專利名稱：水稻廣親和基因s5的分離克隆及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻廣親和基因5"5的分離克隆、功能驗證及在水 稻改良中的應用。
背景技術(shù)：
水稻屬禾本科(Cr柳/"eae)、禾亞科(尸owVeae)的稻屬(Qrj^eae),分為兩個栽培稻種亞洲栽培 稻(Ory幼幼t/ra L.)和非洲栽培稻(&丁za ^aAerri咖)。亞洲栽培稻又分為秈亞種(ssp. y/K/ica) 和粳亞種(ssp. Japo/7ica)。兩個亞種在形態(tài)和遺傳上存在著明顯的差異，同時也存在著生殖障礙，秈粳 亞種間雜種往往表現(xiàn)為不育或半不育(Kato S， Kosaka H, Hara S (1928) On the affinity of rice varieties as shown by fertility of hybrid plants. 5W Fac〃"化 3:132-147;
Oka HI (1988) Origin of cultivated rice. Scientific Societies Press, Tokyo, Japan pp 181 -209; Liu KD， Zhou ZQ， Xu CG， Zhang Q, Saghai Maroof MA (1996) An analysis of hybrid sterility in rice using a diallel cross of 21 parents involving /"o^'ca,力/7cwica and wide compatibility varieties. E卯hytica 90:275 - 280)。水稻秈粳亞種間具有比水稻品種間更強的雜種優(yōu)勢，但秈粳亞種間雜種的不育 性卻限制了對其雜種優(yōu)勢的利用。日本學者Ikehashi和Araki (Ikehashi H， Araki H (1984) Variety screening of compatibility types revealed in Fl fertility of distant cross in rice. Jpn J Breed 34:304- 313)，通過對74種不同生態(tài)型水稻品種間雜交結(jié)果的研究，發(fā)現(xiàn)某些水稻品種與秈粳稻雜交， 雜種都表現(xiàn)為可育，他們將這些特殊的水稻品種稱為廣親和品種(Wide Compatibility Variety, WCV)。 水稻廣親和品種中的廣親和基因可以有效的克服秈粳亞種間雜種的不育性。
研究者利用各種遺傳標記對水稻秈粳亞種間雜種的不育現(xiàn)象進行了廣泛的研究。研究表明影響小穗育 性的位點分別對應于胚囊育性和花粉育性，說明雄性敗育和雌性敗育對亞種間雜種敗育都有著很重要的作 用。
Ikehashi和Araki (Ikehashi H， Araki H (1986) Genetics of Fl sterility in remote crosses of rice. In: IRRI (ed) Rice genetics. IRRI， Manila, pp 119-130)首先將廣親和基因定位在第6染色 體的色素基因C和糯性基因盯之間，并命名為5^。他們通過對育性分離結(jié)果的考察，指出5"5位點是一組 復等位基因5fn (廣親和)、(秈稻)、(粳稻)。其中，由5^nAS^n、 5^n/5^i、 55^n/j 組合而成的合子，雜種育性正常。而由5^jA 54組成的合子，則表現(xiàn)為不育或半不育。
廣親和品種的發(fā)現(xiàn)，使得水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用成為可能。本發(fā)明旨在通過對水稻廣親和基 因55的研究更好的利用水稻秈粳亞種間強大的雜種優(yōu)勢，進一步提高雜交水稻的生物學產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個水稻廣親和基因S5,對該基因進行功能驗證及在水稻改良中的 應用。所述的基因與天冬氨酰蛋白酶基因序列高度同源。利用該基因克服水稻秈粳亞種間雜種的不育性， 從而使秈粳亞種間強大的雜種優(yōu)勢得以發(fā)揮，進一步提高水稻的生物學產(chǎn)量。
本發(fā)明涉及分離和應用一個編碼天冬氨酰蛋白酶的廣親和基因的DM片段，并對該片段的作用機 理進行闡述。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO: 1-3所示，或者基本上相當于SEQ ID NO: 1-3所示的 高度同源DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1-3所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的廣親和基因5"5的DNA片段作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基 因或同源基因。同樣，也可以采用PCR技術(shù)，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的5^基因以及任 何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含S5基因的序列，將這一序 列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對秈稻粳稻廣親和的轉(zhuǎn)基因植 株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導型
啟動子。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密 碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。
攜帶有本發(fā)明55基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿 孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導入植物細胞(Weissbach (1998) Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York, pp. 411-463; Geiserson and Corey, 1998, Plant Molecular Biology(2nd Edition))-可使用包括本發(fā)明55基因的表達載體轉(zhuǎn)化水稻秈稻和粳稻亞種，培育廣親和品種。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID No: 1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有基因編碼區(qū)DNA片段序列。序列表SEQ ID No:2顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有5^j基因編碼區(qū)DNA片段序列。序列表SEQ ID No:3顯示的是本 發(fā)明分離克隆的包含有i基因編碼區(qū)DNA片段序列。
圖l: 5"5基因克隆和分離鑒定流程圖。
圖2: 5"5基因效應下秈稻、粳稻和廣親和品種雜種育性示意圖。
圖3:互補載體構(gòu)建示意圖。
圖4:遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301的結(jié)構(gòu)。
圖5: T,代轉(zhuǎn)基因陽性植株(左)小穗不育和轉(zhuǎn)基因陰性植株(右)小穗可育。 圖6: T,代轉(zhuǎn)基因陰性植株(a)和轉(zhuǎn)基因陽性植株(b)花粉均可育。
圖7: T,代轉(zhuǎn)基因陰性植株(a)胚囊可育和轉(zhuǎn)基因陽性植株(b)胚囊敗育。標尺長度50Wn。 圖8: T。代轉(zhuǎn)基因陽性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株(a)以及T,代轉(zhuǎn)基因陽性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株(b)胚囊 育性、花粉育性和小穗育性圖示。
圖9:廣親和品種、粳稻和秈稻5^基因cDNA結(jié)構(gòu)示意圖。 圖10:廣親和品種、粳稻和秈稻S5蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。
圖ll: 5^基因在水稻全生育期不同組織中表達水平示意圖。使用的芯片數(shù)據(jù)包括秈稻Zhenshan97和 Minghui 63不同生長時期下的25種不同組織。
圖12:體外檢測S5蛋白絕對活性(a)和相對活性(b)。其中絕對活性以水為對照測定，相對活性以該 蛋白活性最高的點為對照測定。白色柱狀圖示意蛋白酶在不同pH條件下活性，深色柱狀圖示意蛋白酶活 性被p印statin A抑制。
圖13: SDS-PAGE膠圖顯示S5蛋白在不同pH條件下自身剪接活性。
圖14:原位雜交確定S5基因在水稻中的表達部位。(a)該基因在Ballila珠被和孢母細胞表達；(b) 該基因在02428珠心和孢母細胞中表達；(c)該基因在Ballila小孢子母細胞中表達。標尺長度為25Wn。
具體實施例方式
以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎(chǔ)上分離克隆包含有S5基因完整 編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證5"5基因功能的方法(發(fā)明流程如圖l所示)。根據(jù)以下的描述和這些實施 例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，對本發(fā)明做 出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。 實施例1 :分離克隆包含有S5基因區(qū)段的DNA片段
