專利名稱：治療慢性纖維化疾病的材料與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療慢性纖維化疾病的方法和組合物.本發(fā)明更具體涉及慢性纖 維化疾病的免疫治療干預(yù).
背景技術(shù)：
炎癥是對組織損傷或感染的協(xié)調(diào)反應(yīng).炎癥發(fā)生時首先是趨化罔子的局部釋 放、血小板活化、凝血和補體旁路的起動，從而對局部內(nèi)皮產(chǎn)生剌激，引起嗜中性 粒細胞和單核細胞的外滲.炎癥的第二個階段以自適應(yīng)免疫細胞(包括淋巴細胞) 進入組織為標志.接下來是溶解階段，以基質(zhì)細胞(如成纖維細胞)對組織損傷的 修補為標志.在溶解階段，過量的白細胞凋亡，然后被組織中的巨噬細胞呑噬.
在修補機制中，局部的靜止成纖維細胞遷移至損傷區(qū)域，分泌細胞外基質(zhì)蛋 白，促進創(chuàng)口收斂或纖維化，也有人提出是循環(huán)中的纖維原前體細胞即纖維細胞 隨血液遷移至創(chuàng)傷處或纖維化部位，然后發(fā)生分化并介導(dǎo)組織修補和其他纖維化 反應(yīng)，纖維細胞由外周血單核細胞前體CD14+分化而來，表達造血干細胞標記物 (CD45、 II型MHC、 CD34)和基質(zhì)細胞標記物(I型和HI型膠原蛋白及纖維 粘連蛋白).成熟的纖維細胞迅速進入組織損傷部位，分泌炎性細胞因子和細胞 外基質(zhì)蛋白、其他細胞罔子和促血管生成素，從而發(fā)生纖維化，
纖維細胞的分化與許多纖維化疾病有關(guān)，包括但不限于硬皮病、瘢痕疙瘩、 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、腎源性纖維化硬皮病和特發(fā)性肺纖維化.纖維細胞在小鼠 感染日本血吸蟲后纖維化病灶的形成中起重要作用，也參與自身免疫疾病的纖維 化.纖維細胞還與放射損傷、萊姆病和肺纖維化的致病性纖維化有關(guān).纖維細胞 也參與胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化，而這種纖維細胞的缺乏導(dǎo)致胰腺癌及 腺癌.當纖維細胞進一步分化為肌纖維母細胞時，哮喘病人和其他肺病如慢性阻
塞性肺病患者還會發(fā)生纖維化.
我們知道有一些特殊的疾病發(fā)生無休止的纖維化反應(yīng)，如特發(fā)性間質(zhì)性肺炎， 是一組以不同程度的肺纖維化為特征的多種多樣慢性肺病.與特發(fā)性間質(zhì)性肺炎 (IIP)中各種獨特的組織結(jié)構(gòu)有關(guān)的嚴重肺纖維反應(yīng)的主要誘因尚不明確，罔此
這些疾病目前尚無有效的臨床治療手段(Green, Overview of pulmonary fibrosis. Chest2002;l22(suppl. 6):334S-9S).盡管其中的許多疾病表現(xiàn)為導(dǎo)致呼吸系統(tǒng) 損傷的肺泡微環(huán)境纖維增生反應(yīng)，但是他們的纖維化病變程度差異相當大
(Nicholason Am. J. Resp. Crit. Car Med/ 2000:162:2213-7; Chapman J. Clin" Invest., 2004; 113:148-57).同樣復(fù)雜的是如何清楚證明抗炎藥物對不太嚴重的 IIP (如非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)和呼吸性細支氣管間質(zhì)性肺病(RBILD)) 具有治療作用，但是常常卻不能防止最嚴重的致命性IIP--普通型間質(zhì)性肺炎
(U1P)病人的呼吸襲竭(Flaherty et al" Am. J. Med. 110:278-282 (2001); Lynch et al.， Curr. Opin. Pulm. Med.， 7:298-308 (2001); Flaherty et a，.， Thorax, 58:143-148(2003)).
獨特的纖維母細胞灶的存在是特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的重要病理特征，顯示不良 預(yù)后和致命的結(jié)果(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 164:1025-1032 (2001)).關(guān)于IIP發(fā)生和維持過程中的肺纖維化病變有一些分歧，在闞明這些 問題之后可以采用新的治療方法(van den. BHnk et a，.， Arch. Immunol. Ther. Exp (Warsz)， 48:539-545 (2000)) . CC趨化因子受體7 ( CCR7，與MLP-3b/CCL19 和6-Ckine/CCL21結(jié)合(Nagira et al.， J. Biol. Chem.， 272:19518-19524 (1997)) 和CX趨化因子受體4 (CXCR4,與SDF-1/CXCL12結(jié)合(Forster et al.， J. Immunol" 160:1522-1531 (1998))被普遍認為是僅由造血干細胞來源的細胞表達 的趨化因子受體(Kim et al.， J. Leukoc. Biol" 66:455-461(1999); Kim et al.， J. Clin Invest., 108:1331-1339 (2001)).在免疫反應(yīng)過程中，CCR7的表達促進成熟樹突 細胞向淋巴組織的運動(Sa，lusto et al" Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999))， 調(diào)控1型和2型T輔助細胞在脾臟中的定位(Randolph et a，.， Science, 286:2159-2162 (1999))，指引2型T輔助細胞向過敏的肺部轉(zhuǎn)移(Hammad et al.， J. Immunol" 169:1524-1534(2002)) . CXCR4的表達和作用主要限于來源于骨鍵 的免疫細胞(Ward et al" Biochem, J.， 333:457-470 (1998》Gonzalo et al" J. Immunol" 165:499-508 (2000)).最近有證據(jù)表明乳腺癌細胞表達CCR7和
CXCR4使其能夠向肺部轉(zhuǎn)移，因此改變了免疫中心的模式(Muller et al.， Nature, 410:50-56(2001)).乳腺細胞不表達這些趨化因子受體，對與之結(jié)合的配體也不 產(chǎn)生反應(yīng)(Mulleretal.， Nature, 410:50-56 (2001)) 這一觀察結(jié)果已被引伸至多 種轉(zhuǎn)移性腫瘤，包括黑色素病(Murakami et al.， J. Dermatol. Sci.， 36:71-78 (2004))和各種類型的白血病(Tavor et al.， Cancer Res" 64:2817-2824 (2004); GhobHal et al" Mayo Clin, Proc.， 79:318-325 (2004))
慢性肺纖維化來源于全肺創(chuàng)傷，可由多種原因產(chǎn)生，包括慢性炎癥(結(jié)節(jié)、 韋格納肉芽腫)、環(huán)境閎素的感染(石棉、硅土、 ^露于某些氣體)、電離放射 瀑露(如對乳腺胂瘤的放射治療)、慢性病(狼掩、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)甚至某些藥 物治療.罹患過敏性肺炎時，人體對吸入的有機粉塵或職業(yè)性化學(xué)物質(zhì)的免疫反 應(yīng)增強，肺部纖維化隨后發(fā)生.這種疾病大多數(shù)由吸入的被細菌、真菌或畜產(chǎn)品 污染的粉塵所致.某些類型的肺纖維化，如非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)，受試 者可能對免疫抑制治療有反應(yīng).慢性肺部炎癥和纖維化常常在不明原罔的情況下 發(fā)展，這種疾病的患者往往對藥物治療沒有反應(yīng)，特別是那些特發(fā)性肺纖維化 (IPF)患者.特發(fā)性肺纖維化的治療手段很有限.目前還沒有任何藥物對這種 疾病有效，罔為結(jié)痂一旦開始就會一直持續(xù)下去.肺移植是唯一可用的治療方法. 在一些仍在進行的研究性試驗中使用不同的藥物延緩纖維性結(jié)痂，有一些肺纖維 化對皮質(zhì)激素(如強的松)和/或其他能夠抑制身體免疫系統(tǒng)的藥物有反應(yīng)，這些 藥物有時被醫(yī)生用來延緩纖維化進程，然而，眾所周知的是，目前還沒有對纖維 化疾病有效的治療方法.在臨床實踐中，標準方案是給病人開處強的松和砥唑嘌 呤，但是沒有數(shù)據(jù)表明這些藥物具有治療作用.實際上，這些藥物的副作用可能 提高UIP患者的死亡率.
在肺纖維化中，趨化因子參與成纖維細胞灶的形成和纖維化反應(yīng)的放大.在 慢性肺纖維化過程中，促纖維化介質(zhì)環(huán)境的具體作用尚不明確，本發(fā)明詳細闡述 了各趨化因子及其受體的作用，從而為藥物治療無效的特發(fā)性疾病提供了新的治 療方法和處方，
發(fā)明概迷
本發(fā)明涉及用于治療所述纖維化疾病的方法和組合物.更具體地，本發(fā)明論 述了對單獨的CCL21活性或其與CCL19結(jié)合的活性的抑制或其它形式的降低，
能有效減少纖維化損害，并改善纖維化疾病的癥狀.
因此，在具體實施方案中，本發(fā)明提供治療哺乳動物的慢性纖維化疾病的方
法，其包括降低纖維細胞和/或成纖維細胞中的CCL21的存在量(presence)或 活性，所迷纖維細胞和/或成纖維細胞位于所述纖維化疾病的纖維化損害處.某些 實施方案中，本方法可進一步包括降低與所述纖維化疾病有關(guān)的成纖維細胞中 CCL19的存在量或活性.例如，降低CCL21的存在量或活性可包括使所述哺乳 動物與有效重的藥劑(agent)接觸，以減輕所迷慢性纖維化疾病的一種或多種 癥狀，所述藥刑從成纖維細胞去除CCL21.這種藥刑的示例可以是與CCL21發(fā) 生特異性免疫反應(yīng)的抗體，例如相比于其他趨化因子，優(yōu)先識別CCL21上的表 位的抗體，
其它實施方案中，所述降低CCL21的存在量或活性包括使所述哺乳動物與 有效量的藥刑接觸，以減輕所述慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀，所述藥刑減 少所述成纖維細胞中的CCL21表達.用于此類實施方案的示例性藥刑可以是定 向抗(directed against) CCL21的siRNA分子.
本發(fā)明可治療的纖維化疾病可以是任何纖維化疾病，包括但不限于選自以下 疾病中的一種肺纖維化、慢性阻塞性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性 心力衰竭、慢性腎病、過敏性肺炎、呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲 感染、原發(fā)性肺動脈高壓(防止叢狀損害形成)、皰疹病毒相關(guān)疾病(包括肺表 現(xiàn)和皮膚表現(xiàn))、瘢痕疙瘩(keloid scarring)、狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、曰 本血吸蟲感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、致病性纖維化、萊姆病、胰 腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維化、角膜纖維化、充血性 心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后結(jié)疤(scarring)(包括腹部粘連)、開角型 (wide angle)青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合，
按照本發(fā)明治療的典型肺動脈高血壓包括原發(fā)性肺動脈高壓(PPH)、繼發(fā)性 肺動脈高壓(SPH)、家族性PPH、偶發(fā)性PPH、毛細血管前肺動脈高壓、肺動 脈高血壓(PAH)、特發(fā)性肺動脈高壓、血栓性肺動脈病(TPA)、致叢性肺動 脈病、功能類別(functional classes) 1~IV的肺動脈高壓，以及與以下疾病相關(guān)、 由以下疾病引起或繼發(fā)的肺動脈高血壓左心室功能不良、二尖瓣病變、縮窄扭 心包炎、主動脈瓣狹窄、心肌病、縱膈纖維化、肺靜脈異位引流、肺靜脈閉塞病、 膠原血管病、先天性心臟病、HIV病毒感染、藥物和毒素(如氟苯丙胺)、先夭
性心臟病、肺靜脈高血壓、慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺病、睡眠呼吸障礙、肺泡 通氣不足、高海拔慢性啄露、新生兒肺病、肺泡毛細血管發(fā)育不良、鐮狀細胞疾
病、其它凝血障礙、慢性血栓栓塞(thromboemboH)、結(jié)締組織疾病、狼疳、 血吸蟲病、結(jié)節(jié)病或肺毛細血管瘤.
