專利名稱：基因作圖和確定單倍型的方法
基因作圖和確定單倍型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及遺傳學(xué)領(lǐng)域。具更體說本發(fā)明涉及基因作圖方法以及測定 對象單倍型的方法。
背景技術(shù)：
基因組圖譜可描述各染色體上基因或其它標志之間的順序及它們之間的 間隔。已構(gòu)建了人類基因組的幾種不同比例或分辨水平的圖譜。分辨率最粗糙
的是基因連鎖圖，是通過各DNA標志(基因和其它可鑒定的DNA序列)在染色 體中的相對位置來描述它們的遺傳方式?；蜻B鎖圖顯示了沿染色體上各特異 性DNA標志的相對位置。個體之間不相同的可在實驗室檢測出來的任何遺傳 的生理或分子特征即是潛在的遺傳標志。這種標志可以是表達的DNA區(qū)域(基 因)或不具有已知編碼功能但其遺傳方式可被遵循的的DNA區(qū)段。DNA序列
的差異是特別有用的標志，因為它們的特征豐富和易于精確鑒定。
所述標志必須具有多態(tài)性方可用于繪制圖譜；也就是說，不同形式必須存 在于諸個體中從而在家族不同成員之間的研究中可檢測它們。多態(tài)性是DNA
序列中的變異，平均每300-500 bp發(fā)生一次。外顯子序列中的變異可產(chǎn)生可觀 察到的性狀改變，如眼球顏色、血型和疾病易感性的差異。大多數(shù)差異發(fā)生在 內(nèi)含子中，它們對器官的外觀或功能只有極小的或沒有影響，但它們可在DNA 水平被檢測到因而可用作這種標志。這些類型的標志例子包括(l)可用DNA 限制性內(nèi)切酶切割的反映DNA位點中序列變異的限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)，和(2)串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目的差異，這種短的重復(fù)序列因重復(fù)單位的數(shù)目 不同而長度不同(一種易于檢測的特征)。人類基因連鎖圖是通過觀察兩種標志 一起遺傳的頻率如何而構(gòu)建的。
位于同一染色體上互相靠近的兩種標志傾向于一起從母親傳遞給孩子。在 精子和卵細胞正常產(chǎn)生期間，DNA雙鏈偶而會斷裂，同一染色體上或同一染 色體另一拷貝(即同源染色體)上的不同位點可發(fā)生連接。這種過程(減數(shù)分裂重
組)可導(dǎo)致原先位于同一染色體上的兩種標志分離。彼此靠近的標志更緊密連 鎖的可能性不大，它們之間的重組將失敗而分離。因此重組頻率可提供對兩種 標志之間距離的估計。
此種基因圖譜的價值是患病個體存在的某DNA標志(但不患病個體缺乏此 標志)遺傳后可在此圖中定位某遺傳疾病，雖然對此疾病的分子基礎(chǔ)可能還不 了解或尚未鑒定到其負責(zé)疾病的基因。業(yè)已利用遺傳圖譜來發(fā)現(xiàn)包括囊性纖維 化、鐮狀紅細胞病、泰-薩克斯病、脆性X綜合征和強直性肌營養(yǎng)不良在內(nèi)的 一些重要疾病基因的確切染色體定位。
目前鑒定基因組中影響基因功能的基因方法具有兩個共同特征首先，利
用非編碼序列變異的標志來提示含有候選基因的染色體區(qū)域；其次，通過基因
組廣泛分析尋找此種序列變異的標志與感興趣表型之間的相關(guān)性。通過基因組
廣泛相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)基因，也稱為連鎖不平衡圖譜，是美國專利No.5，851，762
的主題。
雖然連鎖研究中利用了基因組信息，但認為關(guān)于單倍型的信息對于鑒定感 興趣基因組區(qū)域的標志而明確(基因在)疾病中的功能更為有用。采用單倍型序 列可減少連鎖研究中的錯誤，因為不需要考慮該基因涉及所研究性狀的第二拷 貝(同源染色體上提供的)造成的影響。
2003年，國立衛(wèi)生研究院設(shè)立的國際協(xié)會啟動了一項歷時三年耗資一億美 元的項目來制作人類基因組單倍型圖譜(稱為"HapM叩")，以助于通過基于單 倍型的復(fù)雜疾病中標記等位基因疾病基因相關(guān)性來發(fā)現(xiàn)基因。此種連鎖不平衡 等位基因相關(guān)性圖譜('相關(guān)性圖譜')策略涉及無關(guān)的個體病人，對于不能找 到全家族時的家族(譜系)連鎖分析的傳統(tǒng)方法而言，這是一種更為現(xiàn)代的替代 方法。
關(guān)于HapMap基礎(chǔ)的一種假設(shè)是，通過二倍體DNA基因分型推斷出的單 倍型足以分辨相關(guān)性圖譜從而保證作為基因組泛基因發(fā)現(xiàn)策略的連續(xù)性。
另一種假設(shè)是，對四種人群(西非黑人、日本人、中國人、美國人)數(shù)百位 個體的SNP(單核苷酸多態(tài)性)的分析將足以鑒定出冗余的SNP，因而足以鑒定 單倍型標記的單個SNP，或最小化SNP的套數(shù)，從而表征所有人，包括混合 人群中的單倍型部件。這種HapMap聚集體(consortium)也提示在常見的多基因
疾病中和藥物反應(yīng)性中只有常見的單倍型(>5-10%)才是最重要的，這些常見的 單倍型將在約200名個體硏究中于以鑒定。
還有一種假設(shè)是單倍體組成了不同的"部件(block)"，每個部件具有一可鑒 定的唯一SNP "標簽"。遺傳學(xué)領(lǐng)域目前接受的是利用HapMap方案所揭示的 最小必須SNP來鑒定任何人群中足夠常見的單倍型，以在致病基因搜尋和受 藥物影響的藥物基因組學(xué)研究中檢測共有的過度單倍型。
因此，該技術(shù)目前的狀態(tài)是HapM叩將是明確的，能為連鎖研究提供更充 分的信息。然而，更密切地審查該H叩Map方案后，提示該方案最佳只能獲得 有限的信息，對于揭示多基因疾病的應(yīng)用可能基本上無效。例如，SNP鑒定只 能檢測出一部分真實的單倍型，也許甚至不能檢測出所有常見的單倍型。而不 常見的單倍型(HapMap可能檢測不出)對個體之間基因功能的差異也可能有影 響。
以上假設(shè)的單倍體部件結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致錯誤。預(yù)計重組和其它重排活動將 影響混合人群中單倍型部件的構(gòu)成，這是對"核心"人群的有限分析所不能揭 示的。
當一個染色體區(qū)域中有兩個或多個基因具有不同遺傳方式(隱性、顯性、共 顯性)、具有不同功能(易感疾病、保護不患疾病)、作用于疾病進程的不同階段 時，預(yù)計推斷單倍型方法的分辨力可能受到挑戰(zhàn)。當疾病由兩個染色體所致例 如復(fù)雜的雜合子隱性疾病，且共顯性遺傳基因(如HLA復(fù)合體中的那些基因) 中發(fā)生反式及順式共顯性相互作用時，這種分辨力將受到最大挑戰(zhàn)。本領(lǐng)域還 沒有認識到這些不確定疑問的意義。
