專利名稱：編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
及背景本發(fā)明涉及編碼具類肝素酶(heparanase)活性的多肽的多核苷酸(下文中稱作hpa)，包括此多核苷酸的載體和表達(dá)類肝素酶的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及具類肝素酶活性的重組蛋白。
硫酸乙酰肝素蛋白多糖硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是與脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物組織中的許多細(xì)胞的細(xì)胞表面和胞外基質(zhì)(ECM)有關(guān)的普遍存在的大分子(1-4)?；镜腍SPG結(jié)構(gòu)包括蛋白核心以及與之共價(jià)相連的幾條線性硫酸乙酰肝素鏈。這些多糖鏈通常由重復(fù)的己糖醛和D-葡糖胺二糖單元組成，這些單元不同程度地被N-和O-連接的硫酸組分和N-連接的乙?；鶊F(tuán)所取代(1-4)。對ECM分子參與細(xì)胞附著、生長和分化的研究顯示，HSPG在胚形態(tài)發(fā)生、血管發(fā)生、軸突旁枝突起和組織修復(fù)中處于關(guān)鍵地位(1-5)。HSPG是血管的重要組分(3)。在大血管中，它們主要集中在血管內(nèi)膜和內(nèi)血管中膜，而在毛細(xì)血管中，它們主要在內(nèi)皮下基底膜，支持內(nèi)皮細(xì)胞繁殖和遷移并穩(wěn)定毛細(xì)血管壁的結(jié)構(gòu)。HSPG與ECM大分子如膠原、層粘連蛋白和纖連蛋白等在質(zhì)膜上的不同附著位點(diǎn)相互作用的能力暗示了此蛋白多糖在ECM組分的自組裝和不溶性，以及細(xì)胞粘著和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中起著重要作用。硫酸乙酰肝素(HS)鏈的裂解可導(dǎo)致內(nèi)皮下ECM的降解，從而在血源細(xì)胞的外滲中起決定性作用。HS分解代謝可在炎癥、創(chuàng)傷修復(fù)、糖尿病和癌癥轉(zhuǎn)移中觀察到，說明降解HS的酶在病理過程中起重要作用。類肝素酶活性曾在活化的免疫系統(tǒng)細(xì)胞和高度轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞中描述過(6-8)，但由于缺乏探索疾病狀況下類肝素酶潛在的病原作用的生物工具，因此阻礙了研究。
腫瘤細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移中類肝素酶的參與停留在不同器官毛細(xì)血管床內(nèi)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞必須侵入內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層并降解其底層基底膜(BM)以便侵入血管外組織，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移(9，10)。轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞經(jīng)常附著在鄰近內(nèi)皮細(xì)胞之間的胞間連接處或附近。轉(zhuǎn)移細(xì)胞附著之后，胞間連接破裂，內(nèi)皮細(xì)胞邊界收縮，通過內(nèi)皮缺口向暴露的底層基底膜遷移(9)。一旦定位在內(nèi)皮細(xì)胞和BM之間，則侵入細(xì)胞必須降解BM的內(nèi)皮下糖蛋白和蛋白多糖以便遷移出血管區(qū)室。若干細(xì)胞酶(例膠原酶IV，纖溶酶原激活物，組織蛋白酶B，彈性蛋白酶等)與BM的降解有關(guān)(10)。在這些酶中，有一種內(nèi)切-β-D-葡糖苷酸酶(類肝素酶)，它在特殊鏈內(nèi)位點(diǎn)裂解HS(6，8，11)。HS降解性類肝素酶的表達(dá)與小鼠淋巴瘤(11)、纖維肉瘤和黑素瘤(8)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)。此外，在患有轉(zhuǎn)移腫瘤的動(dòng)物和黑素瘤患者的血清(8)和癌癥患者的腫瘤活組織(12)中檢測到類肝素酶水平升高。
本發(fā)明人以前研究過通過局部微環(huán)境對細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)展進(jìn)行控制，主要著眼于細(xì)胞與培養(yǎng)的角膜和血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用。該培養(yǎng)ECM在其形態(tài)外觀及分子組成方面與體內(nèi)的內(nèi)皮下層十分類似。它包括膠原(主要是III型和IV型，及少量I型和V型)，蛋白多糖(主要為硫酸乙酰肝素和硫酸皮膚素蛋白多糖，以及少量硫酸軟骨素蛋白多糖)，層粘連蛋白，纖連蛋白，巢蛋白和彈性蛋白(13，14)。細(xì)胞降解培養(yǎng)ECM中的HS的能力可通過以下方法研究使細(xì)胞與新陳代謝地硫酸鹽標(biāo)記的ECM相互作用，對釋放到培養(yǎng)基中的降解產(chǎn)物進(jìn)行凝膠過濾(瓊脂糖6B)分析(11)。完整的HSPG在柱的空體積之后洗脫(Kav＜0.2，Mr≈0.5×106)，而標(biāo)記的HS側(cè)鏈降解片段在更接近柱的Vt時(shí)洗脫(0.5＜Kav＜0.8，Mr＝5-7×103)(11)。
本發(fā)明者還研究了各種非抗凝劑類型的肝素對類肝素酶的抑制作用，這些肝素有可能用于防止血源細(xì)胞的外滲。包括16個(gè)或更多糖單位并在N和O位置都具硫酸基團(tuán)的肝素可最成功抑制類肝素酶。O-脫硫作用消除了肝素對類肝素酶的抑制作用，而只要N-取代分子分子量大于等于4,000道爾頓，則O-硫酸化、N-乙?；嗡乇３指咭种苹钚?7)。對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用類肝素酶抑制劑(例如，肝素的非抗凝劑類型)處理，則顯著減少(＞90％)B16黑素瘤、Lewis肺癌和乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)的肺部轉(zhuǎn)移(7，8，16)。與抗凝血酶III具高和低親合性的肝素級分表現(xiàn)出相似的高抗轉(zhuǎn)移活性，這表明肝素的類肝素酶抑制活性而非其抗凝活性在多糖的抗轉(zhuǎn)移特性中起作用(7)。
癌癥患者尿中的類肝素酶活性為嘗試進(jìn)一步闡明類肝素酶在腫瘤發(fā)展中的作用及與人類癌癥的相關(guān)性，對尿樣進(jìn)行類肝素酶活性檢查(16a)。在一部分、而非所有癌癥患者的尿樣中檢測到類肝素酶活性。在患有侵入性轉(zhuǎn)移疾病的患者的尿液中檢測到高水平的類肝素酶活性，而在健康供體的尿液中檢測不到類肝素酶活性。
在20％的正常人和微球蛋白尿胰島素依賴型糖尿病(IDDM)患者中也發(fā)現(xiàn)有類肝素酶活性，這很可能是由于糖尿病性腎病——導(dǎo)致成人腎衰竭的最重要的疾病所致。
類肝素酶可能參與腫瘤血管發(fā)生成纖維細(xì)胞生長因子為結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽家族，具有對肝素高親和性的特征(17)。它們對血管內(nèi)皮細(xì)胞高度促有絲分裂，且是最有效的新血管形成的誘導(dǎo)物之一(17，18)。已從體外生成的內(nèi)皮下ECM(19)和角膜的基底膜(20)中提取出了堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，提示ECM可作為bFGF的儲存器。免疫組化染色顯示bFGF定位在多種組織和血管的基底膜中(21)。盡管bFGF在正常組織中普遍存在，但這些組織中的內(nèi)皮細(xì)胞通常增殖很低，說明bFGF以某種方式與其作用位點(diǎn)隔離。對bFGF與ECM相互作用的研究表明bFGF與ECM中HSPG結(jié)合，且能通過HS降解酶以活化形式釋放(15，20，22)。已證實(shí)血小板、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞表達(dá)的類肝素酶活性與從ECM和基底膜釋放活性bFGF有關(guān)(23)，說明類肝素酶活性可能不僅參與細(xì)胞遷移和侵入，而且還可能誘發(fā)間接新血管反應(yīng)。這些結(jié)果說明ECM HSPG是bFGF、可能還是其它肝素結(jié)合性生長促進(jìn)因子的天然儲存庫(24，25)。因此，bFGF從其在基底膜和ECM內(nèi)的儲備中移位可能是正常和病理狀況下誘導(dǎo)新血管形成的一種新機(jī)制。
近來的研究顯示，肝素和HS參與bFGF與高親和力細(xì)胞表面受體的結(jié)合及bFGF細(xì)胞信號傳導(dǎo)(26，27)。此外，達(dá)到最佳效果所需的HS的大小與類肝素酶釋放的HS片段的大小相似(28)。對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)也得到類似結(jié)果(29)，表明有一個(gè)涉及HS與肝素結(jié)合性生長因子的細(xì)胞相互作用的雙重受體機(jī)制在起作用。因此推斷ECM中內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的限制化避免了它們系統(tǒng)性地作用于血管內(nèi)皮，從而維持極低速率的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換和血管生長。另一方面，bFGF作為與HS片段的復(fù)合體從ECM內(nèi)的儲備中釋放出來可能會(huì)刺激例如創(chuàng)傷愈合、炎癥和腫瘤發(fā)展等過程中的局部內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管生成(24，25)。
免疫系統(tǒng)細(xì)胞的類肝素酶的表達(dá)類肝素酶的活性與免疫系統(tǒng)內(nèi)活化細(xì)胞脫離循環(huán)并引起炎癥和自身免疫反應(yīng)的能力有關(guān)。血小板、粒細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞與內(nèi)皮下ECM的相互作用與通過特異性類肝素酶活性降解HS有關(guān)(6)。類肝素酶在各種活化信號(例如凝血酶，鈣離子載體，免疫復(fù)合體，抗原，有絲分裂原，等)刺激下從細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(例如溶酶體，特殊顆粒，等)釋放，說明其受調(diào)控地參與炎癥和細(xì)胞免疫。
參考文獻(xiàn)6中回顧了關(guān)于類肝素酶的觀察結(jié)果，列舉如下文第一，蛋白水解活性(纖溶酶原激活物)和類肝素酶協(xié)同參與炎性白細(xì)胞和惡性細(xì)胞對ECM HSPG的順序降解。
第二，大部分血小板類肝素酶以潛伏形式存在，很可能是作為與硫酸軟骨素的復(fù)合體存在。該潛伏酶被腫瘤細(xì)胞衍生因子活化，隨后可在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中促進(jìn)通過血管內(nèi)皮的細(xì)胞侵入。
第三，強(qiáng)刺激劑(例如凝血酶)誘導(dǎo)血小板類肝素酶從α-顆粒中釋放，但ECM上血小板活化不誘導(dǎo)釋放。
第四，因閾值激活和細(xì)胞在ECM上孵育，優(yōu)先并很容易地釋放嗜中性粒細(xì)胞類肝素酶。
第五，嗜中性粒細(xì)胞與ECM的接觸抑制了毒性酶(蛋白水解酶，溶菌酶)和氧自由基的釋放，但不抑制能使血細(xì)胞滲出的酶(類肝素酶，明膠酶)的釋放。當(dāng)可溶因子而非可被吞噬的刺激劑刺激時(shí)，可觀察到內(nèi)皮下ECM的這種保護(hù)作用。
第六，細(xì)胞內(nèi)類肝素酶在T細(xì)胞系暴露于特異抗原下幾分鐘內(nèi)即被分泌。
第七，有絲分裂原(ConA，LPS)誘導(dǎo)體外維持的正常T和B淋巴細(xì)胞合成與分泌類肝素酶。T淋巴細(xì)胞類肝素酶也可通過體內(nèi)抗原免疫接種而誘導(dǎo)。
第八，前B淋巴瘤和B淋巴瘤表達(dá)類肝素酶活性，但漿細(xì)胞瘤和靜息狀態(tài)的正常B淋巴細(xì)胞不表達(dá)。
第九，活化的巨噬細(xì)胞在與ECM孵育過程中表達(dá)類肝素酶活性，但僅極少或根本沒有酶釋放到培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)人骨髓白血病細(xì)胞分化為成熟巨噬細(xì)胞時(shí)，得到相似結(jié)果。
第十，低劑量的類肝素酶抑制性非抗凝劑型肝素抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫(30)。
第十一，血小板、嗜中性粒細(xì)胞和轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞表達(dá)的類肝素酶活性從ECM和基底膜釋放活化的bFGF。從ECM內(nèi)的儲備中釋放bFGF可在如創(chuàng)傷愈合、炎癥和腫瘤發(fā)展的過程中引發(fā)局部的新血管反應(yīng)。
第十二，類肝素酶產(chǎn)生的ECM降解產(chǎn)物中具有能體內(nèi)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的三硫酸化雙糖(31)。此種抑制與雙糖對活化的T細(xì)胞進(jìn)行的生物活性TNFα體外生產(chǎn)的抑制作用相關(guān)(31)。
其它潛在的治療應(yīng)用哺乳動(dòng)物的類肝素酶除了參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、炎癥和自身免疫之外，還可用于調(diào)節(jié)肝素結(jié)合性生長因子的生物利用率(15)；針對肝素結(jié)合性生長因子(例如bFGF，VEGF)和細(xì)胞因子(IL-8)的細(xì)胞反應(yīng)(31a，29)；與血漿脂蛋白的細(xì)胞相互作用(32)；對某些病毒和一些細(xì)菌及原生動(dòng)物感染的細(xì)胞易感性(33，33a，33b)；和淀粉狀蛋白斑的分解(34)。由此證明類肝素酶可能在諸如創(chuàng)傷愈合、血管發(fā)生、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、神經(jīng)變性疾病和病毒感染之類狀況中有用。哺乳動(dòng)物類肝素酶能作為血精蛋白的潛在替代物用于中和血漿肝素?？诡惛嗡孛傅目贵w可應(yīng)用于活組織檢查樣品、血漿樣品和體液中的微轉(zhuǎn)移、自身免疫損害和腎衰竭的免疫檢測及診斷中。在基礎(chǔ)研究中也有普遍用途。
編碼類肝素酶的hpa基因的鑒別有助于在異源表達(dá)系統(tǒng)中制備重組酶。如能獲得重組蛋白，將為解決蛋白結(jié)構(gòu)功能關(guān)系鋪平道路，并且為開發(fā)新抑制劑提供工具。
病毒感染細(xì)胞表面上硫酸乙酰肝素的存在是單純皰疹病毒(33)和登革病毒(33a)與細(xì)胞結(jié)合并進(jìn)一步感染細(xì)胞的主要條件。因此通過類肝素酶除去細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素可消除病毒感染(33)。事實(shí)上，用細(xì)菌類肝素酶(降解硫酸乙酰肝素)或肝素酶(降解類肝素)處理細(xì)胞，能降低兩種相關(guān)的動(dòng)物皰疹病毒與細(xì)胞的結(jié)合，使細(xì)胞對病毒感染至少有部分抗性。有跡象表明細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素也參與HIV感染(33b)。
神經(jīng)變性疾病在Genstmann-Straussler綜合癥，Creutzfeldt-Jakob疾病和Scrape的朊病毒蛋白淀粉樣蛋白斑中鑒別出了硫酸乙酰肝素蛋白多糖(34)。類肝素酶可分解這些被認(rèn)為也在早老性癡呆發(fā)病機(jī)理中起作用的淀粉樣蛋白斑。
再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化因內(nèi)皮損傷和富含膽固醇的脂蛋白累積造成的動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖是動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄發(fā)病機(jī)理中的基本事件(35)。HS除了參與SMC增殖(即肝素結(jié)合性生長因子的低親和性受體)外，還參與脂蛋白結(jié)合、滯留和攝取(36)。已證明HSPG和脂蛋白脂酶參與可使富含膽固醇的脂蛋白發(fā)生顯著細(xì)胞和間質(zhì)積累的新分解代謝途徑(32)。后一種途徑可能因促進(jìn)富含apoB和apoE的脂蛋白(即LDL，VLDL，乳糜微粒)的積累而高度促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，而與細(xì)胞固醇含量的反饋抑制無關(guān)。因而預(yù)計(jì)通過類肝素酶除去SMCHS可抑制SMC增殖和脂類積累，因此可以阻止再狹窄和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
因此，人們已普遍認(rèn)識到，得到編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸，包含此多核苷酸的載體，表達(dá)類肝素酶的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞及具類肝素酶活性的重組蛋白，將是有必要的并且非常有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸(即下文所指的hpa、hpa cDNA或hpa基因)，本發(fā)明還提供包含此多核苷酸的載體，表達(dá)類肝素酶的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
在此報(bào)導(dǎo)對編碼類肝素酶的人hpa基因的克隆和通過轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)重組類肝素酶。
對從人肝癌細(xì)胞分離的類肝素酶的純化制品進(jìn)行胰蛋白酶消化和微量測序。公開的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列用于篩選EST數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的DNA序列的同源物。鑒定到兩個(gè)緊密相關(guān)的EST序列，其后發(fā)現(xiàn)二者相同。兩種克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的開放閱讀框及隨后的27bp 3′非翻譯區(qū)和多聚腺苷酸尾。未鑒定到翻譯起始位點(diǎn)。
