專利名稱：：紅曲霉突變株及其發(fā)酵得到黃色素的方法紅曲霉突變株及其發(fā)酵得到黃色素的方法財(cái)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種菌株及其發(fā)酵方法，特別是一種紅曲霉突變株及其發(fā)酵得到黃色素的方法。背景駄歷史上，紅曲在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家被作為一種食品添加劑被廣泛應(yīng)用。有許多美國(guó)專利(U.S.PatNos.4442209和5457039)報(bào)道利用紅曲霉菌株(M膨owsps.)來(lái)生產(chǎn)紅色素，黃色素和橙色素，而這些色素都是作為主要的天然色素廣泛應(yīng)用在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。根據(jù)美國(guó)專利(U.S.Pat.No.5，429,943)報(bào)道，在紅曲霉菌代謝生產(chǎn)的色素中，紅色素和黃色素的產(chǎn)量比例接近1:1，也就是說(shuō)，代謝產(chǎn)生的色素色調(diào)接近1,并且紅曲色素顯示的色調(diào)是紅色，因而，紅曲色素在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要是紅曲紅色素。也有相關(guān)的專利(U.S.Pat.No.5013564)報(bào)道利用紅曲霉菌來(lái)代謝生產(chǎn)黃色素；而在日本專利(JP55088696和81053589)中，艦改變生長(zhǎng)代謝外界環(huán)境來(lái)生產(chǎn)黃色素的相關(guān)報(bào)道，如fflil改變發(fā)酵pH值和培養(yǎng)基成份來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素。但是，生產(chǎn)的黃色素是通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)得到，效率較低，且通過(guò)此方法得到的紅曲黃色素色價(jià)不高，色調(diào)也不高，其黃色素的產(chǎn)量是紅色素的1-2倍。得到的黃色素是一種復(fù)她素，是紅曲色素與培養(yǎng)基成分中的氮源發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成的色素衍生物，呈現(xiàn)黃色色調(diào)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株紅曲霉突變株(Momscw朋femutant)MYM2，此突變株能利用廉價(jià)的原料，艦液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素。本發(fā)明的另一目的^1過(guò)利用該紅曲霉突變株，,一種發(fā)酵得到黃色素的方法。本發(fā)明的MYM2是通過(guò)物理和化學(xué)的復(fù)合誘變得到的一株產(chǎn)黃色素高比例和高色價(jià)的紅曲霉突變株，并且是華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生化工程研究室通過(guò)不斷誘變篩選得到的。本發(fā)明中誘變菌株所用的方法是一些傳統(tǒng)微生物菌種育種的方法，包括化學(xué)物質(zhì)(如硫酸二乙酯、氯化鋰和亞硝基胍)和物理(如紫外照射)的處理。本發(fā)明中的紅曲霉突變菌株(MomscMSmutantMYM2)于2007年11月30日^i在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC2275。該菌株的菌落質(zhì)地較松疏，氈狀平坦，背面有放射狀輻射紋，邊緣平整，菌絲體初期絨毛圓形狀，菌落白色，生長(zhǎng)中期菌落為黃色，成熟期菌落為紅色，M^菌落直徑在30-40pm。本發(fā)明以Mo膨cm朋tomutantMYM2為發(fā)酵菌株，以pH值3~4.5的液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以硫酸銨和玉米漿作為主要氮源，以葡萄糖和可溶性淀粉為主要碳源，在25-35°。下發(fā)酵3-10天，搖床的裙塞為160-300r/min。在本發(fā)明中，一般的碳源和氮源可以作為培養(yǎng)基成分來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)黃色素，碳源不限制于大米粉、玉米淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘油；氮源不限于大豆粉、酵母粉、玉米漿、硫酸銨和硝酸鈉等。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的黃色素是作為一種食品添加劑，并且發(fā)酵得到的黃色素通過(guò)各種傳統(tǒng)技術(shù)能得到進(jìn)一步的純化。如通過(guò)離子交換(JP07216248),通過(guò)控制溶劑和pH值和通過(guò)乙醇抽提。另外，來(lái)源于真菌的黃色素能通過(guò)傳統(tǒng)的方法得到一定程度的純化。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的黃色素能應(yīng)用到食品、服裝領(lǐng)域，如果通過(guò)進(jìn)一步的分離純化能應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的目的在于通過(guò)液態(tài)發(fā)酵技術(shù)，提供一種利用廉價(jià)原料，以Momycuy朋^mutantMYM2為生產(chǎn)菌株，ffiil—定的工藝優(yōu)化，生產(chǎn)得到高色調(diào)的黃色素。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。黃色素和紅色素的分析^M過(guò)液態(tài)發(fā)斷導(dǎo)到的發(fā)酵液進(jìn)行離心，沉淀用70%乙醇抽提，抽提液經(jīng)皿當(dāng)?shù)南♂?