專利名稱：基因取代微生物及使用該微生物的聚酯制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)改良的微生物抹、以及利用該微生物抹的PHA制造方法， 所述改良的微生物抹在微生物降解聚酯的聚幾基鏈烷酸(PHA)的商業(yè)生產(chǎn) 上是有用的。
背景技術(shù)：
聚羥基鏈烷酸是可由多種微生物產(chǎn)生的聚酯型有機分子聚合物。這些 聚合物是具有生物降解性的、熱塑性高分子，此外，其可以由可再生資源 生產(chǎn)，因而，進行了將其作為環(huán)境和諧型材料或生物適應型材料進行工業(yè) 生產(chǎn)，應用于各個產(chǎn)業(yè)的嘗試。
構(gòu)成該聚酯的單體通用名為3-羥基鏈烷酸，具體地，通過使3-羥基丁 酸、3-羥基吉草酸、3-羥基己酸、3-羥基辛酸、或者更長烷基鏈的3-羥基鏈 烷酸單獨重合或共聚來形成聚合物分子。作為3-羥基丁酸(以下，簡稱為3HB) 的均聚合物的聚3-羥基丁酸(以下，簡稱P(3HB)), P(3HB)是1925年在巨大 芽胞桿菌(Sac/〃w meg加en'wm)中首次發(fā)現(xiàn)的，但該P(3HB)的結(jié)晶性高，其 性質(zhì)硬且脆，其應用范圍受到了實用性的限制。因此，進行了以改良其性 質(zhì)為目的地研究。
這其中，公開了由3-羥基丁酸(3HB)、 3-羥基吉草酸(3HV)構(gòu)成的共聚 體(以下，簡稱P(3HB-co-3HV))的制造方法(例如，參照專利文獻l、專利文 獻2)。該PpHB-co-:3HV)較PpHB)更富柔軟性，因此，可以i/v為其具有更 廣泛的應用。然而，實際上，即4吏增加3HV的摩爾比率，P(3HB-co-3HV) 的物性也缺乏隨之發(fā)生的變化，特別是柔軟性并不提高，因此，其只能應 用在洗發(fā)液瓶、 一次性剃刀的把手等硬質(zhì)成型體領(lǐng)域。
此外，已知由烷基鏈的碳原子數(shù)為6~16的3-羥基鏈烷酸構(gòu)成的中鏈 PHA，與P(3HB)、 P(3HB-co-3HV)相比結(jié)晶性低、富有彈力(參照非專利文 獻l)、可以期待其在不同領(lǐng)域的應用。在中鏈PHA的制造研究方面，進行 了下述研究將假單胞菌屬CP化wc/omo"w)的PHA合成酶基因?qū)爰賳伟?br> 3屬、雷氏菌屬(i a/加m^)、大腸桿菌，但生產(chǎn)性均低，不適用于工業(yè)生產(chǎn)(參 照非專利文獻2、非專利文獻3、非專利文獻4)。
近年來，進行了 3HB和3-羥基己酸(以下，簡稱3HH)的2成分共聚聚 酯(以下，簡稱P(3HB-co-3HH))及其制造方法的研究(參照專利文獻3、專利 文獻4)。這些報告中的P(3HB-co-3HH)制造方法是這樣的使用從土壤中分 離出的豚鼠氣單胞菌G4eromo"w cm;/fle),從油酸等脂肪酸或橄欖油等油脂 進行發(fā)酵生產(chǎn)。此外，還開展了關(guān)于P(3HB-co-3HH)的性質(zhì)的研究(參照非 專利文獻5)。在該報告中，以碳原子數(shù)12個以上的脂肪酸為唯一碳源來培 養(yǎng)豚鼠氣單胞菌，發(fā)酵生產(chǎn)3HH組成為11 19mol。/。的P(3HB-co-3HH)。可 知P(3HB-co-3HH)隨著3HH組成的增加，逐漸從P(3HB)的硬且脆的性質(zhì) 轉(zhuǎn)而顯示柔軟的性質(zhì)，并顯示出超過P(3HB-co-3HV)的柔軟性。即，通過改 變3HH的組成，P(3HB-共聚-3HH)可具有從硬質(zhì)聚酯到軟質(zhì)聚酯的廣范圍 的可應用物性，因此可望應用于從諸如電視機外殼等要求硬度的產(chǎn)品到諸 如膠片等要求柔軟性的產(chǎn)品的廣闊領(lǐng)域。然而、本制造方法中，聚酯生產(chǎn) 性低(菌體生產(chǎn)量4g/L、聚酯含量30%)，還不能充分地說其是面向本聚酯的 實用化的生產(chǎn)方法，因此，對面向?qū)嵱没目色@得更高生產(chǎn)性的方法進行 了探索。
以P(3HB-co-3HH)的工業(yè)生產(chǎn)目標進行了 一些努力。使用嗜水氣單胞菌 G4en9momw/z;^raj!7/n7a)進行培養(yǎng)時，在以油酸為碳源的43小時流加培養(yǎng)中， 生產(chǎn)出菌體產(chǎn)量為95.7g/L、聚酯含量為45.2%、 3HH組成為17%的P(3HB-共聚-3HH)(參考非專利文獻 10)。 此外，以葡萄糖和月桂酸為碳源培養(yǎng)嗜水 氣單胞菌，可達到菌體產(chǎn)量為50g/L，聚酯含量為50%，分子量為100萬道 爾頓(參考非專利文獻11)。然而，嗜水氣單胞菌對人體具有病原性(參考非
專利文獻12)，它并不是適于工業(yè)生產(chǎn)的菌種。此外，這些培養(yǎng)生產(chǎn)均使用 高價格的碳源，因此從生產(chǎn)成本的觀點出發(fā)，應該尋求利用更廉價的碳源。 因此，以安全宿主中的生產(chǎn)以及提高生產(chǎn)性為目標，進行了一些努力。 從豚鼠氣單胞菌克隆了聚羥基鏈烷酸(PHA)合成酶基因(參照專利文獻5、非 專利文獻9)。使用將該基因?qū)胝骛B(yǎng)雷氏菌CRa/"ow'a eWrop/za,舊稱 ^ca//ge"as ew^o/ /w)而得到的轉(zhuǎn)化體進行P(3HB-co-3HH)的生產(chǎn)，結(jié)果是 菌體生產(chǎn)性為4g/L、聚酯含量為30%。而且，使用植物油脂作為碳源來培 養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，結(jié)果實現(xiàn)了菌體生產(chǎn)量4g/L、聚酯含量80%(參照非專利文獻10)。而且，對培養(yǎng)方法進行了研究，通過改善培養(yǎng)條件，提高到菌體生產(chǎn)