已通過譜系連鎖分析鑒定了利用單倍型相關(guān)性圖譜的關(guān)鍵性檢測所能鑒 定的感興趣基因區(qū)域。在一個重要的檢測例子中，相關(guān)性圖譜未能檢測出鼻咽 癌致病基因5 6p21.3(HLA)區(qū)(RR:下界20 -上界無限)，而單倍型共同連鎖分 析(haplotype sharing linkage analysis)能檢測出。這指出了該領(lǐng)域的另 一個問題 基于非編碼(區(qū))的策略分辨力不足，不能檢測出任何人類常見癌癥中甚至最強 的遺傳相關(guān)性。
已知或懷疑許多疾病是多基因性疾病。認為大多數(shù)疾病的確是多基因疾 病，單基因疾病是例外。由于遺傳母親和父親基因型諸基因的方式(存在差異)
使現(xiàn)有技術(shù)方法鑒定涉及多基因疾病的基因變得復(fù)雜。因此，雖然已采用了現(xiàn) 有技術(shù)的繪制基因圖和發(fā)現(xiàn)基因的方法來鑒定具有單獨遺傳方式的基因和單 獨涉及疾病的基因，但仍然明顯需要更為有力的方法來闡明復(fù)雜疾病所涉及的 基因。
因此，本發(fā)明一方面的目的是克服或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)不足的問題。具體 說，本發(fā)明的目的是利用單倍體信息提供更精確基因作圖的方法。
本申請書中包括的文件、會議記錄、物質(zhì)、裝置、引用文章等，目的只是 用于提供本發(fā)明的內(nèi)容，并不暗示或代表任何或所有這些材料構(gòu)成了在本申請 各項優(yōu)先權(quán)利要求時間之前的現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)部分，或本領(lǐng)域中與本發(fā)明有關(guān) 的共同通用知識。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及提供對象明確單倍型的方法。用本文所述方法產(chǎn)生的單倍型信 息比現(xiàn)有技術(shù)只能給出推斷的單倍型方法更為精確。因此，本發(fā)明的一方面提 供檢測對象的明確單倍型的方法，該方法包括如下步驟提供對象的基本上分 離的單倍體元件，和獲得此單倍體元件的核苷酸序列信息。申請人提出，利用 基本上分離的單倍體元件可消除對單倍型中兩個或多個基因座相(phase)作出 錯誤推斷或誤導(dǎo)推斷的問題，從而可揭示單倍型中參與的兩個或多個基因，不 會因遺傳方式的差異而復(fù)雜化。通過使用基本分離的單倍型元件作為序列分析 的起始材料本發(fā)明方法能夠確保嚴格的順式相相關(guān)性。
在所述方法的一種實施方式中，使序列信息與等位基因相關(guān)。在所述方法 的另一種實施方式中，所述等位基因是編碼序列的等位基因。
本申請人認識到在明確單倍型中，聯(lián)合利用二倍體物質(zhì)與最大可能性算法 問題本身的重要性。預(yù)計現(xiàn)有技術(shù)所用方法中的錯誤當調(diào)査具有多基因基礎(chǔ) (疾病)的性狀時將倒產(chǎn)生特別重要的問題。
在所述方法的一種實施方式中，基本上分離對象單倍體元件的步驟包括采 用二倍體物質(zhì)作為單倍體元件的來源?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何一種 方法或它們的組合，分離二倍體基因組或其一部分中的單倍體元件。在本發(fā)明 的一種實施方式中，采用物理方法，如顯微解剖法。例如，可顯微解剖通過著
絲粒切開染色體產(chǎn)生兩個染色單體。
可分離二倍體細胞，如體細胞的二倍體基因組或基因組的一部分?？杀苊?采用天然的單倍體物質(zhì)如精細胞和卵細胞，因為臨床上獲得這些性細胞存在問 題。當考慮到減數(shù)分裂過程有時會發(fā)生重組，如原先以順式連接的基因座變成 反式連接時，在單倍體分型中避免采用配子另有一種優(yōu)點。因此，分析配子的 單倍型與分析獲自二倍體細胞的單倍體元件將可能產(chǎn)生不同的(即錯誤的)單倍 型信息。
本發(fā)明另一方面內(nèi)容是利用單倍體元件來測定對象的明確單倍型。 本發(fā)明還有一方面提供測定基因區(qū)域與性狀之間相關(guān)性的方法，該方法包 括如下步驟提供多個對象的第一組單倍體元件，所述對象諸個體代表了常規(guī) 人群的遺傳多樣性，分析所述第一組單倍體元件是否存在等位基因；提供該常 規(guī)人群多個對象的第二組單倍體元件，所述對象具有(疾病)性狀，所述對象不 來自同一家族，分析所述第二組單倍體元件是否存在等位基因，測定第一組與 第二組單倍體元件之間共有等位基因的水平；存在過量的共有等位基因表明該 等位基因與此(疾病)性狀相關(guān)。在該方法的一種實施方式中，所述等位基因是 編碼序列等位基因。
本發(fā)明另一方面對多基因疾病或性狀提供鑒定其所涉及基因的方法，該方 法包括采用本文所述方法。提供本文所述明確的單倍型可消除闡述多基因疾病 系統(tǒng)中某個基因是否參與的混亂不確定性。
附圖簡述


圖1顯示人染色體6的激光壓力彈射(catapulting)的光學(xué)顯微照片。從左至 右的各分圖是分裂中期擴散、染色體6鑒定和彈射(cat叩ult)后視野。
圖2顯示另一例人染色體6彈射的光學(xué)顯微照片。左圖為鑒定，右圖為彈 射后視野。
圖3顯示染色體7彈射的CFTR外顯子10的嵌套式PCR擴增子。泳道1-3 為染色體7。泳道4為陰性對照。泳道5為陽性對照。
圖4顯示激光壓力彈射的單個染色體6s中HLA-A外顯子2的直接嵌套式 PCR產(chǎn)物。泳道1為10微升0.1%曲通X-100(Triton X-100)溶液中單個染色體
6的激光壓力彈射。泳道2為10微升0.1%曲通X-100溶液中單個染色體6的 激光壓力彈射。泳道3為10微升0.1%曲通X-100溶液中單個染色體6的激光 壓力彈射。泳道4為10微升0.P/。曲通X-100溶液中單個染色體6的激光壓力 彈射。泳道5為10微升0.1%曲通X-100溶液中單個染色體6的激光壓力彈射。 泳道6為10微升0.P/。曲通X-100溶液中單個染色體6的激光壓力彈射。泳道 7為10微升0.1%曲通X-100溶液中單個染色體6的激光壓力彈射。泳道8為 10微升0.1%曲通X-100溶液中單個染色體6的激光壓力彈射。泳道9為陰性 對照，所含的PEN膜空白區(qū)用10微升0.P/。曲通X-100溶液捕獲。泳道10為 只含有10微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道11為陽性對照，總體 積為10微升的0.1%曲通X-100溶液中含有1微升200pg/pl gDNA。泳道12 為分子量標記Vm。泳道l、 5和6被用于測序。泳道l、 5和6是純的03序 列-環(huán)圈很亮。
