專利名稱：：一種阿特拉津除草劑降解菌及其菌劑制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種阿特拉津除草劑降解菌及其菌齊糊備方法，屬于生物高
技術領域：
領域，是利用微生物的技術降解化學除草劑，適用于現(xiàn)代農業(yè)生產中綠色無公害農產品的生產與深加工。
背景技術：
：T^六、DDT等化學農藥的使用大大^iS了現(xiàn)代農業(yè)的發(fā)展，為農業(yè)產品產量和質量的提高作出了重要的貢獻，并極大提高了農業(yè)生產的勞動效率和機械化程度。然而，這些AI合成并釋放到環(huán)境中去的農用化學物質對人類健康和生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的潛在風險，農藥大量使用引起的農產品中農藥殘留超標，嚴重影響了人民的身體健康及農產品的出口柳〔。隨著人民生活7jC平的提高和環(huán)境保護意識的增強，全社會對農藥殘留帶來的直接危害和潛在影響越來越關注，人們迫切需要無農藥殘留清潔的綠色無公害農產品。但從目前我國的農業(yè)生產形式和人口狀況來看，以停止農藥使用降低農業(yè)產量為代價的無公害生產模式幾乎是行不通的，農藥作為控制病蟲害的有效手段還將繼續(xù)在農業(yè)生產中發(fā)揮巨大的作用。另外，一些菜農片面追求經濟效益，施用高毒、高殘留農藥，導致農藥殘留量嚴重超標。據(jù)2000年國家質檢總局數(shù)據(jù)，全國47.5%的蔬菜農藥殘留超標。如何解決農業(yè)生產中的這個兩難問題成為科學家們關注的熱點。農藥殘留微生物降解技術是一種新型原位生物修復技術。它利用微生物種類繁多、代謝類型極為豐富等生物多樣性原理與特點，通過篩選高效農藥殘留降解菌株，并經現(xiàn)代化工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵制成菌劑，利用微生物所產生的酶類應用于農藥殘留的降解，達到清除土壤、水體、農產品中有機污染物的目的，并以此為核心技術，與其他配套技術相組合，建立一套生產體系，生產纟tfe、無公害農產品。這種技術可以克服物理、化學處理修復難度大、成本高，還會有二次污染的缺陷。阿特拉津屬于均三氮苯類除草劑，三氮苯類除草劑開發(fā)較早，1952年合成了第一個三氮苯類除草劑阿特拉津，1957年商品化。我國從20世紀80年代初開始^ffl阿特拉津，近年來使用面積不斷擴大，每年用量平均以20%的速度遞增。在我國，P可特拉津是北方旱田主要作物玉米、高粱、果茶園等常用P余草劑。低劑量長期接觸阿特拉津會對人體的免疫和神經系統(tǒng)健康造成劍辦，對人類17(3-雌二醇種性激素與其受體結合產生影響，因此均被美國環(huán)保局列為可奏超文癌物質及內分泌干擾物質。人們在發(fā)現(xiàn)了阿特拉津的危害之后，就一直致力于尋找能夠降解或礦化阿特拉津的微生物，直至1993年，世界上才有不同的實驗室相繼報道了降解阿特拉津的純菌株或混合培養(yǎng)物。但對于采用微生物菌劑對阿特拉津污染環(huán)境進行綜合治理，目前尚未見比較成熟的報道。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是Jlf共一種阿特拉津除草劑降解菌及其菌劑制備方法，針對目前農業(yè)生產實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的農藥殘留降解菌劑，使用本菌齊何以鄉(xiāng)可特拉津除草劑,率87%以上，且生產成本和使用成本均較低。使用該降解菌劑可在農作物的生長過程中正常使用化學除草劑阿特拉津進行草害防治，從而保證農產品中阿特拉津殘留含量符合綠色食品要求。本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提供一種阿特拉津降解菌，該菌株為革蘭氏染色反應陰性的陰溝腸桿菌(五"tera^cterc/oac"e)，主要生物學特性為G—，菌體為桿狀，周生鞭毛；兼性厭氧，37"C時發(fā)酵葡萄糖產酸產氣；檸檬酸鹽i式驗、過氧化氫酶i式驗、VP.試驗陽性；明膠液化緩侵；氧化酶逸驗、M.R.試驗、吲哚試驗陰性；會g夠利用機、蔗糖和甘露醇，不能水解淀粉；能夠利用KN03和(NH4)2S04作為氮源。能利用阿特拉津為唯一碳源和能源進行生長，將其徹底礦化為C02和水及簡單的無機化合物。在實驗室條件搖瓶實驗中，阿特拉津除草劑降解率達87%以上。該菌的最適生長pH為7.07.2，最適生長溫度為3(TC。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產。使用，阿特拉津降解菌生產菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種子液—種子罐—發(fā)酵罐—產品(包裝劑型為液體菌劑或采用玉米芯粉吸附分裝成固體菌劑)。