，用紫外分光光度?jì)于410nm和51Qnm兩個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度檢測(cè)，其中410nm為黃色氣510nm為紅色素。410nm的吸光度值和510nm的吸光度值的比值(即色調(diào))來(lái)判斷黃色素質(zhì)量的高低，比值(色調(diào))越高說(shuō)明黃色素的比例越大。圖l為紅曲黃色素的吸收光譜圖(翻偽70%乙酌。具體實(shí)式實(shí)施例l:菌株的誘變和突變株的篩選。#o/7asc"s朋Aa菌株接種在麥芽汁瓊脂(糖份10%的麥芽纟，10%，瓊脂2%)斜面上，在31。C培養(yǎng)2-3天后，用5mL生理鹽水沖洗菌種斜面的菌體(苔)，經(jīng)玻，打散，無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，制成含孢子1X105個(gè)/mL懸浮液。在15W紫外燈，距離30cm下照射,同時(shí)磁力攪沐紅光下涂平板(含一定濃度氯化鋰的麥芽汁瓊脂平板)，避光培養(yǎng)。培養(yǎng)2-3天后用5mL生理鹽水沖洗菌種斜面的菌體(苔)，經(jīng)玻打歉無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，制成含孢子"105個(gè)/mL懸浮液。取一定量的孢子懸浮液，加入一定量的硫酸二乙酉旨配制成一定濃度，振蕩30min，然后加入硫代硫,終止反應(yīng)。然后倒平板(含一定濃度氯化鋰的麥芽汁瓊脂平板)，培養(yǎng)2-3天后用5mL生理鹽7jC沖洗菌種斜面的菌體(苔)，經(jīng)玻璃珠打散,無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，制成含孢子1X105個(gè)/mL懸浮液。菌懸液加入一定濃度的亞硝基胍,3rC充分振蕩處理30min,離心去上清液，然后用pH7.O的磷酸緩沖液等梯度大量稀釋孢子沉淀以終止反應(yīng)。然后倒平板(麥芽汁瓊脂平板)培養(yǎng)2-3天。通過(guò)皿顏色來(lái)衫隨突變菌株。最后通過(guò)平板培養(yǎng)來(lái)篩選穩(wěn)定性菌株，^謎的形態(tài)穩(wěn)定性菌ttffiii液態(tài)發(fā)酵(培養(yǎng)基成分:玉微7%，硫酸銨1.5%，氯化鈣O.01%，磷酸二氫鉀0.5%,pH4左右)來(lái)驗(yàn)證突變菌株的穩(wěn)定性。突變菌株在麥芽汁瓊脂平板于3rC下培養(yǎng)2-3天，然后用無(wú)菌水洗子，制成孢子個(gè)數(shù)為105個(gè)/mL左右的孢子懸浮液，然后吸取1毫升孢子懸浮液加到30毫升(250毫升的三角瓶，裝液量為30毫升)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在魏為200r/min和3rC下培養(yǎng)6-7天，發(fā)Mm過(guò)離心，用7W乙醇抽提菌體，再離心得到的上清Mii適當(dāng)?shù)南♂專?10nm和510nm下進(jìn)行吸光度檢測(cè)，所有實(shí)驗(yàn)均三個(gè)平行，突變菌,續(xù)進(jìn)行5代的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表l所示，表l為MYM2產(chǎn)黃色素穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。表l的數(shù)據(jù)顯示誘變得到的突變菌株生長(zhǎng)代謝性狀比較穩(wěn)定。表lMYM2傳代微123456黃色素色價(jià)(U/raL)胞內(nèi)色調(diào)鵬卜色調(diào)27.5±0.153.1±0.0353.5±0.07629.8±0.173.2±0.0943.4±0.02427.6±0.203.0±0.0383.27±0.0224.8±0.233.1±0.0923.4±0.01125.6±0.143.2±0.0683.4±0.05126,2±0.193.1±0.0763.3±0.025最后得到的菌株形態(tài)。圖l為紅曲霉突變菌株在麥芽汁瓊脂平板上的菌落形態(tài)。該菌株的菌落質(zhì)地較松疏，氈狀平坦，背面有放射狀輻射紋，邊緣平整，菌絲體初期絨毛圓形狀，菌落白色，生長(zhǎng)中期菌落為黃色，成熟期菌落為紅色，旨菌落直徑在30-40pm。圖l為紅曲黃色素的吸收光譜圖(溶劑:70%乙醇)，圖1表明，突變菌株代謝形成的黃色素在410nm波段左右有最大吸收峰。突變菌株與本實(shí)驗(yàn)室保藏的紅曲霉出發(fā)菌株發(fā)酵液色調(diào)的對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2，其數(shù)據(jù)顯示突變得到的紅曲霉突變菌株MYM2代謝形成的色素發(fā)酵液的黃色素色調(diào)比其它紅曲霉菌株代謝形成的色素發(fā)酵液的黃色素色調(diào)要敲艮多。_^_^_菌株鵬卜色調(diào)胞內(nèi)色調(diào)總色調(diào)Mo羅泌油M531.51±0.0201.32±0.0191.36±0.056Afo順oispw77ure泌M321.23±0.0591.40±0.0471.37±0.0677Wbmscusn^6erKRM121.27±0.0261.26±0.0901.26±0.084JWbmsaa/^ousMPM2451.42±0.0491.83±0.0921.73±0.067MomscusraW^MRM241.34±0.0351.28±0.0791.30±0.030McwoscMsawfe(mutantMYM23.30±0.0253.12±0.0763.21±0.127實(shí)施例2:黃色素發(fā)酵生產(chǎn)pH的選擇根據(jù)實(shí)施例1種所述方法，#o/7asc〃s朋hmutantMYM2的孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下玉米粉70g/L，硝酸鈉30g/L，F(xiàn)eS04.7H200.01g/L,CaCl20.1g/L，KH2P045g/L,培養(yǎng)基初始pH值分別為2.0,3.0，3.5,4.0，4.5，5.0,6.0。