生品種影響(基因型影響)較大，嵌合體和逃逸問題嚴(yán)重，轉(zhuǎn)化率不高；但其優(yōu)點(diǎn)是所需時(shí)間短，從外植體與農(nóng)桿菌共培到獲得轉(zhuǎn)化植株，一般只需6個(gè)月?；驑尳閷?dǎo)轉(zhuǎn)化雖然受花生品種因素影響相對(duì)小，轉(zhuǎn)化率仍低，雖嵌合體和逃逸問題不嚴(yán)重，但仍有少量逃逸嵌合體。其缺點(diǎn)是需要一定設(shè)備條件，同時(shí)從外植體準(zhǔn)備到獲得轉(zhuǎn)化植株需要12個(gè)月，耗費(fèi)人力、物力，且易產(chǎn)生體細(xì)胞變異，造成再生植株開花而不結(jié)實(shí)。因此，上述技術(shù)均需要進(jìn)一步完善。非組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化方法。不通過組培，直接轉(zhuǎn)化成熟種胚或種胚生長(zhǎng)點(diǎn)獲得轉(zhuǎn)化植株的報(bào)道。美國(guó)Mckently等(McKentlyAH，MooreGA，DoostarH，NiedzRP.Agrobacterium—mediatedtransformationofpeanut(Arac力J's々KPO卵朋L)Embryoaxesandthedevelopmemoftransgenicplants.PlantCellR印ots，1995，14:699-703)報(bào)道將保留一片子葉的種胚劃傷接種EHA101菌株，直接播于消毒土內(nèi)，由種胚接種后直接長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化株，獲得轉(zhuǎn)基因花生植株。實(shí)驗(yàn)用花生品種Florigiant800粒種胚，約120粒種胚存活長(zhǎng)出植株，其中11株花生有一片或更多葉片表達(dá)GUS活性，10株獲得種子。PCR和Southern分子雜交證實(shí)外源基因己整合進(jìn)花生基因組。其中11號(hào)株為嵌合體，L代20株苗，GUS活性陽性3株。丁2代植株GUS基因遺傳符合3:1的分離規(guī)律。印度Rohini等(RohiniVK.RaoKS.Transformationofpeanut(Arac力j's力y/x卵eaL):anon-tissueculturebasedapproachforgeneratingtransgenicplants.PlantScience,2000，150:41-49)報(bào)道用LBA4404菌株采用相同接種技術(shù)，獲得轉(zhuǎn)基因花生。優(yōu)化條件實(shí)驗(yàn)表明，在農(nóng)桿菌菌液中加入煙草汁液，與花生種胚共培16h可以增加轉(zhuǎn)化效率，獲得3.3%的轉(zhuǎn)化植株，并通過分子雜交證實(shí)外源基因已整合進(jìn)花生基因組。Brar等(BrarGS，CohenBA,VickCL，JohnsonGW.Recoveryoftransgenicpeanut(^rac力/51力j70卵eaL)plantsfroraelitecultivarsutilizingACCELLtechnology.PlantJournal,1994，5(5):745-753)報(bào)道成熟種胚頂端分生組織，經(jīng)基因槍用包被含Aar和番茄斑萎病毒外源基因的金粉轟擊，3_4周后95%的外植體直接伸長(zhǎng)出枝條，枝條數(shù)量平均5個(gè)。通過GUS活性檢測(cè)篩選轉(zhuǎn)化枝條，結(jié)果說明，供試的兩個(gè)品種，嵌合的轉(zhuǎn)化枝條分別為8.8%和6.4%，GUS活性全株均勻表達(dá)的分別為2-3%和0.6%，分別獲得8和3個(gè)轉(zhuǎn)基因系。Southern分子雜交證實(shí)外源基因己整合到和T。^代轉(zhuǎn)基因花生植株的基因組。不通過組培，通過農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化成熟種胚，由生長(zhǎng)點(diǎn)直接獲得轉(zhuǎn)化植株獲得成功。該項(xiàng)技術(shù)不需要組培設(shè)備，技術(shù)簡(jiǎn)單，并可縮短選育時(shí)間。問題是嵌合體問題嚴(yán)重，篩選純合轉(zhuǎn)化株工作量大。通過導(dǎo)入抗除草劑的^9r基因，可以用除草劑篩選，提高篩選效率。國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用花粉管通道技術(shù)將外源基因?qū)牖ㄉ?，已獲得不少經(jīng)驗(yàn)，因?yàn)槭欠N質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化法，以生殖器官或細(xì)胞為受體，直接利用植物受體本身的有性生殖過程或者種子發(fā)育過程，既免除了離體再生的組織培養(yǎng)，又縮短了獲得可遺傳轉(zhuǎn)基因種子的時(shí)間，值得進(jìn)一步深入研究。綜上所述，不管是基于組織培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)化法，還是非組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化法，都存在著轉(zhuǎn)化和再生效率低、基因型依賴、存在逃逸、嵌合體問題、從轉(zhuǎn)化到獲得轉(zhuǎn)基因(純合)種子的周期長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)中的一項(xiàng)或幾項(xiàng)。目前還沒有一種花生轉(zhuǎn)基因方法實(shí)現(xiàn)了高通量、高效率轉(zhuǎn)化并解決逃逸、嵌合體問題，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，解決目前常用的花生遺傳轉(zhuǎn)化方法中轉(zhuǎn)化效率低，通量小，依賴基因型，存在逃逸，嵌合體等問題，該方法不僅轉(zhuǎn)化效率高、通量高、不存在基因型依賴，而且篩選效率高，避免了逃逸，嵌合體的問題。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化體系有望解決相關(guān)技術(shù)瓶頸。發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)高通量、高效率的花生基因轉(zhuǎn)化，發(fā)明了花生轉(zhuǎn)基因技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是以源于成熟種子胚軸上部的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物為轉(zhuǎn)基因受體。