專利名稱：用于生物合成肝素酶的培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)基，具體說，涉及一種以肝素黃桿菌F/avo6a"en'"m /2e; an'm^ ATCC 13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基。 背錄技術肝素酶能特異性地斷裂肝素和類肝素鏈上具有特定修飾的不同序列， 產(chǎn)生不同的寡糖片段。肝素酶具有許多重要用途，包括體內循環(huán)中肝素的 消除，肝素精確結構的確定，肝素抗凝機理和肝素結構與功能的研究，制 備低分子量肝素及抗腫瘤藥物等。國外報道采用肝素黃桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肝素 酶能夠達到的1，475U/L的效價，而國內的報道也很低。其中，"肝素黃桿 菌發(fā)酵產(chǎn)肝素酶的工藝優(yōu)化" 一文披露，可由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和 玉米漿等作為培養(yǎng)基的有機氮源合成肝素酶但效果并不明顯，其中采用如 下培養(yǎng)配方((g/L):葡萄糖8，氯化銨4，磷酸二氫鹽6，組氨酸0.75,甲硫 氨酸0.75，氯化鎂0.5;微量鹽10"mol/L )可將產(chǎn)酶量比原來提高66% 。 但現(xiàn)有技術中，由于肝素黃桿菌發(fā)酵生物合成肝素酶的效價普遍不高，成 為了制約采用發(fā)酵法規(guī)模化生產(chǎn)肝素酶的主要障礙，是一個迫切需要解決 的問題。發(fā)明內容本發(fā)明需要解決的技術問題是提高肝素黃桿菌發(fā)酵生物合成肝素酶 的效價。為此，本發(fā)明提供一種以肝素黃桿菌尸7ara6acteri咖Aeparz'y^/z ATCC 13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、氨基 酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH4C1、大豆蛋白胨和胰蛋白胨組成。本發(fā)明的獨特之處在于氮源的配方，即同時采用NH4C1、大豆蛋白胨 和胰蛋白胨。所述NH4C1、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的重量百分比為4: 4 5: 2 3， 優(yōu)選4: 4.6: 2.3。所述NH4Cl在培養(yǎng)基中濃度通常為2 5g/L，優(yōu)選濃度為3-4 g/L。所述氨基酸為L-His和L-Met，當其濃度為0.25g/L到0.75g/L時，可以獲 得較好的生長和產(chǎn)酶效果，優(yōu)選濃度為0.4g/L到0.6g/L。所述肝素的濃度為lg/L到5g/L，優(yōu)選2g/L到3g/L。本發(fā)明所使用產(chǎn)生肝素酶的菌種為肝素黃桿菌，菌種編號為ATCC 13125,實際用于生產(chǎn)的菌株可以為自主誘變獲得的肝素酶髙產(chǎn)菌株。本發(fā)明的碳源可包括但不限于葡萄糖、半乳糖等，最優(yōu)地使用葡萄糖， 在培養(yǎng)液中該碳源濃度為l%~7g/L，優(yōu)選濃度為3 5g/L。本發(fā)明采用混合磷酸鹽為磷酸鈉鹽或者磷酸鉀鹽，濃度為3 7g/L， 優(yōu)選為4 6g/L;本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加微量元素(NaMo03 ， CuCl2 ， FeCl2 , CoCl2，MnCl2，CaCl2)，濃度為10—3 10—5M ，最優(yōu)為1(T4M。本發(fā)明生物合成過程中的空氣通氣量通常在0.2 1.5wm,優(yōu)選在0.5 0.8 vvm;溫度控制在23 28'C，優(yōu)選在24'C 26'C;可測得最高酶活力 時間在30 36h，優(yōu)選在32 34h。本發(fā)明在發(fā)酵過程中pH值控制在6.0 7.0，優(yōu)選為6.2 6.8。發(fā)酵結束將細胞培養(yǎng)液離心(10,000r/min ， 8min)收集菌體，以一定 體積0.02mol/L、 pH7.0磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波 破碎。然后離心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶。釆用本發(fā)明培養(yǎng)基配方培養(yǎng)肝素黃桿菌，菌體生長和產(chǎn)酶都優(yōu)于文獻 所報道的培養(yǎng)基，菌體產(chǎn)量可達到15g/L(濕重)，產(chǎn)酶效價可高達2,000U/L。
具體實施方式
實施例1肝素黃桿菌(F/avo6(3"en'Mw/lepan'""/w ， ATCC 13125) ， 750ml搖 瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖3; NH4C1 4;大豆蛋白胨4.6;胰蛋 白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液種齡48小時，10%接種，裝液量90ml/750ml， 25'C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得15g/L (濕 重)的菌體和1，768U/L效價的肝素酶。實施例2肝素黃桿菌(尸/avo6ac&;^ww Zie; arz.w"加，ATCC 13125) ， 750ml搖 瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖3; NH4C1 4;大豆蛋白胨4;胰蛋白胨2; L-Met 0.25; L-His 0.25;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 l(T5M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0,種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量卯ml〃50ml， 25'C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min ， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得14g/L (濕 重)的菌體和約1，550U/L效價的肝素酶。