使用根據(jù)EST克隆序列和復(fù)合體的接頭選擇的引物，通過對來自胎盤Marathon RACE cDNA復(fù)合體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)施對缺失的hpa 5′端的克隆。獲得900bp PCR片段，該片段與鑒定出的EST 3′編碼克隆部分重疊。連接的cDNA片段(hpa)為1721bp長(SEQ IDNO9)，其中包括編碼543個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框，計(jì)算分子量為61，192道爾頓。
運(yùn)用Marathon RACE通過PCR擴(kuò)增從人SK-hep1細(xì)胞系克隆延伸的5′序列。將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA(SEQ ID NO9)序列裝配起來。裝配序列包括開放閱讀框SEQ ID NO13和15，該閱讀框編碼如SEQ ID NO14和15所示的592個(gè)氨基酸的多肽，計(jì)算分子量為66，407道爾頓。
運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，通過在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)hpa的整個(gè)開放閱讀框，檢測hpa基因產(chǎn)品在體外實(shí)驗(yàn)中催化硫酸乙酰肝素降解的能力。含hpa基因的病毒感染的細(xì)胞的提取物和條件培養(yǎng)基，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其對可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平硫酸乙酰肝素降解活性。肝素是類肝素酶的另一底物，它抑制上述降解活性。用不含hpa基因的相似構(gòu)建體感染的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞都不具備此活性。在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中證實(shí)從延伸的5′克隆表達(dá)的類肝素酶有對肝素的活性。
運(yùn)用RT-PCR研究hpa RNA在不同組織和細(xì)胞系中的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)hpa RNA僅在已知具類肝素酶活性的組織和細(xì)胞中表達(dá)。
運(yùn)用一系列單染色體人/CHO和人/小鼠體細(xì)胞雜合體將人類肝素酶基因定位在人第4號染色體上。該新分離的類肝素酶序列可用于鑒定鋪展染色體中具有人類肝素酶基因的染色體區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明以下描述的優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)一步描繪的特征，本發(fā)明提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，該多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它們編碼完整的人類肝素酶。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包括能與hpa cDNA雜交，尤其是與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列與SEQ ID NO9或13至少60％同源，優(yōu)選至少70％同源，更優(yōu)選至少80％同源，最優(yōu)選至少90％同源。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，依照本發(fā)明的多核苷酸片段包括SEQ ID NO9或13的一部分(片段)。例如，這些片段可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721和/或SEQ ID NO9中編碼具類肝素酶催化活性的多肽的區(qū)段。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，由該多核苷酸片段編碼的多肽包括SEQ ID NO10或14中所示氨基酸序列或其功能性部分。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，該多核苷酸序列編碼具類肝素酶活性的多肽，所述多肽與SEQ ID NO10或14至少60％同源，優(yōu)選至少70％同源，更優(yōu)選至少80％同源，最優(yōu)選至少90％同源。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，該多核苷酸片段編碼具類肝素酶活性的多肽，該多肽因此可能是SEQ ID NO10或14所示氨基酸序列的等位變體、種變體和/或誘導(dǎo)變體。任何此類變體也可被認(rèn)作同系物。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供一種單鏈多核苷酸片段，它包括與編碼具如上述類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸鏈的至少一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包括編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列的載體。
該載體可為任何適當(dāng)形式，包括但不限于噬菌體、病毒、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿?；蛏踔寥斯と旧w。編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括以上描述的任何多核苷酸片段。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供含有包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的外源多核苷酸片段的宿主細(xì)胞。
該外源多核苷酸片段可為以上描述的任何片段。宿主細(xì)胞可為任何形式，如原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、細(xì)胞系或作為多細(xì)胞生物一部分的細(xì)胞(例如轉(zhuǎn)基因生物的細(xì)胞)。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包含具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的醫(yī)療裝置的醫(yī)療設(shè)備。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供包括過表達(dá)類肝素酶催化活性的細(xì)胞的類肝素酶過量表達(dá)系統(tǒng)。
根據(jù)描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的進(jìn)一步特征，本發(fā)明提供鑒定鋪展的染色體中包含人類肝素酶基因的染色體區(qū)的方法，包括以下步驟(a)將鋪展的染色體與編碼類肝素酶的標(biāo)記多核苷酸探針雜交；(b)洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針；及(c)搜尋與所述雜交的標(biāo)記多核苷酸探針相關(guān)的信號，其中探測到信號指示包含人類肝素酶基因的染色體區(qū)。
本發(fā)明能用于開發(fā)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、炎癥和自身免疫的新藥。對編碼類肝素酶的hpa基因的鑒定使在異源表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組酶成為可能。
附圖簡述本發(fā)明僅通過舉例的方式，參考附圖在此描述，其中

圖1顯示hpa cDNA的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。在EST(表達(dá)序列標(biāo)志)和PCR擴(kuò)增的cDNA(反轉(zhuǎn)錄RNA)之間，存在位于799位的單核苷酸差異(A改為T)，此差異及其導(dǎo)致的氨基酸替代(Tyr改為Phe)在各取代單元的上下標(biāo)出。半胱氨酸殘基和聚腺苷酸化共有序列下劃線標(biāo)出。星號表示終止密碼子TGA。
圖2表示以pFhpa2病毒感染的High Five細(xì)胞的溶解產(chǎn)物降解可溶的硫酸鹽標(biāo)記HSPG底物。pFhpa2病毒(●)或?qū)φ誴F2病毒(□)感染的High Five細(xì)胞的溶解產(chǎn)物與硫酸鹽標(biāo)記的ECM衍生的可溶性HSPG(峰I)溫育(18h，37℃)。將溫育培養(yǎng)基隨后加入到Sepharose6B上進(jìn)行凝膠過濾。低分子量HS降解片段(峰II)僅在與pFhpa2感染的細(xì)胞溫育時(shí)產(chǎn)生，而pF2感染的細(xì)胞的溶解產(chǎn)物不造成HSPG底物(◇)的降解。
圖3a-b表示可溶性的硫酸鹽標(biāo)記HSPG底物被pFhpa2和pFhpa4感染細(xì)胞的培養(yǎng)基降解。將pFhpa2(3a)或pFhpa4(3b)病毒(●)或?qū)φ詹《?□)感染的High Five細(xì)胞的培養(yǎng)基與硫酸鹽標(biāo)記的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)溫育(18h，37℃)。溫育培養(yǎng)基隨后加至Sepharose 6B上進(jìn)行凝膠過濾。低分子量HS降解片段(峰II)僅在與含hpa基因的病毒溫育時(shí)產(chǎn)生。對照病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)基不降解HSPG底物。
圖4表示pFhpa2感染的細(xì)胞表達(dá)的類肝素酶活性的大小分級分離。將pFhpa2感染的High Five細(xì)胞的培養(yǎng)基加到50kDa的截留膜上。在高分子量(＞50kDa)部分(●)而非低分子量(＜50kDa＝(○)部分中發(fā)現(xiàn)有類肝素酶活性(峰I底物(◇)轉(zhuǎn)換為峰II HS降解片段)。
圖5a-b表示肝素對pFhpa2和pFhpa4感染的High Five細(xì)胞表達(dá)的類肝素酶活性的影響。將pFhpa2(5a)和pFhpa4(5b)感染的HighFive細(xì)胞的培養(yǎng)基與硫酸鹽標(biāo)記的ECM衍生的可溶HSPG(峰I，◇)在缺乏(●)或存在(△)10μg/ml肝素時(shí)溫育(18h，37℃)。在肝素-類肝素酶活性的一種強(qiáng)有力抑制劑存在時(shí)完全不產(chǎn)生低分子量HS降解片段(6，7)。
圖6a-b表示病毒感染的High Five和Sf21細(xì)胞對硫酸鹽標(biāo)記的完整ECM的降解。將High Five(6a)和Sf21(6b)細(xì)胞鋪在硫酸鹽標(biāo)記的ECM之上，以pFhpa4(●)或?qū)φ誴F1(□)病毒感染(48h，28℃)。將對照未感染Sf21細(xì)胞(R)同樣鋪在標(biāo)記的ECM上。培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.0-6.2，37℃溫育24小時(shí)。通過在Sepharose 6B上凝膠過濾，分析釋放到溫育培養(yǎng)基中的硫酸鹽標(biāo)記物質(zhì)。僅有含hpa的病毒感染的細(xì)胞可產(chǎn)生HS降解片段。
圖7a-b表示病毒感染的細(xì)胞對硫酸鹽標(biāo)記的完整ECM的降解。將High Five(7a)和Sf21(7b)細(xì)胞鋪在硫酸鹽標(biāo)記的ECM上，以pFhpa4(●)或?qū)φ誴F1(□)病毒感染(48h，28℃)。對照未感染的Sf21細(xì)胞(R)也鋪在標(biāo)記的ECM上。培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.0-6.2，28℃溫育48小時(shí)。通過在Sepharose 6B上進(jìn)行凝膠過濾，分析釋放到溫育培養(yǎng)基中的硫酸鹽標(biāo)記的降解片段。僅有含hpa的病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生HS降解片段。
圖8a-b表示pFhpa4感染細(xì)胞的培養(yǎng)基對硫酸鹽標(biāo)記的完整ECM的降解。將pFhpa4(●)或?qū)φ誴F1(□)病毒感染的High Five(8a)和Sf21(8b)細(xì)胞的培養(yǎng)基與完整的硫酸鹽標(biāo)記ECM溫育(48h，30℃，pH6.0)。還將ECM與對照未感染Sf21細(xì)胞(R)的培養(yǎng)基溫育。對釋放到反應(yīng)混合物中的硫酸鹽標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行凝膠過濾分析。僅在pFhpa4感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中測得類肝素酶活性。
圖9a-b表示肝素對pFhpa4感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中的類肝素酶活性的影響。在缺乏(●)或存在(V)10μg/ml肝素時(shí)，將硫酸鹽標(biāo)記的ECM與pFhpa4感染的High Five(9a)和Sf21(9b)細(xì)胞的培養(yǎng)基溫育(24h，37℃，pH6.0)。將釋放到溫育培養(yǎng)基中的硫酸鹽標(biāo)記物質(zhì)在Sepharose 6B上凝膠過濾。肝素存在時(shí)，類肝素酶活性(峰II HS降解片段的產(chǎn)生)被完全抑制。
圖10a-b表示在肝素-Sepharose上純化重組類肝素酶。將pFhpa4病毒感染的Sf21細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行肝素-Sepharose層析。用NaCl梯度0.35-2M(◇)進(jìn)行各級分的洗脫。圖10a(●)表示洗脫級分中的類肝素酶活性。對級分15-28進(jìn)行15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈，而后硝酸銀染色。證明在級分19-24中的主蛋白帶(MW～63,000)與類肝素酶活性之間有相關(guān)性。
圖11a-b表示在Superdex 75凝膠過濾柱上純化重組類肝素酶。將從肝素-Sepharose上洗脫的活性級分(圖10a)集中，濃縮，并加到Superdex 75 FPLC柱上。收集各級分并檢查各級分的等分樣品的類肝素酶活性(C，圖11a)，由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳而后硝酸銀染色分析(圖11b)?？梢娂壏?-7中的主蛋白帶(MW～63,000)的存在與類肝素酶活性間有相關(guān)性。
圖12a-e表示對來自人胚組織(12a)、人胚外組織(12b)和不同起源的細(xì)胞系(12c-e)的總RNA進(jìn)行RT-PCR，示hpa基因的表達(dá)。使用hpa特異性引物(I)、GAPDH持家基因的引物(II)和無逆轉(zhuǎn)錄酶的對照反應(yīng)的RT-PCR產(chǎn)物，證明RNA樣品(III)中無基因組DNA或其它污染。M-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)VI(Boehringer Mannheim)。12a泳道1-嗜中性細(xì)胞(成熟的)，泳道2-肌肉，泳道3-胸腺，泳道4-心臟，泳道5-腎上腺。12b泳道1-腎，泳道2-胎盤(8周)，泳道3-胎盤(11周)，泳道4-7-痣(完全水泡狀脂塊)，泳道8-細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(新分離)，泳道9-細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(體外1.5h)，泳道10-細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(體外6h)，泳道11-細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(體外18h)，泳道12-細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(體外48h)。12c泳道1-JAR膀胱細(xì)胞系，泳道2-NCITT睪丸腫瘤細(xì)胞系，泳道3-SW-480人肝癌細(xì)胞系，泳道4-HTR(SV40轉(zhuǎn)化的細(xì)胞滋養(yǎng)層)，泳道5-HPTLP-I肝細(xì)胞癌細(xì)胞系，泳道6-EJ-28膀胱癌細(xì)胞系。12d泳道1-SK-hep-1人肝癌細(xì)胞系，泳道2-DAMI人巨核細(xì)胞系，泳道3-DAMI細(xì)胞系+PMA，泳道4-CHRF細(xì)胞系+PMA，泳道5-CHRF細(xì)胞系。12e泳道1-ABAE牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，泳道2-1063人卵巢細(xì)胞系，泳道3-人乳腺癌MDA435細(xì)胞系，泳道4-人乳腺癌MDA231細(xì)胞系。
圖13表示人hpa的核苷酸序列與小鼠EST cDNA片段(SEQ ID NO12)的比較，小鼠EST cDNA片段與人hpa的3′末端(起始于SEQ IDNO9的核苷酸1066)80％同源。在排列的終止密碼子下劃線。
圖14表示hpa基因的染色體定位。以hpa特異引物擴(kuò)增后，將從體細(xì)胞雜合體衍生的DNA的PCR產(chǎn)物與倉鼠、小鼠和人基因組DNA的PCR產(chǎn)物通過0.7％瓊脂糖凝膠分離。泳道1-BstEII消化的LambdaDNA，泳道2-無DNA對照，泳道3-29，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道3-5-人、小鼠和倉鼠各自的基因組DNA。泳道6-29，分別表示染色體1-22和X與Y的人單染色體體細(xì)胞雜合體。泳道30-BstEII消化的Lambda DNA。僅在泳道5和9觀察到約2.8kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，分別代表人基因組DNA和衍生自攜人染色體4的細(xì)胞雜合體的DNA。這些結(jié)果證明hpa基因位于人染色體4上。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸，在下文中可互換地稱作hpa、hpa cDNA或hpa基因，還涉及包括該多核苷酸的載體，表達(dá)類肝素酶的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案前，必須了解本發(fā)明的應(yīng)用不限于下文說明書或附圖所示的構(gòu)建細(xì)節(jié)和各成分的排列。本發(fā)明能用于其它實(shí)施方案或以不同方式實(shí)施。而且，必須了解在此所用的術(shù)語和專門名詞是為描述目的而不應(yīng)認(rèn)作限制。