詳細實施歩驟為O將阿特拉津降解菌斜面種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，按質量百分數(shù)計，肉湯培養(yǎng)基配方如下牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaC10.5%，pH7.0-7.2，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2)將上述培養(yǎng)好的菌液按10%體積接種量轉入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用培養(yǎng)基配方為(均為質量比)葡萄糖1-2%，(NH4)2S041%，K2HP040.2%，MgSO40.05%，NaC10.01%，蛋白胨0.05%，余量為水，pH7.0-7.2;3)將種子液按照5-15%體積接種量轉入發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基與種子罐相同；4)在種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為l:(0.6-1.2)，攪拌速度為180-240轉/5H中，培織度為30-35。C，發(fā)酵時間為24-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)駄到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后±咅養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶力嗜成液體制劑頓用玉米芯粉吸附分裝成固體菌劑。本發(fā)明中，接種量是指占培養(yǎng)基的體積百分比。本發(fā)明的有益效果如下1、本發(fā)明提供了一種化學除草劑阿特拉津陶軍菌，實驗室生物糊軍實驗結果表明，對阿特拉津卩賴率率達到87%以上。2、使用該發(fā)明生產的農藥殘留卩,菌劑具有生產成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，適合在全國果茶糧食生產出口基地或纟絶食品生產基地大面積推廣使用，特別是我過北方，、高粱大面積種植區(qū)。本發(fā)明對于保護生態(tài)環(huán)境，保護人民的身體健康，提高農產品的附加值具有重要意義，可大大降低生產和使用過程中的工作量，降低生產和使用成本。使用該降解菌齊何以在農作物正常生長過程中正常j頓化學除草劑阿特拉津防治草害從而保證農產品中阿特拉津殘留含量符合綠色食品要求。此外，該菌為革蘭氏陰性菌，在田間的存活時間適當，不會影響以后農藥的使用效果。3、田間試驗表明，采用本發(fā)明生產的降解菌劑直接施用于農作物，可使作物中阿特拉津殘留量降低85%以上。本發(fā)明成功解決了農業(yè)生產中農藥阿特拉津殘留超標問題，既充分發(fā)揮了阿特拉津在植物草害防治中的高效決速作用，又可以生產出綠色環(huán)保的農產品。4、本領域中，公知的革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌只是一種病原菌(如引起腹泄等)，本發(fā)明將革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌用于三氮苯類除草劑阿特拉津降解菌，其酶制劑性價比較高，易大規(guī)模推廣使用。具體實施方式實施例1采集中國科學院沈陽生態(tài)站連續(xù)12年施用阿特拉津的玉米田表層土壤。取10g土壤，加入90ml蒸餾水，制作土壤懸液，以10%的體積比例接入阿特拉津唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中(阿特拉津濃度為5mg/L)，無機鹽培養(yǎng)基的配方為(均為質量比)NH4N030.2%，KH2PO40.3%，K2HP040.15%，CaCl20.001%，MgS04.7H200.2%，F(xiàn)eSO4.7H2O0.001%，pH7.0-7.2，28°C，120rpm富集培養(yǎng)12hrs，富集培養(yǎng)三次。用第三次的富集培養(yǎng)液按10%的體積比例接入相應的培養(yǎng)基中，同時阿特拉津濃度提高至10mg/L，在同樣的^#下培養(yǎng)，富臟次。同樣用第三次培養(yǎng)液以10%的體積比例接入相應的培養(yǎng)基中，阿特拉牽濃度升高至20mg/L，富集三次后，獲得混合培養(yǎng)物。取最終富集培養(yǎng)液稀釋度涂平板，挑取單亂搖瓶實驗復證降解性能，選取降解能力較強的菌株接種試管斜面。經16SrDNA序歹U分析，與五"tera&ctercfoflcaeATCC13047同源性高達100%(GenBank登錄號AJ251469)，因此可認為與其為同一菌株，革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌也可以ililATCC在中國的代理商(如北京中原公司)進行商業(yè)購買。主要生物學特性為G—，菌體為桿狀，周生鞭毛；兼性厭氧，37"C時發(fā)酵葡萄糖產酸產氣;檸檬酸鹽試驗、過氧化氫酶試驗、VR試驗陽性；明膠液化緩慢；氧化酶試驗、Mi試驗、吲哚i離陰性；能夠禾傭7KH、蔗糖和甘露醇，不能水解淀粉；會詢多利用KN03和(NH4》S04作為氮源。實施例2取實施例1中或市購革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌的斜面接種于200ml肉湯培養(yǎng)基中，按質量百分數(shù)計，肉湯培養(yǎng)基配方如下牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，余量為水，pH7.0-7.2，恒溫振蕩培養(yǎng)至X寸數(shù)期，獲得菌液，準^妾種種子罐。