1.利用圖位克隆技術(shù)鑒定水稻廣親和基因
本發(fā)明中構(gòu)建定位群體時用到了三個親本02428、南京11和Balilla。 02428是一個粳型的廣親和 品種，是選用兩個粳稻品種云南螃蟹谷和上海汲浜稻，分別用輻射誘變處理，并經(jīng)高光效篩選出的材料間 雜交，從后代中選育成的(鄒江石等，廣親和選系02428在秈粳亞種間雜交的初步利用.中國農(nóng)業(yè)科學，1989, 22: 6-14)。南京11為江蘇農(nóng)科院育成的中秈品種，屬勝利秈衍生品系。巴利拉(Balilla)是引 自意大利的粳型品種。
本發(fā)明在前期工作中構(gòu)建了一個包含7000個單株的三交F,大群體。1999年春在海南陵水配制02428/ 南京ll雜交組合。同年夏天布^武漢種植F,代植株，篩選陽性單株。1999年冬天，將雜種稻篼移往海南陵 水基地，并盡量分篼。在2000:b天，以02428/南京11真雜種稻篼作為母本，與Balilla大量配制三交 R雜種。2000年夏天，在水稻生長季節(jié)，在華中農(nóng)業(yè)大學(武漢)水稻試驗田分單株植株02428/南京 11〃Balilla三交F,群體,最后共成苗7000株。
考察7000株三交F,群體中所有高結(jié)實率的單株，總共獲得了 1000多株結(jié)實率在70%以上的單株。 從中隨機選取202株結(jié)實率在70%以上的真雜種單株，進行DNA抽提和標記分析，對S5區(qū)段的分子標記 進行重組交換分析。DNA的抽提按Murray和Thompson的CTAB法進行(Murray M G， Thompson W F (1980) Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acids Res. 8: 4321-4325)。分子標記 的RFLP分析，包括DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交，按Liu等人(Liu K D et al. (1997) A ge加me-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theor A卯l Genet. 95:809-814)的實驗程序進行。5"5基因限定在分子標記N29和23D12R之間，結(jié) 果如表1所示。
表1利用202株高結(jié)實率單株對廣親和基因的定位
標記RZ398RZ450RM253to323D12RRG213RG138R2171
交換單株數(shù)68685552525051535365
選取SSR標記RM253或PCR—RFLP標記Cll和RG213對所有高結(jié)實率的單株進行了掃描，單株用到SSR 標記RM276和RM225進行篩選。其中，標記RM225、 RM253和Cll位于基因S5的一側(cè)，標記RG213和RM276 位于基因5"5的另一側(cè)。共篩選到了 44株在標記之間發(fā)生重組的單株。利用5^區(qū)段的分子標記對這44株 高結(jié)實率的重組單株進行了重組分析，結(jié)果顯示廣親和基因S5限定在分子標記7B1和15D2之間，兩端各 有一個重組單株，部分重組單株的信息如表2所示。 表2利用5^區(qū)段的分子標記對44株重組單株的基因型分析(部分數(shù)據(jù))
F 0a 0
F 0 0
F 0 0
F 1 1
F 1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0 0
0
1 1
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
0
0
1
0 0
r i i o
0
1 1 1
1 1 1
1 1 1
0 0 0
0 0 0
aGenotype 0 of each locus was composed of an allele from 02428 and an allele from Balilla bGenotype 1 of each locus was composed of an allele from Nanjing 11 and an allele from Balilla 上述結(jié)果將廣親和基因5"5定位在兩個亞克隆分子標記7B1和15D2之間約40 kb的DNA區(qū)段上。利用 http:〃www. softberry. com網(wǎng)站上的FGENSH軟件對分子標記7B1和15D2之間40 kb的DNA片段進行了 開放閱讀框(open reading frame: 0RF)的預測，共檢測到了 5個完整的ORFs， Blaxt X同源性分析發(fā) 現(xiàn)候選基因0RF5與天冬氨酸蛋白酶(eukaryotic aspartyl protease)高度同源。
RG213
G200
RG138
2349
23D12R
F7
7D3
7F11
15D2
7B1
F29
F34
F38
M6
N29
Cll
E23
A30
HM253
Genotype
Individual
s
2.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的表現(xiàn)
本發(fā)明基因55位點是一組復等位基因^^n(廣親和)、Sfi(秈稻)、5f j(粳稻)。其中，由5^n/5^n、 5fn/5^i、 n/Sf j組合而成的合子，雜種育性正常。而由SfjAS^i組成的合子，則表現(xiàn)為不育或 半不育(圖2)。根據(jù)此基因的功能，申請人采取將秈稻片段轉(zhuǎn)入粳稻植株的策略，從轉(zhuǎn)基因植株(基因型 j/5fj+5^"i)的育性表型來驗證。此基因?qū)a(chǎn)生不育表型。
互補載體的構(gòu)建方法是根據(jù)秈稻南京11基因組序列設(shè)計PCR引物ASPHF(5， _ TAAAAAGCTTCATCATGGGCTGCTGCTAGATGGA-3，)和ASP冊(5' - TGCTAAGCTTTACGAGGTCATGGGTTGAAGTCCT-3，) 將候選基因區(qū)段擴增出來，互補載體外源PCR擴增反應所用的試劑來自Takara公司，反應條件為94'C, 3 min; 94°C， 1 min, 60'C, 1 min， 68°C， 6 min， 30 cycles; 72°C， 5 min。
互補載體構(gòu)建示意圖如圖3所示。PCR產(chǎn)物直接用HindIII酶切，雙元載體(圖4) pCAMBIA1301 (來 自澳大利亞CAMBIA實驗室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture),攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米強啟動子Ubiquitinl的農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化載 體)也采用HindIII酶切，去磷酸化后連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10J3 (購自Invitrogen公司)，篩選陽性克 隆。釆用農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌菌株為超毒力菌株EHA105 (Sun X, Cao Y, Yang Z， Xu C， Li X, Wang S， Zhang Q (2004) Ja鄰 a gene conferring resistance to Ja"t力。/i70/2as o/yzae pv. o/jzae in rice, encoding a LRR rec印tor kinase-like protein. Plant J 37:517-527),轉(zhuǎn)基因的受體為粳稻品 種Balilla。
本發(fā)明遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟、培養(yǎng)基及其配制方法如下所述
(1) 試劑和溶液縮寫
本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA (6-BenzylaminoPurine， 6-芐基腺嘌 呤);CN (Carbenicillin，羧節(jié)青霉素);KT (Kinetin,激動素);NAA (Napthalene acetic acid, 萘乙酸);IAA (Indole-3-acetic acid,巧l哚乙酸):2， 4-D (2, 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2，4-二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone， 乙酰丁香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate， 水解酪蛋白)；HN (HygromycinB，潮霉素)；DMS0 (Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亞砜)；N6max (N6 大量元素成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS 微量元素成分溶液)
(2) 主要溶液配方
1) N6培養(yǎng)基大量元素母液(按照10倍濃縮液(10X)配制) 硝酸鉀(KN03 ) 28 . 3克 磷酸二氫鉀(KH2P04) 4.0克
硫酸銨((NH》2S04) 4.63克 硫酸鎂(MgS04 7H20) 1. 85克
氯化鈣(CaCl2 2H20) 1. 66克
將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000毫升。
2) N6培養(yǎng)基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制 碘化鉀(KI) 0.08克
硼酸(H3B03) 0. 16克
硫酸錳(MnS04 4H20) 0. 44克
硫酸鋅(ZnS04 7H20) 0. 15克