按照本發(fā)明治療的肺動脈高血壓最特別的是與呼吸系統(tǒng)疾病和/或低氧血癥 有關(guān)的肺動脈高血壓，包括慢性阻塞性肺病、間質(zhì)性肺病、睡眠呼吸障礙、肺泡 通氣不足、高海拔慢性曝露、新生兒肺病和肺泡毛細血管發(fā)育不良，尤其是慢性 阻塞性肺病.優(yōu)選實施方案中，纖維化疾病為慢性肺纖維化.
在治療方法中，可將化合物局部施用于纖維化損害(fibrosing lesion )位點， 更具體的實施方案中，纖維化損害在肺中，使組合物與所述摘害局部接觸.某些 實施方案中，預(yù)期藥刑包含將所述藥刑特異性定位于纖維化損害位點的靶向部分.
具體實施方案中，使用選自以下的給藥方式施用所述抗體或抗CCL21或抗 CCL19組合物局部給藥、注射、吸入、儲庫式或泉式持續(xù)釋放(continuous release by depot or pump)，或其任意組合，
本發(fā)明的另一方面是抑制成纖維細胞和/或纖維細胞增殖的方法，包括使所述 成纖維細胞和/或纖維細胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL21抗體或設(shè)計 為抗(deigned against) CCL21的siRNA分子. 一些實施方案中，本方法進一步 包括使所述成纖維細胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL19抗體或設(shè)計為 抗CCL19的siRNA分子.其他實施方案中，本方法進一步包括使所述成纖維細 胞與組合物接觸，所迷組合物包含抗CCR7抗體或設(shè)計為抗CCR7受體的siRNA 分子.受治的纖維細胞和/或成纖維細胞可位于體外或體內(nèi).它們優(yōu)選位于體內(nèi)， 更優(yōu)選位于體內(nèi)肺組織中.
還包括抑制纖維細胞遷移和/或成纖維細胞活化的方法，其包括對使所述纖維 細胞和/或成纖維細胞與抑制CCL21活性的組合物接觸.此類方法中，纖維細胞 位于哺乳動物體內(nèi)，所迷方法抑制纖維細胞向所述哺乳動物的肺組織遷移，由此 防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生.在這些方法中，成纖維細胞優(yōu)選為位于所述哺乳動 物肺組織中的固有(resident)肺成纖維細胞，且所述方法抑制所述哺乳動物肺組 織中所述成纖維細胞的活化，由此防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生.
本文還教導(dǎo)治療肺纖維化的方法，其包括通過抑制所述纖維細胞和/或所迷成 纖維細胞中CCL21的活性或表達來抑制罹患纖維化肺病的哺乳動物的纖維細胞
的遷移和/或位于肺組織中的固有肺成纖維細胞的活化，由此防止細胞外基質(zhì)的過 度產(chǎn)生并改善肺纖維化癥狀.
展，改善其一種或多種癥狀，逆轉(zhuǎn)病情，或達到治療效果的方法，其包括對所述
受試者施用降低所述受試者肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在 重或活性的藥刑，其中所述藥刑可在放射治療之前、和/或期間、和/或之后施用. 這種治療方法可進一步包括施用降低所迷被試者的肺組織中CCL19的存在量或 活性的藥刑.
本發(fā)明的另一方面預(yù)期對受試者治療或抑制藥物誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)展，玫 善其一種或多種癥狀，逆轉(zhuǎn)病情，或達到治療效果的方法，其包括對所述受試者 施用降低所述受試者肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量或活 性的藥劑，其中所述藥劑可在給藥、和/或期間、和/或之后施用.還希望，這種 方法進一步施用降低所述被試者的肺組織中CCL19的存在量或活性的藥刑.有 許多藥物可導(dǎo)致纖維化，這樣的藥劑包括但不限于細胞毒素劑、抗生素、抗心摔 失常藥、消炎藥和違禁藥.可導(dǎo)致肺纖維化的示例性藥物包括但不限于兩性審素 B、博來霉素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡因、環(huán)磷狹 胺、苯妥英、麥角胺、氟卡尼、海洛因、美法侖、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲睇、 美西麥角(methylsergide)、礦物油、呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅酮 (silicone)、柳氮磺吡啶、妥卡尼和長春花生物械類藥刑(vinca alkaloid class of agents )
本文描述的治療方法中，提供輔助治療方案是合意的，其中將影響CCL21 和CCL19的治療劑與皮質(zhì)類固醇和/或免疫抑制刑聯(lián)合.在其他方法中，聯(lián)合治 療可包括給予抗凝劑、利尿劑、強心甙、鈣通道阻斷刑、血管擴張劑、前列環(huán)素 類似物、內(nèi)皮素拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、p2激動刑、抗毒萆堿劑、內(nèi)肽醉抑 制劑、降血脂藥和血栓素抑制劑，或其組合.
此外，本發(fā)明進一步預(yù)期降低纖維化損害處的纖維細胞和/或成纖維細胞中 CCL21和/或CCL19的存在重或活性的藥劑在制備治療慢性纖維化疾病的藥物中 的用途
示例性實施方案中，本發(fā)明提供了用于降低纖維化損害處的纖維細胞和/或成 纖維細胞中CCL21的存在量或活性的藥劑以及任選的降低纖維化損害處的纖維
CCL19的存在量或活性的藥劑在制備治療哺乳動物慢性 纖維化疾病的藥物中的用途.某些實施方案中，所術(shù)藥劑是與CCL21產(chǎn)生特異 性免疫反應(yīng)的抗體，該抗體優(yōu)選為相比于其他趨化罔子，優(yōu)先識別CCL21上的 表位的一種抗體.在其他實施方案中，該藥刑是定向抗CCL21的siRNA分子. 制備所述藥物用于治療選自以下的纖維化疾病肺纖維化、慢性阻塞性肺病、肝 纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力襲竭、慢性腎病、過敏性肺炎、呼吸性細支 氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動脈高血壓、 皰滲病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰疹病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙瘩、狼瘡、 腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、致 病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維 化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、開角型音 光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.優(yōu)選地纖維化疾病為慢性肺纖維化.
優(yōu)選將藥物配制用于選自以下的給藥方式局部給藥、注射、吸入、儲庫式 或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合.
還預(yù)期的是，包含抗CCL21抗體或設(shè)計為抗CCL21的siRNA分子，以及任 選的抗CCL19抗體或設(shè)計為抗CCL19的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維 細胞和/或纖維細胞增殖的藥物中的用途.該用途可進一步包括包含抗CCR7抗體 或設(shè)計為抗CCR7受體的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細胞和/或纖維 細胞增殖的藥物中的用途.
另一方面預(yù)期了抑制CCL21活性的組合物在制備抑制纖維細胞遷移和/或成 纖維細胞活化的藥物中的用途.還提供了抑制纖維細胞中CCL21的活性或表達， 和/或抑制固有肺成纖維細胞活化的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物通過防 止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生并改善肺纖維化癥狀來治療肺纖維化.
另外，本本還預(yù)期了降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存 在量或活性的藥劑或任選的降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL19的
物中的用途.
的藥劑或任選的降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL19的存在量或活 性的藥劑在制備治療藥物誘發(fā)的肺纖維化的藥物中的用途.在這樣的用途中，制
備的藥物用于治療藥物誘發(fā)的非特發(fā)性肺纖維化，所述藥物選自細胞毒素刑、拔
生素、抗心律失常藥、消炎藥和違禁藥，例如所述藥物可選自兩性審素B、博來 霉素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氣芥、可卡因、環(huán)磷觥胺、苯妥 英、麥角胺、氟卡尼、海洛罔、美法侖、美沙稱、甲氨蝶呤、哌甲醋、美西麥角、 礦物油、呋喃妥罔、亞砩基脲類、丙卡巴肼、硅頃、柳氮橫吡啶、妥卡尼和長春 花生物堿類藥劑. 一些實施方案中，考慮聯(lián)合使用藥劑來制備藥物，其中將基于 CCL19或CCL21的藥物與皮質(zhì)類固醇、免疫抑制、抗凝劑、利尿劑、強心甙、 鈣通道阻斷刑、血管擴張刑、前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素拮抗刑、褲酸二SS醉抑制 劑、P2激動劑、抗毒覃減刑、內(nèi)肽酶抑制劑、降血脂藥和血栓素抑制刑，或其紐 合聯(lián)合.
附圖簡迷
圖l.外科肺活檢的上肺葉(lobe)和下肺葉中的(A) CCR7及(B) CXCR4 基因表達的SuperArray基因分析，所述肺葉來自UIP病人(n-7)組、NSIP病 人(n=6)組、RBILD病人(n=6)組以及正常邊緣(normal margin)腫瘤病人 (n=5)組，顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM).未檢測到顯著差異.CCR7為CC 趨化因子受體7, CXCR4為CX趨化因子受體4， GAPDH為3-磷酸甘油醛脫象 醉，NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UH 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖2.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的(A) CCL19、 (B) CCL21及(C〕 CXCL12基因表達的SuperArray基因分析，所迷肺葉來自UlP病人(n-7)組、 NSIP病人(n=6)組、RBILD病人(n=6 )組以及正常邊緣腫瘤病人(n=5 )組. 顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM).未檢測到顯著差異.CCL為cc趨化罔子受體fie 體，CXCL為CX趨化罔子受體配體，GAPDH為3-磷酸甘油眵脫氬酶，NSIP為 非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型 間質(zhì)性肺炎.