圖5顯示對圖4泳道1、 5和6的HLA-A擴增子的測序(結(jié)果)。 圖6顯示分裂中期激光彈射的DRB1外顯子2的嵌套式PCR擴增子。 上面二塊凝膠(用標記有"單個分裂中期"的括號括住)顯示DRB"Ol特異 性PCR(產(chǎn)物)。上面二塊凝膠的泳道內(nèi)容物如下泳道l為分子量標記。泳道 2(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳 道3為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道4為 用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道5為含有6 微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道6為用6微升0.1%曲通X-100溶 液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道7(清晰條帶)為用6微升0.1。/。曲通X-100 溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道8(清晰條帶)為用6微升0.1。/。曲通X-100 溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道9為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕 獲的單個LMPC分裂中期。泳道9(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100溶液 捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道IO(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100 溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道11為含6微升0.1。/。曲通X-100溶液的 陰性對照。泳道12為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中 期。泳道13為用6微升0.1。/。曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳 道14為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道15
為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道16為含6 微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道17為用6微升0.1%曲通X-100 溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道18為標記。泳道19為標記。泳道20 為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道21為用6 微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道22為用6微升 0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道23為含6微升0.1%曲 通X-100溶液的陰性對照。泳道24為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單 個LMPC分裂中期。泳道25(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲 的單個LMPC分裂中期。泳道26(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100溶液 捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道27為含6微升0.1%曲通X-100溶液的陰性 對照。泳道28(清晰條帶)為陽性對照，總體積為10微升的0.1。/。曲通X-100溶 液中含有1微升400pg/W gDNA。泳道29為標記。
下面二塊凝膠顯示DRB1*09特異性PCR(產(chǎn)物)。泳道1為標記。泳道2 為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道3為含6 微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道4為用6微升0.1%曲通X-100溶 液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道5為含6微升0.1%曲通X-100溶液的陰 性對照。泳道6(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC 分裂中期。泳道7為含6微升0.in/。曲通X-100溶液的陰性對照。泳道8為用6 微升0.iy。曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道9為含6微升0.P/。 曲通X-100溶液的陰性對照。泳道10為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的 單個LMPC分裂中期。泳道11為含6微升0.ir。曲通X-100溶液的陰性對照。 泳道12為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道 13為含6微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道14(清晰條帶)為用6微 升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道15為含6微升0.1% 曲通X-100溶液的陰性對照。泳道16(清晰條帶)為用6微升0.1%曲通X-100 溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道17為含6微升0.1%曲通X-100溶液的 陰性對照。泳道18為用6微升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中 期。泳道19為含6微升0.1%曲通X-100溶液的陰性對照。泳道20為用6微 升0.1%曲通X-100溶液捕獲的單個LMPC分裂中期。泳道21為含6微升0.1%
曲通X-100溶液的陰性對照。泳道22(清晰條帶)為陽性對照，總體積為10微
升的0.1%曲通X-100溶液中含有1微升lng/pl純gDNA。泳道23為標記。 圖7顯示染色體彈射(chromopult)產(chǎn)生的DRB1擴增子的斑點印跡表征。
發(fā)明詳述
本發(fā)明一方面內(nèi)容提供測定對象明確的單倍型的方法，該方法包括如下步