將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。
3) 鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)
將3. 73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA 2H20)和2. 78克FeS04 7仏0分別溶解，混合并用蒸餾水定 容至1000毫升，至70'C溫浴2小時，4'C保存?zhèn)溆谩?) 維生素貯存液(按照100X濃縮液配制) 煙酸(Nicotinic acid) 0. l克 維生素Bl (Thiamine HC1) 0. l克 維生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. l克 甘氨酸(Glycine) 0. 2克 肌醇(Inositol) IO克 加蒸餾水定容至1000毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 5) MS培養(yǎng)基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X濃縮液配制) 硝酸銨(NH4N03) 16. 5克
硝酸鉀 19.0克
磷酸二氫鉀 1.7克
硫酸鎂 3. 7克
氯化鈣 4.4克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制) 硫酸錳(MnS04 4H20) 2.23克
硫酸鋅(ZnS047H20〉 0.86克
硼酸(H3B03 ) 0. 62克
碘化鉀(KI) 0.083克 鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0. 025克
硫酸銅(CuS04 5H20 ) 0. 00 25克
氯化鈷(CoCl2 6H20 ) 0. 00 25克
將上述試劑在室溫下溶解，并用蒸餾水定容至1000毫升。
7) 2,4-D貯存液(l毫克/毫升)的配制-
秤取2,4-D100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，于室溫下保存。
8) 6-BA貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，室溫保存。
9) 萘乙酸(NAA)貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取NM100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 10) 噴哚乙酸(IAA )貯存液(l毫克/毫升)的配制
秤取IM 100毫克，用1毫升1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解完全后定容至100 毫升，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 11) 葡萄糖貯存液(0.5克/毫升)的配制
秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4'C保存?zhèn)溆谩?br> 12) AS貯存液的配制
秤取AS 0.392克，加入DMS0 10毫升溶解，分裝至l. 5毫升離心管內(nèi)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 13) 1N氫氧化鉀貯存液
秤取氫氧化鉀5.6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存?zhèn)溆谩?(3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方 1)誘導培養(yǎng)基
N6max母液(取已經(jīng)制備好的10X濃縮液，下同) IOO毫升
N6mix母液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
Fez+EDTA貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
維生素貯存液(取已經(jīng)制備好的100X濃縮液，下同) IO毫升
2， 4-D貯存液(取上述制備好的) 2. 5毫升
脯氨酸(Proline) 0. 3克
CH 0.6克
蔗糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900亳升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9,煮沸并定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口后按常規(guī)方法滅菌(例如12rC下滅菌25分鐘，下述的培養(yǎng)基滅菌方法與本培養(yǎng)基的 滅菌方法相同)。
2) 繼代培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升
N6mix母液(100X) IO毫升
Fe2+EDTA IC存液(100X) IO毫升
維生素貯存液(100X) IO毫升
2， 4-D貯存液 2. 0毫升
脯氨酸 0.5克
CH 0.6克
庶糖 30克
Phytagel 3克
加蒸餾水至900毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分裝到50亳升三角瓶(25 毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。
3) 預培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA Jt存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D fC存液 0. 75毫升
CH 0. 15克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克 加蒸餾水至250毫升，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升 /皿)。
4) 共培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 12. 5毫升
N6mix母液(100X) 1. 25毫升
Fe2+EDTA jt存液(100X) 2. 5毫升
維生素貯存液(100X) 2.5毫升
2， 4-D貯存液 0. 75毫升
CH 0.2克
蔗糖 5克
瓊脂粉 1.75克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升ASIfc存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25毫升/ 每皿)。
5) 懸浮培養(yǎng)基
N6max母液(10X) 5毫升 N6mix母液(100X) 0. 5亳升
Fe2+EDTA貯存液(100X) 0. 5毫升
維生素貯存液(100X) l毫升 2， 4-D貯存液 0. 2毫升
CH 0.08克
蔗糖 2克
加蒸餾水至100毫升，調(diào)節(jié)pH值到5.4,分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。 使用前加入l毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6) 選擇培養(yǎng)基
25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 625毫升
0, 15克 7.5克
1. 75克
加蒸餾水至250毫升，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250微升HN (50毫克/毫升)和400微升CN (250毫克/毫升)分裝倒入培養(yǎng)皿 中(25毫升/皿)。(注第一次選擇培養(yǎng)基羧芐青霉素濃度為400毫克/升，第二次及以后選擇培養(yǎng) 基羧芐青霉素濃度為250毫克/升)。
7) 預分化培養(yǎng)基 N6隨母液(10X) N6mix母液(100X) Fe"EDTA IC存液(100X) 維生素貯存液(100X) 6-BA貯存液
KT ie存液 naa ie存液
IAA !t存液 CH 蔗糖 瓊脂粉
N6隨母液(10X) N6raix母液(100X) Fe^EDTA IC存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2， 4-D貯存液 CH
瓊脂粉
25毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 2. 5毫升 0. 5毫升 0. 5毫升 50微升 50微升 0. 15克 7. 5克 1.75克
加蒸餾水至250毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口，按上述方法滅菌。 使用前溶解培養(yǎng)基，250微升HN (50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫升) 毫升/皿)。 8)分化培養(yǎng)基
N6max母液(10X) IOO毫升 N6mix母液(100X) IO毫升
分裝倒入培養(yǎng)皿中(25
Fe2+EDTA貯存液(100X) IO毫升 維生素貯存液(100X) IO毫升 6-BA JC存液 2毫升 KT貯存液 2毫升 NAA Jt存液 0. 2毫升
IAA貯存液 0. 2亳升
C H l克 蔗糖 30克 Phytagel 3克 加蒸餾水至900毫升，1 N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6. 0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000亳升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌。 9)生根培養(yǎng)基