在建立各類型花生的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物及再生植株系統(tǒng)基礎(chǔ)上，確定了基因槍轉(zhuǎn)化的各條件組合。在各條件組合下，使攜帶外源基因(如潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性等各種篩選標(biāo)記基因和其它目的基因)的DNA轉(zhuǎn)化重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物細(xì)胞，在轟擊1-IO天后通過含致死濃度的篩選劑(如20mg/L潮霉素Hygromycin)的半固體培養(yǎng)基連續(xù)篩選獲得獨(dú)立的抗性細(xì)胞系后，無篩選下再生獲得轉(zhuǎn)基因花生植株T。代苗，及轉(zhuǎn)基因的L代合子(種子)。進(jìn)行分子生物學(xué)方法(如PCR)篩選和分析(如Westernblot)表明外源基因穩(wěn)定整合、表達(dá)遺傳。本發(fā)明可采用保存0-6年的成熟花生種子誘導(dǎo)的，啟始培養(yǎng)后l-10個(gè)月的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物為轉(zhuǎn)基因受體；轉(zhuǎn)基因效率(所有實(shí)驗(yàn)平均效率是每轟擊平均獲得約15.7個(gè)獨(dú)立的抗性細(xì)胞系)明顯提高，是以往報(bào)道的相似方法的最好效率(最好條件下為3-6獨(dú)立的抗性細(xì)胞系/每轟擊，Livingstone和Birch,EficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanutCirac力j's力ypoaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)的至少3倍以上，轉(zhuǎn)化通量高；篩選效率高，無逃逸，無嵌合體；不存在基因型依賴，且再生植株高效容易；可大量獲得轉(zhuǎn)基因后代種子，且外源基因可穩(wěn)定整合、表達(dá)遺傳。這一轉(zhuǎn)基因方法，可以適用于所有花生品種或品系或種質(zhì)資源材料，涉及的篩選標(biāo)記基因和其它目的基因也不僅限于實(shí)施例陳述用的潮霉素抗性基因和人5cJ-W。一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，包括下列步驟一、建立各類型花生的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物保存0-6年的各類型(如蘭娜/弗吉尼亞型、西班牙型、中間型或品系或種質(zhì)資源材料等)花生的成熟莢去殼，種仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸餾水3-5次漂洗。無菌條件下去掉種皮。成熟胚胚軸上部接種于含生長(zhǎng)素的SEM培養(yǎng)基(體胚發(fā)生培養(yǎng)基，MS鹽，B5維生氣0.088M(3%)蔗糖，12.42pM(3mg/L)picloram禾卩0.8%瓊脂，調(diào)pH5.8，121°C滅菌15分鐘后，適當(dāng)溫度控制在(55-60°C)時(shí)補(bǔ)充過濾滅菌6.84pM(1g/L)的谷氨酰胺)。培養(yǎng)皿28'C黑暗培養(yǎng)20-30天。每2-4周轉(zhuǎn)移體胚和胚性愈傷到新SEM培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)]-10個(gè)月獲得重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中主要使用M左治亞綠'品種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但本發(fā)明不限于此花生品種及類型。二、外源DNA或基因構(gòu)建在適當(dāng)?shù)闹参锉磉_(dá)框中并可在同一或不同載體上，抽提、純化外源基因植物表達(dá)框(DNA片段)或載體(質(zhì)粒)和確定其濃度在本發(fā)明陳述的程序中，待轉(zhuǎn)化的外源DNA是各種篩選標(biāo)記基因和目的基因。篩選標(biāo)記基因可為植物表達(dá)載體攜帶的潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性等篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框?；蛑参锉磉_(dá)框包括基因編碼序列和在植物中調(diào)控基因表達(dá)的基本元件，一般為啟動(dòng)子基因編碼序列轉(zhuǎn)錄終止子。植物表達(dá)載體可為pCAMBIA系列和pRT系列等。待轉(zhuǎn)化的外源目的基因?yàn)橹参锊≡剐曰?、作物品質(zhì)和產(chǎn)量等相關(guān)基因，可為人Ac7iZ基因；擬南芥Zffi57—y基因；花生/^Z^基因；花生力raA基因等(人Sc7-x7基因，DickmanMB，ParkYK，OltersdorfT,LiW，ClementeT,FrenchR.Abrogationofdiseasedevelopmentinplantsexpressinganimalanti鄰optoticgenes.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98:6957-6962;擬南芥jW67-v基因，Deslandes，L，Olivier,J.,Peeters,N.,Feng,D.X.，Khounlothara,M.,Boucher,C-,Somssich,I.，Genin，S.andMarco,Y.PhysicalinteractionbetweenRRS1-R:aproteinconferringresistancetobacterialwilt,andPopP2，atypeIIIeffectortargetedtotheplantnucleus.Proc.NatlAcad.Sci.USA,2003，100,8024-8029.;花生/^Z^基因，JungS,SwiftD，SengokuE，PatelM,Teul，F(xiàn)，PowellG，MooreK，AbbottA(2000b)Thehigh-oleatetraitinthecultivatedpeanut[ArachishypogaeaL].I.Isolationandcharacterizationoftwogenesencodingmicrosomaloleoyl-PCdesaturases.MolGenGenet263:796-805;花生^ra力基因，Viquez,0.M.'Koffi，K.N.,Dodo,H.W.