困3.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的CCR7及CCL21基因表達的定i Taqman聚合酶鏈反應(yīng)分析，所述肺葉來自UIP病人(n=18 ) 、 NSIP病人(n-8 )、 RBILD病人(n=6)和正常邊緣病人(n=6).顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM) "為與來自正常邊緣的腫瘤病人組的適當肺葉相比，P<0.01. CCR7為CC趁化 因子受體7， CCL21為CC趨化目子受體4配體，NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，
RBILD為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖4.外科肺活檢的上肺葉和下肺葉中的CCL19、 CCL21和CCL12的酶聯(lián)免 疫吸附法分析，所迷肺葉來自UIP病人(n=18) 、 NS1P病人(n-6) 、 RBILD 病人(n-6)和正常邊緣病人(n-6).顯示的數(shù)據(jù)為平均值(SEM ) , CCL為 CC趁化罔子受體陪體，CXCL為CX趨化因子受體配體，NSIP為非特異性間質(zhì) 性肺炎，RBILD為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖5. SLBs中CCR7的代表性免疫組化分析，所述SLBs來自UIP病人組(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫病病人組
(G、H).組(A)、 (C)、 (E)和(G)顯示對照染色.來自UIP (B)、 NSIP ( D )和RBILD ( F )的SLBs中的病灶區(qū)(focus area )見到CCR7免疫反 應(yīng)性(紅色染色)，但在正常邊緣組(H)則未發(fā)現(xiàn).放大倍數(shù)6200. CCR7為 CC趨化罔子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細支氣管炎 /間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
困6. SLBs中CXCR4的代表性免疫組化分析，所述SLBs來自UIP病人組
(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫瘤 病人組(G、 H).組(A) 、 (C)、 (E)和(G)顯示對照染色.HP和正常 邊緣組SLBs的單核細胞可見CXCR4免疫反應(yīng)性(紅色染色).放大倍數(shù)6200. CXCR4為CX趨化因子受體4， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性 細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.
困7.來自UIP病人組(A-C)和NSIP病人組(D-F)的序列組織切片中CCR7
(B、 E)和CD45 (C、 F)的代表性免疫組化分析.組(A)和(D)顯示對照 染色.UIPSLBs中，CCR7免疫反應(yīng)性(B中紅色染色)與CD45的免疫反應(yīng)性
(C)部分重疊，雙重染色的大部分與單核細胞(C)有關(guān).在序列組織切片中(A、 F) ， CCR7和CD45似乎未在NSIP SLBs中共定位.放大倍數(shù)6200. CCR7為 CC趨化因子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，SLB為外科肺活檢樣，Ulf 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖8. SLBs中CD34的代表性免疫組化分析，所述SLBs來自UIP病人組(A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RBILD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫瘤病人紐
(G、 H).組(A) 、 (C) 、 (E)和(G)顯示對照染色.所有病人的SLBs 中，間質(zhì)區(qū)見到CD34免疫反應(yīng)性(紅色染色).發(fā)現(xiàn)CD34在來自NSIP病入 組(D)的SLBs中表達最高.放大倍數(shù)6200.NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD 為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為外科肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺 炎.
困9. SLBs中1型膠原的代表性免疫組化分析，所述SLBs來自UIP病人組 (A、 B) 、 NSIP病人組(C、 D) 、 RB1LD病人組(E、 F)和正常邊緣的腫癌 病人組(G、 H).組(A) 、 (C)、 (E)和(G)顯示對照染色.膠原免疫反 應(yīng)性(紅色染色)彌散遍布于來自U1P病人組(B) 、 NSIP病人組(D) 、 RBILD 病人組(F)和正常邊緣的腫瘤病人組(H)的SLBs.放大倍數(shù)6200. NSIP為 非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科 肺活檢樣，UIP為普通型間質(zhì)性肺炎.


圖10.來自UIP病人組(A-C )和RBILD病人組(D-F)的SLBs中1型膠 原(B、 E)和CCR7 (C、 F)的代表性免疫組化分析.組(A)和(D)為對照 染色.膠原免疫反應(yīng)性(紅色染色)存在于UIP病人組(B )和RB1LD病人組(E). 但是，在序列組織切片中，1型膠原發(fā)生免疫反應(yīng)的區(qū)域沒有CCR7表達(C， UIP; F， RBILD).放大倍數(shù)6200。 CCR7為CC趨化因子受體7， RBILD為 呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科肺活檢樣，U1P為普通型間質(zhì)性肺 炎.
困11.來自UIP病人組(A-C) 、 NS1P病人組(D-F )和RBILD病人組(G-l 〕 的SLBs中平滑肌肌動蛋白(aSMA)的代表性免疫組化分析.組(A) 、 (D) 和(G)顯示對照染色.來自UIP病人(B) 、 NSIP病人(E)和RBILD病人(H) 的SLBs的病灶區(qū)中見到CCR7免疫反應(yīng)性(紅色染色).在序列組織切片中， 在UIP病人組(C) 、 NSIP病人組(F )和RBILD病人組(I)中還見到aSMA 表達(紅色染色).但是，未見CCR7和aSMA表達的重疊.放大倍數(shù)6200. CCR7為CC趨化因子受體7， NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性細 支氣管炎/間質(zhì)性肺病，SLB為為外科肺活檢樣，aSMA為平滑肌肌動蛋白，DIP 為普通型間質(zhì)性肺炎.
圖12.與其它類型的非纖維化疾病患者相比，來自各種類型的慢性肺纖維化 病人外科肺活檢中CCL21的轉(zhuǎn)錄物表達.不同病人組的CCL21基因表達(用 TAQMANPCR測定)有差異.在普通型間質(zhì)性肺炎(UIP )病人SLBs的上肺葉 和下肺葉中觀察到CCL21的最高表達，但是在下肺葉SLBs檢查中，UIP組與
其它組SLBs之間的差異最為顯著.綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明，在UIP期間，CCR7 和CCL21的表達得到明顯増強.NSIP為非特異性間質(zhì)性肺炎，RBILD為呼吸性 細支氣管炎/間質(zhì)性肺病.
困13.與其它類型的非纖維化疾病患者相比，來自各種類型的慢性肺纖維化 病人外科肺活檢中CCL21的蛋白質(zhì)表達，這里顯示了 HP和非IIP活檢樣本的 ELISA分析結(jié)果.在上肺葉活檢中，UIP、 NSIP和非IIP組的CCL21蛋白質(zhì)表 達水平相似.但是，在下肺葉樣本中(其中IIP病人中的肺纖維化更激進)，IIP 組的CCL21水平更高(即UIP、 NSIP和RBILD組與非IIP組相比).
圖14.CCL21的存在顯著增強了 UIP成纖維細胞的遷移，但不增強非IIP成 纖維細胞.這些實驗包括將人成纖維細胞加到Transwell多孔培養(yǎng)平板系統(tǒng)中， 對在24小時孵育期間遷移通過(migrated through)的成纖維細胞進行計數(shù).UIP 成纖維細胞遷移通過transweH至底孔(bottom well),如果在底孔中加入CCL21, 或用TNF處理成纖維細胞并在底孔中加入CCL21,則該反應(yīng)顯著增強.抗CCL21 抗體的存在顯著減弱了后兩組中成纖維細胞的遷移，但是對笫一組沒有影響.
困15.這里顯示了外源性CCL19和CCL21 (均為10 ng/ml)對來源于正常 SLBs、過敏性肺炎SLBs、類肉痛SLBs和UIP SLBs的原代成纖維細胞系的増殖 反應(yīng)的影響測定，顯然，UIP成纖維細胞對CCL19和CCL21配體的存在呈現(xiàn)增 殖反應(yīng).
圖16.已經(jīng)觀察到，將IIP成纖維細胞引入SCID小鼠促進了間質(zhì)纖維化的 發(fā)展，將接下來的研究設(shè)計為評價抗CCL21在這一模型中的抗纖維化作用.從 第35天開始給各組(五只小鼠一組)腹腔注射純化的IgG或抗CCL21抗體，每 隔一天注射直至第63天.在第63天，摘除肺組織，取代表性切片.IgG處理的 小鼠明顯顯示出間質(zhì)纖維化和重塑.相反，基于組織學(xué)分析，抗CCL21抗體治 療組很少顯示出肺纖維化.
本發(fā)明優(yōu)選實施方案詳述
纖維化涉及纖維細胞的不受抑制的增殖以及分化.纖維細胞是一群獨特的成 纖維細胞樣細胞，其源自外周血單核細胞，外周血單核細胞通常進入組織損傷但 點，促進血管生成和傷口痊愈.本發(fā)明顯示，降低纖維細胞和/或成纖維細胞(存 在于纖維化病變的纖維化損害處)中CCL21的存在量或活性將減少纖維化病" 的存在量，和/或抑制纖維化病灶的形成和/或改善纖維化疾病的一種或多種癥狀， 從而獲得有益的治療結(jié)果，
已知的特發(fā)性慢性肺纖維化具有非常大的臨床挑戰(zhàn)性，各種治療選擇顯示出
效力有限或有毒性(Flaherty et al.， Am. J. Med.， 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. CHt. Care Med.， 149:A878 (1994))，診斷后的中位存活率幾乎 無變化(Ryu et al.， Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ, Health Perspect.， 108 Suppl 4:751-762 (2000)),已知的促纖維化剌激因素包括放 射、吸入的礦物質(zhì)及有機粒子、氣態(tài)氧化刑、藥物和感染性微生物，然而對于引 發(fā)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(HP)的臨床病理實體的致病因素的確認一直存在著爭議. IIP是一組多種形式的疾病，與遠端肺實質(zhì)有關(guān)，其有許多共同的特征，但是很 難為命名為單獨的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path" 24:19-33 (2000)) 不 清楚它們的發(fā)病機理，但集中認為是與肺部受到創(chuàng)傷(或多重損傷)后試困治愈 該創(chuàng)傷有關(guān).成纖維細胞灶是活躍增殖的成纖維細胞的小聚集體，被認為是創(chuàng)傷 的優(yōu)先細胞灶(prior foci)的組織化，顯示纖維化處于活動和進行狀態(tài).
首先，以IIP為例說明慢性纖維化疾病，本文表述的數(shù)據(jù)表明，CCR7和/或 CXCR4在纖維化病癥(此處為IIP外科肺活檢(SLBs))高度表達，而在正常 邊緣的SLBs中表達不高.對來自IIP病人組和正常邊緣的腫瘤病人組的SLBs 進行了詳細的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)分析.趨化罔子和趨化罔子受體轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果表 明，CCR7 (而非CXCR4)在HP (特別是所有UIP活檢分析樣)的間質(zhì)病灶區(qū) 中高度表達，但是在正常邊緣的活檢樣中沒有這樣，IIP活檢中的CCR7陽性區(qū) 域含有纖維細胞，但是假設(shè)存在于CCR7陽性區(qū)域內(nèi)的細胞不共表達纖維細胞標 記物(如CD34和膠原)，CCR7陽性細胞不一定是來源于骨號的細胞.最后表 明，IIP活檢中的CCR7陽性細胞是活化的閨有組織成纖維細胞.因此，這里描 述的例子證明了在嚴重IIP中增加了 CCR7的表達，這種表達定位于缺乏纖維細 胞和肌成纖維細胞的纖維化病灶區(qū).
進一步研究表明，CCR7受體的CCL21和/或CCL19配體的靶向性有良好的 干預(yù)作用，用于慢性纖維化疾病的治療.更具體地，臨床和動物模型數(shù)據(jù)顯示， 在UIP期間CCR7和CCL21的表達得到明顯加強.進一步表明了 CCLM的存在 增強了 UIP成纖維細胞的遷移.另一方面，抗CCL21抗體制刑大大減弱了 U1F 中成纖維細胞的遷移，另外，當CCL21或CCL19配體存在時，U1P成纖維細胞
呈現(xiàn)明顯的增殖反應(yīng).