MSmax母液(10X) 50毫升 MSmix母液(100X) 5 Fe2+EDTA IC存液(100X) 5 維生素貯存液(100X) 5 庶糖 2 Phytagel 3 加蒸餾水至900毫升，用1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化步驟 4. 1愈傷誘導
1) 將成熟的Ballila水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞(HgCh)種子 表面消毒15分鐘；
2) 用滅菌水洗種子4-5次；
3) 將種子放在誘導培養(yǎng)基上；
4) 將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25土1'C。 4. 2愈傷繼代
挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士1'C。 4. 3預培養(yǎng)
挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25士rc。 4. 4農(nóng)桿菌培養(yǎng)
1) 在帶有對應抗性選擇的LA培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基的配制參照J.薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南， 第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002,北京)上預培養(yǎng)農(nóng)桿菌5ffi4205(該菌株來自CAMBIA公 司公開使用的農(nóng)桿菌菌株)兩天，溫度28'C;
2) 將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28'C搖床上培養(yǎng)2-3小時。 4. 5農(nóng)桿菌侵染
1) 將預培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅好菌的瓶子內(nèi)；
2) 調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至0D6。。 0. 8-1. 0;
3) 將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20'C。 4. 6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)
1) 滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；
2) 浸泡在含400毫克/L潮霉素的滅菌水中30分鐘；
毫毫毫魄克3) 轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；
4) 轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2-3次，每次2周。 4.7分化
1) 將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預分化培養(yǎng)基上于黑暗處培養(yǎng)5-7天；
2) 轉(zhuǎn)移預分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26'C。 4.8生根
1)剪掉分化時產(chǎn)生的根；
然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。 4.9移栽
洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)基因T。代水稻植株33株，包括29株陽性單株和4株陰性單株。所獲得的T,代 水稻植株以B10家系為例，包括15株陽性單株和14株陰性單株。
轉(zhuǎn)基因水稻陽性和陰性植株小穗育性(圖5)差異顯著(^=7.4, /M).0000);轉(zhuǎn)基因水稻陰性植株小 穗平均育性(53.3%)遠高于轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株2.8%的小穗育性。申請人亦檢測了 T。代轉(zhuǎn)基因水稻植株 的胚囊育性和花粉育性，其中花粉育性在轉(zhuǎn)基因陽性和陰性水稻植株中無顯著差異(見圖6)，而轉(zhuǎn)基因陰 性植株胚囊育性顯著高于轉(zhuǎn)基因陽性植株胚囊育性(圖7) (t=12.33， P=0.0000)。 T。f^轉(zhuǎn)基因陽性植株和 轉(zhuǎn)基因陰性植株以及T,代轉(zhuǎn)基因陽性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株胚囊育性、花粉育性和小穗育性如圖8所示， 結(jié)果表明S5位點引起水稻秈粳亞種間育性降低是由于胚囊敗育所致。
結(jié)果表明，本發(fā)明克隆的基因5"5是一個介導水稻秈粳亞種間廣親和的基因。
3.含有5"5基因區(qū)段的DNA片段的分離克隆
分別使用cDNA末端快速擴增(RACE)和PCR引物延伸的方法獲得該基因全長cDNA。使用材料為秈稻 南京11 ，粳稻Bal 1 i la和廣親和品種02428幼穗發(fā)育的五期葉片，液氮冷凍后于-70'C冰箱待用。按照TRIZ0L 說明書所述步驟提取RNA (注TRIZ0L Reagent, Invitrogen Cat. No. 15596-018),稀釋濃度至1P g/u 1， -7(TC保存待用。
RACE具體步驟使用Clontech的SMART RACE cDNA Amplification Kit,步驟參照該試劑盒說明書。 5，端RACE引物S5-GSP1: CCGTTCCAACCAGAATAGTCGTGCT
S5-R1: ACCCGAACATGAGATCCATAAACGA 3，端RACE引物S5-GSP2: AAGATGGTGACAGACACGCTGAGGA
S5-RACE4: CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC UPM: Long (0. 4M): CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCAA CGCAGAGT
Short (2uM): CTAATACGACTCACTATAGGGC NUPM: AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 其中UPM和NUPM由上述試劑盒提供。 第一輪PCR反應條件 94'C變性30秒，72'C3分鐘，5個循環(huán); 94。C變性30秒，7(TC退火30秒，72'C延伸3分鐘，5個循環(huán)； 94。C變性30秒，65。C退火30秒，72。C延伸3分鐘，27個循環(huán)； 72'C最終延伸10分鐘。 5' 1^〔￡使用引物1^11+ S5-GSP1 3' 1^^￡使用引物1^1 + S5-GSP2 第二輪PCR反應條件 94'C預變性4分鐘；
94'C變性1分鐘，59'C退火1分鐘，72t;延伸l分鐘20秒，35個循環(huán)；
72'C最終延伸10分鐘。
5， 1^?！晔褂靡飼R 1{+ S5-Rl
3， 1^06使用引物1\11^1 + S5-RACE4
PCR引物延伸具體步驟反轉(zhuǎn)錄采用20" 1體系，按照DNaseI說明書所述步驟去除RNA中痕量DNA 后，按Superscript II說明書所述步驟操作，產(chǎn)物于-20。C保存待用。(注Deoxyribonuclease I， Invitrogen Cat. No. 18068-015; Superscript II Reverse Transcriptase, Invitrogen Cat-No. 18064-022)使用上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物In 1為模板做PCR。使用raAara ￡r fs9(Takara code: DRKOIAM)做 PCR， PCR所用試劑均來自7^ytara r邵包裝。
PCR所用引物如下 F5-3: ATCAACCCATTTCCTTTCCTACG F5-2: CTGCCCCTGAGCAAGCAAGAAAG F19-3: AGCCGACGACGAGTTGGAGTGT 5F2: CCAAGATCTGCCGACGACGAGTTGGAGTGT BDF2: GACGACGAGTTGGAGTGT S5-F11: CAGCCGACGACGAGTTGGAGT S5-F2: GTGCGGCGAGCTGAGGTACGAT S5-GSP2: MGATGGTGACAGACACGCTGAGGA S5-RACE4 CAATCAACAGGCCAACCTACTCAC Rll: ATGTGTAGGATCTGCCGGGATCGA BDR: CATTAGGAACAGGAAGTCGT S5-Rll: CTCTGCCCGTTGGCGATAAGC S5-R2: TCTGGGTGGCAAAGCGAGTGC -S5—R33: ATGGCGGCACGGTCGTATCTT
R3--1ACGTAAACATCTAGTAGTGGCTCA
R3--2TTGGCACGAACGGTTCAAGAG
R3--3GATCAGTTATTTGGGCAAACCAG
R3--4GGTCCCAAATCAAGTACCGCTAG
R3--5GCTCAACAATTAGGACATACGAC
分別對RACE產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物測序獲得所需全長基因。
實施例2: 5"5基因在水稻不同亞種的結(jié)構(gòu)分析