培養(yǎng)^#為3rC和200r/min下振蕩培養(yǎng)6-7天，發(fā)酵液離心后，菌絲體用70%乙醇等#^抽提一小時(shí)，離心上清液于410nrn和510nrn下用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸M，結(jié)果如表3所示。表3為不同pH對(duì)紅曲色素色調(diào)的影響。結(jié)果顯示培養(yǎng)基初始pH值在3-4..5最適合黃色素的代謝形成。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施伊J3:黃色素發(fā)酵^氮源的選擇根據(jù)實(shí)施例2所述方法，朋hmutantMYM2的孢子懸浮液接種于發(fā)^i咅養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下玉米粉70g/L，氮源30g/L，F(xiàn)eS04.7H200.01g/L，CaCl20.1g/L，KH2P045g/L。玉米漿，硝酸鈉，蛋白胨胰蛋白胨，酪蛋胨，酵母抽提物，尿素,.草酸銨，硫酸銨，硝酸銨和M酸三銨作為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源。培養(yǎng)斜牛為25'C和160r/min下培養(yǎng)10天，發(fā)酵液離心后，菌絲體用70%乙醇等體積抽提l小時(shí)，離心后上清液于410nm和510nm下用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度。其結(jié)果如表4，表4為混合氮源(硫酸銨加玉米漿)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，硫酸銨是一種有利于黃色素代謝形成的無(wú)機(jī)氮源，玉米漿是一種有禾盱黃色素代謝形成的有機(jī)氮源。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4:黃色素發(fā)酵^碳源的選擇根據(jù)實(shí)施例2所述方法，其培養(yǎng)斜牛為35。C和300r/min下培養(yǎng)3-4天，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。艙/7asc"s朋hmutantMYM2的孢子懸浮液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下碳源70g/L，硫酸銨1.5%，玉米漿1.0%，F(xiàn)eS04.7H200.01g/L，CaCl20.1g/L，KH2P045g/L。淀粉，麥芽糖，蔗糖，葡萄糖和甘油作為碳源。發(fā)培養(yǎng)方法和色素檢測(cè)方法如實(shí)施例2中所述。結(jié)果如表5。表5為單一碳源對(duì)色調(diào)的影響。淀粉和葡萄糖混合碳源的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6。結(jié)果表明，淀粉和葡萄糖的混合碳源X憤色素的代謝形成有利，色調(diào)也比較高。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>綜上所述，ii31紅曲霉突變株M/7asm9a/2AamutantMYM2發(fā)酵得到的黃色素的色調(diào)和色價(jià)都比較高，并且能利用廉價(jià)的原料aa液態(tài)發(fā)酵得到，得到的黃色素是一種天然的微生物來(lái)源的食品級(jí)色素。權(quán)利要求1、一種紅曲霉突變株MonascusankamutantMYM2，保藏編號(hào)為CGMCC2275。2、一種權(quán)利要求1所述的紅曲霉突變株發(fā)酵得到黃色素的方法，其特征在于，以pH值3~4.5的液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以硫酸銨和玉米漿作為主要氮源，以葡萄糖和可溶性淀粉為主要碳源，在25-35。C下發(fā)酵3-10天，搖床的繊為160-300r/min。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述氮源為大豆粉、酵母粉、玉米漿、硫酸銨或硝酸鈉。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源為大、玉米淀粉、大米淀粉、小麥淀粉、葡萄糖、麥穿糖、蔗糖或甘油。全文摘要本發(fā)明涉及一種紅曲霉突變株及其發(fā)酵得到黃色素的方法，該紅曲霉突變株MonascusankamutantMYM2于2007年11月30日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC2275。該紅曲霉突變株發(fā)酵得到黃色素的方法如下以pH值3～4.5的液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，以硫酸銨和玉米漿作為主要氮源，以葡萄糖和可溶性淀粉為主要碳源，在25-35℃下發(fā)酵3-10天，搖床的轉(zhuǎn)速為160-300r/min。發(fā)酵得到的黃色素著色能力非常強(qiáng)，耐高溫，對(duì)金屬離子穩(wěn)定，在寬pH值下穩(wěn)定，主要為脂溶性黃色素，能與其它色素復(fù)合使用。文檔編號(hào)C12N1/14GK101235353SQ20071003252公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2007年12月14日優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日發(fā)明者吳振強(qiáng),波周,楊曉暾,梁世中,王菊芳申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)