驟提供對象的基本上分離的單倍體元件，和獲得此單倍體元件的核苷酸序列 信息。申請人提出，利用基本上分離的單倍體元件可消除對單倍型中兩個或多 個基因座相作出錯誤推斷或誤導(dǎo)推斷的問題，從而可揭示單倍型中參與的兩個 或多個基因，不會因遺傳方式的差異而復(fù)雜化。
預(yù)計本發(fā)明改進了現(xiàn)有技術(shù)檢測單倍體的方法，本文描述了明確的單倍體 分型方法。為了更好地理解它們的區(qū)別，應(yīng)考慮對目前本領(lǐng)域所理解的單倍型 概念和測定對象單倍型的方法進行重新闡述。
術(shù)語"單倍型"是"單倍體基因型"短語的簡化稱謂，其目前被人們接受 的含義是母親或父親單個染色體上存在的通常作為一個單位一起遺傳的一組 核苷酸序列多態(tài)性或等位基因。以二倍體生物如人為例，某基因座的單倍型含 有一對等位基因中的一個成員。
在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，單倍型的測定開始采用從臨床上常規(guī)獲得的二倍體 物質(zhì)。申請人提出，這種采用二倍體物質(zhì)進行單倍體分型的已接受實施方式是 不夠的。另一種方法是采用天然的單倍體物質(zhì)(例如精子或卵子)，然而，這一 般很不方便，婦女將遭受(手術(shù)的)過度入侵。此外。配子提供的序列信息由于 減數(shù)分裂期間發(fā)生的，如SNP之間的順式相相關(guān)性雜交而會產(chǎn)生混亂，不可 能保證可靠。
由于采用二倍體DNA的方法不能直接測定作為單倍型的順式連接基因座， 故可采用最大可能性和類似的基于算法的估計來推斷單倍型的出現(xiàn)幾率。因此 一直認為順式相連接中可能存在的兩種多態(tài)性不會作為一個孟德爾單位一起 遺傳。因此現(xiàn)有技術(shù)的這種方法更正確的描述應(yīng)為"推斷的單倍型"。本發(fā)明 方法認為孟德爾遺傳的基本單位是以父親重組位點為邊界的染色體區(qū)段，因而 更接近單倍型的精確定義。
因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會懷疑是否會產(chǎn)生利用二倍體原料產(chǎn)生錯誤影響 的問題。因此還沒有認識到測定人群相關(guān)性狀，或?qū)ο髥伪缎涂赡墚a(chǎn)生的問題。 相反，申請人認識到在聯(lián)合利用二倍體物質(zhì)與最大可能性算法來明確單倍型問 題本身的重要性。預(yù)計現(xiàn)有技術(shù)所用方法中的錯誤當調(diào)查具有多基因基礎(chǔ)(疾 病)的性狀時將產(chǎn)生特別重要的問題。
因此，本發(fā)明涉及測定明確的單倍型的方法。本文所用術(shù)語"明確的單倍 型"指只在歸因單倍型時認為嚴格順式相關(guān)的(單倍型)。本文所述方法包括任 何估計或推斷，不論同一DNA分子上是否存在兩種多態(tài)性。這與上述通過查
詢二倍體物質(zhì)的序列信息(如HapM叩方案中實施的)所獲得的"推斷的單倍型" 不同。
除了推斷產(chǎn)生的問題外，利用二倍體細胞還會引入短等位基因優(yōu)勢所致的 復(fù)雜性("等位基因退出(allele dropout)")，此時不能特異性擴增較大的等位基 因。因此，可能完全忽略了較大等位基因的存在和產(chǎn)生錯誤的單倍型信息。
本發(fā)明方法利用基本上分離的單倍體元件作為序列分析的原料保證了嚴格 正確的順式相的相關(guān)性(分析)。本文所用術(shù)語"單倍體元件"指包括只有母親 產(chǎn)生的或只有父親產(chǎn)生的核苷酸序列的任何核酸分子(DNA、 RNA或其衍生 物)。這種單倍體元件可以是任何長度的核酸分子，包括全長染色體、染色單 體或染色單體的一部分。本發(fā)明利用一種或多種單倍體元件來訊問序列信息。 對于人類，所述方法采用所有的46條單倍體元件，和分別分析所有的46條單 倍體元件。
術(shù)語"基本上分離的"指基本上不含有可能干擾訊問時只對單倍體元件順 式相相關(guān)性鑒定的污染基因材料。通常當認為這種單倍體元件是父親產(chǎn)生的 時，其污染的基因材料是母親產(chǎn)生的單倍體元件；當認為這種單倍體元件是父 親產(chǎn)生的時，其污染的基因材料是母親產(chǎn)生的單倍體元件。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括基本上分離對象單倍體的步驟。 獲得基本上分離的單倍體元件的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適 方法。應(yīng)理解實現(xiàn)基本上分離不是限制本發(fā)明的范圍，而是在所述方法的一種 實施方式中，包括用物理方法基本上分離此種單倍體元件。應(yīng)理解，可物理性 去除單倍體元件中的污染基因材料，使單倍體元件與污染的基因材料分離。當
二倍體細胞中存在單倍體元件時，可采用此方法。例如，手工操作或通過非接 觸式儀器操作進行染色體顯微解剖來取得此種單倍體元件?；蛘咴谟崋枙r用物 理方法去除此種單倍體元件中的污染基因材料。
在所述方法的另一種實施方式中，滅活或切除污染的基因材料，使其不再 具有污染基因材料的功能。例如，這可利用小心引導(dǎo)的激光束照射破壞同源染 色體而實現(xiàn)。
另一種可能的方法是用PCR選擇性擴增這種單倍體元件，使單倍體元件
DNA的拷貝數(shù)大大超過污染的DNA。然后可用核酸酶部分消化這種DNA分 子混合物，而基本上消化去除所有污染的DNA，而留下低水平的單倍體元件。
也可通過長PCR(long PCR)，釆用加入了標簽的引物選擇性擴增這種單倍 體元件，然后利用該標簽分離獲得單倍體元件拷貝。
可分離對象基因組或基因組一部分中的這種單倍體元件。本文所用的術(shù)語 "基因組"指對象的全部基因材料，包括對象的全套DNA序列?；蚪M的"一 部分"指核酸的一部分，例如對象基因組的脫氧核糖核酸(DNA)。
可獲得細胞或含核酸生物樣品中的基因組或其一部分。當所述基因組獲自 二倍體細胞時，可通過加入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的誘導(dǎo)劑如秋水仙酰胺，誘導(dǎo) 該細胞進入分裂中期。分裂中期出現(xiàn)不連續(xù)的染色體，可如下所述將其解剖成 為單倍體元件。
在所述方法的一種實施方式中，基本上分離對象的單倍體元件的步驟包括 利用二倍體物質(zhì)作為這種單倍體元件的來源?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任 何一種方法或聯(lián)合方法來分離獲得二倍體基因組或其一部分中的單倍體元件。 本發(fā)明還包括將來可能開發(fā)出的任何其它方法。在本發(fā)明的一種實施方式中， 采用物理方法如顯微解剖法。可通過顯微解剖切斷染色體的著絲粒產(chǎn)生兩個染 色單體，每個即為單倍體元件?；蛘?，在著絲粒遠端切斷染色體分離產(chǎn)生p和 q臂，每個臂即為單倍體元件。因此，這種單倍體元件可以是染色單體或染色 單體區(qū)段。