將IIP成纖維細胞引入SCID小鼠，小鼠的發(fā)育引起間質(zhì)性纖維化的發(fā)展. 此模型用作IIP的人源化SCID模型.與未經(jīng)抗CCL21抗體處理的IIP人源化 SCID小鼠模型相比，用抗CCL21抗體治療這些模型小鼠時，該小鼠很少或不顯 示肺纖維化的組織學(xué)證據(jù).
從本文顯示的數(shù)據(jù)可以預(yù)期，涉及降低和/或抑制CCL21和/或CCL19活扭 的方法和組合物，對于治療肺部和其他組織的纖維化疾病是特別有用.人成纖絲 細胞對CCL19和CCL21的反應(yīng)性(由于其對CCR7的正調(diào)節(jié)作用)導(dǎo)致這些細 胞的不當活化，從而造成IIP中觀察到的極度纖維化反應(yīng).有趣的是，肺纖維化 病人的細胞因子環(huán)境可能有利于CCL19和CCL21的異常反應(yīng)，因為已經(jīng)有其傳 研究者文獻記栽了 TNF-a蛋白水平升高(Sallusto et al.， Eur. J. Immunol. 29:1617-1625 (1999); Randolph et al" Science, 286:2159-2162 (1999))和IL-10減 少(Hammad et al.， J. Immunol., 169:1524-1534 (2002))，這兩種細胞罔子均調(diào) 控與這些配體結(jié)合的受體.來自嚴重肺纖維化病人的人成纖維細胞明顯對CCL" 和CCL21起反應(yīng)，罔此使這些配體成為治療肺部(可能還有其他組織)的纖雄 化疾病的吸引性靶點.
鑒于以上討論，應(yīng)理解，在某些實施方案中可以預(yù)期，靶向CCL21和/或 CCL19的組合物特異性地抑制趨化罔子與CCR7受體的相互作用.此類組合物可 以定向抗CCL21和/或CCL19本身(例如抗這些趨化因子的抗體、設(shè)計為抗這些 趨化因子反義分子或設(shè)計為抗這些分子的siRNA分子).或者，此類組合物可定 向抗CCR7受體(例如抗該受體的抗體、設(shè)計為抗該受體的反義分子或設(shè)計為抗 該受體的siRNA分子)，其它選擇中，此類組合物可包含趨化閎子與CCR7受偉 相互作用的小分子抑制劑.這些同樣用于治療和/或改善受試者疾病征狀的組合敎 和方法將在后面進行更為詳細的討論.
任何纖維化疾病都是可以治療的.例如，這些疾病可包括肺纖維化、慢性fi 塞性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力衰竭、慢性腎病、過敏性肺炎、 呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病、更氏血吸蟲感染、原發(fā)性肺動脈高壓(防止叢批 損害形成)、皰疹病毒相關(guān)疾病(包括肺表現(xiàn)和皮膚表現(xiàn))、瘢痕疙瘩、狼瘡、 腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾病、效 病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵巢纖維
化、角膜纖維化、克血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后結(jié)疤(包括腹部粘連)、 開角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合，所述方法適用的其它領(lǐng)域是抑
制上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化(EMT).這是一種現(xiàn)象，其中各種器官(特別是 腎)中的上皮細胞"退化"成更"原始"的細胞表型(類似成纖維細胞).這種 過程有助于組織機體發(fā)育布局的形成，EMT在胚胎發(fā)育方面得到了很好的研究， 在成人組織的器官纖維化過程中，其對成纖維細胞的發(fā)生也發(fā)揮著作用.腎纖維 化研究的最新證據(jù)表明，全部疾病相關(guān)成纖維細胞中超過三分之一來源于損傷位 點處的管狀上皮細胞，這種過程可被KaHuri和Nielsen發(fā)明的組合物抑制(J. Clin. Invest. 112:1776-1784(2003)).
充血性心力衰竭、非典型性肺炎(包括肺孢子蟲類)和腫瘤淋巴彌散的病人 可出現(xiàn)肺纖維化，環(huán)堍性或職業(yè)性瀑露(包括吸入接觸無機粉塵，例如硅稱、石 棉、鈹(bery出os)，黑肺)也被認為是引起這些肺疾病的原罔.接觸蛋白質(zhì)抗 原(如農(nóng)民肺、飼鵒者肺、熱浴肺(hot-tub lung))以及接觸有毒氣體、煙霧、 浮塵和蒸氣(如地窖裝填者病(silo-fiHer，s disease))也會引起纖維化.瀑露于 放射(電離放射，頻繁使用于醫(yī)學(xué)治療)也是眾所周知的肺纖維化起罔，其還是 風(fēng)濕病/結(jié)締組織病(例如硬皮病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病、系統(tǒng)性紅 斑狼瘡)的有關(guān)原罔.在以下疾病中也可見到纖維化肺腎綜合征(即Wegner 或Goodpasture病癥)；結(jié)節(jié)病和其他肉芽胂性疾病(例如鈹中毒)；系統(tǒng)性疾 病，如丙型肝炎；炎癥性腸道疾??；獲得性免疫缺陷綜合征；特發(fā)性或罕見性 DPLDs，如COP(特發(fā)性)、肺郎格漢斯細胞組織細胞增生癥(罕見)、嗜酸細 胞性肺炎.另外，纖維化可見于家族性IPF或結(jié)節(jié)病、結(jié)節(jié)性硬化癥、神經(jīng)纖維 瘤、Niemann-Pick病、Gaucher病和Hermansky-Pudlak綜合癥*
可使用本發(fā)明的治療性干預(yù)的另一領(lǐng)域為各種腫瘤治療引起的纖維化.例如， 本發(fā)明的治療方法可成為放射腫瘤治療方案的輔助治療方法.放射誘發(fā)的肺炎和 隨后的肺纖維化;lii射治療的副作用，其影響了放射治療的效果，典型的例子是, 在腫瘤治療中，放療的施用刑量為20-85gray.但是，對病人的研究已表明，當放 射劑量增加時，肺葉炎形式的肺毒性幾乎與之呈線性關(guān)系.隨后還見到纖維化損
和/或活性的藥刑，將改善放療誘發(fā)的肺葉炎和/或放療誘發(fā)的肺纖維化的發(fā)展或 進展.在某些實施方案中，預(yù)期本發(fā)明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性
的治療法可在放射治療之前和/或之后施用，以及/或與放療同時施用.在某些實
例中，優(yōu)選在實施放療后的l、 2、 3、 4或5天內(nèi)施用這樣的藥刑.
已被證明導(dǎo)致明顯的肺纖維化的另一種癌癥治療是在施用砥酸博來審素時 出現(xiàn)藥物誘發(fā)的纖維化.博來審素沉積在皮膚和肺部而引起纖維化.雖然有人建 議停止用藥并給予皮質(zhì)類固醇，但是對博來莓素引起的肺損傷的治療未見說明. 預(yù)期本發(fā)明降低CCL19和/或CCL21的存在量或活性的治療法可在給與砥酸博來 莓素之前、和/或之后，和/或同時施用.施用降低CCL19和/或CCL21的存在量 或活性的藥刑將有效降低接受疏酸博來霧素的病人的肺纖維化發(fā)生或發(fā)展.
雖然將疏酸博萊霧素描迷為導(dǎo)致肺纖維化的示例性藥刑，但是其他藥物也可 誘發(fā)肺病，近年來這已經(jīng)成為大家關(guān)注的一個領(lǐng)域.1972年公認可引起肺病的藥 物只有19種.2001年的一篇文獻綜述指出，至少有150種藥物已被顯示能導(dǎo)致 肺病，這一名單還在增加中.這其中，已知纖維化可由以下藥物引起細胞毒刑， 如博來審素、白消安、甲氦蝶呤；抗生素，如呋喃妥因、柳氮磺吡啶；抗心律不 齊藥，如胺碘S^、妥卡尼；消炎藥，如黃金、青審胺；違禁藥，如快克可卡因、 海洛因.具體實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療以下藥物引起的纖 維化兩性審素B、博來審素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、 可卡因、環(huán)褲酰胺、苯妥英、麥角胺、象卡尼、海洛因、美法侖、美沙頃、甲承 蝶呤、哌甲酯、美西麥角、礦物油、呋喃妥罔、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅頃、 柳氮磺吡啶、妥卡尼和長春花生物堿類藥刑，包括絲裂審素和抗微生物刑.已這 意到亞硝基脲類(如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀)，尤其卡莫司汀的使用， 高達25%的接受卡莫司汀的病人發(fā)生早發(fā)型(在卡莫司汀治療開始后36個月內(nèi)) 肺纖維化.
術(shù)語"受試者"和"病人"是指哺乳動物或非哺乳動物物種的一個或多個威 員，其可對本文所述的制藥方法、組合物和治療存在需要.罔此，受試者和病入 包括但不限于靈長類(包括人)、犬科、貓科、有蹄類(如馬科、?？?、豬科(例 如豬))、禽類，以及其受試者.特別感興趣的是人和具有商業(yè)重要性的非人勁 物(例如家畜和馴養(yǎng)動物)."哺乳動物"是指任何哺乳物種的一個或多個成員， 舉例來說，包括犬科、貓科、馬科、?？?、綿羊科、嚙齒目等，以及靈長類(尤 其是人類).非人動物棋型，尤其哺乳動物(例如靈長類、鼠科、兔類等)可用 于實驗性研究.含有一種或多種抑制CCL21和/或CCL19的活性、表達和數(shù)量的藥劑的組會 物可用于抑制不恰當位置、纖維化病癥、慢性炎癥等中的纖維化.這樣的組合啦 可局部施用于纖維化損害位點，或者可全身施用.此外，這種旨在減少、抑止、 抑制或其它方式消除CCL21和/或CCL19的活性/效果的組合物可以單獨施用或 者與其他可用于治療纖維化疾病的藥劑聯(lián)合施用.這些其他組合物可例如包括皮 質(zhì)類固醇和其他抗炎藥，強的松、疏唑噪呤以及IFN"Y細胞因子治療也是有益的. 特別預(yù)期這些組合物與抗CCL21/抗CCL19組合物的組合.以前提出單獨使用免 疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇足以治療肺纖維化，但是現(xiàn)在公認聯(lián)合皮質(zhì)類閨醇的免疾 抑制治療對于治療該疾病是無效的，罔為這種干預(yù)不僅對于改變疾病的m無效， 其也沒有使存活預(yù)后有任何提高.肺纖維化受試者的預(yù)后為，當缺少手術(shù)干預(yù)時， 該疾病是致命的.這樣，這些病人唯一的選擇就是肺移植.因此，第一項發(fā)明的 組合物和方法與現(xiàn)有治療方法相比是一項重大的進步，因為它們提供了能夠阻止 或減緩該疾病的發(fā)展/進展的治療方案.
具體實施方案中，含有抗CCL21抗體的組合物可用來降低靶位置中CCL21 的濃度.降低人體中CCL21和CCL19所需的刑量推測在較低的微克范閨.例如， 可以使用5-40 pg/kg大約刑量范閨的抗體.理想的是，這些抗體將在5-10 pg/kg 的較低劑量范閨內(nèi)發(fā)揮作用.