對實施例1中測序得到的序列進行分析水稻品種02428 (廣親和)、Ballila (粳稻)和南京11 (秈 稻)的全長cDNA分別是1778bp、 1912bp和1911bp，其結(jié)構(gòu)由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成(圖9)。秈 稻和粳稻有且僅有三個堿基的差異，其中南京11在3'非翻譯區(qū)有一個單堿基的缺失，南京11和Ballila 在編碼區(qū)有兩個單堿基多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)，這兩個SNP在編碼蛋白中形 成兩個錯義突變(圖10) 。 55基因編碼一個472氨基酸的蛋白質(zhì)，BLASTp分析 (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/ )表明該蛋白與天冬氨酰蛋白酶高度同源。PROSITE (http:〃麗.expasy.ch/cgi-bin/prosite/)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在第129-140個氨基酸和334-345個氨基 酸存在兩個活性位點。SignalP 3.0 (http:〃麗.cbs. dtu. dk/cgi-bin/)軟件分析表明S5蛋白存在一 個信號肽，它在蛋白成熟過程中被切除。
實施例3:利用芯片數(shù)據(jù)檢測S5基因在水稻全生育期中表達水平
本發(fā)明禾U用芯片數(shù)據(jù)(Database of the National Center of Plant Gene Research, available at
http:〃cr印.ncpgr.cn/.)檢測5"5基因在水稻全生育期不同組織中表達水平，使用的芯片數(shù)據(jù)包括秈稻 Zhenshan 97和Minghui 63不同生長時期下的25種不同組織(表3)的表達譜(圖11)。結(jié)果表明S5基 因在全生育期都極低水平表達。
表3芯片數(shù)據(jù)對應水稻組織名稱_
_5"柳; je 7Yss"e__________
1 Calli:15 day after induction
2 Resistant calli-screening stage
3 Seed: germination (72 h after imbibition)
4 Seedling: 3 days after sowing
5 Seedling: trefoil stage
6 Shoot: seedling with 2 tillers
7 Root: seedling with 2 tillers
8 Panicle: secondary branch primordium differentiation stage
9 Leaf: secondary branch primordium differentiation stage
10 Sheath: secondary branch primordium differentiation stage
11 Panicle: 4-5 cm young panicle
12 Leaf: 4-5 cm young panicle
13 Sheath: 4-5 cm young panicle
14 Panicle: pistil/stamen primordium differentiation stage
15 Panicle: pollen-mother cell formation stage
16 Stem: 5 days before heading
17 Flag leaf: 5 days before heading
18 Stem: heading stage
19 Panicle: heading stage
20 Glume: one day before flowering
21 Stamen: one day before flowering
22 Spikelet: 3 days after pollination
23 Endosperm: 7 days after pollination
24 Endosperm: 14 days after pollination
_25 EndospeniK 21 days after pollination_
實施例4: S5蛋白具有天冬氨酰蛋白酶活性
天冬氨酰蛋白酶在酸性條件下被激活且其活性為p印statin A所抑制(Rawlings ND， Barrett AJ (1995) Families of aspartic peptidases, and those of unknown catalytic mechanism. Methods Enzymol. 248:105-20)。而本發(fā)明基因與天冬氨酰蛋白酶高度同源，為了驗證本發(fā)明基因55是否是一個典型的天冬 氨酰蛋白酶，本實例設(shè)計一個體外實驗來驗證S5蛋白是否具有這一功能。
具體實施步驟為
(1) 原核表達載體構(gòu)建
設(shè)計引物5F1 (5， - GGGAGATCTATGGTGATCTTGGAGCAGCCA-3'， 接頭加BglII酶切位點)和5R (5'-AGGCTCGAGCGACGATCAGCAMCGGCA-3' 接頭加Xhol酶切位點)，以日本晴全長cDNA (來自北京凱拓公司) 為模板PCR擴增全長。PCR擴增反應所用的試劑來自Takara公司。反應條件為94°C， 5min; 94'C, 1 min， 59°C， 1 min， 72°C, 1. 5min， 30 cycles; 72°C, 5 min。產(chǎn)物構(gòu)建到pGEM ~T (購自Promega)載體中， 測序驗證。然后分別將外源構(gòu)建到PMAL-c2x載體中(購自5i'oZa6s),載體用BamHI和Xhol酶切。
(2) 蛋白誘導表達
將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化表達菌株BL21 (購自Invitrogen公司)，等菌液0D值達到0. 6時，加入終 濃度為0. 5mM的IPTG(isopr叩yl 1-thio-P -D-galact叩yranoside),然后37。C誘導表達3hrs。收集菌體， 加入一倍體積的PBS懸浮，置-20 'C過夜。第二天溶解，立即放在冰上，加入終濃度為lmM的PMSF，超聲 處理，整個超聲過程在冰上進行，以保證蛋白處于天然狀態(tài)。超聲處理完成之后12000rpm， 4'C冷凍離心。 收集上清，用Amylose Resin (購自A'oZaAsO純化。純化步驟參照pMAL Protein Fusion and Purification Instruction Manual, Catalog ttE8000S
(3) 蛋白酶活性檢測
20ul (10ug)純化的蛋白，加入等體積的pH緩沖液與20u 1 FITC-casein(Protease Fluorescent Detection Kit), 37。C下反應15小時后加入lOOul 0.6N三氯乙酸(TCA)沉淀，12000rpm離心lOtnin,吸 上清100ul，力口入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(Fluorescence spectrophotometer, Hitachi850) 測量。水為對照。
pH緩沖液配方
0.1M Gly-HCl， pH2. 5
0. 1M 0.1 M sodium citrate, pH3. 0, pH3. 5, pH 4.0; 0. 1M sodium acetate, pH 5.0; 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0;
(4) 檢測ASP是否被p印statin A抑制劑抑制
實驗步驟8ug純化的目標蛋白中加入終濃度為0.15mM p印statin A， 4°C孵育1.5小時后，加入 pH二3的緩沖液至終體積40iil，然后再加入底物FITC-Casein 20 li 1 (sigma， PF0100), 37 。C下孵育12小 時后，加入100 u 1 0. 6NTCA沉淀，吸上清100 u 1，加入2ml assay buffer,用熒光分光光度計(Hitachi M850 fluorescence spectrophotometer ， Japan)測量。只含有標簽麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的純化蛋白 作為對照，每個做三次重復。
(5) 天冬氨酸蛋白酶的自身剪接，形成成熟蛋白的初步分析
原核表達純化的/I邵10ul(20ug),加入1/2體積的PH緩沖液，37'C反應過夜，加入一倍體積的 loading buffer,水煮5min， 12%SDS_PAGE電泳，考馬斯藍染液染膠。
結(jié)果表明該蛋白在pH3.0的條件下活性最高(圖12)，且被p印statin A完全抑制(圖12)。實驗同 時表明該蛋白pH 2.5-4.0的條件下通過自身剪接，形成成熟蛋白(圖13)。
上述結(jié)果表明本發(fā)明基因確實編碼一個典型的天冬氨酰蛋白酶。 實施例5: S5基因的表達部位
為了確定55基因的表達部位，本實例使用了 RNA原位雜交技術(shù)。根據(jù)RNA探針雜交信號確定本發(fā)明 基因在珠心、珠被、孢母細胞和小孢子母細胞中表達(圖14)。
RNA原位雜交流程參見Drews (Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71 Drews GN (1998) In situ hybridization. Methods Mol Biol 82:353-71)。序列表
<110> 〈120> <130〉 <141〉 <160> <170> <210〉 <211> <212〉 <213> <220> <221〉 <222> <223> <220> <221〉 <222> <223> <220〉 <221> <222> <223> <220> <221> <222〉 〈223> <400>
華中農(nóng)業(yè)大學
水稻廣親和基因S5的分離克隆及應用
2007-10-10 7
Pstentin version 3.1 1
1778 DNA
水稻(Oryza sativa) gens
(l).. (1778)
5' UTR (1441).