，2003.Structureandorganizationofthegenomiccloneofamajorpeanutallergengene,Arah1.Mol.Immunol.40,565-571.等)。目的基因可通過常規(guī)分子克隆方法在適當(dāng)?shù)闹参锉磉_(dá)載體上(如pCAMBIA系列，pRT系列)構(gòu)建目的基因植物表達(dá)框。目的基因與篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框可連一起，即構(gòu)建到同一植物表達(dá)載體上；目的基因與篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框也可以分別處于不同植物表達(dá)載體上(如pCAMBIA系列，pRT系列)或DNA片段中。外源基因的植物表達(dá)框或載體構(gòu)建、質(zhì)?；駾NA片段的抽提、純化和確定濃度的具體操作參照常規(guī)分子克隆方法(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1998)。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，人^"-;^為目的基因，但本發(fā)明不限于用潮霉素抗性基因和人5"-W基因。三、微粒轟擊轉(zhuǎn)化重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物和篩選獨(dú)立抗性細(xì)胞系放置重復(fù)體胚發(fā)生胚性組織在SEM培養(yǎng)基中。準(zhǔn)備金微粒懸浮液；金微粒懸浮與含篩選基因和非篩選目的基因的質(zhì)粒或DNA片段混合。震蕩中依次加入氯化鈣和亞精胺。震蕩懸浮，短暫離心。乙醇漂洗包裹質(zhì)?；駾NA片段的金微粒，乙醇重懸微粒，重懸微粒滴于金微粒載片(Macrocarrier)。根據(jù)Bio-RadPDS1000/He系統(tǒng)說明書進(jìn)行轟擊。在轟擊后1-10天，被轟擊的胚性組織轉(zhuǎn)入含相應(yīng)致死濃度篩選劑(如20mg/L潮霉素)的半固體SEM培養(yǎng)基連續(xù)篩選。在篩選約1個(gè)月后，仔細(xì)地辨認(rèn)、分離獨(dú)立的可能的抗性細(xì)胞系。各系組織直接地繼代培養(yǎng)于新鮮的含致死濃度篩選劑的半固體SEM培養(yǎng)基中篩選。在以后各輪篩選，可存活增殖，抗性被證實(shí)的獨(dú)立系獲得抗性細(xì)胞系系號(hào)。在篩選之下繼代培養(yǎng)(約1-2個(gè)月)增殖抗性細(xì)胞系，增殖體胚用于植株再生。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中使用潮霉素抗性基因和潮霉素，以篩選轉(zhuǎn)基因抗性細(xì)胞系，但本發(fā)明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素。四、再生植株和傳代抗性細(xì)胞系體胚在含植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中26°C黑暗成熟。體胚轉(zhuǎn)移入含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)基操作過程1TDZ或3B1G，在16/8小時(shí)光周期光照培養(yǎng)(約6w)萌芽。切下至少2cm長(zhǎng)的芽于含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基生根(約lw)。生根的小植株移入花土中，最后轉(zhuǎn)移到溫室。在人工生長(zhǎng)室按照正常的栽培管理措施管理，收獲L代合子(種子)。按照正常的栽培管理措施對(duì)各T,代種子系繼續(xù)傳代選育。五、轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因后代分子分析分子分析抗性細(xì)胞系、再生植株和種子。參照常規(guī)方法，從
發(fā)明內(nèi)容二、三、四中不同的抗性細(xì)胞系、再生植株和種子獲得適量的愈傷、再生植株葉、種子子葉提取DNA(YangH,SingsitC，WangA,GonsalvesD，Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998，17(9):693-699)或RNA(YangH，SingsitC,WangA,GonsalvesD,Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleoca,psidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印,1998,17(9):693-699)或蛋白質(zhì)(SingsitC,AdangMJ,LynchRE，AndersonWF,WangAM，CardineauG,Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997,6:169-176)。按照常規(guī)分子分析方法(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1998)PCR分析初步確定目的基因和篩選基因整合與否。Southernblot分析進(jìn)一步確定外源基因在抗性細(xì)胞系、再生植株和種子中的穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)化性和轉(zhuǎn)化事件獨(dú)立性(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1998)。Northernblot(YangH，SingsitC,WangA，GonsalvesD，Ozias-AkinsP.Transgenicpeanutplantscontaininganucleocapsidproteingeneoftomatospottedwiltvirusshowdivergentlevelsofgeneexpression.PlantCellR印，1998,17(9):693—699)、Westernblot(J.