量45g/L、聚酯含量62.5%、 3HH組成8.1。/。(專利文獻6參照)。
此外，雖然已經(jīng)構(gòu)建了能夠以果糖為碳源生產(chǎn)P(3HB-co-3HH)的 Ralstoniaeutropha，但該菌抹的聚酯生產(chǎn)性低，不能說適用于實際生產(chǎn)(參照 非專利文獻11)。
還構(gòu)建了以大腸桿菌為宿主的P(3HB-co-3HH)生產(chǎn)抹。將氣單胞菌屬的 PHA合成酶基因以及Ralstonia eutropha的NADP-乙酰乙酰基Co—A還原酶 基因等導入大腸桿菌構(gòu)建了菌抹。以十二烷為碳源培養(yǎng)該大腸桿菌的結(jié)果 是生產(chǎn)性為40.8小時培養(yǎng)時，菌體量79g/L、聚酯含量27.2%、 3HH組成 10.8%(參照非專利文獻12)。
以提高P(3HB-co-3HH)的生產(chǎn)性和3HH組成控制為目標，進行了 PHA 合成酶的人工修飾。在豚鼠氣單胞菌來源的PHA合成酶變體中，第149位 的氨基酸即天冬酰胺被絲氨酸取代的變體酶、第171位的天冬氨酸被甘氨 酸取代的變體酶顯示出在大腸桿菌內(nèi)改善PHA合成酶活性、3HH組成(非 專利文獻13參照)。此外，有報道稱該酶的518位的苯丙氨酸被異亮氨酸 取代的變體酶或214位的纈氨酸被甘氨酸取代的變體酶在大腸桿菌中的 PHA合成酶活性、聚酯含量有所提高(參照非專利文獻14)。但是，這些方 法使用特殊的大腸桿菌作為宿主，且聚酯含量仍然低，因此，有必要靈活 運用這些變體酶的特點，進行更適用于工業(yè)生產(chǎn)的改良。
使用應用重組DNA技術(shù)制作的菌抹、工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)PHA時最重要的 課題之一是導入的基因的穩(wěn)定性。基因?qū)肟梢岳檬褂觅|(zhì)粒的方法、重 組入宿主染色體的方法等。然而、已知質(zhì)粒會在重組菌增殖、分裂時脫落(參 照專利文獻7)。因此，質(zhì)粒發(fā)生脫落的菌體喪失了 PHA生產(chǎn)能力，從而商 業(yè)生產(chǎn)性低下。傳統(tǒng)上， 一般的策略是在重組菌體的培養(yǎng)中，通過在培 養(yǎng)基中添加抗生素來僅選擇性地使質(zhì)粒保有菌體繁殖并保持，但由抗生素 的使用帶來的成本提高、由培養(yǎng)廢液中的殘留抗生素造成的環(huán)境影響等成 為問題。此外，為了使質(zhì)粒穩(wěn)定化，將Rl質(zhì)粒來源的parB基因重組到P(3HB) 生產(chǎn)質(zhì)粒中，制備了重組大腸桿菌(參照非專利文獻15)。該大腸桿菌在培養(yǎng) 110-120代后基本上100%保持了質(zhì)粒。然而、質(zhì)粒仍然存在脫落的危險性。
另一方面，可以認為重組在染色體上的基因是穩(wěn)定的，報告了將PHA 合成相關(guān)基因重組到染色體上而得的微生物(參照專利文獻8、非專利文獻16、非專利文獻17)。
菌染色體上而制備的大腸桿菌抹，該大腸桿菌抹以超過細胞干燥重量的 85%的水平產(chǎn)生P(3HB)。然而、為了在大腸桿菌中產(chǎn)生實用物性良好的 P(3HB-co-3HH),必須還要共存有用于提供基質(zhì)單體的基因，或必須向培養(yǎng) 基中供給昂貴的脂肪酸等，而且，這妨礙了高生產(chǎn)效率的實現(xiàn)。而且，當 在染色體上隨機重組基因時，視發(fā)生重組的位點而定，會影響到該位點上、 或者該位點周圍的基因的表達，存在作為PHA生產(chǎn)抹不能充分發(fā)揮能力的 情況。
將外源性PHA合成酶基因以質(zhì)粒形式導入宿主時、或者重組在染色體 上時，如果是使用雷氏菌屬、假單胞菌屬等天然地生產(chǎn)PHA的微生物種作 為宿主，則會利用無法天然地生產(chǎn)PHA的菌抹。這樣的菌株是經(jīng)變異操作 而制備的，因此，與其親本抹相比，增殖能力、生物活性處于劣勢(參照非 專利文獻18、非專利文獻19、非專利文獻20等)，作為PHA生產(chǎn)抹還不能 說發(fā)揮了充分的生產(chǎn)能力。
另 一方面，報導了將Ralstonia eutropha的染色體上的PHA合成酶基因 成取代酒色著色菌(Chromatium vinosum)來源的PHA合成酶基因，積累了超 過野生抹的、占細胞干燥重量91%的P(3HB)(非專利文獻17)。然而，菌體 量低至1.8g/L,生產(chǎn)的聚酯也是硬且脆的P(3HB),而非期待有廣泛應用的 P(3HB-co-3HH)，聚酯的商業(yè)生產(chǎn)中仍存在問題。
專利文獻l特開昭57-150393號公報
專利文獻2特開昭59-220192號公報
專利文獻3特開平5-93049號公報
專利文獻4特開平7-265065號公報
專利文獻5特開平10-108682號公報
專利文獻6特開2001-340078號公報
專利文獻7特開昭59-205983號公報
專利文獻8美國專利6593116號說明書