IL-12、層粘連蛋白-1、交聯(lián)IgG和IgG聚集體已經(jīng)顯示出抑制單核細胞分化 成纖維細胞(美國專利申請No. 20050238620).這些組合物可用于本文所討論的 組合中.
在本治療方法中，可施用于靶位置的所述組合物可來自外源性來源，或者它 們由靶位置中的細胞或與靶位置相同的器官(organism)中的細胞在體內(nèi)產(chǎn)生. 這些組合物可從捐贈的人體組織(包括體液)中分離.也可以在細菌、組織培養(yǎng)
蛋白，它們也可以合成制備，或通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法來制備.如果這 些組合物在體內(nèi)制備，則它們可以是轉(zhuǎn)基因的表達產(chǎn)物，或者它們可得自存在于 體內(nèi)的來源的生產(chǎn)增強，如果這些組合物正常存在于靶位置，則也可以通過降仳 其正常的降解速率來提高其濃度.另外，例如通過供應(yīng)輔助因子，也可能增強這 些組分對纖維細胞分化的抑制能力.
雖然以IIP作為纖維化疾病的例子來說明本發(fā)明方法，但是應(yīng)理解，這種疾
病是用作其他纖維化疾病的范例.根據(jù)本文的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到， 可被治療的其它疾病包括其中希望抑制纖維化的任何疾病，從而，本發(fā)明的方法
涉及由這樣的病癥引起的纖維化，其包括但不限于硬皮??；瘢痕疙瘩；風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎；狼瘡；腎源性纖維化皮膚??；纖維化損害，例如日本血吸蟲感染后形成的 損害；自身免疫疾?。恢虏⌒岳w維化；萊姆病；胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維 化；哮喘；特發(fā)性肺纖維化；慢性阻塞性肺??；肺纖維化；子宮肌瘤；印巢纖維 化；其他纖維囊性形成物；角膜纖維化或其他眼部纖維化，例如角膜屈光手術(shù)引 起的纖維化；以及充血性心力襲竭和其他缺血后遣癥引起的纖維化；術(shù)后結(jié)疙， 包括腹部粘連；開角型青光眼小梁切除.某些這樣的纖維化疾病中，纖維細胞可 能不代表纖維化的最后階段，例如，在津喘中，纖維細胞進一步分化為成肌纖維 細胞，后者持續(xù)存在于變厚的氣道壁中.對于治療，應(yīng)了解纖維化疾病癥狀的任 何改善都是有益效果，并應(yīng)視為治療的證據(jù).罔此，病癥或疾病的"治療(treating or treatment)"包括(1 )預(yù)防所述病癥的至少一種癥狀，即使哺乳動物的臨 床癥狀沒有明顯發(fā)展，所述哺乳動物可能暴露于疾病或有疾病先兆，但是尚未經(jīng) 歷疾病或表現(xiàn)疾病的癥狀；(2)抑制疾病，即阻滯或減援疾病或其征狀的發(fā)展； 或(3)減輕疾病，即使疾病或其臨床癥狀好轉(zhuǎn).這里所說的治療、預(yù)防和改善病 癥例如包括減輕或根除與纖維化疾病有關(guān)的有毒或有害狀況.這類治療的例子包 括減輕細菌感染、增強肺功能、對促炎細胞因子進行降調(diào)節(jié)，以及對單核細胞 聚集的升調(diào)節(jié).
具體實施方案中，可通過施用抑制或其它形式降低CCL21和/或CCL19的作 用的藥劑來治療肺纖維化或其他肺纖維化疾病.治療可減慢與纖維化有關(guān)的細胞 生長，也減少膠原沉積，治療可防止進一步纖維化，或咸小現(xiàn)有纖維化的影響. 藥刑可以任何刑量給予，且為任何刑型，只要能夠減輕病人的疾病的至少一種癥 狀.可以每隔一天靜脈給藥，并且持續(xù)選定的時期.這種刑量、給藥方法和給藥 時間表對于治療其他纖維化疾病也是有用的.劑量、刑型和給藥方式可以用疾病 的動物模型加以優(yōu)化.
下面提供的例子中給出用于肺纖維化的示例性模型.但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員 會意識到這種纖維化疾病的其他模型.例如，在美國專利No. 20050238620中， 通過向其肺中注射博來審素，誘發(fā)大鼠(Sprague Dawley，含手術(shù)植入頸靜脈導(dǎo) 管，Charles River Laboratories, Wilmington, Mass)肺纖維化，博來莓素是一
種抗腫瘤藥，注入動物氣道時導(dǎo)致肺部纖維化.這是研究肺纖維化的標準方法
(Crouch, E. 1990. Pathobiology of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 259:L159-L184).在此類方法中，為了誘發(fā)纖維化，對大鼠進行麻 醉和監(jiān)控，以保證獲得并維持合適的麻醉手術(shù)平面.翔部腹側(cè)剃毛、消毒，準備 進行切口手術(shù).在頸部腹側(cè)做一個垂直中線切口，縮回頸部肌肉，暴露氣管.取 300 pi 3.3 U/ml (1個單位)博來審素(Calbiochem/EMD Biosciences. San Diego， Calif.)的0.9%生理鹽水無菌溶液，用注射器和26號針頭注入氣管腔內(nèi).對照組 大鼠注入生理鹽水.縫合2-3針閉合切口，該操作按照Underwood等人的方法進 行(2000, SB 239063， a p38 MAPK inhibitor, reduces neutrophilia, inflammatory cytokines, MMP-9, and fibrosis in lung. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:L895-L902.).在該搮作期間以及手術(shù)后，動物被安置于加熱燈下， 一旦其 完全恢復(fù)就放回籠內(nèi).在該搮作過程中，對動物進行檢查，以保證其i)呼吸規(guī) 律，ii)耳朵和粘膜呈粉紅色，Hi)捏其腳趾不縮腳，iv)眼睛或眼瞼受觸碰不眨 眼.
為了試驗抗CCL21組合物的效果，經(jīng)由銷售者植入的頸靜脈導(dǎo)管對纖維化 模型靜脈注射抗CCL21組合物.該組合物可以有利地用生理鹽水(0.9%NaCl) 配制，使用前通過0.2pm過濾器.
用于本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的抗CCL21組合物是與CCL21產(chǎn)生免疫反應(yīng)的 抗體.優(yōu)選地，此類抗體是只與CCL21及其變異體產(chǎn)生免疫反應(yīng)而對不與其它 趨化罔子反應(yīng)的單克隆抗體.優(yōu)選該抗CCL21抗體為配制用于對人被試者施用 的人源化抗體.本領(lǐng)域技術(shù)人員對用于研究目的的抗CCL21抗體非常了解.例 如，R&D Systems ( Minneapolis, MN )有一種可得商品制劑BAF457,這是一種 小鼠重組抗CCL21抗體，由大腸桿菌產(chǎn)生，可以用于本發(fā)明.P印roTech.( Rocky 訓(xùn)l， NJ )也有抗CCL21單克隆抗體，Abeam ( Cambridge, U.K., and Cambridge MA， USA)有與CCL21產(chǎn)生免疫反應(yīng)的多克隆抗體(例如山羊抗CCL21多克隆 產(chǎn)品abl0350和abl0364),其可以很容易地用于再現(xiàn)實驗，以顯示在模型動物 中抑制CCL21的作用可改善纖維化.
由于本領(lǐng)域中很容易獲得鼠科和山羊抗CCL21單克隆抗體，預(yù)期此類抗體 可以容易地作為"模板"用于制備相同單抗的人版本(human version)，用于人 體治療，例如，預(yù)期可使用噬菌體呈現(xiàn)法來構(gòu)建(device)能用于本發(fā)明治療方
法的全長抗體或抗體片段.其它實施方案中，有可能制備全長人源化小鼠或山羊
重鏈或輕鏈免疫球蛋白，其含有人恒定區(qū)、小鼠或山羊CDRs以及具有許多"人 源化"改造氨基酸的實質(zhì)小鼠或山羊構(gòu)架，由此將降低此類種抗體對人類受試者 施用時發(fā)生不良反應(yīng)的可能性，許多實施方案中，"人源化抗體"是含有人源化 可變輕鏈和/或人源化可變重鏈的抗體，通過"人源化"過程已經(jīng)被"人源化"了 的修飾抗體與抗原(與提供CDRs的母抗體所結(jié)合的抗原相同)結(jié)合，且與母抗 體相比，其通常對人體的免疫原性較小.當然，以上關(guān)于抗CCL21抗體的描述 也適用于CCL19,后者的抗體在本領(lǐng)域也是可得的.
應(yīng)理解，這里所使用的抗體可以含有Fc域，也可以不含F(xiàn)c域.在一些實施 方案中，多價抗體可用作治療性組合物."多價抗體"是指含有針對多個表位的 結(jié)合域的重組抗體樣分子，例如，同時與CCL21和CCL19結(jié)合的多價抗體可被 認為對于治療纖維化特別有用.在其他治療性組合物中，抗體衍生蛋白包括其中 抗體Fab鏈已與結(jié)合域融合的分子，例如Fab-scFv 二體(bibodies )或三體 (tribodies).這些分子是有用的中等重量的不含F(xiàn)c部分的重組雙特異性抗體. 產(chǎn)生缺乏Fc域的抗體是有利的，因為當抗體相關(guān)的治療分子上存在該域時，該分 子趨于延長其在血清中的保留時間，以防止其在肝臟中代謝，該分子還可能通過 其與Fc受體的相互作用而與其它細胞發(fā)生交聯(lián)，從而因全身觸發(fā)(systemic triggering)免疫效應(yīng)細胞而產(chǎn)生毒性副作用.因此，某些抗體相關(guān)的治療性分子 缺乏Fc域.本領(lǐng)域技術(shù)人員知道構(gòu)建這類抗體相關(guān)分子的方法.例如，為了有效 產(chǎn)生多特異性抗體，可以由抗體衍生的結(jié)構(gòu)單元(例如Fc、 (Fab，)2、 Fab、 scFv 和雙體(diabody))與異源二聚模體的組合來制備重組抗體，
除抗體之外，預(yù)期設(shè)計為抗CCL21和/或CCL19的siRNA分子也將是治療 纖維化疾病的有用組合物，本領(lǐng)域技術(shù)人貝熟知，通過稱為RNA干擾(RNAi ) 的過程，雙鏈RNA(dsRNA)可在許多有機體中引起序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默. 最近的研究表明，RNA片段是RNAi的序列特異性介質(zhì)(Elbashir et al.， Nature, 411,494,2001),通過這些小干擾RNA (siRNA)對基罔表達的干擾現(xiàn)在被認為 是使線蟲、果蠅、植物以及小鼠的胚胎干細胞、卵母細胞和早期胚胎中的基因沉 默的天然策略(Cogoni et al.， Antonie Van Leeuwetihoek， 65， 205， 1994; Bau，combe， Plant Mol. Biol" 32， 79， 1996; Kennerde，l， CeH， 95， 1017 1998; Timmons， Nature, 395， 854， 1998; Waterhouse et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A.