種子罐500L，投料量為400L，培養(yǎng)基配方為(均為質量比)葡萄糖1-2%，(NH4)2S041%，K2HP040.2%,MgS040.05%,NaCl0.01%，蛋白胨0.05%,pH7.0-7.2。投料完畢后12rC高壓濕熱滅菌，冷卻至35。C后，將上述培養(yǎng)好的搖并隨液按照10%體積接種量轉入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長肌攪拌速度為220轉/分鐘，無菌空氣的通氣量為l:0.8。將達到X寸數(shù)期的種子液按10%體積接種量轉入發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵罐所用培養(yǎng)基與種子罐相同。發(fā)酵罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的發(fā)酵罐Ukg/cm2的壓力下，12rC高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35。C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的發(fā)酵罐溫度控制在30-35°C，培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8-1.0，攪拌速度為240轉/分鐘，發(fā)酵時間為48-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)駄到10億個/ml以上。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體制劑或采用玉米芯粉吸附分裝成固體菌劑。應用例1在實驗室^^牛下，應用實施例2中的液體P絲早菌劑，按1%體積接種量接種于實施例1的無機鹽培養(yǎng)基中，ffi31搖瓶實驗顯示出對阿特拉津具有較強的陶率作用，對另一種典型的三氮苯類除草劑西瑪津也具有一定的卩絲率效果(見表l)。表1.革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌X邪可f寺拉津和西瑪津的降解<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種阿特拉津除草劑降解菌，其特征在于，該菌株為革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌。2、一種阿特拉津除草劑卩絲軍菌的菌劑制備方法，其特征在于，具體歩驟如下:1)將革蘭氏染色陰性的陰溝腸桿菌的斜面種接種于肉湯培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；2)將上述培養(yǎng)好的菌液按5畫15%體積接種量轉入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按質量百分比計，種子罐所用培養(yǎng)基配方為葡萄糖1-2%，(NH4)2S041%，K2HPO40.2%，MgSO40.05%，NaC10.01%，蛋白胨0.05%，余量為水，pH7.0-7.2;3)將種子液按照5-15%體積接種量轉入發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā),戶;f用培養(yǎng)基與種子罐相同；4)在種子罐和發(fā)酵罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為h0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉">1中，培im度為30-35'C，發(fā)酵時間為24-60小時，發(fā)酵結束后菌體數(shù)Sii到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶，或包裝瓶分裝成液體制劑，或采用玉米芯粉吸附分裝成固體菌劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種阿特拉津除草劑降解菌及其菌劑制備方法，屬于生物高
技術領域：
，是利用微生物的技術降解化學除草劑，適用于現(xiàn)代農業(yè)生產中綠色無公害農產品的生產與深加工。所用菌株為陰溝腸桿菌，菌劑生產工藝為斜面種→搖瓶種子液→種子罐→發(fā)酵罐→產品。本發(fā)明針對目前農業(yè)生產實踐中的實際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的農藥殘留降解菌劑，降解菌劑直接施用可使農作物中阿特拉津殘留量降低87％以上，解決了農業(yè)生產中農藥殘留超標問題，可生產出無毒無公害的綠色農產品，從而可大幅增加農產品價值。菌劑制品價格低廉，易大面積推廣應用。文檔編號C12N1/20GK101165170SQ20071001298公開日2008年4月23日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權日2007年9月28日發(fā)明者倪志龍,史榮久,穎張,張忠澤,慧徐,慧李,楊偉超,陳冠雄,韓斯琴申請人:中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所