本發(fā)明能用于開發(fā)各種疾病的治療方法，開發(fā)這些疾病的診斷方法以及為基礎(chǔ)研究特別是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域提供新工具。
特別地，本發(fā)明可用于開發(fā)抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、炎癥和自身免疫的新藥物。對編碼類肝素酶的hpa基因的鑒定使在異源表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組酶成為可能。
進(jìn)一步地，本發(fā)明能用于調(diào)節(jié)肝素結(jié)合性生長因子的生物利用率，針對肝素結(jié)合性生長因子(例如bFGF，VEGF)和細(xì)胞因子(IL-8)的細(xì)胞反應(yīng)，細(xì)胞與血漿脂蛋白的相互作用，對病毒、原生動(dòng)物和一些細(xì)菌感染的細(xì)胞易感性，和神經(jīng)變性斑的分解。因此重組類肝素酶是創(chuàng)傷愈合、血管發(fā)生、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、神經(jīng)變性疾病(例如Genstmann-Straussler綜合癥，早老性癡呆癥，Scrape)，和某些病毒、細(xì)菌和原生動(dòng)物感染的潛在治療物。重組類肝素酶可作為魚精蛋白的潛在替代物用于中和血漿肝素。
如在此所用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”包括實(shí)質(zhì)性地抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)一種疾病的進(jìn)展，實(shí)質(zhì)性地改善疾病或狀況的臨床癥狀，或?qū)嵸|(zhì)性地阻止疾病或狀況的臨床癥狀的出現(xiàn)。因此“調(diào)節(jié)子”包括可調(diào)節(jié)疾病或狀況的因子。對病毒、原生動(dòng)物和細(xì)菌感染的調(diào)節(jié)包括實(shí)質(zhì)性地中斷、阻止或減少任何病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物活性和/或病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物生命周期的階段，或者減少或阻止病毒、細(xì)菌或原生動(dòng)物對目標(biāo)，如人或低等動(dòng)物的感染的任何作用。
如在此所用的，術(shù)語“創(chuàng)傷”包括對目標(biāo)軀體的任何部分的任何傷害，包括但不僅限于急性疾病，如在紫外輻射如日灼下過度暴露造成的灼傷、化學(xué)灼傷、放射灼傷、熱灼傷，因勞動(dòng)和分娩而對身體組織如會(huì)陰造成的傷害，包括在醫(yī)學(xué)方法如外陰切開術(shù)過程中持續(xù)的損傷，外傷誘導(dǎo)的損傷包括切除，在汽車和其它機(jī)械事故中持續(xù)的損傷，子彈、刀片及其它武器所致的損傷，和外科術(shù)后損傷，以及慢性疾病如褥瘡，涉及糖尿病和循環(huán)不良的疾病，和所有類型的痤瘡，等。
針對重組酶產(chǎn)生的抗類肝素酶抗體，可用于活組織檢查標(biāo)本、血漿樣品和體液中微轉(zhuǎn)移、自身免疫損害和腎衰竭的免疫檢測和診斷中。這種抗體也可用作類肝素酶活性的中和劑。
在此報(bào)導(dǎo)對編碼類肝素酶的人hpa基因的克隆和通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)重組類肝素酶。這是首次克隆的哺乳動(dòng)物類肝素酶基因。
對從人肝癌細(xì)胞分離的類肝素酶的純化制品進(jìn)行胰酶消化和微量測序。
利用公開的YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)序列篩選EST數(shù)據(jù)庫，尋求相應(yīng)的DNA序列的同源物。鑒定到兩個(gè)緊密相關(guān)的EST序列并發(fā)現(xiàn)二者相同。
兩克隆都包括1020bp的插入片段，此插入片段包括973bp的開放閱讀框及隨后的27bp的3′非翻譯區(qū)和聚腺苷酸尾，但未鑒定到翻譯起始位點(diǎn)。
通過對來自胎盤Marathon RACE cDNA復(fù)合體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用根據(jù)EST克隆序列和復(fù)合體的接頭選擇的引物，克隆缺失的5′末端。
獲得900bp的PCR片段，與鑒定到的3′編碼EST克隆部分重疊。連接的cDNA片段(hpa)長1721bp(SEQ ID NO9)，包括編碼具有如圖1和SEQ ID NO11所示543個(gè)氨基酸、計(jì)算分子量為61192道爾頓的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框。
觀察到EST克隆和PCR擴(kuò)增的cDNA之間在799位有一個(gè)單核苷酸差異(A→T)。此區(qū)別導(dǎo)致單個(gè)氨基酸取代(Tyr改為Phe)(圖1)。此外，發(fā)表的EST序列包括一個(gè)未鑒定的核苷酸，對兩個(gè)EST克隆的DNA測序?qū)⒃撐磋b定核苷酸分辨為兩個(gè)核苷酸(分別為SEQ ID NO9中1630和1631位的G和C)。
體外實(shí)驗(yàn)中hpa基因產(chǎn)物催化硫酸乙酰肝素降解的能力通過運(yùn)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完整的開放閱讀框而檢測。
已證明含hpa基因的病毒感染的細(xì)胞的提取物和條件培養(yǎng)基對可溶性的ECM衍生HSPG和完整ECM均有高水平的硫酸乙酰肝素降解活性，此活性被肝素抑制，而被不含hpa基因的類似構(gòu)建體感染的細(xì)胞或非感染細(xì)胞則無此活性。
用RT-PCR檢測hpa RNA在不同組織和細(xì)胞系中的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)其僅在已知具類肝素酶活性的組織和細(xì)胞中表達(dá)。
使用Marathon RACE，通過PCR擴(kuò)增，從人SK-hep1細(xì)胞系克隆延伸的5′序列。將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)裝配起來。裝配的序列包括一個(gè)開放閱讀框，SEQ ID NO13和15，它編碼如SEQ ID NO14和15所示的592個(gè)氨基酸的多肽，計(jì)算分子量為66407道爾頓。此開放閱讀框顯示指導(dǎo)催化活性的類肝素酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。Western印跡分析中用抗類肝素酶抗體可檢測表達(dá)的類肝素酶。
運(yùn)用一系列單染色體的人/CHO和人/小鼠體細(xì)胞雜合體將人類肝素酶基因定位在人染色體4上。因此新分離的類肝素酶序列能用于鑒定鋪展的染色體中含人類肝素酶基因的染色體區(qū)域。
因此，本發(fā)明提供包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段(單鏈或雙鏈DNA或RNA)術(shù)語“類肝素酶催化活性”或與其相當(dāng)?shù)男g(shù)語“類肝素酶活性”都指對乙酰肝素或硫酸乙酰肝素蛋白多糖底物特異的哺乳動(dòng)物內(nèi)切糖苷酶水解活性，這種活性與通過β-消除的方法降解肝素或硫酸乙酰肝素的細(xì)菌酶(肝素酶I，II和III)的活性相反(37)。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸片段包括SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869，它們編碼完整的人類肝素酶。
但本發(fā)明的范圍不僅限于人類肝素酶，因其是對編碼任何哺乳動(dòng)物類肝素酶的開放閱讀框(ORF)的首次公開。運(yùn)用hpa cDNA、其部分或根據(jù)其序列設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定到包括來自其它哺乳動(dòng)物物種的同源序列的基因組和/或cDNA克隆。
因此本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括能與hpa cDNA，尤其是與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交(嚴(yán)格或允許雜交條件下的堿基配對，參見如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis.T.(1989)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約)的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
事實(shí)上，編碼具類肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸序列和與SEQID NO9或13至少60％同源、優(yōu)選至少70％同源、更優(yōu)選至少80％同源、最優(yōu)選至少90％同源的任何多核苷酸序列均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸片段可包括SEQ ID NO9或13的任何部分。例如，它可包括SEQ ID NO9的核苷酸63-721，這是一個(gè)新序列。它可包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的SEQ ID NO9或13的任何區(qū)段。
當(dāng)在此和以下的權(quán)利要求部分應(yīng)用術(shù)語“編碼具類肝素酶催化活性的多肽”時(shí)，指的是能夠指導(dǎo)在例如ECM和細(xì)胞表面相關(guān)HS的降解中有催化活性[如其活性所需，也可以是在翻譯后修飾(包括但不限于蛋白水解，例如除去信號肽和蛋白原或前蛋白原序列)、甲硫氨酸修飾、糖基化、烷基化(如甲基化)、?；群笥写嘶钚註的多肽的合成。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，此多核苷酸片段編碼的多肽包括SEQID NO10或14中所示的氨基酸序列或其功能性部分，即具類肝素酶催化活性的部分。
編碼具類肝素酶活性的多肽的任何多核苷酸片段都在本發(fā)明范圍內(nèi)。因此，該多肽可為SEQ ID NO10或14所示氨基酸序列或其功能性部分的等位變體、物種變體和/或誘導(dǎo)變體。
事實(shí)上，與SEQ ID NO10或14至少60％同源、優(yōu)選至少70％同源、更優(yōu)選至少80％同源、最優(yōu)選至少90％同源的任何編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸序列，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還提供單鏈多核苷酸片段，此片段包括與編碼具如上述類肝素酶活性之多肽的多核苷酸鏈的至少一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列。術(shù)語“互補(bǔ)”在此用于指堿基配對的能力。
此單鏈多核苷酸片段可為DNA或RNA，甚至包括核苷酸類似物(例如硫代核苷酸)，它可為合成的寡核苷酸或由轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞制備，它可為仍能提供特異堿基配對的任何希望的長度(例如長8或10個(gè)核苷酸，優(yōu)選更多核苷酸)，且它可包括不妨礙堿基配對的錯(cuò)配序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的載體。
載體可為任何類型。它可為感染細(xì)菌的噬菌體或感染真核細(xì)胞的病毒。它也可為質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、桿?；蛉斯と旧w。編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列可包括上述的任何多核苷酸片段。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括編碼具類肝素酶催化活性之多肽的外源多核苷酸片段的宿主細(xì)胞。
外源多核苷酸片段可為以上描述的任何片段。宿主細(xì)胞可為任何類型。它可為原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、細(xì)胞系或作為生物體一部分的細(xì)胞。外源多核苷酸片段可永久或瞬時(shí)存在于細(xì)胞中。換而言之，按穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞均在本發(fā)明范圍內(nèi)。在此運(yùn)用的術(shù)語“外源的”指多核苷酸片段是從外部引入細(xì)胞的。其中多核苷酸片段可以任何挎貝數(shù)單個(gè)存在，它可整合到一或多個(gè)染色體的任何部位或作為染色體外物質(zhì)存在。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括過量表達(dá)類肝素酶催化活性的細(xì)胞的類肝素酶過量表達(dá)系統(tǒng)。細(xì)胞可為被包括編碼具類肝素酶活性之多肽的多核苷酸序列和指導(dǎo)類肝素酶過量表達(dá)的合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列的任何適當(dāng)載體瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。過量表達(dá)細(xì)胞也可以是在表達(dá)細(xì)胞的內(nèi)源類肝素酶基因上游插入啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列(例如通過同源重組)而得到的細(xì)胞，此插入將指導(dǎo)從內(nèi)源基因的過量表達(dá)。在以下說明書和權(quán)利要求中所用的術(shù)語“過量表達(dá)”指在其它條件相同下表達(dá)水平高于給定細(xì)胞通常具有的表達(dá)基礎(chǔ)水平。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
重組蛋白可通過任何常規(guī)的蛋白純化方法純化至幾乎均質(zhì)和/或與添加物混合。重組蛋白可運(yùn)用以上描述的任何細(xì)胞制備。重組蛋白可以任何形式存在可為結(jié)晶形式、脫水干粉形式或存在于溶液中。重組蛋白可用于獲得純類肝素酶，純類肝素酶又可用于產(chǎn)生單克隆或多克隆的抗類肝素酶抗體，并作為抗類肝素酶抑制劑或藥物篩選試驗(yàn)或系統(tǒng)中的篩選活性組分。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
局部給藥的制劑可包括，但不限于洗液，藥膏，凝膠劑，膏狀物，栓劑，滴劑，液體，噴霧劑和粉末。常規(guī)的水性、粉狀或油基藥學(xué)載體、增稠劑及其它是必要的或所希望的。外被的保險(xiǎn)套、斯坦特固定膜、活動(dòng)的墊及其它醫(yī)療裝置也有用。事實(shí)上，本發(fā)明的范圍包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的任何醫(yī)療設(shè)備，如醫(yī)療裝置。
口服的組合物包括粉末或顆粒，水或非水介質(zhì)中的懸浮液或溶液，粉袋、膠囊或片劑。增稠劑、稀釋液、調(diào)味品、分散輔助劑、乳化劑或粘合劑也可能合乎需要。
用于胃腸外給藥的制劑可包括，但不限于無菌水溶液，其中還可包含緩沖液、稀釋液和其它合適添加物。
所用劑量取決于待治療疾病的嚴(yán)重性和反應(yīng)性，但通常為每天1劑或更多，療程為幾天至幾個(gè)月或者直到治療有效或病狀成功減低。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能很容易確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。
本發(fā)明還提供鑒定鋪展的染色體上包含人類肝素酶基因的染色體區(qū)的方法。該方法包括以下方法步驟，其中第一步將鋪展的染色體(細(xì)胞間期或中期)與編碼類肝素酶的標(biāo)記多核苷酸探針雜交。此標(biāo)記優(yōu)選熒光標(biāo)記。第二步中，洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針。最后查找與雜交的標(biāo)記多核苷酸探針相關(guān)的信號，其中探測到的信號指示包含人類肝素酶基因的染色體區(qū)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會(huì)懂得如何在合適的標(biāo)記反應(yīng)中運(yùn)用在此公開的序列以及如何運(yùn)用標(biāo)記的探針在原位雜交中探測包含人類肝素酶基因的染色體區(qū)。
現(xiàn)參照下述實(shí)施例，這些實(shí)施例及上述說明書均以非限制方式一起闡明本發(fā)明。
實(shí)施例以下方法和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)在隨后的實(shí)施例中引用。
從人肝癌細(xì)胞系和人胎盤純化類肝素酶并進(jìn)行特性鑒定選擇人肝癌細(xì)胞系(SK-hep-1)作為純化人腫瘤衍生的類肝素酶的來源?；旧先缡谟鐵uks的美國專利No.5,362,641中所描述的進(jìn)行純化，所述的專利全文收入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。簡要的，懸浮培養(yǎng)500升5×1011細(xì)胞，類肝素酶通過應(yīng)用以下步驟提純240,000倍(i)在pH6.0，NaCl梯度0.3-1.4M進(jìn)行陽離子交換(CM-Sephadex)層析，(ii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時(shí)，NaCl梯度0.3-1.1M，進(jìn)行陽離子交換(CM-Sephadex)層析；(iii)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時(shí)，NaCl梯度0.35-1.1M，進(jìn)行肝素-Sepharose層析；(iv)在pH6.0，包含0.1％CHAPS和1M NaCl的緩沖液中進(jìn)行Con A-瓊脂糖凝膠層析，用0.25M α-甲基甘露糖苷洗脫；和(v)在pH7.4，0.1％CHAPS存在時(shí)，用NaCl梯度0.25-1M進(jìn)行HPLC陽離子交換(Mono-S)層析。