技術(shù)人員熟悉用于顯微操作的平臺和工具。雖然技術(shù)上要求嚴格，但高級 實驗室裝備中包括可利用的顯微解剖器材。裝備要求包括配有顯微操作器和旋 轉(zhuǎn)臺、移液抽吸器(可產(chǎn)生顯微針)的顯微鏡。推薦具有振動分離器的顯微鏡。
雖然不需要特別清潔的實驗室，但顯微解剖得到的染色體片段只含毫微微克量的DNA，必須控制其被外源性DNA污染。
可采用非接觸式方法。此法的一個例子是采用激光微束。激光微束顯微解 剖包括采用與顯微鏡接口的高束流質(zhì)量(beam quality)的脈沖式紫外激光?？舍?用市場購得的德國P.A丄.M.公司(P.A丄.M.GmbH Bernried，Grmany)制造的 P.A丄.M⑧羅伯特微光束儀(RA丄.NP) Robot Microbeam)進行激光束顯微解剖。 所述激光的波長通常不會損傷或破壞基因組區(qū)段，如337nm激光離核酸如 DNA的最大吸收波長相距很遠。
可用于染色體激光顯微解剖的另一系統(tǒng)是萊卡激光顯微解剖顯微鏡。此系 統(tǒng)采用DMLA直立顯微鏡，包括可移動噴嘴、可移動平臺、xyz-控制元件和新 型DMLA顯微鏡的所有其它優(yōu)點。所用激光是波長337nm的紫外激光。通過 移動照射光切割，同時保持平臺靜止。在監(jiān)控器上標記出感興趣區(qū)域，用PC 控制切割。不用額外力使樣品落入PCR試管中。通過自動化查看方式不難核 査切割的結(jié)果。
例如，可用PALM激光，利用激光彈射染色體進行顯微解剖，實現(xiàn)單倍體 元件的分離。此時，所述非接觸方式包括用激光消蝕靶單倍體元件的外周，然 后用激光壓力彈射使所確定的元件落入試管蓋，如微離心管蓋上，隨后分析單 個臂的DNA。
可用激光壓力彈射回收產(chǎn)生的單倍體元件。通過聚焦激光微束于(例如)感 興趣的單倍體基因組某區(qū)段或幾個區(qū)段而實現(xiàn)激光壓力彈射，由于產(chǎn)生的光子 密度高而產(chǎn)生力，導(dǎo)致所需的單倍體元件彈射掉不需要的基因組區(qū)段。在所述 方法的一種實施方式中，使樣品在光波上方移動而被彈射到收集管中。本領(lǐng)域 技術(shù)人員知道合適的收集管，包括例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)常用的試管或微 離心管。
可用制備型流式細胞儀基本上分離獲得單倍體元件。另一方法是采用幅射 狀雜交體，其中發(fā)育的二倍體物質(zhì)包含人的染色體作為唯一的各對染色體之 一。另一策略是采用GMP科技有限公司(GMP Technologies Inc.)開發(fā)的"基因 轉(zhuǎn)變技術(shù)"。GMP基因轉(zhuǎn)變技術(shù)(GMP Conversion Technology) 采用的方法可將 成對的染色體分離成為單個染色體。分離后，可用能鑒定基因序列的基因探針
分別分析等位基因。此技術(shù)可應(yīng)用于基因、染色體或整個人類基因組。
通常分離體細胞常染色體的二倍體基因組或其一部分術(shù)語"常染色體"指
正常體細胞或生殖細胞中除性染色體外的任何染色體。例如，人的1-22號染
色體就是常染色體。
如上所述，避免了采用天然的單倍體物質(zhì)如精細胞或卵細胞是由于臨床上
獲得這些性細胞存在問題。在單倍體分型中避免采用配子的另一優(yōu)點是應(yīng)考慮
到減數(shù)分裂時有時可能發(fā)生重組，使原先順式連接的基因座變成反式相關(guān)。因
此，分析配子的單倍型將產(chǎn)生與二倍體細胞獲得的店倍體元件不同的(即錯誤
的)單倍型信息。
參見"獲得序列信息"指包括用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來測定核
酸分子的核苷酸序列，包括直接測序。可用熟知的技術(shù)，例如Maniatis等編著 的《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),冷泉港 實驗室(Cold Spring Habor Laboratory), 1982中所述的那些技術(shù)來獲得核酸序 列。也可用自動化技術(shù)，包括利用從市場購買的儀器進行核酸測序。本文所用 術(shù)語"核酸"包括單鏈或雙鏈核酸分子，包括完整核酸分子的片段或一部分。 包括DNA和RNA 二者。
也可用間接方法，如采用寡核苷酸探針獲得序列信息。要獲得序列信息通 常包括鑒定SNP，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力設(shè)計出能檢測SNP的探針。探針一 般約長25個核苷酸，設(shè)計的多態(tài)性位點雜交時位于探針中心。
獲得序列信息的前體步驟通常是用側(cè)接有感興趣區(qū)域的引物擴增核酸?？?獲得任何實質(zhì)組織來源(除了純的紅細胞外)的DNA。例如，可方便獲得的組織 樣品包括全血、精液、唾液、眼淚、尿液、糞便材料、汗液、口頰液、皮膚和 毛發(fā)。
制備的DNA可用本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的適當方法，包括采用相應(yīng)引物的 PCR方法進行分析。當需要分析整個基因組時，可采用全基因組擴增(WGA) 方法。例如，可反式激活分裂后期細胞而分離得到兩種單倍體，然后進行WGA。 此種方法所用的商品化試劑盒不難購得，包括美國密蘇里州圣路易斯西格瑪公 司(Sigma-Aldrich Corp)， St Louis, MO， USA)的GenoPlex⑧完全WGA試劑盒 (GenoPlex Complete WGAkit)。此試劑盒以基因組的隨機片段化成為一系列模
板為基礎(chǔ)。得到的較短DNA鏈可產(chǎn)生含有3'端引發(fā)和5'端引發(fā)的DNA片段 庫。在起始階段用線性恒溫擴增復(fù)制該庫，然后用有限輪次的幾何(PCR)擴增。
用PCR擴增DNA有許多方法。這些方法包括Klein等人(PNAS 96(8): 4494-4499， 1999-4-13)所述的()完全無偏斜全基因組擴增，和(2)前景是能夠擴 增所分離的單倍體元件中數(shù)十至數(shù)百個基因座的方法。
也經(jīng)常對mRNA樣品進行擴增。此時，擴增前通常要逆轉(zhuǎn)錄?？砂碬O 96/14839和WO 97/01603中所述擴增所有表達的mRNA。如果提供樣品的對 象是雜合子在表達的mRNA中含有多態(tài)性位點，擴增其二倍體樣品中的RNA 可產(chǎn)生兩種靶分子。
鑒定核苷酸多態(tài)性的方便方法是采用微陣列技術(shù)。本發(fā)明此種實施生生世