非專利文獻1 Madison等、Microbiol.Mol,Biol.Rev., 63: 21-53(1999) 非專利文獻2Matsusaki等、J.Bacteriol., 180: 6459-6467(1998) 非專利文獻3 Matsusaki等、Appl.Micrbiol.Biotechnol., 53: 401-409(2000)非專利文獻4 Langenbach等、FEMS Microbiol.Lett., 150: 303-309(1997)非專利文獻5Doi等、Macromolecules, 28: 4822-4828(1995)非專利文獻6Lee等、Biotechnol.Bioeng.， 67: 240-244(2000)非專利文獻7Chen等、Appl.Microbiol.Biotechnol., 57: 50-55(2001)
非專利文獻8國立感染癥研究所病原體等安全管理規(guī)定別表1附表1(1999)
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題
如上述，在PHA的商業(yè)生產(chǎn)中還存在許多問題。
本發(fā)明的目的是提供在工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)工藝中可期待具有廣泛用途的、穩(wěn)定地以高水平累積共聚聚酯的重組微生物菌林、以及提供利用該重組微生物菌林的共聚聚酯制造方法。解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人為解決上述問題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將存在于染色
得的聚酯生產(chǎn)微生物能夠穩(wěn)定地以高水平累積PHA。
有提示為了使PHA的合成穩(wěn)定，在染色體上導入基因是有效的，但是，使用野生林、將其PHA合成酶基因位點特異性地取代為PHA合成酶基因、同時進行既有基因的破壞與導入基因的表達來累積共聚聚酯時的效果還不為人所知，此外，這也不能從已知技術(shù)來簡單地進行預測。
如實施例所示，將Ralstonia eutropha HI6株的染色體上的聚羥基鏈烷酸合成酶基因取代成豚鼠氣單胞菌來源的聚羥基鏈烷酸合成酶變體基因而得到的4鼓生物林，在48小時的培養(yǎng)中，以菌體生產(chǎn)量110.4g/L、聚酯含量73.8wt。/。生產(chǎn)了 P(3HB-co-3HH)。該生產(chǎn)性較已報導的P(3HB-co-3HH)的生產(chǎn)性有大幅提高。此外，還發(fā)現(xiàn)該菌林在整個培養(yǎng)工程中均無需抗生素或其它任何選擇壓力，培養(yǎng)結(jié)束時基本上所有細胞中均累積了P(3HB-co-3HH)。
即，本發(fā)明如下。
1. 一種生產(chǎn)共聚聚酯的微生物，所述共聚聚酯由選自3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十三烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十五烷酸以及3-羥基十六烷酸中的2種以上單體單元構(gòu)成，該微生物的染色體上本來具有聚羥基鏈烷酸合成酶基因，并且現(xiàn)在該聚羥基鏈烷酸合成酶基因的至少一部分已被取代成外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因。
2. 項l所述的微生物，其中，所述共聚聚酯由3-羥基丁酸和3-羥基己酸單體單元構(gòu)成。
3. 項l或2所述的微生物，其中，所述染色體上本來具有聚羥基鏈烷酸合成酶基因的微生物為真養(yǎng)雷氏菌CRa/Wom'a ei^o; /2a)。
4. 項3所述的微生物，其中，所述真養(yǎng)雷氏菌為真養(yǎng)雷氏菌H16抹。
5. 項1~4中任一項所述的微生物，其中，所述外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因編碼豚鼠氣單胞菌04womo"aw caWae)來源的酶或其變體。
6. 項5所述的微生物，其中，所述變體至少進行了以下(a)、 (b)之一的氨基酸取代
(a) 第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成絲氨酸，
(b) 第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸。
7. 項1~4中任一項所述的微生物，其中，所述外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因編碼用SEQIDNO: 9的氨基酸序列表示的豚鼠氣單胞菌來源的變體酶，該變體酶是第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成絲氨酸、且第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸而成的。8. —種微生物，其為KNK-005抹。
9. 使用了項1~8中任一項所述的微生物的聚酯制造方法。 本發(fā)明的共聚聚酯是用以下通式表示的以3-羥基鏈烷酸為單體單元的
聚合物中、由選自3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十三烷 酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十五烷酸以及3-羥基十六烷酸中的2種或3種 以上單體單元構(gòu)成的共聚聚合物。