(1778)
3'UTR (l).. (21)
CDS (22).
1
(1440)
atcaacccat ttcctttcct a cgt ttg
Arg Leu 1
caa gaa 3ga sag aa3 gaa ggg 3tt Gin Glu Arg Lys Lys Glu Gly lie 15
gca gcc gac gac gag ttg gag tgt Ala Ala Asp Asp Glu Leu Glu Cys 30
gtg aac tct caa ggc gcc att cag Val Asn Ser Gin Gly Ala lie Gin 45
caa tgc etc cgc cca tgg tct gtc Gin Cys Leu Arg Pro Trp Ser Val 60 65
act gcc tgc Thr Al3 Cys 5
aaa ttt get Lys Phe Ah 20
ccc tec tec Pro Ser Ser 35
ttc ccc gtg Phe Pro Val 50
cgt gca acc Arg Ala Thr
ctg ccc ctg Leu Pro Leu
taa tec ggc Ser Gly
ate ttc gat lie Phe Asp
ttc Phe
CElg
Gin
C8C
His
Ala 70
aag
Lys
55
tec
Ser
age Ser
gcc Ala
C3C
His 40
Lys
sag
Lys
10
aca
Thr
25
get
Ala
cac His
teg acc Ser Thr
51
99
147
195
243
ggs gca tc3 gga gcs gg3 aaei gga gga gga ttg犯c肪t cta cag g33 291 Gly Ala Ser Gly Ala Gly Lys Gly Gly Gly Leu Asn Asn Leu Gin Glu
75 80 85
gag gag ate act tea tea agt agt aca aaa ate gac gtg ate gaa gac 339 Glu Glu lie Thr Ser Ser Ser Ser Thr Lys lie Asp Val lie Glu Asp 90 95 100 105
age age ate aac gac ttc ctg ttc cta atg gcc gtc agt ctg ggc aag 387 Ser Ser lie Asn Asp Phe Leu Phe Leu Met Ala Val Ser Leu Gly Lys
110 115 120
cca ccg gtt gtg aac ctg gtg gcg ate gac acg gga tec acc etc teg 435 Pro Pro Val Val Asn Leu Val Ala lie Asp Thr Gly Ser Thr Leu Ser
125 130 135
tgg gtg caa tgc cag ccg tgc gcg gtg cac tgc cac acg cag tec gcg 483 T卬Val Gin Cys Gin Pro Cys Ala Val His Cys His Thr Gin Ser Ala
140 145 150
aag gcc ggc ccg ata ttc gat ccc ggc aga tec tac aca tec egg cga 531 Lys Ala Gly Pro lie Phe Asp Pro Gly Arg Ser Tyr Thr Ser Arg Arg
155 160 165
gtt cgc tgc teg teg gtc肌g tgc ggc gag ctg鄉(xiāng)tac gat ctg egg 579 Val Arg Cys Ser Ser Val Lys Cys Gly Glu Leu Arg Tyr Asp Leu Arg 170 175 180 185
etc cag caa gcc aat tgc atg gag aag gaa gac age tgc acg tac age 627 Leu Gin Gin Ala Asn Cys Met Glu Lys Glu Asp Ser Cys Thr Tyr Ser
190 195 200
gtc acg tac ggg aac ggg tgg gcg tac age gtg ggc aag atg gtg aca 675 Val Thr Tyr Gly Asn Gly Trp Ala Tyr Ser Val Gly Lys Met Val Thr
205 210 215
gac acg ctg agg att ggg gac teg ttt atg gat etc atg ttc ggg tgc 723 Asp Thr Leu Arg lie Gly Asp Ser Phe Met Asp Leu Met Phe Gly Cys
220 225 230
age atg gat gtc aag tac age gaa ttc gag gcc ggc ate ttt ggt ttc 771 Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly lie Phe Gly Phe
235 240 245
ggc age age age ttc tct ttc ttc gag cag ctg gca ggg tac cct gat 819 Gly Ser Ser Ser Phe Ser Phe Phe Glu Gin Leu Ala Gly Tyr Pro Asp 250 255 260 265
att ctg agt tac aag gca ttc age tac tgc ttg ccc act gac gag acc 867 lie Leu Ser Tyr Lys Ala Phe Ser Tyr Cys Leu Pro Thr Asp Glu Thr
270 275 280
aag ccc gga tac atg ate ctg gga卿tac gac cgt gcc gcc atg gat 915 Lys Pro Gly Tyr Met lie Leu Gly Arg Tyr Asp Arg Ala Ala Met Asp
285 290 295
ggg ggt tac act cct etc ttc egg tea ate aac agg cca acc tac tea 963 Gly Gly Tyr Thr Pro Leu Phe Arg Ser lie Asn Arg Pro Thr Tyr Ser300
ctg acg atg gag atg ctt
Leu Thr Met Glu Met Leu 315
tct tcg gag atg ate gtc
Ser Ser Glu Met lie Val
330 335
cct tec act ttt get etc
Pro Ser Thr Phe Ala Leu 350
tcg att Ser lie
tgc tac Cys Tyr
ccc ttc Pro Phe 395 ggc ggt Gly Gly 410
Pro His
ggg tat Gly Tyr 365 tta tcg Leu Ser 380
tec犯c Ser Asn
get gC3 Ala Ala
cgc ggt Arg Gly
C2LC
His
gag Glu
tgg Trp
etc Leu
ttg ILeu 430
ggg Gly
egg Arg
His
tec Ser
get Ala 415 tgc Cys
ate lie 320 gat Asp
ctt Leu
￡Lca Thr
gac Asp
gcc Ala 400 ttg Leu
3tg Met
305
gcc犯c Ala Asn
tec ggg Ser Gly
g￡ic犯g Asp Lys
tX￡L 3g￡L
Ser Arg 370 tat tct Tyr Ser 385
ttg cct Leu Pro
CC￡l ccc Pro Pro
acc ttt Thr Phe
ggg csg Gly Gin
gCC C￡lg
Ala Gin 340 3CC ate Thr lie 355
gcg cgc Ala Arg
ggt tgg Gly Trp
ctg ctg Leu Leu
3g3犯c Arg Asn 420 get C3g Ala Gin 435
cga tec Arg Ser
tct cag ata ctg ggg aac agg gtt act Ser Gin lie Leu Gly Asn Arg Val Thr 445 450 gac ate cag ggg ￡L3a c犯ttc ggc ttc a犯tat Asp lie Gin Gly Lys Gin Phe Gly Phe Lys Tyr
460 465 tegtcgatta ttcctcatcc tatgatatat cttatagctt gtttgcccaa ataactgatc ggattggagt cttctcccgc gategtatea c犯gctagcg gtacttgatt tgggacctaa cagcttaatt tgggacctag tagctagctg agccactact tccgtcgttt gtttgtgtct cctgtgcttg tgctaasicct c犯cttaatt atttggtcgt atgtcctaat tgttgatc 〈210〉 2 〈211〉 21 〈212〉 PRT
〈213〉 水稻(0ryza sativa) <400> 2
Arg Leu Thr Ala Cys Leu Pro Leu Ser Lys Gin 1 5 10
310 卿ttg Arg Leu 325
鄉(xiāng)acg Arg Thr
scg cag Thr Gin
caa g犯 Gin Glu
￡L￡LC ggC
Asn Gly 390 gag ate Glu lie 405
gtc ttc Val Phe
aat cct Asn Pro
ttc gga Phe Gly
gtg Val
tec Ser
Ala
tea Ser 375 acc Thr
ggc Gly
tac Tyr
get Ala
Thr 455 tgc Cys
tcg Thr Ser
ctg tgg Leu Trp 345 atg tcg Met Ser 360
tac ate Tyr lie
ate lie
ttc Phe
Asn
etc Leu 440
Thr
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gat Asp 425 ￡igg Arg
ttc Phe
gcc get Als Ala 470
gegggtcgat t犯ttagctg gctacactac ccctagctgc ttcgttcaaa肌aaacttgg agatgtttac gtaccagcta atctcttg犯ccgttcgtgc
1011
1059
1107
1155
1203
1251
1299
1347
1395
1440
1500 1560 1620 1680 1740 1778
Glu Arg Lys Lys Glu 15 Gly lie Lys
<210〉 3 <211〉 450 <212> PRT <213> 水稻 ■〉 3 Ser Gly Ala 1
Phe Asp His
His Lys Lys 35
Ala Ser Ser 50
Asn Leu Gin 65
Val lie Glu
Ser Leu Gly
Ser Thr Leu 115
Thr Gin Ser
130 Thr Ser Arg 145
Tyr Asp Leu
Cys Thr Tyr
Lys Met Val 195
Met Phe Gly
210 lie Phe Gly 225
Gly Tyr Pro
Thr Asp Glu
Ala Ala Met 275
Pro Thr Tyr
Phe Ala 20
C0ryza sativs!)
Thr Ala Ala Asp Asp Glu 5
Ala Val Asn Ser Gin Gly 20 25 Cys Leu
Leu Glu 10
Ala lie
His
Thr
Glu
Asp
Lys 100 Ser
Ala
Arg
Arg
Ser 180 Thr
Cys
Phe
Asp