世的例子可參見八{&11^1^ 投放市場的基因芯片&61160^口@)技術(shù)。此技術(shù)依
據(jù)光蝕刻加工5" X5"石英晶片包衣層，并用光敏化合物防止晶片與DNA探針 的第一核苷酸之間發(fā)生偶聯(lián)。利用平板印刷遮光板阻斷光或傳送光到晶片表面 的特定位置。這種表面浸沒在含有腺苷、胸苷、胞苷或鳥苷的溶液中，偶聯(lián)只 發(fā)生在玻片上已通過光照脫保護的那些區(qū)域中。偶聯(lián)的核酸還帶有光敏保護基 團，因此要重復(fù)循環(huán)進行。許多公司，包括英國牛津的牛津基因技術(shù)公司 (Oxford Gene Technology, Oxford, UK)，美國加州帕羅阿托的阿吉蘭特科技 公司(Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA)和美國威斯康星州麥迪遜 的寧布萊根系統(tǒng)有限公司(Nimblegen Systems Inc., Madison, WI， USA)提供 了其它固定探針的方法。
預(yù)計可將設(shè)計的探針所提供的對象兩種單倍型信息加入到一個微陣列芯片 上。負責(zé)提供父親單倍型信息的探針可用一種類型的熒光標簽標記，而母親的 單倍型信息可用不同的標簽標記。
在本發(fā)明的一種實施方式中，兩種或多種多態(tài)性組成了等位基因編碼序列 的-一部分?？捎帽景l(fā)明方法通過證明共有的等位基因過量來顯示基因與性狀之 間的相關(guān)性。本發(fā)明內(nèi)容中，術(shù)語"等位基因"用于指與編碼區(qū)相關(guān)的基因變 異，包括給定基因的交替剪接形式。本文所用的術(shù)語"共有等位基因"指一組 個體中某基因存在著(或共享)等位基因?？捎眉夹g(shù)人員能得到的許多統(tǒng)計學(xué)軟 件包之一來發(fā)現(xiàn)共有等位基因的存在和程度。利用(存在有)與HapM叩所用的
非編碼序列變體(如SNP和STR)不相同的等位基因編碼序列可間接表明存在編 碼的單倍型。這種HapMap間接法本身不能確定SNP是否代表了群體單倍型 的多樣性、單倍型部件的長度、連鎖不平衡和相。雖然本發(fā)明不限于分析任何 特定等位基因，但示范性等位基因是與CFTR、 DRB1和HLA-A有關(guān)的那些等 位基因。
本發(fā)明另一方面提供利用單倍體元件來測定對象的明確單倍型。 本發(fā)明還有一方面提供測定基因區(qū)與性狀之間相關(guān)性的方法，該方法包括 以下步驟提供多個對象的第一組單倍體元件，所述個體代表了總體人群的遺 傳多樣性，分析該第一組單倍體元件中是否存在等位基因，提供總體人群多個 對象的第二組單倍體元件，所述對象具有性狀而且不是來自同一家族，分析該 第二組單倍體元件中是否存在等位基因，測定第一與第二組單倍體元件之間等 位基因中共有等位基因的水平，共有等位基因過量表明該等位基因與性狀相 關(guān)。在該方法的一種實施方式中，所述等位基因是編碼序列等位基因。
本發(fā)明另一方面提供鑒定涉及多基因疾病或性狀的基因的方法，該方法包 括采用本文所述的方法。鑒于現(xiàn)有的單倍體分型方法依靠推斷，不是不可能而 是非常難以完全查明某給定基因在多基因疾病或性狀中的作用。而本文提供的 明確單倍型方法可消除對多基因系統(tǒng)疾病中涉及的單個基因的混亂闡述所產(chǎn) 生的不確定性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，本發(fā)明可有許多用途。在一實施方式中，本發(fā)明提 供利用本文所述方法來鑒定涉及單基因疾病或表型的基因。另一實施方式用本 文所述方法來鑒定涉及多基因疾病或表型的基因。提供明確的單倍型也能組織 移植時供者與受者更好匹配。
本發(fā)明可應(yīng)用于任何對象。所述對象可以是人、馬、牛、山羊、綿羊、狗、 貓、或豬。技術(shù)人員將明白，生物如植物也適合這種應(yīng)用。某些生物是多倍體 (如某些植物和有殼水生生物)，鑒于它們的每個細胞存在三個或多個同源染色 體而產(chǎn)生的混亂情況，預(yù)期本發(fā)明具有甚至更大的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一方面提供用本文所述方法來鑒定參與藥物反應(yīng)的基因。藥物 基因組學(xué)是研究個體的遺傳特性是如何影響機體對藥物的反應(yīng)。藥物基因組學(xué) 的基礎(chǔ)是可為個體按他們本身的基因組成定制藥物。環(huán)境、飲食、年齡、生活
類型和健康狀態(tài)等都可能影響個體對藥物治療的反應(yīng)，但應(yīng)理解認為個體的基 因組成是制定更高效更安全的個體化給藥的關(guān)鍵。
利用本發(fā)明方法，可根據(jù)與基因和疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)、酶及RNA分子制
定給藥方案。這將有利于發(fā)現(xiàn)藥物，使研究人員能制定耙向特定患病(細胞)的 治療方案，其精確程度不僅最大程度提高了療效而且也減少了對臨近健康細胞 的損傷。
代替標準的使病人與正確藥物相配的反復(fù)試驗方法，臨床醫(yī)師將能夠分析 病人的遺傳概貌，從而在治療開始時即能開出最佳的可利用的治療藥物處方。 這不僅可猜測出要為病人確定的正確藥物，而且由于消除了發(fā)生不良反應(yīng)的可 能性而加速了康復(fù)時間提高了安全。藥物基因組學(xué)有潛力顯著降低美國估計的
因藥物不良反應(yīng)導(dǎo)致每年發(fā)生10萬人死亡和2百萬人住院的現(xiàn)狀。
實施本發(fā)明的一種結(jié)果可能是制定出更精確測定藥物適合劑量的方法。目 前依據(jù)體重和年齡確定基礎(chǔ)劑量的方法將代之以依據(jù)病人遺傳學(xué)的劑量方法。 依據(jù)精確的遺傳概貌，例如依據(jù)機體如何代謝該藥物和分解代謝該藥物所花費 的時間來制定給藥方案。這將最大程度提高療效和減少過量的可能性。
實施本發(fā)明的另一種結(jié)果可能是改進疾病篩選的方法。知曉個體的遺傳概 貌就可能明確其對一種或多種疾病的易感性。知曉這種易感性則可讓個人在較 年青時采取正確生活方式和改變環(huán)境以避免發(fā)生遺傳病或減輕其嚴重程度。同 樣，預(yù)先知曉對特定疾病的易感性可小心監(jiān)視該個體，在最適當?shù)碾A段進行治 療使療效最佳。
實施本發(fā)明的還有一種結(jié)果是改進疫苗接種。用遺傳物質(zhì)如DNA或RNA 制備的疫苗沒有現(xiàn)用疫苗的所有危險而顯示出優(yōu)良的應(yīng)用前景?；蛞呙缒芗?活免疫系統(tǒng)但不引起感染。此種疫苗不昂貴、穩(wěn)定、易于貯存，能夠經(jīng)工程改 造而同時攜帶幾種病原體的(抗原)。