化學式1<formula>formula see original document page 9</formula>
(式中，R^和W表示碳原子數(shù)為1以上的烷基基團，它們在聚合物中可 以相同，也可以不同。m和n表示該聚合物的單體單元數(shù)，為1以上。)。
作為上述共聚聚酯，優(yōu)選由3-羥基丁酸和3-羥基己酸的單體單元構(gòu)成。
本發(fā)明中使用的微生物，只要是屬于染色體DNA上原本具有聚羥基鏈 烷酸合成酶基因的物種的微生物即可，對其使用沒有限制，包括經(jīng)修飾而 能夠利用其它碳源的微生物、經(jīng)修飾而能夠合成或攝入基質(zhì)單體的微生物、 或者經(jīng)修飾而生產(chǎn)性提高的微生物。例如，包括Ralstonia eutropha(分類學 上與Wautersia eutropha、 Cupriavidus necator同一)等Ralstonia屬、豚鼠氣單 胞菌等氣單胞菌屬、廣泛產(chǎn)堿桿菌04/0^^""/"^ )等產(chǎn)堿桿菌屬、綠膿假 單胞菌、惡臭假單胞菌等假單胞菌屬(Pseudomonas)等細菌。從安全性和生 產(chǎn)性的觀點來看，優(yōu)選Ralstonia屬，更優(yōu)選Ralstonia eutropha,更優(yōu)選 Ralstonia eutropha H16抹。
本發(fā)明中使用的外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因，只要是各種PHA累 積生物來源的基因中的使得能夠累積共聚聚酯的基因即可，可以是任何基 因。作為這樣的基因有從例如豚鼠氣單胞菌(非專利文獻9)、珊瑚紅諾卡氏 菌(A^carafe cora〃/"a)(GenBank登錄號AF019964)、綠膿假單胞菌(Timm 等、Eur丄Biochem. ， 209: 15-30(1992》、食油假單胞菌(尸化wcfowomw 。/e,r謹)(Huisman等、J.Biol.Chem.， 266: 2191-2198(1991))、紫堇嚢硫菌(Thiocystis violaceae)(Liebergesell等、Appl.Microbiol.Biotechnol. ， 38: 493-501(1993))等分離出的聚羥基鏈烷酸合成酶基因。優(yōu)選編碼豚鼠氣單胞 菌來源的酶或其變體的基因。
此外，在不喪失目的酶活性的范圍內(nèi)，改變這些基因的一部分堿基序 列(從而使得氨基酸序列發(fā)生改變)而得的基因也是可以使用的。優(yōu)選使用例 如非專利文獻13記載的、第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成了絲氨 酸的豚鼠氣單胞菌來源的聚酯合成酶基因(N149S變體基因)，第171位的氨 基酸即天冬氨酸被取代成了甘氨酸的豚鼠氣單胞菌來源的聚酯合成酶基因 (D171G變體基因)，或者組合了上述2個氨基酸取代的、用SEQIDNO: 9 的氨基酸序列表示的豚鼠氣單胞菌來源的聚酯合成酶基因等。
上述基因可以具有啟動子和/或核糖體結(jié)合位點，但并非必要。 聚酯合成酶基因的取代方式，只要該取代使得染色體上原本存在的聚 酯合成酶基因(被取代基因)所編碼的酶活性喪失、且外源性聚酯合成酶基因 (取代基因)得以表達即可，可以是任何取代方式。取代后，被取代基因可以 完全從染色體上消失，也可以還存在一部分、還可以以被分割開的形式存 在。作為取代的一種方式，在取代基因具有核糖體結(jié)合位點，但不具有啟
外，作為取代的其它方式，在取代基因不具有啟動子和核糖體結(jié)合位點時， 可以選擇使其連接在被取代基因的核糖體結(jié)合位點的下游的取代方式?？?以選擇使得取代后所表達的聚酯合成酶蛋白為取代基因編碼的單一蛋白的 取代方式，也可以選擇使得取代后所表達的聚酯合成酶蛋白為與被取代基 因編碼的蛋白的融合蛋白的取代方式。本發(fā)明可采用的聚酯合成酶基因的 取代方式不限于以上示例，優(yōu)選的方式是這樣的將被取代基因的從起始 密碼子到終止密碼子取代成取代基因的從起始密碼子到終止密碼子。
對染色體上的基因位點特異性地進行取代的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公 知的。作為代表性方法有利用轉(zhuǎn)座子和同源重組機制的方法(Ohman等、 J.Bacteriol.， 162: 1068-1074(1985))或以同源重組機制引起的位點特異性重 組和基于第二階段的同源重組的脫落為原理的方法(Noti等、Methods Enzymol.， 154: 197-217(1987))等，此外，還可以利用這樣的方法使枯草 桿菌來源的sacB基因與取代基因共存，將sacB基因因第二階段的同源重組 而脫落(Schweizer、 Mol.Microbiol., 6: 1195-1204(1992)、 Lenz等、J.Bacteriol.,
10176: 4385-4393(1994))的微生物抹作為蔗糖添加培養(yǎng)基耐性抹容易地分離出 來，只要能夠取代染色體上的基因，對所用的方法沒有特殊限制。
以下，對將Ralstonia eutropha的PHA合成酶基因(phaCRe)取代為豚鼠氣 單胞菌的PHA合成酶基因(phaCAe)時的取代方法做更具體的示例。