實施例3肝素黃桿菌(F/avo6a"eWw/w/z印a"'""OT ， ATCC 13125) ， 750ml搖 瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4;胰蛋 白胨3; L-Met 0.25; L-His 0.25;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 l(T5M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml〃50ml， 25'C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min ， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得15g/L (濕 重)的菌體和約1,550U/L效價的肝素酶。實施例4肝素黃桿菌(F/。vo6a"e"'w/w ZiepaW"w附，ATCC 13125) ， 750ml搖瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖5; NH4C1 4;大豆蛋白胨5;胰蛋白胨2; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10_4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml/750ml， 25'C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10,000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得13g/L (濕 重)的菌體和1,650U/L效價的肝素酶。實施例5肝素黃桿菌(F/avo6a"e".Mm/z印aW""/n ， ATCC 13125) ， 750ml搖 瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨5;胰蛋白胨3; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml/750ml, 25。C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10,000r/min，8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得14g/L (濕 重)的菌體和1，620U/L效價的肝素酶。實施例6肝素黃桿菌(F/avo6a"e".MW Zie; flW""w ， ATCC 13125) ， 750ml搖 瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨2; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml/750ml， 25。C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得13g/L (濕 重)的菌體和1，600U/L效價的肝素酶。實施例7肝素黃桿菌(F/avo6a"e"wm/z印ot/""加，ATCC 13125) ， 750ml搖瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨3; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml〃50ml， 25'C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min，8min)收集菌體，以一定體積O.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得14.5g/L(濕 重)的菌體和1，610U/L效價的肝素酶。實施例8肝素黃桿菌(F/avo6a"eWw附/z印or/""加，ATCC 13125) ， 750ml搖瓶，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖5; NH4Cl 4;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨2.5; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，種子液 種齡48小時，10%接種，裝液量90ml/750ml， 25。C培養(yǎng)32小時。將細胞 培養(yǎng)液離心(10，000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得15g/L (濕 重)的菌體和1，720U/L效價的肝素酶。實施例9使用半乳糖替換實施例1中的葡萄糖進行試驗，余同實施例1，可以 獲得13g/L (濕重)的菌體和2，000U/L效價的肝素酶。實施例10使用半乳糖替換實施例2中的葡萄糖進行試驗，余同實施例1，可以 獲得10g/L (濕重)的菌體和1，500U/L效價的肝素酶。實施例11使用半乳糖替換實施例3中的葡萄糖進行試驗，余同實施例1，可以 獲得14g/L (濕重)的菌體和1,840U/L效價的肝素酶。實施例12肝素黃桿菌(i^vo6ac^7Mm/z印"W肌m ， ATCC 13125) ， 5L發(fā)酵罐，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，種子液種齡48 小時，10%接種，空氣通氣量0.5 vvm;溫度控制在25'C;發(fā)酵過程pH 值控制在6.5到7.0，泡敵流加，發(fā)酵時間32h。發(fā)酵結束將細胞培養(yǎng)液離 心(10，000r/min ， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0磷酸緩 沖液洗漆后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得13 15g/L (濕重) 的菌體和約1700U/L效價的肝素酶。實施例13肝素黃桿菌(F/avo6fl"en"w/iep^7" w ， ATCC 13125) , 5L發(fā)酵罐， 培養(yǎng)液組成為(g/L)半乳糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，種子液種齡48 小時，10%接種，空氣通氣量0.5 vvm;溫度控制在25'C;發(fā)酵過程pH 值控制在6.5到7.0，泡敵流加，發(fā)酵時間32h。