95， 13959, 1998; Wia呵and Zemicka-Goetz， Nat. Cell Biol" 2， 70， 2000; Yang et al*， Mol， Cell Biol" 21， 7807， 2001j Svoboda et al" Development, 127， 4147 2000 ) 在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中，通過用合成RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染細胞，已實現(xiàn)siRNA 介導(dǎo)降低基因表達(Caplan et al" Proc. Na". Acad. Sci. U.S.A., 98， 9742， 2001; Elbashir et al.， Nature, 411， 494， 2001 ).
典型地，為了實現(xiàn)治療性siRNA的細胞內(nèi)表達，構(gòu)建含有發(fā)夾序列(例如 21-bp發(fā)夾)的RNA分子，所述發(fā)夾序列代表定向?qū)垢信d趣基因的序列(本案 中為CCL21基因和/或CCL19基罔.將SiRNA或編碼該siRNA的DNA序列導(dǎo) 入把細胞中，例如在纖維化損害位點產(chǎn)生CCL21的細胞.siRNA降低目標inRNA 和該試刑的基因蛋白表達.使用組織特異性啟動子將獲得治療性siRNA分子的有 益的組織特異性靶標.編碼治療性siRNA的構(gòu)建物具有這樣的構(gòu)型，以致啟動子 與發(fā)夾緊密相鄰.根據(jù)是否需要可誘導(dǎo)的，組織或細胞特異性表達siRNA,從本 領(lǐng)城已知的容易得到的啟動子中選擇用于具體構(gòu)建物的啟動子.例如通過注射將 該構(gòu)建物導(dǎo)入靶細胞，使細胞中靶基因表達減小.
因此，在示例性實施方案中，本發(fā)明提供了包含表達盒的栽體(即在重組基 因表達和/或送遞中通常使用的病毒栽體，例如腺病毒栽體、慢病毒栽體、腺伴隨 病毒(AAV)栽體、逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體、脊鏈灰質(zhì)炎病毒栽體、單純皰務(wù)病毒(HSV) 栽體或鼠Maloney-based病毒栽體等)，其中表達盒包含分離的編碼靶向抗CCL21 的小干擾RNA分子(siRNA)的核酸序列.CCL21的核酸結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知，CCL19的結(jié)構(gòu)也一樣，參見例如Genbank Accession No. AB002409, 其記栽了人CCL21的mRNA序列；Genbank Accession No. NM_006274，其記栽 了人CCL21的mRNA序列，恒河猴的CCL21記栽于Genbank Accession No. NM_001032855，在提出本申請時，豬、小鼠和狗的序列也可在Genbank得到. 這些序列都可以制備，且可將siRNA設(shè)計為對抗確定為CCL21的功能表達重要 的那些分子區(qū)域(注意相關(guān)蛋白質(zhì)的序列公開可用于制備相同蛋白質(zhì)的重組抗 體及產(chǎn)生其抗體).該siRNA可靶向于沿該核酸序列的任意10-30個相鄰核酸片 段，特別有用的是對趨化因子的功能表達有重要的那個序列.siRNA可形成含有 雙鏈體結(jié)構(gòu)和環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)的發(fā)夾結(jié)構(gòu).環(huán)結(jié)構(gòu)可含有4-10個核苷酸，例如4 個、5個或6個核普酸.雙鏈體的長度優(yōu)選小于30個核苷酸，例如19-25個核普 酸.siRNA可進一步包含突出區(qū)(overhang region ).這種突出可以是3，突出區(qū)、
5，突出區(qū)或3，和5，同時突出區(qū)，突出區(qū)可以是例如長度為1-6個核苷酸.表達盒 可進一步包含啟動子.啟動子的例子包括可調(diào)控啟動子(regulataWe promoters 〕 和組成型啟動子.例如，啟動子可以為CMV、 RSV或polIH啟動子.表達盒可 進一步含有聚腺苷酸化信號，例如合成的最小聚腺苷酸化信號.核酸序列可進一 步含有標記基因.
當然，除了定向抗CCL21和/或CCL19的組合物外，所述組合物還可以定向 抗CCR7 (這些趁化因子的受體)的組合物.此外，特別預(yù)期聯(lián)合治療，其中注
法聯(lián)合使用.特別預(yù)期的其他具體聯(lián)合治療為其中基于降低纖維化疾病中CCL21 活性的治療方法與已有的纖維化治療的聯(lián)合的那些治療.例如，目前已經(jīng)證明單
用可有效改善肺纖維化.臨床項目在波生坦(bosentan) ( Tracker )對于特發(fā)
果.疏唑噪呤在纖維化疾病中對于穩(wěn)定肺功能和改善癥狀也發(fā)揮作用.細胞閎子
(IFN-Y)治療對于纖維化疾病也是一種有用的治療方法.為了減輕、消除或其它 形式中止纖維化癥狀，可將任何此類組合物與基于抗CCL21的治療和/或基于抗 CCL19的治療聯(lián)合使用(注意"基于抗CCL21"或"基于抗CCL19"的治療既 指抗體治療，又指使用siRNA分子的治療).
不管抗體是在動物體內(nèi)對抗具體的抗原而產(chǎn)生的，或是通過噬菌體呈現(xiàn)法和 抗體工程技術(shù)制備的嵌合抗體，此類抗體將最終被配制成用于治療纖維化疾病的 藥物制刑.同樣，siRNA組合物最終也將被配制成用于治療纖維化疾病的組合物. 局部遞送這些組合物是優(yōu)選的，但是預(yù)期全身遞送也是可能的，
按照本發(fā)明，用于施用的藥物組合物可以包含前面討論的任何基于抗CCL21 和/或抗CCL19的組合物.該藥物組合物還包括另一種用于治療表面活性物質(zhì)代 謝紊亂的藥劑，例如支氣管擴張藥，特別是當病人表現(xiàn)出氣道反應(yīng)性跡象時；以 及溶軲液劑，如乙酰半胱氨酸、胰蛋白醉和氨溴索和/或GM-CSF;皮質(zhì)類閨醉和 其他抗炎藥物，在某些方面，這些制刑中的每一種以藥學(xué)上可接受的形式提供， 任選與藥學(xué)上可接受的栽體組合.可通過達到其預(yù)期目的的任何方法施用這些組 合物.使用本發(fā)明方法施用用于抑制、消除等纖維化損害處的CCL21或CCL19 的作用的組合物的個體化劑量和方案可以很容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過試
驗來確定，所述試驗用于疾病的診斷以及測定給定治療性干擾產(chǎn)生的效果水平.
在IIP的治療中，可以很容易地對先前用于治療肺病的任何規(guī)程、刑型、紿 藥途徑等等進行修改，用于本發(fā)明.在一些實施方案中，當呼吸短促特別嚴重時，
可進行機械通氣.這種通氣包括高頻振蕩通氣(HFOV)或其他非常規(guī)形式的枳 械通氣.
本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括包含至少一種用于降低CCL21效應(yīng)或活性的藥 刑的所有組合物，所迷藥刑的用量為有效達到其降低、抑制、預(yù)防或減少CCL2
活性目的(例如減少或降低纖維化病變損害位點處的成纖維細胞的數(shù)量)的量. 在某些方面，這種治療將緩解IIP的一種或多種癥狀.
其它方面中，通過吸入或口服給與本發(fā)明使用的組合物.
應(yīng)理解，按照本發(fā)明的組合物的適當劑量將取決于接受者的年齡、健康狀況 和體重，以及同時進行的治療(如果有的話)類型、治療頻率和想要的效果性質(zhì). 但是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員無需進行過度的試驗，就能夠理解并能確定的，針對各 別受試者對刑量進行調(diào)整.這一般包括對標準劑量的調(diào)整，例如如果病人是低侔 重，則減小劑量，
治療劑的總刑量可以多刑量或單刑量形式給與，在某些實施方案中，單獨施 用所述組合物，在其它實施方案中，所迷組合物與其它針對該疾病或針對它的其 他癥狀的治療結(jié)合施用.
在某些方面，將本發(fā)明的組合物配制成適當?shù)乃幬锝M合物，即，適合在纖維 化疾病的治療性干預(yù)中進行體內(nèi)施用的劑型. 一般地，這需要制備基本不含熱原 以及可對人體或動物有害的其他雜質(zhì)的組合物.在某些方面，制備這些組合物用 于直接對肺施用.這些制刑借助吸入器進行口服，但是，預(yù)期其他的給藥途徑(例 如注射等)，從CCL21在IIP成纖維細胞中高度表達但在正常成纖維細胞或其他 組織中并非如此的發(fā)現(xiàn)可以得出結(jié)論，這種趨化罔子的主要位點整體涉及于纖維 化損害的形成，這在HP中似乎特別真實.這樣，預(yù)期促使這些組合物容易施用 于肺組織的制刑和給藥途徑將特別有用.
人們通常希望使用適當?shù)柠}和緩沖液以使所述組合物保持穩(wěn)定，且允許在靶 位點被攝入.通常本發(fā)明的蛋白質(zhì)組合物以凍干形式提供，施用前進行重構(gòu).或 者，可能將這些組合物配制成片刑或其他口服遞藥的刑型.用于重構(gòu)治療刑的鍵 沖液或溶液可與藥物制刑一起提供，以產(chǎn)生本發(fā)明的水性組合物，用于施用.A
類水性組合物將包含有效量的被使用、溶解或分散于藥學(xué)上可接受的栽體或水性
介質(zhì)中的各種治療刑.此類組合物也稱為接種體(inocula).本文所用的"藥學(xué) 上可接受的"指對人體或動物施用時不產(chǎn)生不良反應(yīng)、過敏反應(yīng)或其他不利反應(yīng) 的分子實體和組合物.本文所用的"藥學(xué)上可接受的栽體"包括任意和所有的容 劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲刑和吸收延遲劑等等.對藥物活 性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥刑為本領(lǐng)域所熟知.除了與這些治療性組合物不相容的 常規(guī)介質(zhì)或藥劑之外，預(yù)期其在治療性組合物中的使用，補充活性組合物也并入 這些組合物.
配制蛋白質(zhì)和核酸用于治療給藥的方法也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知.可通過任 何常用途徑施用按照本發(fā)明的這些組合物，只要通過該途徑能夠到達靶組織.最 常用的是，將這些組合物配制成口服給藥的制劑，例如由吸入器吸入.但是，也 可使用其他常規(guī)給藥途徑(尤其當口服給藥有問題時)，例如通過皮下、靜脈內(nèi)、 皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、乳內(nèi)、腹腔內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)(例如定期釋放)、 氣霧劑、舌下、鼻腔、肛門、陰道或透皮給藥，或通過在特定位點的手術(shù)植入. 治療可為單劑量，也可為一段時間內(nèi)的多次給藥.
在某些實施方案中，將用于施用的活性化合物制備成游離減或藥學(xué)上可接受 的鹽的水溶液，與表面活性劑(如羥丙基纖維素)適當混合.也可在甘油、液體 聚乙二醇及其混合物和油中制備分散體(dispersion),在普通的儲存和使用條件 下，這些制劑含有防腐刑以防止微生物的生長.