合并活性級分，TCA沉淀，對沉淀物進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和/或胰酶消化和反相HPLC。純化蛋白的胰酶消化肽通過反向HPLC(C8柱)分離，對均質(zhì)的峰進(jìn)行氨基酸序列分析。
對純化的酶進(jìn)行反相HPLC，并用氨基酸順序分析儀(AppliedBiosystems)進(jìn)行N-末端氨基酸測序。
細(xì)胞如前述由牛眼建立牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞(BCEC)的培養(yǎng)物(19，38)。培養(yǎng)物原代維持在補(bǔ)充10％新生小牛血清和5％FCS的DMEM(1g葡萄糖/升)中。活躍細(xì)胞生長階段，每隔一天加bFGF(1ng/ml)(13，14)。
鋪有ECM的皿的制備將BCEC(2-50代)以2×105細(xì)胞/毫升的初始密度鋪在4孔板中，在無硫酸鹽的Fisher培養(yǎng)基加5％葡聚糖T-40中培養(yǎng)12天。在接種后第一天和第5天加入Na235SO4(25μCi/ml)，將培養(yǎng)物與標(biāo)記物溫育，不換培養(yǎng)基。用含0.5％Triton X-100和20mMNH4OH的PBS溶解(5分鐘，室溫)細(xì)胞層，隨后PBS洗4次，暴露內(nèi)皮下ECM。ECM保持完整，無細(xì)胞碎片，并牢固附著于組織培養(yǎng)皿的全部區(qū)域上(19，22)。
為制備可溶的硫酸鹽標(biāo)記的蛋白多糖(峰I物質(zhì))，用胰酶消化ECM(胰酶25μg/ml，6h，37℃)，消化液通過反透析濃縮，將濃縮物質(zhì)加到Sepharose 6B凝膠過濾柱上。收集得到的高分子量物質(zhì)(Kav＜0.2，峰I)。結(jié)果顯示多于80％的標(biāo)記物質(zhì)由硫酸乙酰肝素蛋白多糖組成(11，39)。
類肝素酶活性將細(xì)胞(1×106/35mm培養(yǎng)皿)、細(xì)胞溶解產(chǎn)物或條件培養(yǎng)基在20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.2)存在時(shí)于35S標(biāo)記的ECM上溫育(18h，37℃)。也將細(xì)胞溶解產(chǎn)物和條件培養(yǎng)基與硫酸鹽標(biāo)記的峰I物質(zhì)(10-20μl)溫育。收集溫育培養(yǎng)基，離心(18000×g，4℃，3分鐘)，在Sepharose CL-6B柱(0.9×30cm)上凝膠過濾分析硫酸鹽標(biāo)記的物質(zhì)。用PBS洗脫級分(0.2ml)，流速為5ml/h，用Bio-fluor液閃計(jì)數(shù)放射性。蘭色葡聚糖表示已占體積(Vo)，酚紅表示總內(nèi)含體積(Vt)。后者與自由硫酸根共遷移(7，11，23)。HS側(cè)鏈的裂解片段在0.5＜Kav＜0.8(峰II)從Sepharose 6B洗脫(7，11，23)。在Vo后洗脫(Kav＜0.2，峰I)由胰酶從ECM釋放的近乎完整的HSPG，以及與PBS單獨(dú)溫育時(shí)較低程度釋放的HSPG。加到柱上的標(biāo)記物質(zhì)的回收在不同實(shí)驗(yàn)中范圍從85％-95％(11)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次，洗脫位置(Kav值)變化不超過+/-15％。
hpa cDNA的克隆從I.M.A.G.E協(xié)會(huì)(2130 Memorial ParkwaySW，Hunstville，AL 35801)得到cDNA克隆257548和260138。cDNA最初克隆到質(zhì)粒載體pT3T7D-Pac的EcoR I和Not I克隆位點(diǎn)。盡管這兩個(gè)克隆被報(bào)導(dǎo)略有區(qū)別，但DNA序列分析測定證明它們彼此相同。Marathon RACE(cDNA末端的快速擴(kuò)增)人胎盤(多聚腺苷酸)cDNA復(fù)合體由Tel Aviv大學(xué)Yossi Shiloh教授贈(zèng)送。此復(fù)合體不含載體，包括反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段，所述片段的兩末端均連接了雙鏈和部分單鏈的銜接子。所用特異復(fù)合體的結(jié)構(gòu)在參考文獻(xiàn)39a中描述。
根據(jù)Clontech實(shí)驗(yàn)室提供的方法，進(jìn)行hp3 PCR片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增所用的模板是來自以上復(fù)合體的樣品。擴(kuò)增所用的引物為第一步5′-引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO1；3′-引物HPL2295′-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO2。
第二步嵌套5′-引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3′，SEQID NO3；嵌套3′-引物HPL1715′-GCATCTTAGCCG TCTTTC TTCG-3′，SEQ ID NO4。HPL229和HPL171是根據(jù)EST克隆的序列選擇的。它們各自包括SEQ ID NO9的核苷酸933-956和876-897。
PCR程序?yàn)?4℃4分鐘，而后94℃40秒、62℃1分鐘、72℃2.5分鐘30個(gè)循環(huán)。用Expand High Fidelity(Boehringer Mannheim)進(jìn)行擴(kuò)增。將所得約900bp的hp3 PCR產(chǎn)物用Bfr I和PvuII消化。用EcoR I消化克隆257548(phpa1)，末端補(bǔ)平，然后Bfr I進(jìn)一步消化。此后將hp3 PCR產(chǎn)物的PvuII-Bfr I片段克隆至phpa1克隆的平端-Bfr I端，得到完整cDNA克隆在pT3T7-pac中的載體，稱為phpa2。
DNA測序序列測定用載體特異性和基因特異性引物，使用自動(dòng)DNA測序儀(Applied Biosystems 373A型)進(jìn)行。每個(gè)核苷酸讀自至少兩個(gè)獨(dú)立的引物。
序列的計(jì)算機(jī)分析運(yùn)用Blast網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索分析序列相似性。對DNA和蛋白序列的序列分析和對比用Wisconsin大學(xué)Genetic Computer Group(GCG)開發(fā)的DNA序列分析軟件包完成。
RT-PCR用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)根據(jù)生產(chǎn)制造商指導(dǎo)制備RNA。取1.25μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用MuMLV反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL)和Oligo(dT)15引物，SEQ ID NO5，(Promega)。用Taq聚合酶(Promega)進(jìn)行所得第一鏈cDNA的擴(kuò)增。運(yùn)用以下引物HPU-3555′-TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC-3′，SEQ ID NO6，SEQ ID NO9或11中的核苷酸372-394。HPL-2295’-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3′，SEQ ID NO7，SEQ ID NO9或11中的核苷酸933-956。PCR程序94℃4分鐘，然后94℃40秒、62℃1分鐘、72℃1分鐘30個(gè)循環(huán)。
重組類肝素酶在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)將細(xì)胞、High Five和Sf21昆蟲細(xì)胞系在SF900II-SFM培養(yǎng)基(Gibco BRL)中作為單層培養(yǎng)物維持培養(yǎng)。
重組的桿狀病毒用Bac to Bac系統(tǒng)(GibcoBRL)構(gòu)建包含hpa基因的重組病毒。轉(zhuǎn)移載體pFastBac用Sal I和Not I消化，并與XhoI和Not I消化的phpa2的1.7kb片段連接。所得質(zhì)粒稱為pFasthpa2。重復(fù)制備命名為pFasthpa4的相同質(zhì)粒，二者獨(dú)立地應(yīng)用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中。根據(jù)生產(chǎn)制造商的說明，用pFasthpa2、pFasthpa4和pFastBac產(chǎn)生重組桿粒。后者作為陰性對照。轉(zhuǎn)染重組桿粒DNA到Sf21昆蟲細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5天收獲重組病毒并用其感染T-25瓶中的3×106個(gè)High Five昆蟲細(xì)胞。感染后2-3天后收獲細(xì)胞。將4×106個(gè)細(xì)胞離心，重懸于包含20mM磷酸檸檬酸鹽緩沖液、50mMNaCl的反應(yīng)緩沖液中。細(xì)胞經(jīng)過三個(gè)凍融循環(huán)，溶解產(chǎn)物保存在-80℃。條件培養(yǎng)基保存在4℃。
重組類肝素酶的部分純化通過肝素-Sepharose柱層析，隨后通過Superdex 75柱凝膠過濾進(jìn)行重組類肝素酶的部分純化。對pFhpa4病毒感染的Sf21細(xì)胞的培養(yǎng)基(150ml)進(jìn)行肝素-Sepharose層析。在含0.1％CHAPS和1mM DTT的10mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)存在時(shí)用0.35-2M NaCl梯度洗脫1ml級分。檢測每級分25μl樣品的類肝素酶活性。類肝素酶活性在0.65-1.1M NaCl范圍洗脫(級分18-26，圖10a)。對每級分中5μl進(jìn)行15％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色。合并從肝素-Sepharose洗脫的活性級分(圖10a)并在YM3截留膜上濃縮(X6)。將0.5ml的濃縮物質(zhì)加到30ml Superdex 75 FPLC柱上，該柱用含0.8M NaCl、1mM DTT和0.1％CHAPS的10mM乙酸鈉緩沖液(pH5.0)平衡過。以流速0.75ml/分鐘收集各級分(0.56ml)。從每級分中取等分檢測類肝素酶活性，并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色(圖11b)。
實(shí)施例1
hpa基因的克隆將從人肝癌細(xì)胞(SK-hep1)分離的類肝素酶的純化級分進(jìn)行胰酶消化和微量測序。篩選EST(表達(dá)序列標(biāo)記)數(shù)據(jù)庫以尋找相應(yīng)于所獲肽的DNA序列的同源物。兩個(gè)EST序列(登記號N41349和N45367)中包含編碼肽YGPDVGQPR(SEQ ID NO8)的DNA序列。這兩個(gè)序列衍生自從8-9周胎盤的cDNA文庫(Soares)制備的克隆257548和260138(I.M.A.G.E.協(xié)會(huì))。發(fā)現(xiàn)兩個(gè)克隆是相同的，它們包括1020bp的一個(gè)插入片段，此插入片段包含973bp的開放閱讀框(ORF)及隨后的27bp 3′非翻譯區(qū)和聚腺苷酸尾。在這些克隆的5′末端未鑒定到翻譯起始位點(diǎn)(AUG)。
通過對胎盤Marathon RACE cDNA復(fù)合體的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行對缺失的5′末端的克隆。獲得900bp的片段(命定為hp3)，它與已鑒定的3′編碼EST克隆部分重疊。
連接的cDNA片段長1721bp(SEQ ID NO9)，它包括編碼543個(gè)氨基酸、計(jì)算分子量為61 192道爾頓的多肽(SEQ ID NO10)的開放閱讀框，如圖1和SEQ ID NO11所示。克隆257548和260138中包括的部分cDNA插入片段的3′末端起始于SEQ ID NO9和圖1的核苷酸G721。
如圖1中進(jìn)一步顯示，在EST克隆和PCR擴(kuò)增序列之間有單個(gè)序列差異，導(dǎo)致EST中的Tyr246替換為擴(kuò)增的cDNA中的Phe246。從兩個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)PCR擴(kuò)增的cDNA片段的核苷酸序列。該新基因命名為hpa。
如上所述，EST克隆257548和260138中所含的部分cDNA插入片段的3′末端起始于hpa(SEQ ID NO9)的核苷酸721。運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬分析hpa cDNA形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)、如包括在721位附近的核苷酸序列的莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的能力。研究發(fā)現(xiàn)，在核苷酸698-724(SEQ IDNO9)之間很可能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。此外，hpa基因的5′末端區(qū)具高GC含量的特點(diǎn)，GC含量高達(dá)70％，而在3′區(qū)，GC含量僅為約40％。這些發(fā)現(xiàn)可解釋EST克隆的不成熟終止及因此引起的5′末端缺失。
為檢測hpa基因產(chǎn)物在體外試驗(yàn)中催化硫酸乙酰肝素降解的能力，用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)完整的開放閱讀框。包含hpa基因的病毒所感染的細(xì)胞的提取物表現(xiàn)有高水平的硫酸乙酰肝素降解活性，而在以不含hpa基因的類似構(gòu)建體感染的細(xì)胞及未感染細(xì)胞的提取物中則不含此活性。這些結(jié)果在隨后的實(shí)施例中進(jìn)一步說明。
實(shí)施例2可溶的ECM衍生的HSPG的降解以包含pFasthpa質(zhì)粒的重組桿狀病毒或含無插入片段的質(zhì)粒的對照病毒感染High Five細(xì)胞的單層培養(yǎng)物(72h，28℃)。收獲細(xì)胞，在類肝素酶反應(yīng)緩沖液中經(jīng)過三個(gè)凍融循環(huán)使之裂解。隨后將細(xì)胞裂解物與硫酸鹽標(biāo)記的ECM衍生HSPG(峰I)溫育(18h，37℃)，再對反應(yīng)混和物進(jìn)行凝膠過濾分析(Sepharose 6B)。
如圖2所示，底物本身包括在Vo之后洗脫的幾乎所有高分子量(Mr)物質(zhì)(峰I，級分5-20，Kav＜0.35)。當(dāng)HSPG底物與以對照病毒感染的細(xì)胞的裂解物溫育時(shí)，得到相似的洗脫圖。與之形成對照，HSPG底物與以包含hpa的病毒感染的細(xì)胞的裂解物溫育，導(dǎo)致高分子量底物完全轉(zhuǎn)換為低分子量的標(biāo)記降解片段(峰II，級分22-35，0.5＜Kav＜0.75)。
在峰II洗脫的片段顯示是硫酸乙酰肝素的降解產(chǎn)物，因?yàn)樗鼈?i)比用堿性氫硼化物或木瓜蛋白酶處理而從ECM釋放的完整硫酸乙酰肝素側(cè)鏈(Kav近似0.33)小5-6倍；且(ii)抗木瓜蛋白酶或軟骨素酶ABC的進(jìn)一步消化，且對亞硝酸脫氨基作用敏感(6，11)。
在Sf21細(xì)胞中獲得相似的結(jié)果(未給出)。同樣，在以含hpa的病毒(pFhpa)感染的細(xì)胞中探測到類肝素酶活性，而在以對照病毒(pF)感染的細(xì)胞中檢測不到。此結(jié)果是從兩個(gè)獨(dú)立產(chǎn)生的重組病毒獲得的。未感染的High Five細(xì)胞對照的裂解物無法降解HSPG底物。
在隨后的實(shí)驗(yàn)中，將標(biāo)記的HSPG底物與感染的High Five或Sf21細(xì)胞的條件培養(yǎng)基溫育。
如圖3a-b所示，由高M(jìn)r峰I底物向代表HS降解片段的低Mr峰II的轉(zhuǎn)變所反映的類肝素酶活性，發(fā)現(xiàn)存在于pFhpa2或pFhpa4病毒而非對照pF1或pF2病毒感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基中。在對照未感染的High Five或Sf21細(xì)胞的培養(yǎng)基中未探測到類肝素酶活性。
將以pFhpa4病毒感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基通過50kDa截留膜，從而獲得對重組類肝素酶的分子量的粗略估定。如在圖4中說明，所有的酶活性保留在上層部分，而流過(＜50kDa)物質(zhì)中無活性。此結(jié)果與hpa基因產(chǎn)物的預(yù)期分子量一致。
為進(jìn)一步表征肝素對hpa產(chǎn)物的抑制作用，檢查類肝素酶介導(dǎo)的HS降解的強(qiáng)抑制劑(40)。
如圖5a-b所示，由峰I底物向峰IIHS降解片段的轉(zhuǎn)變在肝素存在時(shí)被徹底消除。
綜上所述，這些結(jié)果表明被包含新鑒定的人hpa基因的桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞以活性形式表達(dá)類肝素酶。
實(shí)施例3完整ECM中HSPG的降解接著研究完整的感染昆蟲細(xì)胞降解完整、天然產(chǎn)生的ECM中的HS的能力。為此目的，將High Five或Sf21細(xì)胞接種在代謝性地硫酸鹽標(biāo)記的ECM上，隨后用pFhpa4或?qū)φ誴F2病毒感染(48h，28℃)。而后將培養(yǎng)基pH調(diào)到6.2-6.4，細(xì)胞在標(biāo)記ECM中進(jìn)一步培養(yǎng)48h(28℃)或24h(37℃)。對釋放到溫育培養(yǎng)基中的硫酸鹽標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行Sepharose 6B上的凝膠過濾分析。