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Gin
Gly
Glu
Ser
85
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Trp
Lys
Val
Leu 165 Val
Asp
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Gly
lie 245 Lys
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Leu
Arg Pro 40
Ala
Glu
70
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Val
Ala
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Thr
Met
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Pro
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55
lie
lie
Val
Gin
Gly 135 Cys
Gin
Tyr
Leu
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Gly
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Val
Cys 120 Pro
Ser
Ala
Gly
Arg 200 Val
Ser
Tyr
Tyr
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Ala
Ser
Asp
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lie
Ser
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Asn 185 lie
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Phe
Lys
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Phe
90
Leu
Pro
Phe
Val
Cys 170 Gly
Gly
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Leu
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Phe 235 Phe
Leu
Phe
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Gly
60
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Phe
Ala
Ala
Pro 140 Cys
Glu
Ala
Ser
Glu 220 Phe
Ser
Gly
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Ala
Pro Ser Ser lie 15
Phe Pro Val Phe 30
Arg Ala Thr Gin 45
Gly
Thr
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lie
Val 125 Gly
Gly
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Phe 205 Phe
Glu
Tyr
Arg
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Gly Leu Asn Lys Met
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Arg
Glu
Glu
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Glu
Gin
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lie
Gly
lie Asp 80
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Cys His
Ser Tyr
Leu Arg 160 Asp Ser 175
Val Gly
Asp Leu
Ala Gly
Leu Ala 240 Leu Pro 255
Asp Arg Asn Arg Gin Arg
290
Leu Val Thr Ser Ser Ser 305 310 Thr Ser Leu Trp Pro Ser 325
Gin Ala Met Ser Ser lie 340
Glu Ser Tyr lie Cys Tyr 355
Gly Thr lie Thr Pro Phe 370
lie Gly Phe Ala Gly Gly 385 390 Phe Tyr Asn Asp Pro His 405
Pro Ala Leu Arg Ser Gin 420
Gly Thr Thr Phe Asp lie 435
Ala Cys 450
〈210>4
<211〉1912
<212>腿
<213〉水稻(Oryza sativa)
<220>
<221〉gen6
<222>(l).. (1912)
<223>
<220〉
〈221>5'UTR
<222>(1577)., (1912)
<223>
<220>
〈221>3' UTR
<222>(l).. (157)
〈223>
<220〉
<221>CDS
<222>(158).. (1576)
<223>
<400>4
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10 15 20
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25 30 35
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40 45 50
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75 80 85
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90 95 100
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105 110 115
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120 125 130
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155 160 165
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170 175 180
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185 190 195
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200 205 210
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Met Phe Gly Cys Ser Met Asp Val Lys Tyr Ser Glu Phe Glu Ala Gly
235 240 245
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250 255 260
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265 270 275
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280 285 290
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315 320 325
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330 335 340
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345 350 355
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360 365 370
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395 400 405
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410 415 420
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425 430 435
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455 460 465 47G
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〈211〉 472 〈212〉 PRT 〈213>水稻 <400> 5 Met Val lie
1
Val
Glu
lie
Ser
65
L>ys
Ser
Leu
Val
Cys 145 Asp
Lys
Met
Trp
Asp
Ala
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Gly
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Ala 130 Ala
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Cys
Glu
Ala 210 Ser
(Oryza sativa) Leu Glu Gin Pro
Ala
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Phe
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Gly
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Asp
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Arg
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Ser
Met
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Ala
Ser
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Leu
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Cys
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Phe
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Ser
Leu
lie
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Leu
Ser
Arg
Leu 185 Tyr
Leu
10
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Ala
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Glu
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Asp