適合于注射使用的藥物刑型包括無菌水溶液或分散體，以及可即時配制成無 菌注射溶液或分散體的無菌粉末.在所有情況下，刑型都必須無菌，且必須有良 好的流動性，易于注射.其在生產(chǎn)和儲存條件下必須穩(wěn)定，并必須不受到微生物 (例如細菌和真菌)的污染影響，在某些方面，栽體為溶劑或含有諸如水、乙醇、 多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其適當?shù)幕旌衔镆约爸参镉偷?分散介質(zhì).通過以下方法保持適當?shù)牧鲃有岳缡褂冒?例如卵磷脂)；對 于分散體，保持所需的粒度；以及使用表面活性刑.通過各種抗菌刑和抗真菌刑 來防止微生物的作用，所述抗菌刑和抗真菌劑例如為對輕基苯甲酸酯、氟丁醇、 苯酚、山梨酸、硫柳汞等.在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖或氯化鈉. 在藥刑組合物中使用延遲吸收刑(例如硬脂酸鋁和明膠)，延長注射組合物的吸 收， 通過以下方法制備無菌注射溶液:將所需量的活性化合物混入的適當溶劑(按 需要含有以上列舉的各種其他成分)中，然后過濾滅菌.通常，通過在無菌賦形 刑中混入各種經(jīng)過滅菌的活性成分制備分散體，所迷無菌賦形劑中含有基礎(chǔ)分散 介質(zhì)和以上列舉的其他需要的成分，就用于制備無菌注射溶液的無菌粉末而言， 其制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，由預(yù)先經(jīng)過無菌過濾的溶液得到活性成 分加上任何附加的所需成分的粉末.
本文所用的"藥學(xué)上可接受的栽體"包括任意和所有的容劑、分散介質(zhì)、包 衣、抗菌刑和抗真菌刑、等滲刑和吸收延遲刑等.對藥物活性物質(zhì)使用此類介質(zhì) 和藥刑為本領(lǐng)域所熟知.除了與這些活性成分不相容的常規(guī)介質(zhì)或藥刑之外，預(yù) 期其在治療性組合物中的使用.補充活性成分也并入這些組合物.
在某些方面，對中性或鹽形式的本發(fā)明組合物進行配制.制藥學(xué)上可接受的 鹽包括酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成)以及與無機酸(例如鹽酸或鱗酸) 或有機酸(例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的鹽.與游離羧基形成的 鹽也可以來源于無機減(例如氨氣化鈉、氬氧化鐘、氬氣化銨、氳氧化鈣或氬氧 化鐵)以及有機械(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普香卡因等).
對于制刑，溶液將以與劑量制刑(dosage formulation )相容的方式，并以治 療有效的量施用.各種劑型(例如注射溶液、釋藥膠囊等)的制刑容易施用.例 如，對于腸胃外給藥的水溶液，需要時對該溶液進行適當緩沖，并且首先用足量 的生理鹽水或葡萄糖使液體稀釋刑保持等滲，這些特殊的水溶液特別適于靜脈內(nèi)、 肌肉內(nèi)、皮下和腹腔內(nèi)給藥.
"單位劑量"定義為散于適當栽體中的治療組合物的不連續(xù)量.在某些實施 方案中，治療性化合物的腸胃外給藥由推注開始，然后進行連續(xù)輸注，以維持藥 物產(chǎn)品的治療循環(huán)水平.本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)良好的醫(yī)療規(guī)范和病人的個體 情況將容易地優(yōu)化有效刑量和給藥方案.
給藥頻率將取決于藥劑的藥代動力學(xué)參數(shù)和給藥途徑.本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù) 給藥途徑和所需的劑量確定最佳的藥物制刑.此類制刑可能影響被施用藥物的物 理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率.根據(jù)給藥途徑，按體重、體表 面積或器官大小計算合適的刑量.動物模型的有效性對于確定給定治療劑的合適 治療刑量特別有用.本領(lǐng)域普通技術(shù)人員無需經(jīng)過過度試驗，可常規(guī)地對確定適 當治療劑量所必需的計算進行改進，特別是根據(jù)劑量信息和本文揭示的分析方法， 以及在動物或人體臨床試驗中觀察到的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)進行改進，
一般地，通過使用已經(jīng)建立的用于測定血藥濃度的分析方法結(jié)合相關(guān)的刑量 反應(yīng)數(shù)據(jù)來確定合適的劑量.最終的刑量方案由主治醫(yī)師考慮改變藥物作用的罔 素來確定，所述因素例如為藥物的比活度，損傷的嚴重程度以及病人的反應(yīng)性， 病人的年齡、身體狀況、體重、性別和飲食，任何感染的嚴重程度，給藥時間和 其他臨床因素.隨著研究的進行，將披露有關(guān)具體疾病和病癥的合適刑量水平和 療程的進一步信息.使用疾病模型(例如本文描述的那些嚙齒類動物模型)可以 容易地優(yōu)化任何這樣的刑量.
應(yīng)了解，本發(fā)明的藥物組合物和治療方法有用于人藥和善藥領(lǐng)域.因此，被 治療的受試者是哺乳動物，例如人或其他哺乳動物.就善醫(yī)學(xué)而言，受試者的例
子包括農(nóng)場動物，包括母牛、綿羊、豬、馬和山羊；伴侶動物，例如狗和貓；珍 奇動物和/或動物園動物；實驗室動物，包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠；以及 家禽，如雞、火雞、鴨子和鵝.
本發(fā)明還預(yù)期用于治療纖維化疾病的試刑盒.此類試劑盒包含至少一種笫一 組合物，其含有位于藥學(xué)上可接受的栽體中的上述基于抗CCL21和/或抗CCL19 的治療劑.另一種組分是用于治療該疾病的笫二治療刑連同適當?shù)娜萜饕约坝糜?施用所述治療組合物的工具(vehicle).這種試劑盒可另外包含影響第一組合物 和笫二組合物遞送的溶液或援沖劑.這種試刑盒可進一步包含導(dǎo)管、注射器或其 他遞藥裝置，用于遞送在本發(fā)明方法中使用的一種或多種組合物.這種試劑盒可 進一步包含治療方法的施用方案的說明書.
實施例
以下實施例對本發(fā)明的某些實施方案進行說明.本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在 實施例中揭示的技術(shù)遵循發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的代表技術(shù)，以在本發(fā)明實踐中發(fā)揮良好作 用，因此被認為構(gòu)成本發(fā)明實踐的某些方面，但是，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)城扭 術(shù)人員應(yīng)認識到，對所公開的具體實施方案可做# 多變化，并仍能獲得相似的結(jié) 果，而不脫離本發(fā)明的精神和范囤.
實施例1:用于顯示CCR7在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中的作用的方法和材料 病人為疑患IIP者，根據(jù)臨床、生理學(xué)、放射影像學(xué)和病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的匯編來 確定(Flaherty et al" Am, J, Med.， 110:278-282 (2001》Flaherty et al" Curr, Opir Pulm, Med.， 6:404-410 (2000》Kazerooni et al" AJR Am, J, Roentgenol.
169:977-983 (1997); American Thoracic Society, European Respiratory Society (ATS/ERS)， Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 165:277-304 (2002)).之前，招入本 研究的病人沒人經(jīng)歷過活檢手術(shù)或接受過IIP治療.2000年5月至2004年8月， 進行SLBs,作為密執(zhí)安大學(xué)?？蒲芯恐行?University of Michigan Specialized Center of Research )評價纖維化肺病病理生物學(xué)的一部分.從因肺癌而經(jīng)受過胸 切除術(shù)的病人的切除樣本遠端邊緣(distant margins)獲得組織學(xué)正常的肺活檢， 無疾病的病理學(xué)跡象.在層流通風(fēng)櫥中用無菌技術(shù)單獨處理各個SLB，進行分子、 蛋白質(zhì)和免疫組化分析(見下文).
由SLBs制備RNA和cDNA.將每份SLB中用于分子分析的部分速凍于液 氮中，并儲存于-280lC.對于RNA分離，將這些樣本在冰上解凍，在TRIzoIH 試刑(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA )中進行機械勻漿， 然后按生產(chǎn)商的說明制備總RNA.隨后使用BRL逆轉(zhuǎn)錄試刑盒和oligo (dT) 12-18 引物將得自SLBs的純化RNA逆轉(zhuǎn)錄至cDNA中.擴增緩沖液含有50mMKC,、 10 mM Tris/HCI (pH 8.3)和2.5 mM MgCI2,
基因陣列分析，如在先描述的，使用Super Array Inc (Bethesda， Maryland, USA)的Non-Rad GEArray基因陣列膜分析的人趨化罔子以及趁化罔子受體的 基因概況(profile)的變化(Choi et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med.， 170:508-515 (2004)).由于3-褲酸甘油搭脫氬酶(GAPDH)在本研究分析的所 有SuperArrays中一致表達，罔此將其用作內(nèi)部陽性對照.
實時TaqmanPCR分析，如在先描述的，通過實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合醉鏈反應(yīng) (PCR)程序，使用ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City，CaH化rnia，USA)分析人CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12基 因在HP及正常邊緣SLBs中的表達(J(akubzick et al.， Am. J. Pathol" 162:1475-1486 (2003)).對來源于上、下肺葉SLBs的cDNAs分析趨化因子受體、 趨化因子和GAPDH (內(nèi)部對照)的表達，所用的所有引物和探針均購自Applied Biosystems.在計算趨化罔子表達中的倍數(shù)變化之前，將趨化因子基因的表達歸 一化至GAPDH.通過將所有病人的基罔表達與正常邊緣腫瘤病人組的上肺葉或
下肺葉中所測定的基因表達進行比較，計算細胞罔子基因表達中的倍數(shù)增加.
ELISA分析.使用標準的夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA敗術(shù)(R&D Systems Minneapolis, Minnesota, USA )測定50 ml來自勻漿化IIP和正常邊緣SLBs的不
含細胞的上清液樣本中人CCL19、 CCL21和CXCL12的濃度.用重組人細胞因 子來繪制標準曲線，由此推知樣本中的存在濃度.CCL19的檢測限制，如在先描 述的，用免疫組織化學(xué)的常規(guī)免疫化學(xué)技術(shù)測定SLBs中CCR7、 CXCR4、 CD45、 CD34和aSMA ( Jakubzick et al" J. Clin. Pathol" 57:477-486 (2004)) 使用下列 目標抗體及其合適的同種型對照購自BD Biosciences PharMingen ( San Diego: California, USA )的小鼠抗人CCR7抗體和小鼠IgMk;購自R&D Systems的小 鼠抗人CXCR4和小鼠IgG2B;購自Abeam ( Cambridge, Massachusetts, USA) 的小鼠抗人CD45、 CD34和1型膠原抗體；購自R&D Systems的小鼠IgGl.使 用這些免疫組化技術(shù)對10名UIP病人、6名NSIP病人和5名RBILD病人的上 肺葉和下肺葉SLBs進行分析.對5名病人的切除胂病的正常邊緣進行分析.對 每份SLB的連續(xù)切片(5mm厚)進行分析，在緊鄰的連續(xù)切片上實施CCR7與 其他抗原的共定位.