如圖6a-b和7a-b所示，ECM與對照pF2病毒感染的細(xì)胞溫育造成標(biāo)記物質(zhì)的恒定釋放，此標(biāo)記物幾乎全部(＞90％)由在Vo之后或與之同洗脫的高M(jìn)r片段(峰I)組成。以前的研究顯示，存在于ECM本身和/或由細(xì)胞表達(dá)的蛋白水解活性負(fù)責(zé)高M(jìn)r物質(zhì)的釋放(6)。此近乎完整的HSPG為類肝素酶進(jìn)行的隨后降解提供了可溶底物，類肝素酶被肝素抑制時(shí)相對大量的峰I物質(zhì)積累也說明了這一點(diǎn)(6，7，12，圖9)。另一方面，標(biāo)記的ECM與pFhpa4病毒感染的細(xì)胞溫育導(dǎo)致60％-70％的ECM相關(guān)放射性以低Mr的硫酸鹽標(biāo)記片段的形式(峰II，0.5＜Kav＜0.75)釋放，而不論感染細(xì)胞與ECM是在28℃還是在37℃溫育。對照完整未感染Sf21或High Five細(xì)胞無法降解ECM HS側(cè)鏈。
在隨后的實(shí)驗(yàn)中，如圖8a-b所示，以pFhpa4或?qū)φ誴F1病毒感染High Five細(xì)胞和Sf21細(xì)胞(96h，28℃)，將培養(yǎng)基與硫酸鹽標(biāo)記的ECM一起溫育。僅在與pFhpa4感染細(xì)胞的條件培養(yǎng)基溫育時(shí)，才從ECM釋放低Mr HS降解片段。如圖9所示，肝素存在時(shí)，這些片段不再產(chǎn)生。在對照未感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中，未檢測到類肝素酶活性。這些結(jié)果說明pFhpa4病毒感染的細(xì)胞所表達(dá)的類肝素酶，當(dāng)其與天然產(chǎn)生的完整ECM的其它大分子成分(即纖連蛋白，層粘連層白，膠原蛋白)復(fù)合時(shí)，能以類似于報(bào)導(dǎo)的高度轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞或免疫系統(tǒng)活化細(xì)胞中的方式降解HS(6，7)。
實(shí)施例4重組類肝素酶的純化通過肝素-Sepharose層析從pFhpa4感染的Sf21細(xì)胞的培養(yǎng)基中部分純化重組類肝素酶(圖10a)，隨后對合并活性級分通過FPLCSuperdex 75柱凝膠過濾(圖11a)。觀察到1個(gè)63kDa蛋白，如銀染SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所探測的，其量與有關(guān)柱級分中的類肝素酶活性相關(guān)(分別為圖10b和11b)。此蛋白在對照pF1病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中未探測到，將其加到肝素-Sepharose上進(jìn)行相似分級分離(未示)。
實(shí)施例5各種細(xì)胞類型、器官和組織中hpa基因的表達(dá)參考圖12a-e，應(yīng)用RT-PCR估計(jì)各種細(xì)胞類型和組織中hpa基因的表達(dá)。為此目的，反轉(zhuǎn)錄總RNA并擴(kuò)增之。在人腎、胎盤(8和11周)和痣組織中，以及在新鮮分離的和短期(1.5-48h)培養(yǎng)的人胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中，清楚顯示有預(yù)期的585bp長的cDNA(圖12a)，以上細(xì)胞均已知表達(dá)高類肝素酶活性(41)。正常人嗜中性粒細(xì)胞也表達(dá)hpa轉(zhuǎn)錄物(圖12b)。與之形成對照，在胚胎人肌肉組織、胸腺、心臟和腎上腺中，無可檢測水平的hpa mRNA表達(dá)(圖12b)。部分而非所有人膀胱癌細(xì)胞系(圖12c)、SK肝癌(SK-hep-1)，卵巢癌(OV1063)、乳腺癌(435，231)、黑素瘤和巨核細(xì)胞(DAMI，CHRF)人細(xì)胞系(圖12d-e)表達(dá)hpa基因。
以上描述的hpa轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)模式經(jīng)確定與各種組織和細(xì)胞類型中測定的類肝素酶活性水平有極好相關(guān)性(未示)。
實(shí)施例6hpa同源基因篩選EST數(shù)據(jù)庫，尋找與hpa基因同源的序列。鑒定到三種小鼠EST(登記號Aa177901，源于小鼠脾，Aa067997源于小鼠皮膚，Aa47943源于小鼠胚)，將其裝配為包含629bp的部分開放閱讀框(缺失5′末端)和195bp的3′非翻譯區(qū)的824bp cDNA片段(SEQ ID NO12)。如圖13所示，編碼區(qū)與hpa cDNA序列的3′末端80％相似。這些EST很可能是編碼小鼠類肝素酶的小鼠hpa同源物的cDNA片段。
搜尋共有序列蛋白區(qū)，發(fā)現(xiàn)類肝素酶和幾種前體蛋白如前膠原蛋白Alpha1前體，酪氨酸蛋白激酶RYK，F(xiàn)ibulin-1，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白和幾種其它蛋白間在氨基末端有同源性。此氨基末端高度疏水并包含潛在的跨膜區(qū)。與已知信號肽序列的同源性說明它能作為信號肽為蛋白定位發(fā)揮功能。
實(shí)施例7從人SK-hep1細(xì)胞系分離hpa cDNA的延伸5′末端使用Marathon RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)試劑盒(Clontech)，通過PCR擴(kuò)增從人SK-hep1細(xì)胞系分離hpa cDNA的5′末端。按照生產(chǎn)制造商說明使用TRI-Reagent(Molecular research center Inc.)從SK-hep1細(xì)胞制備總RNA。使用mRNA分離試劑盒(Clonetech)分離PolyA+RNA。
按照生產(chǎn)制造商推薦構(gòu)建Marathon RACE SK-hep1 cDNA復(fù)合體。使用銜接子特異引物AP15′-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQ ID NO1)，和相應(yīng)于SEQ ID NO9核苷酸119-99的hpa特異性反義引物hpl-6295′-CCCCAGGAGCAGCAGCATCAG-3′(SEQ IDNO17)，進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二循環(huán)擴(kuò)增，使用銜接子特異性嵌套引物AP25′-ACTCACTATAGGGCTC GAGCGGC-3′，SEQ ID NO3，和相應(yīng)于SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特異性反義嵌套引物hpl-666 5′-AGGCTTCGAGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR過程如下熱起始94℃1分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)90℃30秒，68℃4分鐘。從瓊脂糖膠提取所獲的300bp DNA片段，將其克隆到載體pGEM-T Easy(Promega)中。獲得的重組質(zhì)粒命名為pHPSK1。
確定pHPSK1插入片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)其包括胎盤hpa cDNA(SEQ ID NO9)5′末端的62個(gè)核苷酸和上游的額外178個(gè)核苷酸，即SEQ ID NO13和15的頭178個(gè)核苷酸。
鑒定到SK-hep1 cDNA和胎盤cDNA之間有單個(gè)核苷酸差異。胎盤cDNA(SEQ ID NO9)第9位的“T”衍生物，在SK-hep1 cDNA(SEQID NO13)的相應(yīng)第187位被“C”衍生物替換。
此差異可能是由于在胎盤cDNA克隆的5′末端有突變，通過對從胎盤分離的幾個(gè)額外cDNA克隆(它們?nèi)鏢K-hep1 cDNA一樣在SEQ IDNO9的第9位包括C)進(jìn)行序列分析證實(shí)了這一點(diǎn)。
將SK-hep1 hpa cDNA的5′延伸序列與從人胎盤分離的hpa cDNA序列(SEQ ID NO9)裝配起來。裝配后序列包括編碼如SEQ ID NO14和15中所示計(jì)算分子量為66407道爾頓的592個(gè)氨基酸的多肽的開放閱讀框。該開放閱讀框側(cè)接有93bp的5′非翻譯區(qū)(UTR)。
實(shí)施例8hpa基因的上游基因組區(qū)的分離使用Genome Walker試劑盒(Clontech)，按照生產(chǎn)制造商說明分離hpa基因的上游區(qū)。此試劑盒包括5種人基因組DNA樣品，每個(gè)樣品用不同限制性核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生平末端EcoRV，ScaI，DraI，PvuII和SspI。
將平末端DNA片端與部分單鏈的銜接子連接。使用銜接子特異性引物和基因特異性引物，對基因組DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用ExpandHigh Fidelity(Boehringer Mannheim)擴(kuò)增。
第一循環(huán)擴(kuò)增使用ap1引物5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，SEQ ID NO19，和相應(yīng)于SEQ ID NO9核苷酸83-63的hpa特異性反義引物hpl-6665′-AGGCTTCG AGCGCAGCAGCAT-3′，SEQ IDNO18。PCR程序如下熱起始94℃3分鐘，然后36個(gè)循環(huán)，每循環(huán)為94℃40秒67℃4分鐘。
將第一次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物按1∶50稀釋。將稀釋樣品的1μl用作第二次擴(kuò)增的模板，其中使用嵌套的銜接子特異性引物ap25′-ACTATA GGGCACGCGTGGT-3′，SEQ ID NO20，和相應(yīng)于SEQ ID NO9核苷酸62-42的hpa特異性反義引物hpl-690，5′-CTTGGGCTCACCTGGCTGCTC-3′，SEQ ID NO21。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。從5個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)獲得5種不同的PCR產(chǎn)物。從凝膠中提取SspI消化DNA樣品所得的約750bp的DNA片段。將純化的片段連接到質(zhì)粒載體pGEM-T Easy(Promega)上。所獲的重組質(zhì)粒命名為pGHP6905，確定hpa插入片段的核苷酸序列。
SEQ ID NO16中給出了594個(gè)核苷酸的部分序列。SEQ ID NO16的最后一位核苷酸相應(yīng)于SEQ ID NO13的核苷酸93。SEQ ID NO16中的DNA序列包括hpa cDNA的5′區(qū)和被預(yù)測為包括hpa基因啟動(dòng)子區(qū)的基因組上游區(qū)501個(gè)核苷酸。
實(shí)施例9
592個(gè)氨基酸的HPA多肽在人293細(xì)胞系中的表達(dá)通過將相當(dāng)于SK-hep1 hpa cDNA 5′末端的110bp與胎盤cDNA相連，構(gòu)建592個(gè)氨基酸的開放閱讀框(SEQ ID NO13和15)。更具體而言，將胎盤hpa DNA的Marathon RACE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用Sac I消化，并將近似1kb片段連接到Sac I消化的pGHP6905質(zhì)粒中。所得質(zhì)粒用Ear I和Aat II消化，鈍化Ear I粘性末端，分離出約280bp的Ear I/已鈍化Aat II片段。使用Klenow片段補(bǔ)平EcoR I消化的pFasthpa，并進(jìn)一步用Aat II消化，將所得pFasthpa與上述片段連接。所獲質(zhì)粒包括1827bp的插入片段，此插入片段包括1776bp的開放閱讀框，31bp的3′UTR和21bp的5′UTR。此質(zhì)粒命名為pFastLhpa。
構(gòu)建哺乳動(dòng)物表達(dá)載體以驅(qū)動(dòng)592個(gè)氨基酸的類肝素酶多肽在人細(xì)胞中表達(dá)。用BssHII和Not I從pFastLhpa切下hpa cDNA。將所得1850bp的BssHI I-Not I片段連接到Mlu I和Not I消化的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pSI(Promega)中。將所得重組質(zhì)粒pSIhpaMet2轉(zhuǎn)染到人293胚胎腎細(xì)胞系中。
592個(gè)氨基酸的類肝素酶的瞬時(shí)表達(dá)通過Western印跡分析檢測，使用凝膠移位試驗(yàn)檢查酶活性。這些操作在1998年5月1日提交的美國專利申請NO.09/071,739中有詳細(xì)描述，此申請?jiān)诖巳募{入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。轉(zhuǎn)染后3天收獲細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞重懸于包括150mMNaCl，50mM Tris pH7.5，1％Triton X-100，1mM PMSF和蛋白酶抑制劑混和物(Boehringer Mannheim)的裂解緩沖液中。對40μg蛋白提取物樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離。將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF Hybond-P膜(Amersham)上。將膜與親合純化的多克隆抗類肝素酶抗體溫育(如美國專利申請?zhí)?9/071,739中所述)。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到約50kDa的主帶及約65kDa的次帶。在pShpa轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的提取物中觀察到相似的圖(如美國專利申請?zhí)?9/071,739中所述)。這兩條帶很可能代表轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的重組類肝素酶蛋白的兩種形式。65kDa蛋白很可能代表類肝素酶前體，而50kDa蛋白在此推測為已加工或成熟形式。
pShpaMet2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白的催化活性通過凝膠移位試驗(yàn)檢測。轉(zhuǎn)染細(xì)胞和模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的提取物在含20mM磷酸檸檬酸鹽緩沖液(pH5.4)，1mM CaCl2，1mM DTT和50mM NaCl的反應(yīng)體系中于37℃與肝素(每反應(yīng)6μg)溫育過夜。然后將反應(yīng)混合物在10％聚丙烯酰胺凝膠上分離。與轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物溫育的肝素分子與對照相比快速遷移，這清楚表明了重組類肝素酶的催化活性?？焖龠w移說明高分子量肝素分子的消失和低分子量降解產(chǎn)物的產(chǎn)生。
實(shí)施例10hpa基因的染色體定位利用從UK HGMP Resource Center(Cambridge，England)獲得的單染色體人/CHO和人/小鼠體細(xì)胞雜合體板對hpa基因進(jìn)行染色體作圖。
對40ng每種體細(xì)胞雜合體DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用相應(yīng)于SEQ ID NO9核苷酸564-586的hpa引物hpa565 5′-AGCTCTGTAGATGTGCTATACAC-3′(SEQ ID NO22)，和相應(yīng)于SEQ IDNO9核苷酸897-876的反義引物hpl 171 5′-GCATCTTAGCCGTCTTTCTTCG-3′(SEQ ID NO23)。
PCR程序如下94℃3分鐘熱起始，然后7個(gè)循環(huán)94℃45秒、66℃1分鐘、68℃5分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)94℃45秒、62℃1分鐘、68℃5分鐘、最后72℃10分鐘延伸。
反應(yīng)用Expand long PCR(Boehringer Mannheim)進(jìn)行。所得擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖14所述，從染色體4及對照人基因組DNA獲一條約2.8kb的帶。2.8kb的擴(kuò)增產(chǎn)物被認(rèn)為是基于對基因組hpa克隆的擴(kuò)增(未示數(shù)據(jù))。在小鼠和倉鼠的對照DNA樣品和其它人染色體的體細(xì)胞雜合體中，都未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
盡管結(jié)合具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然還有許多變換方式、修改和變動(dòng)。所以，本發(fā)明包括落入所附權(quán)利要求精神和寬范圍內(nèi)的所有這些變換方式、修改和變動(dòng)。
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序列表(1)一般信息(i)申請人 Iris Pecker，Israel Vlodavsky 和 ElenaFreinstein(ii)發(fā)明名稱 編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸及其在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)(iii)序列數(shù) 23(iv)通信地址(A)地址Mark M.Friedman c/o Robert Sheinbein(B)街 2940 Birchtree Lane(C)城市Silver Spring(D)州 Maryland(E)國家美國(F)郵政編碼20906(v) 機(jī)讀形式(A)介質(zhì)類型1.44M，3.5吋軟盤(B)計(jì)算機(jī)Twinhead*Slimnote-890TX(C)操作系統(tǒng)MS DOS6.2版視窗3.11版(D)軟件相應(yīng)視窗2.0的Word，轉(zhuǎn)化為ASCI文件(vi)當(dāng)前申請信息(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請信息(A)申請?zhí)? 08/922，170(B)申請日1997年9月2日(viii)律師/代理人信息(A)名字Friedmam，Mark M.