薩姆布魯克等著，金東雁等譯，候云德等校，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1998)、E1ISA(SingsitC，AdangMJ，LynchRE，AndersonWF，WangAM,CardineauG，Ozias-AkinsP.ExpressionofaBacillusthuringiensiscryIA(c)geneintransgenicpeanutplantsanditsefficacyagainstlessercornstalkborer.TransgenRes.1997，6:169-176)等分析進(jìn)一步確定目的基因和篩選基因的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和傳代遺傳情況。在各代中篩選劑抗性分析進(jìn)一步確定篩選基因的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和傳代遺傳情況。本發(fā)明的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化效率高、通量高、不存在基因型依賴，而且篩選效率高避免了逃逸，嵌合體的問題。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面本發(fā)明提供以源于貯藏0-6年各類型花生的成熟種子胚軸上部建立花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物的方法及體胚再生的培養(yǎng)基操作過程1TDZ和3B1G兩種再生植株方法，均不依賴于花生基因型且高效。在本發(fā)明提供的花生轉(zhuǎn)化方法，對(duì)轉(zhuǎn)化各條件進(jìn)行分析、優(yōu)化和組合，達(dá)到了提高轉(zhuǎn)化效率的目的。本發(fā)明提供的花生轉(zhuǎn)化方法效率高是目前報(bào)道的類似方法最好條件下最好效率的至少3倍以上，實(shí)現(xiàn)了高通量基因轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明提供的花生轉(zhuǎn)化方法中轉(zhuǎn)化不依賴于花生基因型，即適合任何品種、品系或種質(zhì)資源材料，克服了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法中基因型依賴問題。本發(fā)明中轟擊l-10d后在含致死濃度篩選劑的半固體培養(yǎng)基中啟始篩選，篩選效率高，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，也避免了目前普遍使用的轉(zhuǎn)化方法中存在的逃逸和嵌合體問題。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植株可大量獲得轉(zhuǎn)基因后代種子，且外源基因可穩(wěn)定整合、表達(dá)遺傳。圖1外源基因表達(dá)載體示意圖。目的基因人5"-;^和篩選基因知t均CaMV35S啟動(dòng)子控制下。圖2重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物。啟始培養(yǎng)后3個(gè)月(4次繼代培養(yǎng))獲得明顯的花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物。圖3大約1個(gè)月篩選后，獨(dú)立的可能的抗性細(xì)胞系。大約1個(gè)月篩選后，一部分胚狀體能變成更大的堅(jiān)實(shí)白色體胚，并且低部通常黑死，和一部分胚狀體能形成新的次級(jí)體胚而舊體胚變成棕色(不生長(zhǎng))。這些白色體胚被認(rèn)為是潛在的潮霉素抗性體胚。其它大多數(shù)胚狀體則變棕黑，收縮或解體不可見；圖4從潮霉素抗性細(xì)胞系愈傷提取基因組DNA對(duì)(非篩選)目的基因5c7-;d編碼區(qū)(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應(yīng)中空白對(duì)照(Nullcontrol)為水；負(fù)對(duì)照(Negativecontrol)為非轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物愈傷提取基因組DNA;正對(duì)照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl，即轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。其他各孔為各潮霉素抗性細(xì)胞系其愈傷提取基因組DNA(標(biāo)明了各潮霉素抗性細(xì)胞系系號(hào))。約60%的潮霉素抗性細(xì)胞系編碼區(qū)PCR分析呈陽性，即產(chǎn)生特定的W編碼區(qū)700bp片段條帶。同時(shí)，所有花生基因組樣品(包括負(fù)對(duì)照非轉(zhuǎn)化花生基因組)可產(chǎn)生400bp條帶，表明在此擴(kuò)增條件下花生基因組自身的400bp片段被擴(kuò)增?？瞻讓?duì)照和正對(duì)照均無此400bp條帶。圖5a為再生植株的葉子提取基因組DNA對(duì)篩選基因力pt(850bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應(yīng)中空白對(duì)照(Nullcontrol)為水；負(fù)對(duì)照(Negativecontrol)為非轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物愈傷提取基因組DNA;正對(duì)照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl，即轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。其他各孔為再生植株的葉子提取基因組DNA(標(biāo)明了各再生植株株號(hào)，由各潮霉素抗性細(xì)胞系系號(hào)加最后植株株號(hào)數(shù)字段形成)。100%的再生植株力pt篩選基因PCR分析呈陽性，即產(chǎn)生特定的力/^的850bp條帶。即表明了轉(zhuǎn)化篩選無逃逸。圖5b為再生植株的葉子提取基因組DNA(同樣樣品)對(duì)(非篩選)目的基因5cJ-W編碼區(qū)(700bp片段)PCR分析。