首先，制備取代片段。取代片段為下述形式在phaCRe的編碼序列(CDS: 包含從起始密碼子到終止密碼子)的緊鄰(直前)上游序列上連接phaCAc的 CDS,在其后連接phaCRe的CDS的緊鄰(直后)下游序列。即，取代片段為 僅CDS被取代為phaC^的CDS的phaCReDNA片段。上游序列和下游序列 是為了與染色體上的基因發(fā)生同源重組而必需的同源序列， 一般來說，其 長度越長重組頻率越高，但只要能引起同源重組即可，對其長度可任意設(shè) 定。
取代片段上可以附加在基因取代時作為選擇標記的基因。作為選擇標 記的基因，可以使用例如卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、氨千西林等抗生 素的抗性基因，或與各種營養(yǎng)缺陷互補的基因等。在利用Ralstoniaeutropha 進行時，優(yōu)選卡那霉素抗性基因。
而且，除此之外，還可以附加下述基因，所述基因用于容易地選擇含 有選擇標記基因的區(qū)域因第二階段的同源重組而發(fā)生脫落的^[鼓生物抹。作 為這樣的基因，可以列舉出枯草桿菌來源的sacB基因(Schweizer、 Mol.Microbiol.， 6: 1195-1204(1992))。已知表達該基因的微生物抹不能在 含蔗糖的培養(yǎng)基上生長繁育，可以通過在含蔗糖培養(yǎng)基上的生長繁育，容 易地選擇該基因因脫落而喪失的菌抹。
通過將這樣構(gòu)成的取代片段連接到不在宿主微生物抹中復制的載體上 來制備基因取代用質(zhì)粒。在可在雷氏菌屬、假單胞菌屬等中利用的這樣的 載體方面，可以列舉出例如pUC載體、pBluescript載體、pBR322載體或 者與它們具有相同復制起點的載體等。而且，還可以使mob、 oriT等DNA 序列共存，上述DNA序列使得可以進行接合轉(zhuǎn)移。
以這樣的構(gòu)成制備成的基因取代用質(zhì)粒DNA，可以采用電穿孔法、接 合轉(zhuǎn)移法等公知方法導入Ralstonia eutr叩ha等微生物，可以進行同源重組。
接著，選擇基因取代用質(zhì)粒DNA因同源重組而插入染色體上的菌株。 選擇可以通過下述方法進行，所述方法利用了在基因取代用質(zhì)粒DNA上共 存的選擇用基因。當使用卡那霉素抗性基因時，可以選擇在含卡那霉素的培養(yǎng)基上長出的菌抹。
在下一階段，選擇下述菌抹，所述菌抹中的包含選擇標記基因的區(qū)域 因第二次同源重組而從染色體上脫落。可以基于插入時所利用的選擇用基
因、選擇例如在含卡那霉素的養(yǎng)基上不能生長繁育的菌抹，但當sacB基因
共存于基因取代用質(zhì)粒上時，可以容易地選擇出在含蔗糖培養(yǎng)基上長出的 菌抹。為了確認這樣獲得的菌抹是不是所希望的基因取代菌株，可以采用
PCR法、South雜交法或DNA石咸基序列測定等公知的方法。如上述操作， 可以獲得Ralstonia eutr叩ha的PHA合成酶基因(phaCRe)被豚鼠氣單胞菌的 PHA合成酶基因(phaCAc)取代的菌林。作為這樣的菌抹，可以列舉出以下實 施例中制備的KNK-005抹等。
在本發(fā)明中，通過在碳源存在下增殖本發(fā)明的微生物，可以在微生物 體內(nèi)累積共聚聚酯。作為碳源，可以使用糖、油脂或脂肪酸。作為碳源以 外的營養(yǎng)源，可以任意使用氮源、無機鹽類、其它有機營養(yǎng)源。
糖類例如有葡萄糖、果糖等碳水化合物。油脂包括富含碳原子數(shù)為10 以上的飽和.不飽和脂肪酸的油脂，例如有椰子油、棕櫚油、椋櫚仁油等。 脂肪酸例如有己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞油酸、亞麻 酸、肉豆蔻酸等飽和.不飽和脂肪酸或這些脂肪酸的脂或鹽等脂肪酸衍生物。
作為氮源，例如有氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽，其它還可以 舉出蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等。
作為無機鹽類，例如有磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、 氯化鈉等。
作為其它有機營養(yǎng)源，例如有甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、脯 氨酸等氨基酸；維生素B1、維生素B12、維生素C等維生素。
培養(yǎng)溫度，只要是該菌林可以生長繁育的溫度即可，但優(yōu)選20。C至 40°C。培養(yǎng)時間沒有特別的限定，可以為1-10日左右。
聚酯的回收，可以采用例如下述方法進行。培養(yǎng)結(jié)束后，用離心分離 器等從培養(yǎng)液中分離菌體，分離的菌體用蒸餾水及曱醇洗凈，并干燥。使
用氯仿等有機溶劑從這些干燥菌體中抽提聚酯。采用過濾等方法從含有該 聚酯的有機溶劑溶液中除去菌體成分，向該濾液中加入甲醇或己烷等不良 溶劑以沉淀聚酯。然后，可以采用過濾或離心分離等方法除去上清液，干 燥、回收聚酯。確認產(chǎn)生聚酯的簡易方法可以采用尼羅紅染色法。即，在重組菌生長
繁育的瓊脂培養(yǎng)基上加入尼羅紅，培養(yǎng)重組菌1-7天，觀察其重組菌是否變
紅，以此確認是否產(chǎn)生了聚酯。 發(fā)明的效果
本發(fā)明提供下述重組微生物抹，所述重組微生物林能夠在產(chǎn)業(yè)用發(fā)酵