(B)登記號 33，883(C)參考/摘要號910/1(ix)電信信息(A)電話972-3-5625553(B)傳真972-3-5625554(C)電報(bào)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度 27(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線狀(xi)序列描述SEQ ID NO1CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度 24(B)類型 核酸(C)鏈型 單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線狀(xi)序列描述SEQ ID NO2GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO3
ACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC 23(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO4GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 22(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度15(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO5TTTTTTTTTT TTTTT 15(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO6TTCGATCCCA AGAAGGAATC AAC 23(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度24(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO7GTAGTGATGC CATGTAACTG AATC 24(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度9(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO8Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg5 9(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度1721(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO9CTAGAGCTTT CGACTCTCCG CTGCGCGGCA GCTGGCGGGG GGAGCAGCCA GGTGAGCCCA 60AGATGCTGCT GCGCTCGAAG CCTGCGCTGC CGCCGCCGCT GATGCTGCTG CTCCTGGGGC 120CGCTGGGTCC CCTCTCCCCT GGCGCCCTGC CCCGACCTGC GCAAGCACAG GACGTCGTGG 180ACCTGGACTT CTTCACCCAG GAGCCGCTGC ACCTGGTGAG CCCCTCGTTC CTGTCCGTCA 240CCATTGACGC CAACCTGGCC ACGGACCCGC GGTTCCTCAT CCTCCTGGGT TCTCCAAAGC 300TTCGTACCTT GGCCAGAGGC TTGTCTCCTG CGTACCTGAG GTTTGGTGGC ACCAAGACAG 360ACTTCCTAAT TTTCGATCCC AAGAAGGAAT CAACCTTTGA AGAGAGAAGT TACTGGCAAT 420CTCAAGTCAA CCAGGATATT TGCAAATATG GATCCATCCC TCCTGATGTG GAGGAGAAGT 480TACGGTTGGA ATGGCCCTAC CAGGAGCAAT TGCTACTCCG AGAACACTAC CAGAAAAAGT 540TCAAGAACAG CACCTACTCA AGAAGCTCTG TAGATGTGCT ATACACTTTT GCAAACTGCT 600CAGGACTGGA CTTGATCTTT GGCCTAAATG CGTTATTAAG AACAGCAGAT TTGCAGTGGA 660ACAGTTCTAA TGCTCAGTTG CTCCTGGACT ACTGCTCTTC CAAGGGGTAT AACATTTCTT 720GGGAACTAGG CAATGAACCT AACAGTTTCC TTAAGAAGGC TGATATTTTC ATCAATGGGT 780CGGAGTTAGG AGAAGATTAT ATTCAATTGC ATAAACTTCT AAGAAAGTCC ACCTTCAAAA 840ATGCAAAACT CTATGGTCCT GATGTTGGTC AGCCTCGAAG AAAGACGGCT AAGATGCTGA 900AGAGCTTCCT GAAGGCTGGT GGAGAAGTGA TTGATTCAGT TACATGGCAT CACTACTATT 960TGAATGGACG GACTGCTACC AGGGAAGATT TTCTAAACCC TGATGTATTG GACATTTTTA 1020TTTCATCTGT GCAAAAAGTT TTCCAGGTGG TTGAGAGCAC CAGGCCTGGC AAGAAGGTCT 1080GGTTAGGAGA AACAAGCTCT GCATATGGAG GCGGAGCGCC CTTGCTATCC GACACCTTTG 1140CAGCTGGCTT TATGTGGCTG GATAAATTGG GCCTGTCAGC CCGAATGGGA ATAGAAGTGG 1200TGATGAGGCA AGTATTCTTT GGAGCAGGAA ACTACCATTT AGTGGATGAA AACTTCGATC 1260CTTTACCTGA TTATTGGCTA TCTCTTCTGT TCAAGAAATT GGTGGGCACC AAGGTGTTAA 1320TGGCAAGCGT GCAAGGTTCA AAGAGAAGGA AGCTTCGAGT ATACCTTCAT TGCACAAACA 1380CTGACAATCC AAGGTATAAA GAAGGAGATT TAACTCTGTA TGCCATAAAC CTCCATAACG 1440TCACCAAGTA CTTGCGGTTA CCCTATCCTT TTTCTAACAA GCAAGTGGAT AAATACCTTC 1500TAAGACCTTT GGGACCTCAT GGATTACTTT CCAAATCTGT CCAACTCAAT GGTCTAACTC 1560TAAAGATGGT GGATGATCAA ACCTTGCCAC CTTTAATGGA AAAACCTCTC CGGCCAGGAA 1620GTTCACTGGG CTTGCCAGCT TTCTCATATA GTTTTTTTGT GATAAGAAAT GCCAAAGTTG 1680CTGCTTGCAT CTGAAAATAA AATATACTAG TCCTGACACT G 1721(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度543(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro Pro Leu Met Leu Leu5 10 15Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro Gly Ala Leu Pro Arg Pro20 25 30Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro35 40 45Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn50 55 60Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu65 70 75 80Arg Thr Leu Ala Arg Gly Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly85 90 95Thr Lys Thr Asp Phe Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe100 105 110Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys115 120 125Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu 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Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys355 360 365Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val370 375 380Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385 390 395 400Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr405 410 415Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg420 425 430Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly435 440 445Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu450 455 460Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465 470 475 480Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn485 490 495Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met500 505 510Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser515 520 525Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile530 535 540 543(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度1718(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO11CT AGA GCT TTC GAC 14TCT CCG 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Lys Glu Ser Thr Phe100 105 110GAA GAG AGA AGT TAC TGG CAA TCT CAA GTC AAC CAG GAT ATT TGC AAA 446Glu Glu Arg Ser Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys115 120 125TAT GGA TCC ATC CCT CCT GAT GTG GAG GAG AAG TTA CGG TTG GAA TGG 494Tyr Gly Ser Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp130 135 140CCC TAC CAG GAG CAA TTG CTA CTC CGA GAA CAC TAC CAG AAA AAG TTC 542Pro Tyr Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe145 150 155 160AAG AAC AGC ACC TAC TCA AGA AGC TCT GTA GAT GTG CTA TAC ACT TTT 590Lys Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe165 170 175GCA AAC TGC TCA GGA CTG GAC TTG ATC TTT GGC CTA AAT GCG TTA TTA 638Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu Leu180 185 190AGA ACA GCA GAT TTG CAG TGG AAC AGT TCT AAT GCT CAG TTG CTC CTG 686Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu Leu Leu195 200 205GAC TAC TGC TCT TCC AAG GGG TAT AAC ATT TCT TGG GAA CTA GGC AAT 734Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu Leu Gly Asn210 215 220GAA CCT AAC AGT TTC CTT AAG AAG GCT GAT ATT TTC ATC AAT GGG TCG 782Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe Ile Asn Gly Ser225 230 235 240CAG TTA GGA GAA GAT TAT ATT CAA TTG CAT AAA CTT CTA AGA AAG TCC 830Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys Leu Leu Arg Lys Ser245 250 255ACC TTC AAA AAT GCA AAA CTC TAT GGT CCT GAT GTT GGT CAG CCT CGA 878Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro Asp Val Gly Gln Pro Arg260 265 270AGA AAG ACG GCT AAG ATG CTG AAG AGC TTC CTG AAG GCT GGT GGA GAA 926Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu275 280 285GTG ATT GAT TCA GTT ACA TGG CAT CAC TAC TAT TTG AAT GGA CGG ACT 974Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr290 295 300GCT ACC AGG GAA GAT TTT CTA AAC CCT GAT GTA TTG GAC ATT TTT ATT 1019Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile305 310 315 320TCA TCT GTG CAA AAA GTT TTC CAG GTG GTT GAG AGC ACC AGG CCT GGC 1067Ser Ser Val Gln Lys Val Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly325 330 335AAG AAG GTC TGG TTA GGA GAA ACA AGC TCT GCA TAT GGA GGC GGA GCG 1115Lys Lys Val Trp Leu Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala340 345 350CCC TTG CTA TCC GAC ACC TTT GCA GCT GGC TTT ATG TGG CTG GAT AAA 1163Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys355 360 365TTG GGC CTG TCA GCC CGA ATG GGA ATA GAA GTG GTG ATG AGG CAA GTA 1211Leu Gly Leu Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val370 375 380TTC TTT GGA GCA GGA AAC TAC CAT TTA GTG GAT GAA AAC TTC GAT CCT 1259Phe Phe Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro385 390 395 400TTA CCT GAT TAT TGG CTA TCT CTT CTG TTC AAG AAA TTG GTG GGC ACC 1307Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr405 410 415AAG GTG TTA ATG GCA AGC GTG CAA GGT TCA AAG AGA AGG AAG CTT CGA 1355Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu Arg420 425 430GTA TAC CTT CAT TGC ACA AAC ACT GAC AAT CCA AGG TAT AAA GAA GGA 1403Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys Glu Gly435 440 445GAT TTA ACT CTG TAT GCC ATA AAC CTC CAT AAC GTC ACC AAG TAC TTG 1451Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr Lys Tyr Leu450 455 460CGG TTA CCC TAT CCT TTT TCT AAC AAG CAA GTG GAT AAA TAC CTT CTA 1499Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp Lys Tyr Leu Leu465 470 475 480AGA CCT TTG GGA CCT CAT GGA TTA CTT TCC AAA TCT GTC CAA CTC AAT 1547Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys Ser Val Gln Leu Asn485 490 495GGT CTA ACT CTA AAG ATG GTG GAT GAT CAA