發(fā)酵結束將細胞培養(yǎng)液離 心(10，000r/min, 8min)收集菌體，以一定體積0,02mol/L、 pH7.0磷酸緩 沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得ll 13g/L (濕重) 的菌體和約1，600U/L效價的肝素酶。實施例14肝素黃桿菌(F/avo6a"eWww/i印an'w"m ， ATCC 13125) ， 15L發(fā)酵 罐，培養(yǎng)液組成為(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋 白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，種子液種齡48 小時，10%接種，空氣通氣量0.5 vvm;溫度控制在25'C;發(fā)酵過程pH 值控制在6.5到7.0，泡敵流加，發(fā)酵時間32h。發(fā)酵結束將細胞培養(yǎng)液離 心(10,000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0磷酸緩 沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心(14,000 r/min, 30min)收集上清即得無細胞粗酶液。可以獲得12 15g/L (濕重) 的菌體和1,600 1，700U/L效價的肝素酶。實施例15肝素黃桿菌(F/avo6a"eWwm A印an"";w ， ATCC 13125) ， 15L發(fā)酵 罐，培養(yǎng)液組成為(g/L)半乳糖3;NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸鹽5;肝素鈉2;微量元 素l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，種子液 種齡48小時，10%接種，空氣通氣量0.5vvm;溫度控制在25'C;發(fā)酵過 程pH值控制在6.5到7.0，泡敵流加，發(fā)酵時間32h。發(fā)酵結束將細胞培 養(yǎng)液離心(10，000r/min， 8min)收集菌體，以一定體積0.02mol/L、 pH7.0 磷酸緩沖液洗滌后懸浮細胞，在冰浴中進行超聲波破碎。破碎液離心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得無細胞粗酶液?？梢垣@得10 14g/L(濕重)的菌體和1，700 1,900U/L效價的肝素酶。
權利要求
1. 一種以肝素黃桿菌Flavobacterium heparinum ATCC 13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH4Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨組成。
2. 如權利要求l所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述NH4C1、大豆蛋白 胨和胰蛋白胨的重量百分比為4: 4 5: 2 3。
3. 如權利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述NH4C1、大豆蛋白 胨和胰蛋白胨的重量百分比為4: 4.6: 2.3。
4. 如權利要求1到3任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述NH4C1在培 養(yǎng)基中的濃度為2 5g/L。
5. 如權利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述NH4Cl在培養(yǎng)基中 的濃度為3 4g/L。
6. 如權利要求l所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸為L-His和 L-Met。
7. 如權利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述L-His和L-Met的濃 度均為0.25g/L到0.75g/L。
8. 如權利要求7所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述L-His和L-Met的濃 度均為0.4g/L到0.6g/L。
9. 如權利要求l所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述肝素的濃度為lg/L 到5g/L。
10. 如權利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述肝素的濃度為2g/L 到3g/L。
11. 如權利要求l所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源為葡萄糖或 半乳糖，濃度為l 7g/L。
12. 如權利要求ll所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源為葡萄糖， 濃度為3 5g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以肝素黃桿菌Flavobacterium heparinum ATCC 13125為菌種，生物合成肝素酶的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨組成。本發(fā)明培養(yǎng)基中，肝素黃桿菌的菌體產(chǎn)量可達到15g/L(濕重)。采用本發(fā)明培養(yǎng)基合成肝素酶，產(chǎn)酶效價可達2,000U/L，且成本低，控制簡單容易，易于實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/24GK101235356SQ200710036928
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月29日 優(yōu)先權日2007年1月29日
發(fā)明者軍 馮, 朱裕輝, 綱 林, 田永輝, 程睛華, 薛春佳, 趙文杰, 雪 陳, 魏曉東, 齊艷艷 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院