PCR模板在各反應(yīng)中空白對(duì)照(Nullcontrol)為水；負(fù)對(duì)照(Negativecontrol)為非轉(zhuǎn)化再生植株提取基因組DNA;正對(duì)照(Postivecontrol)為pRT-66-Bcl,即轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。其他各孔為再生植株的葉子提取基因組DNA(標(biāo)明了標(biāo)明了各再生植株株號(hào)，由各潮霉素抗性細(xì)胞系系號(hào)加最后植株株號(hào)數(shù)字段形成)?？汕宄乜吹接赏怀泵顾乜剐约?xì)胞系再生的植株W編碼區(qū)PCR分析完全相同，即都表現(xiàn)陽性產(chǎn)生特定的W編碼區(qū)700bp片段條帶或陰性。表明了同一潮霉素抗性細(xì)胞系是非嵌合體，即無嵌合體問題。圖5B與圖5A的各樣品順序和標(biāo)示是完全一樣的。圖6從再生植株的葉子提取蛋白Westernblot分析5c7-,7表達(dá)Bcl-xl蛋白水平。正對(duì)照(Postivecontrol)為重組人Bcl-xLprotein;負(fù)對(duì)照(Negativecontrol)為非轉(zhuǎn)化植株。部分轉(zhuǎn)化植株5c7-;^基因穩(wěn)定整合表達(dá)Bcl-xl蛋白，而負(fù)對(duì)照無信號(hào)具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例l:獲得花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物?；ㄉ贩N粵油116(廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育，連續(xù)開花亞種珍珠豆型，subsp.Var.n/7卵"'s，Spanishtype西班牙型)、魯花9號(hào)(山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育，連續(xù)開花亞種中間型)、'佐治亞綠'(美國(guó)佐治亞大學(xué)培育，交替開花亞禾中普通型，Subsp./ypogaesVar./y/w《3es，runner/virginiatype蘭娜/弗吉尼亞型)。這些品種是優(yōu)質(zhì)或抗病花生品種，是各地域主要栽培品種之一。按照正常栽培管理和肥水措施種植收獲果莢(粵油116、魯花9號(hào)本人留存，'佐治亞綠'從美國(guó)佐治亞大學(xué)獲得)。成熟果莢在密封塑料袋中5'C下貯藏1-6年。去殼種仁70%乙醇表面消毒l-3分鐘，然后在1%NaOCl(20%Clorox商業(yè)漂白液)消毒30-60分鐘，用重蒸餾水3-5次漂洗。無菌條件下去掉種皮。成熟胚胚軸上部接種SEM培養(yǎng)基(somaticembryogenesismedium,體胚發(fā)生培養(yǎng)基).'MS鹽(Murashige和Skoog1962)，B5維生素(Gamborg等1968)，0.088M(3%)蔗糖，12.42nM(3mg/L)picloram禾卩0.8%瓊脂，調(diào)pH5.8，121°C滅菌15分鐘后，適當(dāng)溫度控制在(55-6(TC)時(shí)補(bǔ)充過濾滅菌6.84pM(lg/L)的谷氨酰胺。培養(yǎng)皿Parafilm(AmericanNationalCan,Chicago,IL.,USA)密封，28'C黑暗培養(yǎng)20-30天。觀察統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生胚性愈傷或體胚的外植體數(shù)量和外植體總數(shù)。每2-4周轉(zhuǎn)移體胚和胚性愈傷到新SEM培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。觀察統(tǒng)計(jì)體胚數(shù)、總胚性愈傷數(shù)及體胚發(fā)生方式等情況。在啟始培養(yǎng)后約3個(gè)月(約4-5次繼代培養(yǎng))獲得明顯的花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物(附圖2)。每次繼代培養(yǎng)后體胚數(shù)至少翻倍，體細(xì)胞胚發(fā)生百分比效率在80%左右，培養(yǎng)物可繼代多年仍保持再生能力。各類型花生及貯藏年限均對(duì)獲得花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物無影響。(表l)。貯藏1-6年的花生成熟種子仍能用于誘導(dǎo)重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物是以往文獻(xiàn)未報(bào)道的，將在實(shí)際育種和組培中有用。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中使用'佐治亞綠'品種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，但本發(fā)明不限于此花生品種及類型。200710053585.3說明書第18/22頁表1不同貯藏年限"佐治亞綠"成熟種子啟始培養(yǎng)3個(gè)月后重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生百分比效率成熟種子貯藏年限(年)12456體細(xì)胞胚發(fā)生百分比效率(％)77.480.579.976.080.2實(shí)施例2:外源DNA或基因構(gòu)建在適當(dāng)?shù)闹参锉磉_(dá)框中并連在同一載體上，抽提、純化外源基因植物表達(dá)載體(質(zhì)粒)和確定其濃度。pZP211-Bel-xL中目的基因人A7-;^基因植物表達(dá)框(DickmanMB,ParkYK，OltersdorfT,LiW,ClementeT，F(xiàn)renchR.Abrogationofdiseasedevelopmentinplantsexpressinganimalantiapoptoticgenes.ProcNatlAcadSciUSA,2001，98:6957-6962)經(jīng)尸"/酶切克隆于pUC19(本實(shí)驗(yàn)室保存)后經(jīng)過分b/z^ci/雙酶切亞克隆于質(zhì)粒pRT-66(Dr.R.T5pfer惠贈(zèng))植物表達(dá)載體，質(zhì)粒pRT-66帶篩選標(biāo)記基因(潮霉素抗性力pt基因)植物表達(dá)框(T6pferR，MaasC，Horicke-GrandpierreC，SchellJ，SteinbissH-H.Expressionvectorsforhigh-levelgeneexpressionindicotyledonousandmonocotyledonousplants.MethEnzymol，1993，217:66-78)。