ACC TTG CGA CCT TTA ATG 1595Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln Thr Leu Pro Pro Leu Met500 505 510GAA AAA CCT CTC CGG CCA GGA AGT TCA CTG GGC TTG CCA GCT TTC TCA 1643Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser515 520 525TAT AGT TTT TTT GTG ATA AGA AAT GCC AAA GTT GCT GCT TGC ATC TGA 1691Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile530 535 540 543AAA TAA AAT ATA CTA GTC CTG ACA CTG 1718(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度824(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO12CTGGCAAGAA GGTCTGGTTG GGAGAGACGA GCTCAGCTTA CGGTGGCGGT GCACCCTTGC 60TGTCCAACAC CTTTGCAGCT GGCTTTATGT GGCTGGATAA ATTGGGCCTG TCAGCCCAGA 120TGGGCATAGA AGTCGTGATG AGGCAGGTGT TCTTCGGAGC AGGCAACTAC CACTTAGTGG 180ATGAAAACTT TGAGCCTTTA CCTGATTACT GGCTCTCTCT TCTGTTCAAG AAACTGGTAG 240GTCCCAGGGT GTTACTGTCA AGAGTGAAAG GCCCAGACAG GAGCAAACTC CGAGTGTATC 300TCCACTGCAC TAACGTCTAT CACCCACGAT ATCAGGAAGG AGATCTAACT CTGTATGTCC 360TGAACCTCCA TAATGTCACC AAGCACTTGA AGGTACCGCC TCCGTTGTTC AGGAAACCAG 420TGGATACGTA CCTTCTGAAG CCTTCGGGGC CGGATGGATT ACTTTCCAAA TCTGTCCAAC 480TGAACGGTCA AATTCTGAAG ATGGTGGATG AGCAGACCCT GCCAGCTTTG ACAGAAAAAC 540CTCTCCCCGC AGGAAGTGCA CTAAGCCTGC CTGCCTTTTC CTATGGTTTT TTTGTCATAA 600GAAATGCCAA AATCGCTGCT TGTATATGAA AATAAAAGGC ATACGGTACC CCTGAGACAA 660AAGCCGAGGG GGGTGTTATT CATAAAACAA AACCCTAGTT TAGGAGGCCA CCTCCTTGCC 720GAGTTCCAGA GCTTCGGGAG GGTGGGGTAC ACTTCAGTAT TACATTCAGT GTGGTGTTCT 780CTCTAAGAAG AATACTGCAG GTGGTGACAG TTAATAGCAC TGTG824(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度1899(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO13GGGAAAGCGA GCAAGGAAGT AGGAGAGAGC CGGGCAGGCG GGGCGGGGTT GGATTGGGAG 60CAGTGGGAGG GATGCAGAAG AGGAGTGGGA GGGATGGAGG GCGCAGTGGG AGGGGTGAGG 120AGGCGTAACG GGGCGGAGGA AAGGAGAAAA GGGCGCTGGG GCTCGGCGGG AGGAAGTGCT 180AGAGCTCTCG ACTCTCCGCT GCGCGGCAGC TGGCGGGGGG AGCAGCCAGG TGAGCCCAAG 240ATGCTGCTGC GCTCGAAGCC TGCGCTGCCG CCGCCGCTGA TGCTGCTGCT CCTGGGGCCG 300CTGGGTCCCC TCTCCCCTGG CGCCCTGCCC CGACCTGCGC AAGCACAGGA CGTCGTGGAC 360CTGGACTTCT TCACCCAGGA GCCGCTGCAC CTGGTGAGCC CCTCGTTCCT GTCCGTCACC 420ATTGACGCCA ACCTGGCCAC GGACCCGCGG TTCCTCATCC TCCTGGGTTC TCCAAAGCTT 480CGTACCTTGG CCAGAGGCTT GTCTCCTGCG TACCTGAGGT TTGGTGGCAC CAAGACAGAC 540TTCCTAATTT TCGATCCCAA GAAGGAATCA ACCTTTGAAG AGAGAAGTTA CTGGCAATCT 600CAAGTCAACC AGGATATTTG CAAATATGGA TCCATCCCTC CTGATGTGGA GGAGAAGTTA 660CGGTTGGAAT GGCCCTACCA GGAGCAATTG CTACTCCGAG AACACTACCA GAAAAAGTTC 720AAGAACAGCA CCTACTCAAG AAGCTCTGTA GATGTGCTAT ACACTTTTGC AAACTGCTCA 780GGACTGGACT TGATCTTTGG CCTAAATGCG TTATTAAGAA CAGCAGATTT GCAGTGGAAC 840AGTTCTAATG CTCAGTTGCT CCTGGACTAC TGCTCTTCCA AGGGGTATAA CATTTCTTGG 900GAACTAGGCA ATGAACCTAA CAGTTTCCTT AAGAAGGCTG ATATTTTCAT CAATGGGTCG 960CAGTTAGGAG AAGATTATAT TCAATTGCAT AAACTTCTAA GAAAGTCCAC CTTCAAAAAT 1020GCAAAACTCT ATGGTCCTGA TGTTGGTCAG CCTCGAAGAA AGACGGCTAA GATGCTGAAG 1080AGCTTCCTGA AGGCTGGTGG AGAAGTGATT GATTCAGTTA CATGGCATCA CTACTATTTG 1140AATGGACGGA CTGCTACCAG GGAAGATTTT CTAAACCCTG ATGTATTGGA CATTTTTATT 1200TCATCTGTGC AAAAAGTTTT CCAGGTGGTT GAGAGCACCA GGCCTGGCAA GAAGGTCTGG 1260TTAGGAGAAA CAAGCTCTGC ATATGGAGGC GGAGCGCCCT TGCTATCCGA CACCTTTGCA 1320GCTGGCTTTA TGTGGCTGGA TAAATTGGGC CTGTCAGCCC GAATGGGAAT AGAAGTGGTG 1380ATGAGGCAAG TATTCTTTGG AGCAGGAAAC TACCATTTAG TGGATGAAAA CTTCGATCCT 1440TTACCTGATT ATTGGCTATC TCTTCTGTTC AAGAAATTGG TGGGCACCAA GGTGTTAATG 1500GCAAGCGTGC AAGGTTCAAA GAGAAGGAAG CTTCGAGTAT ACCTTCATTG CACAAACACT 1560GACAATCCAA GGTATAAAGA AGGAGATTTA ACTCTGTATG CCATAAACCT CCATAACGTC 1620ACCAAGTACT TGCGGTTACC CTATCCTTTT TCTAACAAGC AAGTGGATAA ATACCTTCTA 1680AGACCTTTGG GACCTCATGG ATTACTTTCC AAATCTGTCC AACTCAATGG TCTAACTCTA 1740AAGATGGTGG ATGATCAAAC CTTGCCACCT TTAATGGAAA AACCTCTCCG GCCAGGAAGT 1800TCACTGGGCT TGCCAGCTTT CTCATATAGT TTTTTTGTGA TAAGAAATGC CAAAGTTGCT 1860GCTTGCATCT GAAAATAAAA TATACTAGTC CTGACACTG 1899(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度592(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Glu Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu5 10 15Glu Arg Arg Lys Gly Arg Trp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg20 25 30Ala Leu Asp Ser Pro Leu Arg Gly Ser Trp Arg Gly Glu Gln Pro35 40 45Gly Glu Pro Lys Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro50 55 60Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro65 70 75Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu80 85 90Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe95 100 105Leu Ser Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe110 115 120Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly125 130 135Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe140 145 150Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser155 160 165Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser170 175 180Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr185 190 195Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys200 205 210Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe215 220 225Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu230 235 240Leu Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu245 250 255Leu Leu Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu260 265 270Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe275 280 285Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys290 295 300Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro305 310 315Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser320 325 330Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His335 340 345His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu350 355 360Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser ser Val Gln Lys Val365 370 375Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu380 385 390Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu Ser395 400 405Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu410 415 420Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Mer Arg Gln Val Phe Phe425 430 435Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu440 445 450Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr455 460 465Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu470 475 480Arg Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys485 490 495Glu Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr500 505 510Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp515 520 525Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Lcu Ser Lys530 535 540Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln545 550 555Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser560 565 570Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度1899(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO15GGG3AAA GCG AGC AAG GAA GTA GGA GAG AGC CGG GCA GGC GGG GCG GGG 48TTG GAT TGG GAG CAG TGG GAG GGA TGC AGA AGA GGA GTG GGA GGG 93ATG GAG GGC GCA GTG GGA GGG GTG AGG AGG CGT AAC GGG GCG GAG 138Met Glu Gly Ala Val Gly Gly Val Arg Arg Arg Asn Gly Ala Glu5 10 15GAA AGG AGA AAA GGG CGC TGG GGC TCG GCG GGA GGA AGT GCT AGA 183Glu Arg Arg Lys Gly Arg Trp Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Arg20 25 30GCT CTC GAC TCT CCG CTG CGC GGC AGC TGG CGG GGG GAG CAG CCA 228Ala Leu Asp Ser Pro Leu Arg Gly Ser Trp Arg Gly Glu Gln Pro35 40 45GGT GAG CCC AAG ATG CTG CTG CGC TCG AAG CCT GCG CTG CCG CCG 273Gly Glu Pro Lys Met Leu Leu Arg Ser Lys Pro Ala Leu Pro Pro50 55 60CCG CTG ATG CTG CTG CTC CTG GGG CCG CTG GGT CCC CTc TCC CCT 318Pro Leu Met Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gly Pro Leu Ser Pro65 70 75GGC GCC CTG CCC CGA CCT GCG CAA GCA CAG GAC GTc GTG GAC CTG 363Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ala Gln Ala Gln Asp Val Val Asp Leu80 85 90GAC TTc TTC ACC CAG GAG CCG CTG CAC CTG GTG AGC CCC TCG TTC 408Asp Phe Phe Thr Gln Glu Pro Leu His Leu Val Ser Pro Ser Phe95 100 105CTG TCC GTC ACC ATT GAC GCC AAC CTG GCC ACG GAC CCG CGG TTC 453Leu Ser yal Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ala Thr Asp Pro Arg Phe110 115 120CTC ATC CTC CTG GGT TCT CCA AAG CTT CGT ACC TTG GCC AGA GGC 498Leu Ile Leu Leu Gly Ser Pro Lys Leu Arg Thr Leu Ala Arg Gly125 130 135TTG TCT CCT GCG TAC CTG AGG TTT GGT GGC ACC AAG ACA GAC TTC 543Leu Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Phe Gly Gly Thr Lys Thr Asp Phe140 145 150CTA ATT TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA ACC TTT GAA GAG AGA AGT 588Leu Ile Phe Asp Pro Lys Lys Glu Ser Thr Phe Glu Glu Arg Ser155 160 165TAC TGG CAA TCT CAA GTC AAC CAG GAT ATT TGC AAA TAT GGA TCC 633Tyr Trp Gln Ser Gln Val Asn Gln Asp Ile Cys Lys Tyr Gly Ser170 175 180ATC CCT CCT GAT GTG GAG GAG AAG TTA CGG TTG GAA TGG CCC TAC 678Ile