過程中穩(wěn)定地高性能地生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸(PHA),本發(fā)明可以簡便、大量且 廉價地制造高純度的聚羥基鏈烷酸(PHA)。


圖1為顯示實施例1中構(gòu)建的基因取代用質(zhì)粒pBlue-phaCRe:: N149S/D171G-KmSAC的構(gòu)成的示意圖。
圖2為示意性地顯示實施例2中進行的基因取代的程序的圖。
發(fā)明的
具體實施例方式
以下，通過實施例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。 (實施例l)基因取代用質(zhì)粒的制備
以Ralstonia eutr叩ha H16抹的菌體為模板DNA的供給源，使用SEQ ID NO: l和SEQ ID NO: 2所示的引物進行PCR反應，得到了含有聚羥基鏈 烷酸合成酶基因(phaCRe)的結(jié)構(gòu)基因的DNA片段。PCR條件如下(1)94°C2 分鐘、(2)94°C30秒、(3)45°C30秒、(4)72°C3分鐘、(2)~(4)25個循環(huán)、(5)72°C5 分鐘；使用TaKaRaLATaq(TaKaRaBio公司制造)作為聚合酶。將PCR所得 的DNA片段用限制酶BamHI切割，然后亞克隆到用相同酶切割載體 pBluescriptIIKS(-)(TOYOBO公司制造)而形成的位點上(pBlue-phaCRe)。
如下述地制備作為豚鼠氣單胞菌來源的聚酯合成酶變體基因的 N149S/D171G變體。首先，將pBluescriptIIKS(-)(TOYOBO公司制造)用Pstl 處理，使用DNA Blunting Kit(TaKaRaBio公司制造)進行平末端化并進行連 接，從而使Pstl位點缺失。然后，將該質(zhì)粒進行Xhol處理，使用DNA Blunting Kit(TaKaRaBio公司制造)進行平末端化并進行連接，使Xhol位點缺失，從 而制備了質(zhì)粒pBlue-New。在該質(zhì)粒的EcoRI位點上克隆了使用相同酶從 pJRD215-EE32dl3(專利文獻5)切出的d13片段(pBlue-d13)。然后，以從理化學研究所獲得的克隆E2-50來源的質(zhì)粒(非專利文獻13)為模板,使用SEQ ID NO: 3和4所述的引物的組合以及SEQIDNO: 5和6所述的引物的組 合，分別通過PCR法進行擴增，得到了2個片段。PCR條件為(1)94'C2分 鐘、(2)94。C30秒、(3)55。C30秒、(4)72。C2分鐘、(2) (4)25個循環(huán)、(5)72°C5 分鐘。將擴增出的2個片段等摩爾混合，再進行PCR反應，使這2個片段 結(jié)合。PCR條件為(1)96。C5分鐘、(2)95。C2分鐘、(3)72。Cl分鐘、(2) (3)12 個循環(huán)，使用Pyrobest聚合酶(TaKaRaBio公司制造)作為聚合酶。將目的大 小的DNA片段從瓊脂糖電泳凝膠中切出，用Pstl和Xhol進行處理，以片 段替換的形式將其克隆在用相同酶處理的pBlue-d13 中 (pBlue-N149S/D171G)。堿基序列測定使用PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS公司制造的DNA測序儀310 Genetic Analyzer進行，確認獲 得了變異基因，其中，PHA合成酶的第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代 為絲氨酸、第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代為甘氨酸。該氨基酸序列 示于SEQ ID NO: 9。
以pBlue-N149S/D171G為模板，使用SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8 所示的引物進行PCR反應，擴增了 N149S/D171G變體的結(jié)構(gòu)基因DNA。 PCR條件為(1)94。C2分鐘、(2)94°C30秒、(3)45°C30秒、(4)72°C2分鐘、 (2)~(4)25個循環(huán)、(5)72°C5分鐘，使用TaKaRa LA Taq(TaKaRaBio公司制 造)作為聚合酶。然后，將pBlue-phaCRe用限制酶Sbfl和Csp45I進行處理， 以用相同酶處理的上述擴增DNA片段取代phaCRe結(jié)構(gòu)基因的形式進行了克 隆(pBlue-phaCRe: : N149S/D171G)。
然后，將質(zhì)粒pJRD215(ATCC37533)用限制酶Xhol和Dral進行處理， 分離出含卡那霉素抗性基因的約1.3kb的DNA片段后，使用DNABlunting Kit(TaKaRaBio公司制造)對末端進行平滑化，將其插入到了用限制酶Sail 切割pBlue-phaCRe: : N149S/D171G后同樣進行了平末端化而形成的位點 上(pBlue-phaCRe: : N149S/D171G畫Km)。
接著，將質(zhì)粒pMT5071(Tsuda、 GENE， 207: 33-41(1998))用限制酶Notl 進行處理，分離出包含sacB基因的約8kb的DNA片段，將其插入到用相 同酶切割pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-Km而形成的位點上，從而制備了 基因取代用質(zhì)粒pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-KmSAC。