也可利用本發(fā)明來加速藥物開發(fā)和審批程序。制藥公司利用基因組中的靶 序列能更容易發(fā)現(xiàn)潛在的治療藥物?？苫仡櫼酝〉暮蜻x藥物它們是否能與 其服務(wù)的贏利市場人群相匹配。應(yīng)能加速藥物審批過程，因為申報的臨床試驗 是針對特定的遺傳疾病人群，只要成功程度更好。通過只針對對藥物具有反應(yīng) 的那些個人進行臨床試驗可減少費用和危險性。
因此，本發(fā)明提供的精確遺傳信息可減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生、減少藥物 臨床試驗的失敗、減少當局批準藥物應(yīng)用的時間、減少病人的治療時間、減少 病人獲得有效治療必須服用的藥物數(shù)量、減少疾病對機體的影響(通過早期檢 測)和提高藥物可能治療的目標疾病范圍。這些優(yōu)點可導(dǎo)致保健費用的凈降低。
如上所述，本發(fā)明方法也可用于鑒定賦予個體對疾病易感的基因或多個基 因，具體說的例子是多基因疾病如糖尿病。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)糖尿病易 感基因使帶有缺陷拷貝的人發(fā)生2型糖尿病的可能性提高了 3倍。已知鈣蛋白
酶-10(—種蛋白酶)基因中的SNP與2型糖尿病相關(guān)。易患此病的墨西哥美國 人證明了這種相關(guān)性。對這種人群的DNA樣品測序并進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn) 這些墨西哥美國人有胰島素抗性，顯示鈣蛋白酶-10表達水平降低。本發(fā)明可 以更簡化基因/疾病相關(guān)性的測定，促進其它遺傳性復(fù)雜疾病如哮喘、精神分裂 癥和阿耳茨海默病的基因基礎(chǔ)鑒定。
本發(fā)明另一方面提供用于鑒定藥物靶基因(或靶蛋白)或基因治療的方法。 實施本發(fā)明可了解疾病的遺傳基礎(chǔ)，從而提供藥物設(shè)計和基因治療的有效靶 標。例如，如果鑒定到某基因或某些基因與疾病相關(guān)，可增強或抑制該基因的 活動來提供治療效果?；蛘?，可利用此基因的蛋白產(chǎn)物作為基礎(chǔ)進行篩檢試驗， 通過結(jié)合調(diào)節(jié)此蛋白的活性。另外，如果了解此蛋白的三維結(jié)構(gòu)，可進行合理 的藥物設(shè)計。
另一方面，本發(fā)明提供用本文所述方法鑒定對疾病易感的個體。 一旦鑒定 出某基因與特定疾病相關(guān)，采用本發(fā)明方法技術(shù)人員將能設(shè)計出篩檢該基因缺 陷形式的試驗。鑒定到處于某些疾病發(fā)病危險的個人將能采取預(yù)防措施，如給 予藥物治療和改變生活方式。
還有一方面，本發(fā)明提供用所述方法鑒定對環(huán)境剌激易產(chǎn)生反應(yīng)的個體。 這種應(yīng)用的一個例子是鑒定對各種物質(zhì)過敏的個人。某些個人對過敏原(如花 生或蜂毒)的反應(yīng)可能導(dǎo)致潛在的致死性過敏反應(yīng)。鑒定出特別敏感的個體即
能采取脫過敏治療程序。
現(xiàn)通過以下非限制性實施例來說明本發(fā)明。
實施例
實施例1:用PALM羅伯特微光束儀在100X物鏡下利用激光顯微解剖和 壓力彈射(LMPC)程序進行分裂中期染色體分離
在載玻片上制備分裂中期細胞涂片，該載玻片適合隨后用PALM顯微鏡在 lOOx物鏡下進行激光捕獲。將一個分裂中期染色體與其姐妹染色體作空間分 離，包括用標準P.A丄.M顯微鏡程序?qū)蝹€染色體彈射到裝有6微升0.1%(Wv) 曲通-X-100的200jJ的超通量平帽PCR管(UItraFlux Flat Cap PCR tube)的帽中。
離心使彈射物轉(zhuǎn)移到管底用于分析。
實施例2:擴增分離的染色體
通過PCR或MDA用標準程序擴增激光顯微捕獲分離的DNA。 CFTR(外 顯子10)、 HLA-A(外顯子2)、 DRB1(外顯子2)的外顯子特異性PCR擴增程序 如下。
CFTR
用嵌套PCR方法擴增gDNA、分裂中期或單個染色體中的CFTR基因座外 顯子IO。第一輪擴增反應(yīng)體積為30微升，采用TaqDNA聚合酶，所用引物如 下
CF-1F 5GACTTCACTTCTAATGATGAT-3'禾口
CF-l.R 5 ' —CTCTTCTAGTTGGCATGC-3 '
循環(huán)條件如下95。C3分鐘；95。C30秒，50。C30秒，72°C 45秒，共25 輪；72°C 5分鐘；4"C保持。
用第一輪產(chǎn)物作為模板進行第二輪嵌套式PCR，所用引物如下
CF-2F 5'-TGGGAGAACTGGAGCCTT-3'和
Cf-2r 5'-GCTTTGATGACGCTTCTGTAT—3'
將2微升第一輪產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到30微升反應(yīng)液中，采用Taq聚合酶，循環(huán)條
件如下95。C3分鐘；95。C30秒，55。C30秒，72。C30秒，共40輪；72°C 5
分鐘；4X:保持。 HLA-A
用嵌套PCR方法擴增gDNA、分裂中期或單個染色體中的HLA-A基因座 外顯子2。第一輪擴增HLA-A外顯子2采用以下通用引物
sqr2
5'-CTCGGACCCGGAGACTGT-3'和 M13—5AInl-4 6
將基因組DNA、單個分裂中期或單個染色體用作起始模板。PCR采用 Platinum TaqDNA聚合酶，反應(yīng)體積為25微升，在以下循環(huán)條件下進行反應(yīng) 98°C 2分鐘；98°C 5秒，60°C 120秒，72°C 120秒，10輪；98°C 5秒，65°C 30 秒，72"C60秒，25輪；72t:i0分鐘，4。C保持。
用2微升第一輪產(chǎn)物進行HLA-A基因座外顯子2的第二輪嵌套式擴增， 反應(yīng)體積25微升，循環(huán)條件如下98°C 30秒；98°C 5秒，65°C 30秒，72°C 60 秒，10輪；98。C5秒，6(TC30秒，72。C60秒，25輪；72°C IO分鐘；4。C保
持。采用以下引物
5 ' -■ 丁tgggacgaggac-acagggaaag-3 ',
5 ' -'gggaccaggagacacggaatg-3 ', 5'—gggacgaggagacacggaagg-3',
a e217 4b a5e2174e a3'e2174h
afe217 4(; a.fe2174d
a3"e217 4g sqr2
-GGjACGGGGAGACACGGAATG-3 ',
-丁tgggaccaggac;acacggaata-3 ', -gga(;gg(igagacacggaaag-3 ',
-〔;ggaccggaaca(:acggaawg, -gggacctgcagacacggaatg—3'和 —ctcggacccggagactgt-3'
HLA-DRB1