Pro Pro Asp Val Glu Glu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Pro Tyr185 190 195CAG GAG CAA TTG CTA CTC CGA GAA CAC TAC CAG AAA AAG TTC AAG 723Gln Glu Gln Leu Leu Leu Arg Glu His Tyr Gln Lys Lys Phe Lys200 205 210AAC AGC ACC TAC TCA AGA AGC TCT GTA GAT GTG CTA TAC ACT TTT 768Asn Ser Thr Tyr Ser Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Tyr Thr Phe215 220 225GCA AAC TGC TCA GGA CTG GAC TTG ATC TTT GGC CTA AAT GCG TTA 813Ala Asn Cys Ser Gly Leu Asp Leu Ile Phe Gly Leu Asn Ala Leu230 235 240TTA AGA ACA GCA GAT TTG GAG TGG AAC AGT TCT AAT GCT CAG TTG 858Leu Arg Thr Ala Asp Leu Gln Trp Asn Ser Ser Asn Ala Gln Leu245 250 255CTC CTG GAC TAC TGC TCT TCC AAG GGG TAT AAC ATT TCT TGG GAA 903Leu Leu Asp Tyr Cys Ser Ser Lys Gly Tyr Asn Ile Ser Trp Glu260 265 270CTA GGC AAT GAA CCT AAC AGT TTC CTT AAG AAG GCT GAT ATT TTC 948Leu Gly Asn Glu Pro Asn Ser Phe Leu Lys Lys Ala Asp Ile Phe275 280 285ATC AAT GGG TCG CAG TTA GGA GAA GAT TAT ATT CAA TTG CAT AAA 993Ile Asn Gly Ser Gln Leu Gly Glu Asp Tyr Ile Gln Leu His Lys290 295 300CTT CTA AGA AAG TCC ACC TTC AAA AAT GCA AAA GTC TAT GGT CCT 1038Leu Leu Arg Lys Ser Thr Phe Lys Asn Ala Lys Leu Tyr Gly Pro305 310 315GAT GTT GGT CAG CCT CGA AGA AAG ACG GCT AAG ATG CTG AAG AGC 1083Asp Val Gly Gln Pro Arg Arg Lys Thr Ala Lys Met Leu Lys Ser320 325 330TTC CTG AAG GCT GGT GGA GAA GTG ATT GAT TCA GTT ACA TGG CAT 1128Phe Leu Lys Ala Gly Gly Glu Val Ile Asp Ser Val Thr Trp His335 340 345CAC TAC TAT TTG AAT GGA CGG ACT GCT ACC AGG GAA GAT TTT CTA 1173His Tyr Tyr Leu Asn Gly Arg Thr Ala Thr Arg Glu Asp Phe Leu350 355 360AAC CCT GAT GTA TTG GAC ATT TTT ATT TCA TCT GTG CAA AAA GTT 1218Asn Pro Asp Val Leu Asp Ile Phe Ile Ser Ser Val Gln Lys Val365 370 375TTC CAG GTG GTT GAG AGC ACC AGG CCT GGC AAG AAG GTC TGG TTA 1263Phe Gln Val Val Glu Ser Thr Arg Pro Gly Lys Lys Val Trp Leu380 385 390GGA GAA ACA AGC TCT GCA TAT GGA GGC GGA GCG CCC TTG CTA TCC 1308Gly Glu Thr Ser Ser Ala Tyr Gly Gly Gly Ala Pro Leu Leu Ser395 400 405GAC ACC TTT GCA GCT GGC TTT ATG TGG CTG GAT AAA TTG GGC CTG 1353Asp Thr Phe Ala Ala Gly Phe Met Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu410 415 420TCA GCC CGA ATG GGA ATA gAA GTG GTG ATG AGG CAA GTA TTC TTT 1398Ser Ala Arg Met Gly Ile Glu Val Val Met Arg Gln Val Phe Phe425 430 435GGA GCA GGA AAC TAC CAT TTA GTG GAT GAA AAC TTC GAT CCT TTA 1443Gly Ala Gly Asn Tyr His Leu Val Asp Glu Asn Phe Asp Pro Leu440 445 450CCT GAT TAT TGG CTA TCT CTT CTG TTC AAG AAA TTG GTG GGC ACC 1488Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu Leu Phe Lys Lys Leu Val Gly Thr455 460 465AAG GTG TTA ATG GCA AGC GTG CAA GGT TCA AAG AGA AGG AAG CTT 1533Lys Val Leu Met Ala Ser Val Gln Gly Ser Lys Arg Arg Lys Leu470 475 480CGA GTA TAC CTT CAT TGC ACA AAC ACT GAC AAT CCA AGG TAT AAA 1578Arg Val Tyr Leu His Cys Thr Asn Thr Asp Asn Pro Arg Tyr Lys485 490 495GAA GGA GAT TTA ACT CTG TAT GCC ATA AAC CTC CAT CAC GTC ACC 1623Glu Gly Asp Leu Thr Leu Tyr Ala Ile Asn Leu His Asn Val Thr500 505 510AAG TAC TTG CGG TTA CCC TAT CCT TTT TCT AAC AAG CAA GTG GAT 1668Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Tyr Pro Phe Ser Asn Lys Gln Val Asp515 520 525AAA TAC CTT CTA AGA CCT TTG GGA CCT CAT GGA TTA CTT TCC AAA 1713Lys Tyr Leu Leu Arg Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Leu Ser Lys530 535 540TCT GTC CAA CTC AAT GGT CTA ACT CTA AAG ATG GTG GAT GAT CAA 1758Ser Val Gln Leu Asn Gly Leu Thr Leu Lys Met Val Asp Asp Gln545 550 555ACC TTG CCA CCT TTA ATG GAA AAA CCT CTC CGG CCA GGA AGT TCA 1803Thr Leu Pro Pro Leu Met Glu Lys Pro Leu Arg Pro Gly ser Ser560 565 570CTG GGC TTG CCA GCT TTC TCA TAT AGT TTT TTT GTG ATA AGA AAT 1848Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val Ile Arg Asn575 580 585GCC AAA GTT GCT GCT TGC ATC TGA AAA TAA AAT ATA CTA GTC CTG 1893Ala Lys Val Ala Ala Cys Ile590 592ACA CTG 1899(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度594(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO16ATTACTATAG GGCACGCGTG GTCGACGGCC CGGGCTGGTA TTGTCTTAAT GAGAAGTTGA 60TAAAGAATTT TGGGTGGTTG ATCTCTTTCC AGCTGCAGTT TAGCGTATGC TGAGGCCAGA 120TTTTTTCAGG CAAAAGTAAA ATACCTGAGA AACTGCCTGG CCAGAGGACA ATCAGATTTT 180GGCTGGCTCA AGTGACAAGC AAGTGTTTAT AAGCTAGATG GGAGAGGAAG GGATGAATAC 240TCCATTGGAG GCTTTACTCG AGGGTCAGAG GGATACCCGG CGCCATCAGA ATGGGATCTG 300GGAGTCGGAA ACGCTGGGTT CCCACGAGAG CGCGCAGAAC ACGTGCGTCA GGAAGCCTGG 360TCCGGGATGC CCAGCGCTGC TCCCCGGGCG CTCCTCCCCG GGCGCTCCTC CCCAGGCCTC 420CCGGGCGCTT GGATCCCGGC CATCTCCGCA CCCTTCAAGT GGGTGTGGGT GATTTCGTAA 480GTGAACGTGA CCGCCACCGG GGGGAAAGCG AGCAAGGAAG TAGGAGAGAG CCGGGCAGGC 540GGGGCGGGGT TGGATTGGGA GCAGTGGGAG GGATGCAGAA GAGGAGTGGG AGGG 594(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO17CCCCAGGAGC AGCAGCATCA G 21(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO18AGGCTTCGAG CGCAGCAGCA T 21(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度22(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO19GTAATACGAC TCACTATAGG GC 22(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO20ACTATAGGGC ACGCGTGGT 19(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO21CTTGGGCTCA CCTGGCTGCT C 21(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCTCTGTAG ATGTGCTATA CAC 23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度22
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu) 線狀(xi)序列描述SEQ ID NO23GCATCTTAGC CGTCTTTCTT CG 2權(quán)利要求
1.包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9的核苷酸63-721。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸如SEQ IDNO9或13中所示。
5.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的區(qū)段，該區(qū)段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
6.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含如SEQ IDNO10或14中所示的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區(qū)段，該區(qū)段具有所述類肝素酶催化活性。
8.權(quán)利要求1的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
9.包含與編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸鏈至少一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列的單鏈多核苷酸片段。
10.權(quán)利要求9的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO9或13的至少一部分。
11.包含編碼具類肝素酶催化活性之多肽的多核苷酸序列的載體。
12.權(quán)利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
13.權(quán)利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9的核苷酸63-721。
14.權(quán)利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列是SEQ ID NO9或13中所示序列。
15.權(quán)利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO9或13的區(qū)段，該區(qū)段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
16.權(quán)利要求11的載體，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
17.權(quán)利要求11的載體，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區(qū)段，該區(qū)段具有所述類肝素酶催化活性。
18.權(quán)利要求11的載體，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
19.一種包含外源多核苷酸片段的宿主細(xì)胞，其中所述外源多核苷酸片段包含編碼具類肝素酶催化活性的多肽的多核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-1691，或SEQ ID NO13的核苷酸139-1869。
21.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9的核苷酸63-721。
22.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列是SEQ IDNO9或13中所示序列。
23.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列包含SEQID NO9或13的區(qū)段，該區(qū)段編碼具所述類肝素酶催化活性的所述多肽。
24.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多肽包含如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區(qū)段，該區(qū)段具有所述類肝素酶催化活性。
26.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述多核苷酸序列選自雙鏈DNA、單鏈DNA或者RNA。
27.一種表達(dá)重組類肝素酶的宿主細(xì)胞。
28.包含具類肝素酶催化活性的多肽的重組蛋白。
29.權(quán)利要求28的重組蛋白，其中所述多肽包含SEQ ID NO10或14的區(qū)段。
30.包含能與SEQ ID NO9的核苷酸1-721雜交的多核苷酸序列的多核苷酸片段。
31.如SEQ ID NO9或13中所示的多核苷酸序列。
32.與SEQ ID NO10或13同源的多核苷酸序列。
33.如SEQ ID NO10或14中所示的氨基酸序列。
34.與SEQ ID NO10或14同源的氨基酸序列。
35.一種包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的藥物組合物。
36.一種包含過量表達(dá)類肝素酶催化活性的細(xì)胞的類肝素酶過量表達(dá)系統(tǒng)。
37.調(diào)節(jié)肝素結(jié)合性生長因子、對肝素結(jié)合性生長因子和細(xì)胞因子的細(xì)胞應(yīng)答、與血漿脂蛋白的細(xì)胞相互作用、對病毒、原生動(dòng)物和細(xì)菌感染的細(xì)胞易感性或者神經(jīng)變性斑分解的調(diào)節(jié)子，其中包含具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分。
38.包括含有具類肝素酶催化活性的重組蛋白作為活性組分的醫(yī)療裝置的醫(yī)療設(shè)備。
39.權(quán)利要求11的載體，其中所述載體是桿狀病毒載體。
40.權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
41.權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
42.鑒定鋪展的染色體中含人類肝素酶基因的染色體區(qū)的方法，包括以下步驟(a)將鋪展的染色體與編碼類肝素酶的標(biāo)記多核苷酸探針雜交；(b)洗滌鋪展的染色體，從而除去過剩的未雜交探針；(c)搜尋與所述雜交的標(biāo)記多核苷酸探針相關(guān)的信號，其中探測到的信號指示含人類肝素酶基因的染色體區(qū)。
全文摘要
編碼具類肝素酶活性的多肽的多核苷酸,包括該多核苷酸的載體,表達(dá)類肝素酶的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和具類肝素酶活性的重組蛋白。
文檔編號A61M15/00GK1272886SQ98809759
公開日2000年11月8日 申請日期1998年8月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月2日
發(fā)明者I·佩克, I·弗羅達(dá)夫斯基, E·菲斯坦因 申請人:洞察策略與營銷有限公司, 哈達(dá)斯特醫(yī)療研究服務(wù)和開發(fā)有限公司