本實施例中構(gòu)建的基因取代用質(zhì)粒pBlue-phaCRe ::
14N149S/D171G-KmSAC的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1。 C實施例2)基因取代林的制備
用基因取代用質(zhì)粒pBlue-phaCRe: : N149S/D171G-KmSAC轉(zhuǎn)化大腸桿 菌S17-1抹(ATCC47005),與Ralstonia eutropha H16株一起在Nutrient Agar 培養(yǎng)基(Difco公司制造)上混合培養(yǎng)，進行了接合轉(zhuǎn)移。選擇在含250mg/L 卡那霉素的Simmons瓊脂培養(yǎng)基(檸檬酸鈉2g/L、氯化鈉5g/L、七水合硫酸 鎂0.2g/L、磷酸二氫銨lg/L、磷酸氫二鉀lg/L、瓊脂15g/L、 pH6.8)上生長 繁育出的菌抹，從而得到了質(zhì)粒重組到Ralstonia eutropha H16抹的染色體 上的菌抹(第一階段的同源重組)。將該菌抹用Nutrient Broth培養(yǎng)基(Difco 公司制造)培養(yǎng)2代，然后，稀釋涂布在含15%蔗糖的Nutrient Agar培養(yǎng)基 上，選擇生長繁育出的菌林，得到了含選擇標記基因的區(qū)域已經(jīng)脫落的菌 抹(第二階段的同源重組)。而且，通過基于PCR的分析，分離出了 phaCRe 基因已被取代成N149S/D171G變體基因的菌林。將該基因取代林命名為 KNK-005抹，使用PERKIN ELMER APPL正D BIOSYSTEMS公司制造的 DNA測序儀310 Genetic Analyzer進行堿基序列測定，確認了 獲得的菌抹 中，染色體上的phaCRe基因的從起始密碼子到終止密碼子被取代成了 N149S/D171G變體基因的從起始密碼子到終止密碼子。
本實施例中進行的基因取代的程序示意性地示于圖2。通過第一階段的 同源重組，基因取代用質(zhì)粒插入到染色體中，通過第二階段的同源重組， 相當于該質(zhì)粒的部分重新成環(huán)并從染色體上脫離。在第二階段的同源重組 時，視發(fā)生同源重組的位置而定，存在兩種情況——與和原初相同的取代 基因(圖中的phaCRe: : N149S/D171G)—起脫離的情況(A1),以及，與被取 代基因(圖中的phaCRe)—起脫離的情況(A2)，本發(fā)明的KNK-005抹，是通 過在A2的位置進行第二階段的同源重組而獲得的菌抹。
(實施例3)聚酯的生產(chǎn)和純化
種子培養(yǎng)基的組成為lw/v%肉提取物、lw/v%細菌胰蛋白胨 (Bacto-Trypton) 、 0.2w/v%酵母提取物、0.9w/v%Na2PO4 . 12H20 、 0.15w/v%KH2PO4、 pH6.8。
前培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成為Uw/v% Na2P04.12H20、 0.19w/v% KH2P04、 1.29w/v%(NH4)2S04 、 0.1w/v% MgS04'7H20、 2.5w/v%Palm W 。lein油、 0.5v/v%微量金屬鹽溶液(在0.1N鹽酸中溶解1.6w/v% FeCl3 6H20、 lw/v%CaCl2 2H20、 0.02w/v% CoCl2. 6H20、 0.016w/v% CuS04. 5H20、0,012w/v% NiCl2.6H20而得)。
聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成為0.385w/v% Na2P04. 12H20、 0.067w/v% KH2P04、 0'291w/v%(NH4)2SO4、 0.1w/v% MgS04'7H20、 0.5v/v%微量金屬 鹽溶液(在0.1N鹽酸中溶解1.6w/v% FeCl3'6H20、 lw/v% CaCl2'2H20、 0.02w/v% CoCl2 6H20、0.016w/v% CuS04 5H20、 0.012w/v% NiCl2 6H20而 得)、0.05w/v。/oBIOSPUREX200K(消泡劑Cognis Japan公司制造)。在碳源 方面，使用椋櫚仁油分級的低熔點級分即棕櫚仁油油精作為單一碳源，在 整個培養(yǎng)過程中流加，使得比基質(zhì)供給速度為0.08-0.1(油脂(g))x(凈千燥菌
體重量(g))"x(h)"。
在種子培養(yǎng)基(10ml)中接種KNK-005林的甘油儲液(50pl)，培養(yǎng)24小 時，按1.0 v/v。/。接種于裝有1.8L前培養(yǎng)基的3L小型發(fā)酵罐(丸菱BIOENG 生產(chǎn)，MDL-300型)中。運行條件為培養(yǎng)溫度30°C、攪拌速度500rpm、通 氣量1.8L/min，控制pH值在6.7-6.8之間，培養(yǎng)28小時。pH值控制使用 7%氫氧化銨水溶液。
聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)是將前培養(yǎng)種子按5.0 v/v。/。接種于裝有6L生產(chǎn)培養(yǎng)基的 10L小型發(fā)酵罐(丸菱BIOENG生產(chǎn)，MDL-1000型)中。運轉(zhuǎn)條件為培養(yǎng)溫 度28°C 、攪拌速度400rpm、通氣量3.6L/min,控制pH值在6.7-6.8之間。 pH值控制使用7%氫氧化銨水溶液。培養(yǎng)進行約48小時，培養(yǎng)結(jié)束后通過 離心分離回收菌體，用曱醇洗凈并冷凍干燥，測定干燥菌體重量為110.4g/L。
向約lg所得的干燥菌體中加入100ml氯仿，于室溫攪拌一晝夜，抽提 菌體內(nèi)的聚酯。濾去菌體殘渣后，用蒸發(fā)器濃縮至總?cè)莘e為約30ml,然后 緩慢加入約卯ml的己烷，在緩慢攪拌下放置1小時。將析出的聚酯濾出后， 于50。C真空干燥3小時。測定干燥聚酯的質(zhì)量，計算菌體內(nèi)的聚酯含量。 其結(jié)果是，KNK-005林48小時產(chǎn)生的聚酯的含量高達73.8(wt%)。
(實施例4)聚酯生產(chǎn)能力的穩(wěn)定性評價
稀釋實施例3的聚酯生產(chǎn)培養(yǎng)結(jié)束時的培養(yǎng)菌液，將其接種于Nutrient Agar培養(yǎng)基，將生長繁育出的菌落接種于含尼羅紅(Nilered)培養(yǎng)基(磷酸氫 二鈉.12H20 9g、磷酸二氬鉀1.5g、氯化銨0.05g、硫酸鎂'7H2O0.02g、果 糖0.5g、氯化鈷'6H20 0.25ppm、氯化鐵(111)'61120 16ppm、氯化4丐'2&0 10.3ppm、氯化鎳'61120 0.12ppm、硫酸銅.5H20 0.16ppm、 Nilered 0.5mg、
16瓊脂15g/lL)。 30°C、培養(yǎng)3天后呈紅色的菌落可判定為正在生產(chǎn)聚酯。考
察了100個菌落，結(jié)果是全部菌落均保持聚酯生產(chǎn)能力。
工業(yè)實用性
本發(fā)明提供下述重組微生物林，所述重組微生物抹能夠在產(chǎn)業(yè)用發(fā)酵 過程中穩(wěn)定地高性能地生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸(PHA)，本發(fā)明可以簡便、大量且 廉價地制造高純度的聚羥基鏈烷酸(PHA)。
權(quán)利要求
1. 一種生產(chǎn)共聚聚酯的微生物，所述共聚聚酯由選自3-羥基丁酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十三烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十五烷酸以及3-羥基十六烷酸中的2種以上單體單元構(gòu)成，該微生物的染色體上本來具有聚羥基鏈烷酸合成酶基因，并且該聚羥基鏈烷酸合成酶基因的至少一部分已被取代成外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中，所述共聚聚酯由3-羥基丁酸 和3-羥基己酸單體單元構(gòu)成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微生物，其中，所述染色體上本來具有聚 羥基鏈烷酸合成酶基因的微生物為真養(yǎng)雷氏菌(i a/Wom'a e"&o; /za)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物，其中，所述真養(yǎng)雷氏菌為真養(yǎng)雷氏 菌H16株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的微生物，其中，所述外源性聚羥 基鏈烷酸合成酶基因編碼來源于豚鼠氣單胞菌04eromomw caw'ae)的酶或其變體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物，其中，所述變體至少進行了以下(a)、 (b)之一的氨基酸取代(a) 第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成絲氨酸，(b) 第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的微生物，其中，所述外源性聚羥 基鏈烷酸合成酶基因編碼用SEQIDNO: 9的氨基酸序列表示的豚鼠氣單胞 菌來源的變體酶，該變體酶是第149位的氨基酸即天冬酰胺被取代成絲氨 酸、且第171位的氨基酸即天冬氨酸被取代成甘氨酸而成的。
8. —種微生物，其為KNK-005抹。
9. 使用了權(quán)利要求1~8中任一項所述的微生物的聚酯制造方法。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供下述重組微生物株，所述重組微生物株能夠在產(chǎn)業(yè)用發(fā)酵過程中穩(wěn)定地高性能地生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸(PHA)。本發(fā)明為存在于微生物的染色體上的聚羥基鏈烷酸合成酶基因被外源性聚羥基鏈烷酸合成酶基因取代而得到的重組微生物株。
文檔編號C12N1/20GK101501182SQ20068005542
公開日2009年8月5日 申請日期2006年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月21日
發(fā)明者丸山裕之 申請人:株式會社鐘化;梅雷迪安股份有限公司