質(zhì)粒載體構(gòu)建(附圖l)、質(zhì)粒的抽提、純化、濃度確定和序列測(cè)定具體操作參照常規(guī)分子克隆方法或從商業(yè)服務(wù)獲得。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中使用潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，人A/-為目的基因，但本發(fā)明不限于用潮霉素抗性基因和人實(shí)施例3:微粒轟擊轉(zhuǎn)化重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物和篩選獨(dú)立抗性細(xì)胞系。從實(shí)施例1中啟始培養(yǎng)3-IO個(gè)月后的花生重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物取大約10-15個(gè)重復(fù)體胚發(fā)生胚性組織，放置在SEM培養(yǎng)基中大約3cm直徑區(qū)域之內(nèi)(約7cm2)。將準(zhǔn)備好的50W金微粒(直徑0.6或1.0Mm，Bio-Rad)懸浮液(60mg/ml)(Ozias-Akins等1993)與5W(lPg/Hl)含CaMV35S啟動(dòng)子控制下篩選基因(力pt)和非篩選目的基因(人iW-;r7)植物表達(dá)框的質(zhì)?；旌?。震蕩中依次加入50W2.5M氯化鈣和2(￥10.1M亞精胺。震蕩懸浮5-8分鐘，短暫離心10000卬111。100%乙醇漂洗金微粒，60W100%乙醇重懸(Ozias-AkinsP,SchrmllJA，AndersonWFetal.Regenerationoftransgenicpeanutplantsfromstablytransformedembryogeniccallus.PlantScience,1993,93:185-194)。吸取8-10W微粒懸浮滴于金微粒載片(Macrocarrier)。根據(jù)Bio-RadPDS1000/He系統(tǒng)說明書進(jìn)行轟擊，條件是12410kPa(1800psi)破裂膜，95kPa(28英寸汞柱)真空壓力，培養(yǎng)皿在金微粒載片下6cm。在轟擊后1-10天，被轟擊的胚性組織轉(zhuǎn)入含20mg/L潮霉素(致死濃度)半固體SEM培養(yǎng)基。該篩選策略是以往文獻(xiàn)從未采用的，具有明顯新穎性。在約1個(gè)月篩選后，仔細(xì)地辨認(rèn)、分離獨(dú)立的可能的抗性細(xì)胞系(附圖3)。各系組織直接地繼代培養(yǎng)于新鮮的含20mg/L潮霉素(致死濃度)半固體SEM培養(yǎng)基中。在以后各輪篩選，可存活增殖、抗性被證實(shí)的獨(dú)立系獲得抗性細(xì)胞系系號(hào)。轉(zhuǎn)基因效率在各條件組合下為每轟擊平均獲得15.7(1035/66，獨(dú)立的抗性細(xì)胞系數(shù)/轟擊數(shù))個(gè)獨(dú)立的抗性細(xì)胞系，最佳條件下的實(shí)驗(yàn)平均可達(dá)20.5以上(656/32)，轉(zhuǎn)化通量高(表2)。在采取新篩選策略下，轉(zhuǎn)化效率明顯好于(3-6倍于)以往報(bào)道的相似方法的最好效率(最好條件下3-6獨(dú)立的抗性細(xì)胞系/每轟擊，LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpea皿tG4rac/w'51力j7oaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999，5(1):43-51)，體現(xiàn)了其創(chuàng)造性和實(shí)用價(jià)值，即高效率、高通量轉(zhuǎn)化。在篩選之下繼代培養(yǎng)(約1-2個(gè)月)增殖潮霉素抗性細(xì)胞系，增殖體胚用于植株再生。在本發(fā)明實(shí)施例陳述中使用潮霉素抗性基因(力pt)，以潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因抗性細(xì)胞系，但本發(fā)明不限于用潮霉素抗性基因和潮霉素篩選。表2"佐治亞綠"重復(fù)體胚發(fā)生胚性組織在一些條件組合下轉(zhuǎn)化效率."(獨(dú)立的抗性細(xì)胞系/轟擊數(shù))重復(fù)體胚發(fā)生胚性組織5啟始培養(yǎng)后(月)9999啟始篩選在轟擊后(天)3每轟擊平均獲得獨(dú)立的6121320.539.6511.4抗性細(xì)胞系數(shù)(個(gè))(18/3)"(208/16)(656/32)(96/10)(57/5)實(shí)施例4:再生植株和傳代實(shí)施例2獲得部分(60個(gè))獨(dú)立的潮霉素抗性細(xì)胞系的體胚在MSBO培養(yǎng)基(MS鹽、B5維生素和0.088M蔗糖)加5.37賜(1mg/L)NAA(稱為1NAA)26°C黑暗培養(yǎng)促使體胚成熟。源于同一獨(dú)立抗性細(xì)胞系的體胚隨機(jī)地(不挑選)進(jìn)入兩個(gè)再生方法之一，培養(yǎng)條件均是30MMolm-2s-l光強(qiáng)、16/8小時(shí)光周期。其一的培養(yǎng)基操作過程(稱為1TDZ):通過含4.9W(約lmg/L)TDZ(噻二唑苯基)MS培養(yǎng)基培育，促使體胚轉(zhuǎn)換。第二種再生處理(稱為3B1G):轉(zhuǎn)到于基礎(chǔ)培養(yǎng)基加13.31剛(3mg/L)BA和2.89PM(]mg/L)GA培養(yǎng)基中促體胚轉(zhuǎn)換。兩種培養(yǎng)基操作過程在6個(gè)星期以后，統(tǒng)計(jì)枝芽的數(shù)量和體胚總數(shù)，體胚產(chǎn)生至少帶一片四具小葉葉子的枝芽被認(rèn)為是體胚轉(zhuǎn)換(萌芽)。實(shí)驗(yàn)被重復(fù)一次。長(zhǎng)度至少2cm的枝芽被切下于基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上0-0.54NAA生根lw(大約95%)。生根的小植株移入花土中，最后轉(zhuǎn)移到溫室觀察再生植物的育性。結(jié)果表明兩種再生方法的體胚轉(zhuǎn)換(萌芽)率無明顯差異(表3)，但比以往的相似轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的再生方法效率高和相當(dāng)(LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut//paaesL)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43—51)。