用嵌套式PCR方法擴增gDNA、分裂中期或單個染色體中的HLA-DRB1 基因座外顯子2。用特異性引物進行HLA-DRB1*01和-DRB"09外顯子2的
第一輪擴增。采用以下引物擴增DRBPOh
R31mf
5' --tgtaaaacgacggccag丁tcccagtgcccgctccct-3'和 R32mr
5' -c'aggaaacagcta了gaccm:acactcagattctccgc丁t-3 ' 采用以下引物擴增DRBP09:
工l-RB15mf
5 ' -tgtaaaacgacggccagtcagttaaggt1'ccagtgcca-3
和12-RB28mr
5 ' -CAGGAAACAGCrATGACCACACACACACTC'AGATTCCCA-3 '
將基因組DNA、單個分裂中期或單個染色體用作起始模板。PCR采用 Platinum TaqDNA聚合酶，體積25微升，在以下循環(huán)條件下進行反應(yīng)95°C 3 分鐘；95。C30秒，50。C120秒，72。C90秒，30輪；72°C 10分鐘，4。C保持。
50微升第二輪(嵌套)反應(yīng)液中包含2微升此初次反應(yīng)液，采用TaqDNA聚 合酶和降解引物
GH46V1 5 ' -CCGGA丁(:STTCGTGTCCCCACAGCAYG-3 ', AnipB 5 * -CCGCTGCACTGTGAAGCTCT-3 ',
ArnpBl 5 ' -CCGCTGCACCGTGAAGC丁CT-3 ',
AmpB2 5 ' -CCGCTGCACTGTGAArCTCT-.3 '
循環(huán)條件如下95。C3分鐘；95。C30秒，55。C30秒，72。C30秒，30-40
輪；72°C 5分鐘；4。C保持。
CFTR基因座10、 HLA-A、 HLA-DRB1的分析結(jié)果見圖1-7。這些圖證實 了用激光顯微解剖和彈射技術(shù)獲得了分離的單倍體元件的有價值的序列信息。
最后，應(yīng)知道，可對(上述內(nèi)容)作出各種其它修飾和/或變化，但不脫離本 文所述的本發(fā)明思路。
權(quán)利要求
1.一種測定對象明確的單倍型的方法，該方法包括如下步驟提供對象的基本上分離的單倍體元件，和獲得此單倍體元件的核苷酸序列信息。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括基本上分離對象 的單倍體元件的步驟。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基本上分離單倍體元件的步驟采用物理方法。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述物理方法是染色體顯微解 剖法。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法包括用激光彈射 單倍體元件而有效地基本上分離該單倍體元件。
6. 如權(quán)利要求2-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述基本上分離對 象的單倍體元件的步驟包括采用二倍體物質(zhì)作為所述單倍體元件的來源。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述二倍體物質(zhì)獲自體細胞。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，所述單倍體元件是 染色單體或染色單體的一個區(qū)段。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列信 息是是否存在單核苷酸多態(tài)性。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列 信息提供了等位基因信息。
11. 如權(quán)利要求l-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述序列信息通 過直接測序提供。
12. 如權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于，所述序列信息通過與信息寡核苷酸探針雜交而提供。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸探針可檢測是 否存在單核苷酸多態(tài)性。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，只提供順式相單核苷酸多態(tài) 性相關(guān)。
15. 如權(quán)利要求10-14中任一項所述的方法，其特征在于，所述等位基因是編碼區(qū)等位基因。
16. 如權(quán)利要求10-15中任一項所述的方法，其特征在于，所述等位基因 與CFTR、 DRB1或HLA-A相關(guān)。
17. 單倍體元件在測定對象明確單倍型中的應(yīng)用。
18. —種測定基因區(qū)域與性狀之間相關(guān)性的方法，該方法包括如下步驟提供多位個體的第一組單倍體元件，所述個體代表了常規(guī)人群的遺傳多樣性，分析第一組單倍體元件是否存在某等位基因；提供所述常規(guī)人群中多位個體的第二組單倍體元件，所述個體具有所述性 狀，所述個體不來自同一家族；分析第二組單倍體元件是否存在所述等位基因，測定第一組與第二組單倍 體元件二者之間共有等位基因的水平；共有等位基因水平過度表明所述等位基因與性狀相關(guān)。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述等位基因是編碼序列等 位基因。
20. —種鑒定涉及多基因疾病或性狀的基因的方法，所述方法包括采用權(quán) 利要求18或權(quán)利要求19所述的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供對象明確單倍型的方法。用本文所述方法產(chǎn)生的單倍型信息比現(xiàn)有技術(shù)只能給出推斷的單倍型的方法提供的更為精確。因此，本發(fā)明一方面提供測定對象明確的單倍型的方法，該方法包括如下步驟提供對象的基本上分離的單倍體元件，和獲得此單倍體元件的核苷酸序列信息。申請人提出，利用基本上分離的單倍體元件可消除對單倍型中兩個或多個基因座相作出錯誤推斷或誤導(dǎo)推斷的問題，從而可揭示單倍型中參與的兩個或多個基因，不會因遺傳方式的差異而復(fù)雜化。本發(fā)明方法采用基本上分離的單倍體元件作為序列分析的原料，保證了嚴格正確的順式相相關(guān)性。
文檔編號C12Q1/68GK101365944SQ200680051103
公開日2009年2月11日 申請日期2006年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者M·J·西蒙斯 申請人:西蒙斯單倍體有限公司