Lys
Ser
Ala
Arg 170 Arg
Ser Val Thr Phe Gly Cys
Leu
Ala
Val
Gin
Gly
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Glu
Ser
Pro
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Leu
Val
Asp
Ser
Leu
Ala
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Cys
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Ala
Glu
Ser
Pro
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Arg
Gin
Thr
Thr 220 Met
Leu
Asp
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Ser
lie
lie
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Gly
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Gin
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Gly
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Cys
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Arg
Val
Leu
15
Glu
Gly
Pro
Ala
Ser
95
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Gin
lie
Ser 175 Asn
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lie
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Leu
Leu
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Gly
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Phe
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Cys
Gly
Gly
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Phe Phe
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Glu
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Ser
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Gly
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Phe
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Arg
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(0ryza sativa)
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〈221〉 gene <222> (1)..(1911) 〈223> <220〉
〈221> 5'UTR
<222> (1577). . (1911)
<223>
〈220〉
230 Gly
Ala
Pro
Arg
Arg 310 Arg
Arg
Thr
Gin
Asn 390 Glu
Val
Asn
Phe
Ala 470
235 240 lie Phe Gly Phe Gly Ser Ser Ser Phe Ser
250 255 Gly Tyr Pro Asp lie Leu Ser Tyr Lys Ala
265 270 Thr Asp Glu Thr Lys Pro Gly Tyr Met lie
280 285 Ala Ala Met Asp Gly Gly Tyr Thr Pro Leu 295 300
T ，___ T>_____ r ___ T ___ TM___ If— j /~>，國國1,— j T ___
irir iyr ot;r Lt;u inru丄u ivi" lgu 315 320 Val Thr Ser Ser Ser Glu Met lie Val
330 335 Ser Leu Trp Pro Ser Thr Phe Ala Leu
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Thr lie Thr Pro Phe Ser Asn Trp Ser 395 400 Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ala Leu Ala
410 415 Tyr Asn Asp Pro His Arg Gly Leu Cys
425 430 Ala Leu Arg Ser Gin lie Leu Gly Asn 440 445 Thr Thr Phe Asp lie Gin Gly Lys Gin 460
Cys
Pro
Leu
Thr
Gin
Glu 375 Gly
lie
Phe
Pro
Gly 455 Val
<221> 3'證 <222〉 (1)..(157) 〈223〉 <220>
〈221> CDS
〈222> (158).. (1576)
〈223〉
<400> 6
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ate lie
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Gly
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tcctaattgt tgatc 1911
Leu
Ala
Val
Gin
Gly
75
Glu
Ser
Pro
Trp
Lys
Leu Leu Leu Ala Asn
Asp
Cys
60
Ala
Glu
Ser
Pro
Val 140 Ala
Ser 45 Leu
Ser
lie
lie
Val 125 Gin
Gly
Asp
30
Gin
Arg
Gly
Thr
Asn 110 Val
Cys
Pro
Leu
15
Glu
Gly
Pro
Ala
Ser
95
Asp
Asn
Gin
lie
Leu
Leu
Ala
Trp
Gly
80
Ser
Phe
Leu
Pro
Phe
145
Asp Pro Gly
Lys Cys Gly Glu 180 Glu
150
Arg Ser Tyr 165
Leu Arg
Met Glu Lys 195
Trp Ala Tyr
210 Asp Ser Phe 225
Ser Glu
Phe Phe
Phe Ser
Leu Gly 290 Phe Arg 305
lie Ala
Asp Ser
Leu Asp
Thr Ser 370 Asp Tyr 385
Ala Leu
Leu Pro
Met Thr
Arg Val 450 Phe Gly 465
Phe
Glu
Tyr 275 Arg
Ser
Asn
Gly
Lys 355 Arg
Ser
Pro
Pro
Phe 435 Thr
Phe
Ser
Met
Glu
Gin 260 Cys
Tyr
lie
Gly
Ala 340 Thr
Ala
Gly
Leu
Arg 420 Ala
Arg
Asp Ser
Val Gly
Asp Leu 230 Ala Gly 245
Leu
Leu
Asp
Asn
Gin 325 Gin
lie
Arg
Trp
Leu 405 Asn
Gin
Ser
Tyr
Ala
Pro
Arg
Arg 310 Arg
Arg
Thr
Gin
Asn 390 Glu
Val
Asn
Phe
Ala 470
Thr
Tyr
Cys
l>ys 215 Met
lie
Gly
Thr
Ala 295 Pro
Leu
Thr
Gin
Glu 375 Gly
lie
Phe
Pro
Gly 455 Ala
Ser
Asp
Thr 200 Met
Phe
Phe
Tyr
Asp 280 Ala
Thr
Val
Ser
Ala 360 Ser
Thr
Gly
Tyr
Ala 440 Thr
Cys
Arg Arg 170 Leu Arg 185
Tyr Ser
Val
Gly
Gly
Pro 265 Glu
Met
Tyr
Thr
Leu 345 Met
Tyr
lie
Phe
Asn 425 Leu
Thr
Thr
Cys
Phe 250 Asp
Thr
Asp
Ser
Ser 330 Trp
Ser
lie
Thr
Ala 410 Asp
Arg
Phe
155 Val
Leu
Val
Asp
Ser 235 Gly
lie
Lys
Gly
Leu 315 Ser
Pro
Ser
Cys
Pro 395 Gly
Pro
Ser
Asp
Arg Cys
Gin Gin
Thr Tyr 205 Thr Leu 220
Met Asp
Ser Ser
Leu Ser
Pro Gly 285 Gly Tyr 300
Thr Met
Ser Glu
Ser Thr
lie Gly 365 Tyr Leu 380
Phe Ser
Gly Ala
His Arg
Gin lie 445 lie Gin 460
Ser
Ala 190 Gly
Arg
Val
Ser
Tyr 270 Tyr
Thr
Glu
Met
Phe 350 Tyr
Ser
Asn
Ala
Gly 430 Leu
Gly
160 Ser Val 175
Asn Cys
Asn Gly
lie Gly
Lys Tyr 240 Phe Ser 255
Lys Ala
Met lie
Pro Leu
Met Leu 320 lie Val 335
Ala Leu
His Arg
Glu His
Trp Ser 400 Leu Ala 415
Leu Cys Gly Asn Lys Gin
權(quán)利要求
1、分離克隆的水稻秈粳亞種廣親和基因S5，它是(a)SEQ ID NO1中第1-1778位所示的核苷酸序列，SEQ ID NO2中第1-1912位所示的核苷酸序列和SEQ ID NO3中第1-1911位所示的核苷酸序列，或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質(zhì)相同的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2、 合適啟動子連接的權(quán)利要求l所述的核苷酸序列。
3、 權(quán)利要求1所述的基因S5在水稻改良中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個水稻廣親和基因S5的分離克隆、功能驗證及其在改良水稻中的應用。所述基因的DNA片段包含一個編碼天冬氨酰蛋白酶的水稻廣親和基因。水稻秈粳亞種間具有比水稻品種間更強的雜種優(yōu)勢，但秈粳亞種間雜種的不育性卻限制了對其雜種優(yōu)勢的利用。利用本發(fā)明克隆的廣親和基因，能夠克服水稻秈粳亞種間雜種的不育性，從而利用秈粳亞種間強大的雜種優(yōu)勢以進一步提高水稻的產(chǎn)量。
文檔編號C12N15/29GK101200725SQ20071005355
公開日2008年6月18日 申請日期2007年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日
發(fā)明者丁寄花, 劉克德, 張啟發(fā), 歐陽亦聃, 陳炯炯 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學