從啟始培養(yǎng)到獲得抗性再生植株大約需9-12個(gè)月，比以往的相似轉(zhuǎn)化方法快和相當(dāng)(LivingstoneDM，BirchRG.Eficienttransformationandregenerationofdiversecultivarsofpeanut(Arac/w-s//poaeaL.)byparticlebombardmentintoembryogeniccallusproducedfrommatureseeds.MolecularBreeding,1999,5(1):43-51)。轉(zhuǎn)移生根的植株入土生存率高(大約95%)。生存的三百左右植株移入溫室后，大半開花，與以往的相似轉(zhuǎn)化方法相當(dāng)。在人工生長(zhǎng)室按照正常的栽培管理措施管理，收獲T,代合子(種子)，多達(dá)2500顆正常種子，體現(xiàn)了高效率、高通量的特點(diǎn)。按照正常的栽培管理措施對(duì)各t代種子系繼續(xù)傳代選育。表3兩種再生方法的體胚轉(zhuǎn)換(萌芽)率<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實(shí)施例5:轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因后代分子分析參照常規(guī)分子克隆方法，從
發(fā)明內(nèi)容二、三、四中不同的抗性細(xì)胞系、再生植株和種子獲得適量的愈傷、再生植株葉、種子子葉以適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ崛NA或RNA或蛋白質(zhì)。按照常規(guī)分子分析方法PCR分析初步確定5c7-W和篩選基因整合與否。Southernblot分析進(jìn)一步確定抗性細(xì)胞系、再生植株和種子的穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)化性和獨(dú)立性。Northernblot、Westernblot、ELISA和其他適當(dāng)方法分析進(jìn)一步確定5"i7的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和傳代遺傳情況。在各代中篩選劑抗性分析進(jìn)一步確定篩選基因的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和傳代遺傳情況。1)以PCR分析潮霉素抗性細(xì)胞系和再生植株為實(shí)施例進(jìn)行陳述初步確定U-"'和篩選基因(知O整合與否從不同的潮霉素抗性細(xì)胞系取愈傷或再生植株葉大約70毫克以快速CTAB方法提取DNA。使用PCR擴(kuò)增700bp5d-;d編碼序列(正義引物5'-ctagatatcatgagtcagagcaaccgggagctg-3，；反義弓|物5'-catgagctctagatcatttccgactgaagag-3，)禾口850bp如f序歹U(正義弓I物5'-gaaaaagcctgaactcaccgcgac-3，；反義弓l物5'-cgcccasgctgcatcatcgaaatt-3')分析5c7-;^和力/z:整合與否。在(微升)PCR體系中分別加入去離子水13.3Hl，10XBuffer2W,2.5mMdNTPO.5W，25mMMgCl21.5W,Taq酶0,1(l單位),植物總DNA(50-100ng)。PCR條件94°C2分鐘94°C30秒，50°C30秒，72°C60秒35個(gè)周期；72°C7分鐘。1%瓊脂糖膠TBE電泳分析PCR產(chǎn)品。從潮霉素抗性細(xì)胞系愈傷提取基因組DNA對(duì)非篩選基因&7-W全長(zhǎng)度編碼區(qū)(700bp片段)PCR分析，估計(jì)W與力/^共轉(zhuǎn)化效率大約是60%(附圖4)。PCR分析證實(shí)所有從不同的系再生植株的葉子均整合篩選基因力pt，表明在這個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中沒有逃逸問題，既使在再生過程中沒有篩選壓力情況下(附圖5a)。對(duì)非篩選目的基因ScJ-;d的PCR分析表示，從同一獨(dú)立體胚系再生的不同的植物通常產(chǎn)生同一PCR結(jié)果，表明在這個(gè)轉(zhuǎn)化篩選系統(tǒng)中嵌合體問題也幾乎不存在(附圖5b)。2)以Westernblot分析再生植株為實(shí)施例進(jìn)行陳述初步確定5c7-W基因穩(wěn)定整合表達(dá)與否從不同再生植株取適當(dāng)發(fā)育階段的葉子，提取總蛋白。按照常規(guī)方法進(jìn)行Westernblot分析，所用儀器試劑為電泳儀(mini-ProteanII鄰paratus，Biorad，Hercules,CA),正對(duì)照重組人Bcl-xLprotein(ProteinXUb,SanDiego,CA)，負(fù)對(duì)照非轉(zhuǎn)化的'佐治亞綠'，一抗為人Bcl-xLprotein單克隆抗體(anti-Bcl-xLmonoclonalantibody,ChemiconInternational,Temecula,CA)，酶耳關(guān)二抗(Alkalinephosphataseconjugatedsecondaryantibody,ChemiconInternational,Temecula,CA)，顯色檢測(cè)系統(tǒng)(NBT-BCIPdetectionsystem,Roche,Pleasanton，CA)。結(jié)果表明部分轉(zhuǎn)化植株5c7-義7基因穩(wěn)定整合表達(dá)Bcl-xl蛋白，而負(fù)對(duì)照無信號(hào)(附圖6)。3)對(duì)各L代種子系繼續(xù)傳代，葉片潮霉素抗性抗性分析進(jìn)一步確定篩選基因可以穩(wěn)定性表達(dá)和遺傳，Westernblot分析表明Ac7-;d基因可以在部分后代中穩(wěn)定整合表達(dá)Bcl-xl蛋白。權(quán)利要求1、一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，它包括下列步驟A、建立花生的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物貯藏0-6年花生的成熟莢去殼，種仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸餾水3-5次漂洗，無菌條件下去掉種皮，成熟胚胚軸上部接種于含生長(zhǎng)素的SEM培養(yǎng)基，體胚發(fā)生培養(yǎng)基，MS鹽，B5維生素，0.088M3％蔗糖，12.42μM3mg/Lpicloram和0.8％瓊脂，調(diào)pH5.8，121℃滅菌15分鐘后，溫度控制在55-60℃時(shí)補(bǔ)充過濾滅菌6.84μM(1g/L)的谷氨酰胺，培養(yǎng)皿28℃黑暗培養(yǎng)20-30天，每2-4周轉(zhuǎn)移體胚和胚性愈傷到新SEM培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1-10個(gè)月獲得重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物；B、外源DNA或基因構(gòu)建在植物表達(dá)框中并在同一或不同載體上，抽提、純化外源基因植物表達(dá)框或載體和確定其濃度待轉(zhuǎn)化的外源DNA是篩選標(biāo)記基因和目的基因，篩選標(biāo)記基因?yàn)橹参锉磉_(dá)載體攜帶的潮霉素抗性、草銨膦抗性、草甘膦抗性篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框，植物表達(dá)載體為pCAMBIA系列和pRT系列，待轉(zhuǎn)化的外源目的基因?yàn)橹参锊≡剐曰颉⒆魑锲焚|(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)基因，為人Bc1-x1基因；擬南芥RRS1-R基因；花生FAD2基因；花生Arah基因，在植物表達(dá)載體上構(gòu)建目的基因植物表達(dá)框，目的基因與篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框可連一起，即構(gòu)建到同一植物表達(dá)載體上；目的基因與篩選標(biāo)記基因植物表達(dá)框分別處于不同植物表達(dá)載體上或DNA片段中，外源基因的植物表達(dá)框或載體構(gòu)建、質(zhì)粒或DNA片段的抽提、純化和確定濃度；C、微粒轟擊轉(zhuǎn)化重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物和篩選獨(dú)立抗性細(xì)胞系放置重復(fù)體胚發(fā)生胚性組織在SEM培養(yǎng)基中，準(zhǔn)備金微粒懸浮液，金微粒懸浮與含篩選基因和非篩選目的基因的質(zhì)粒或DNA片段混合，震蕩中依次加入氯化鈣和亞精胺，震蕩懸浮，離心，乙醇漂洗包裹質(zhì)粒的金微粒，乙醇重懸微粒，重懸微粒滴于金微粒載片，轟擊，被轟擊的胚性組織轉(zhuǎn)入含致死濃度篩選劑培養(yǎng)基，在1個(gè)月篩選后，分離獨(dú)立的抗性細(xì)胞系，各系組織直接地繼代培養(yǎng)于新鮮的含致死濃度篩選劑的半固體SEM培養(yǎng)基中篩選，存活增殖、抗性被證實(shí)的獨(dú)立系獲得抗性細(xì)胞系系號(hào)，在篩選之下繼代培養(yǎng)增殖抗性細(xì)胞系，增殖體胚用于植株再生；D、再生植株和傳代抗性細(xì)胞系體胚在含植物調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中26℃黑暗成熟，體胚轉(zhuǎn)移入含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)基操作過程1TDZ或3B1G，在16/8小時(shí)光周期光照培養(yǎng)萌芽，切下2cm長(zhǎng)的芽于含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基生根，生根的小植株移入花土中，最后轉(zhuǎn)移到溫室，栽培管理，收獲T1代合子，對(duì)T1代種子系繼續(xù)傳代選育；E、轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因后代分子分析，分子分析抗性細(xì)胞系、再生植株和種子從B、C、D步驟中的抗性細(xì)胞系、再生植株和種子的愈傷、再生植株葉、種子子葉提取DNA或RNA或蛋白質(zhì)，確定目的基因和篩選基因整合，確定外源基因在抗性細(xì)胞系、再生植株和種子的穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)化性和轉(zhuǎn)化事件獨(dú)立性，確定目的基因的表達(dá)水平、穩(wěn)定性和傳代遺傳。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于轟擊后1-10天啟始半固體培養(yǎng)基篩選。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，其特征在于篩選劑為20mg/L潮霉素的半固體培養(yǎng)基連續(xù)篩選。全文摘要本發(fā)明公開了一種花生轉(zhuǎn)基因的方法，其步驟是首先建立花生的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物；其次是將外源DNA或基因構(gòu)建在植物表達(dá)框或表達(dá)載體中，抽提、純化和確定外源DNA的濃度；第三是微粒轟擊轉(zhuǎn)化重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物和篩選獨(dú)立抗性細(xì)胞系；第四是再生植株和傳代；第五是轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因后代分子分析。本發(fā)明采用保存0-6年的成熟花生種子誘導(dǎo)的，啟始培養(yǎng)后1-10個(gè)月的重復(fù)體細(xì)胞胚發(fā)生培養(yǎng)物為轉(zhuǎn)基因受體；轉(zhuǎn)基因效率高，轉(zhuǎn)化通量高；轟擊后篩選效率高，無逃逸，無嵌合體；整個(gè)過程不存在基因型依賴，且再生植株高效容易，可大量獲得轉(zhuǎn)基因后代種子，且外源基因可穩(wěn)定整合、表達(dá)遺傳。文檔編號(hào)C12N15/09GK101186910SQ20071005358公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年10月18日優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日發(fā)明者鄧向陽申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所;鄧向陽