實施例2:顯示CCR7在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎中的作用的結(jié)果 SuperArray分析在IIP和正常邊緣SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12轉(zhuǎn)錄物.用特異性SuperArray GEArray分析IIP和正常邊縴 SLBs中CCR7和CXCR4的存在，雖然這是一種定性而非定量技術(shù)，可將CCR7 (圖IA)和CXCR4 (困IB)的表達歸一化為GAPGH的表達，該兩種受體的數(shù) 值得到顯示.CCR7和CXCR4的最高相對表達見于來自UlP病人組(n-7)的上 肺葉和下肺葉活檢樣.對來自NSIP病人組(n=6) 、 RBILD病人組(n=6)和正 常邊緣(n=5)腫瘤病人組的下肺葉和上肺葉活檢樣進行了類似的分析.雖然沒 有檢測到顯著的差異，總體上，兩種趁化因子受體的相對表達遵循以下疾病嚴重 性模式(disease severity pattern ) : UIP、 NSIP、 RBILD、正常邊緣.至今確定 的兩種CCR7配體為CCL19 (Yoshida et a，., J. Biol. Chern" 272:13803-13209
(1997) )和CCL21 ( Campbell et al"丄Cell Bio," 141:1053-1059 (1998)) CCL19 (或ELC、 exodus-3和CKb-U34)組成型表達于傳入淋巴內(nèi)皮以及淋巴結(jié)的T
細胞區(qū)域，由此說明其在樹突狀細胞和T細胞向這些免疫位點的運動中起主要作 用(Sal，usto et al.， Eur. J. Immunol" 29:1617-1625 (1999)).同時進行的研究表 明，CCL21 (或SLC、 exodus-2、 TCA-4和CKb-99)具有類似的功能和類似的 表達模式，但是，已經(jīng)在肺(Gunn et al" Proc, Natl. Acad, Sci. USA， 95:258-263
(1998) )和腎臟(Banas et al" J. Immunol" 168:4301-4307 (2002))中檢測到該兩
種趨化因子，說明它們可能具有除免疫監(jiān)視之外的作用.CCL19的相對轉(zhuǎn)錄物表 達的分析揭示，這種CCR7配體在UIP上肺葉和下肺葉活檢樣中的量較高(困 2A).在NSIP和RBILD活檢樣中檢測到相似量的CCL19轉(zhuǎn)錄物，在正常邊緣 活檢樣中見到的量最低.但是，在IIP和正常邊緣活檢樣中沒有看到CCL21 (圖 2B)和CXCL12 (困2C)轉(zhuǎn)錄物表達的明確模式.
IIP和正常邊緣SLBs中的CCR7、 CXCR4、 CCX19、 CCL21和CXCL12轉(zhuǎn) 錄物表達的定量實時PCR分析，對四個病人組的上肺葉和下肺葉活檢樣的 Taqman實時PCR分析揭示，與正常邊緣肺瘤病人組(n-5 )的適當活檢樣相比， UlP病人組(n-18)上肺葉和下肺葉SLBs中CCR7的轉(zhuǎn)錄物表達均明顯增加(困 3A ).與正常邊緣病人組的適當肺葉相比，UIP上肺葉和下肺葉SLBs中平均CCR7 轉(zhuǎn)錄物值(transcript values)分別大約高146倍(SEM， 58)和675倍(SEM， 300).相比于UIP上肺葉活檢樣，UIP下肺葉活檢樣中檢測到的CCR7轉(zhuǎn)錄物 表達大約高5倍.與正常邊緣SLBs相比，NSIP上肺葉和下肺葉SLBs中平均CCR7 轉(zhuǎn)錄物值均增加4倍(SEM， 1).相對于正常邊緣SLBs，在RBILDSLBs中也 提高了平均CCR7轉(zhuǎn)錄物值上肺葉SLBs中增加36倍(SEM, 28)，下肺葉活 檢樣中增加4.4倍(SEM， 3.2). NSIP和RBILD的SLBs中CCR7轉(zhuǎn)錄物表達 相對于正常邊緣SLBs的增加不顯著.
這些發(fā)現(xiàn)是CCR7所特有的，罔為對CXCR4的Taqman PCR分析發(fā)現(xiàn)，IIP SLBs中的CXCR4轉(zhuǎn)錄物表達相對于正常邊緣SLBs沒有顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示). 最后，在所檢查的IIP和正常邊緣腫瘤病人組中間，CCL19(數(shù)據(jù)未顯示)、CCL21 (困3B)和CXCL12 (數(shù)據(jù)未顯示)轉(zhuǎn)錄物表達未表現(xiàn)出或被檢測到清楚的模式 或顯著的差異.但是發(fā)現(xiàn)，相對于正常邊緣腫瘤病人組，UIP病人組的上肺葉和 下肺葉活檢樣中CCL21轉(zhuǎn)錄物表達的増加最大(比正常邊緣SLB值高40倍以 上)，與NSIP的SLBs相比，RBILD上肺葉和下肺葉SLBs中的CCL21轉(zhuǎn)錄物 表達有較大增加.這些數(shù)據(jù)合起來表明CCR7轉(zhuǎn)錄物表達在DIP中大量增加， CCR7轉(zhuǎn)錄物表達的增加存在于稍輕度的HP.
IIP和正常邊緣SLBs中CCL19、 CCL21和CXCL12蛋白的ELISA分析， 圖4顯示了得自SLBs勻漿的不含細胞的上清液中CCL19 (圖4A ) 、 CCL21 (困 4B)和CXCL12 (困4C)蛋白的濃度，未發(fā)現(xiàn)CCL表達的明確棋式，所分析的 各組病人之間未檢測到顯著的差異，罔此，這些數(shù)據(jù)表明IIP的纖維化病變與肺中增加產(chǎn)生CCR7和CXCR4配體無關(guān).
IIP SLBs中的灶性間質(zhì)性的(focal interskial) CCR7蛋白表達，SuperArray 和實時PCR轉(zhuǎn)錄物分析顯示，CCR7在IIP SLBs中的表達比在正常邊緣SLBs 中的表達高得多，因此，對IIP和正常邊緣SLBs的全肺切片進行免疫組化分析 以證實這些觀測結(jié)果.如困5所示，在UIP、 NSIP和RBILD病人組的SLBs中 見到灶性間質(zhì)性的CCR7表達，雖然在RBILD病人的巨噬細胞中看見CCR7表 達(困5F)，灶性間質(zhì)性模式的CCR7表達并不唯一地與UIP (圖5B )和NSIP (困5D)活檢樣中的免疫細胞相關(guān).在UIP病人組(n-10)的所有上肺葉和下 肺葉SLBs的間質(zhì)區(qū)域中存在著多個CCR7蛋白灶性表達區(qū)域.注意到，CCR7 表達的細胞灶并不唯一地包含成纖維細胞，其它細胞(包括單核細胞和上皮細胞) 似乎也表達這種趨化因子受體.相比于更嚴重的亞型UIP， NSIP和RBILD亞 型表達的CCR7均更少.雖然這些活檢樣中的50。/o呈現(xiàn)CCR7染色，NSIP病人 組(n-6)上肺葉和下肺葉SLBs中所見到的表達CCR7的細胞灶區(qū)域要少得多. 在四分之三的RBILD (n=5) SLBs中，CCR7常常局限于血管和單核細胞，但是 在該IIP組的活檢樣的間質(zhì)區(qū)域中很少觀察到CCR7染色，與UIP SLBs中見到 的明顯染色相反，對正常邊緣病人組(n-5)的上肺葉和下肺葉SLBs進行的免疫 組化分析中，沒有發(fā)現(xiàn)CCR7表達(圖5H ).
用于CCR7測定的相同IIP和正常邊緣SLBs中，CXCR4染色看來局限于免 疫細胞，更為重要的是，這一趨化罔子受體的表達不是灶性的，在被試驗的4組 病人之間沒有差異.所測定的所有HP和正常邊緣活檢樣顯示與單核細胞相關(guān)的 CXCR4高度表達，這在閨6中體現(xiàn)，困6顯示了 UIP(困6B) 、 NSIP (困6D)、 RBILD (圖6F)和正常邊緣(圖5D) SLBs中的代表性CXCR4染色，因此，免 疫組化調(diào)查揭示了與CXCR4不同，CCR7主要在IIPSLBs中表達，但并不在正 常邊緣SLBs中表達，并且CCR7的表達似乎定位于IIP中的灶性間質(zhì)區(qū)。
為了闡述構(gòu)成IIP SLBs中CCR7陽性區(qū)域的細胞的身份，對連續(xù)切片進行針 對CD45和CCR7表達的另外染色試驗(圖7),在檢查UIP SLBs時，發(fā)現(xiàn)CCR7 的免疫組化表達(圖7B)與CD45(困7C)的部分重疊.同時表達CCR7和CD45 的細胞看起來是單核細胞，相反，雖然CCR7在NSIP活檢樣中高度表達(困7E )， 這種趨化因子受體的免疫定位與CD45不一致.對RBILD SLBs的類似免疫組化 研究揭示同樣缺乏CCR7與CD45的共定位(未顯示).因此，單核細胞上的CD45與CCR7的雙重表達存在于UIP中，但并不存在于非其他形式的IIP.如上所述， CD34是造血干細胞抗原，其已經(jīng)在外周血纖維細胞上得到鑒定(Abe et al.， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).發(fā)明者接下來檢查了能否在IIP和正常邊緣活 檢樣的組織學(xué)切片中鑒定這種標記物(困8).令人感興趣的是，在UIP活檢樣 (困8B)中CD34表達很少，并且當該抗原被檢測到時，其主要定位于活檢樣的 間質(zhì)區(qū)域.發(fā)現(xiàn)CD34在NSIP活檢樣中表達最高，其中這種標記物在間質(zhì)區(qū)域 中的單核細胞上高度表達(困8D).在RBILD (固8F)和正常邊緣(困8H) SLBs的間質(zhì)區(qū)域中也檢測到強的CD34表達.對CD34和CCR7共定位的進一步 檢查沒有揭示在HP或正常邊緣SLBs中顯示這些蛋白質(zhì)的雙重表達(未顯示) 的區(qū)域.因此，CD34突出表達于較不嚴重的IIP形式以及正常邊緣的SLBs中.
1型膠原主要由纖維細胞表達，這些細胞在組織損傷位點聚集并產(chǎn)生膠原 (Abe etal" J. Immunol., 166:7556-7562 (2001)).困9總結(jié)了 l型膠原蛋白在IIP 和正常邊緣SLBs中表達的免疫組化分析.在UIP (困9B) 、 NSIP (困9D)、 RBILD (圖9F)和正常邊緣(圖9H)腫瘤病人活檢樣中，1型膠原免疫定位于 的間質(zhì)區(qū)域.l型膠原的最高表達見于UIP SLBs,但是在正常邊緣SLBs中也可 發(fā)現(xiàn)1型膠原蛋白的高度表達.為了確定1型膠原和CCR7是否在IIP活檢樣中 共定位，還對連續(xù)切片進行染色，以測定這兩種蛋白質(zhì)的表達(困10).雖然l 型膠原在所有UIP SLBs (困10B )中高度表達，但是CCR7在1型膠原高度表達 的區(qū)域(圖IOC)沒有表達.類似的情況見于NSIP (未顯示)和RBILD (困IOE， F) SLBs,其中1型膠原(圖10E)與CCR7表達(圖10F)看來并未呈現(xiàn)共定 位.罔此，IIP SLBs中的CCR7陽性區(qū)域并不也是1型膠原的陽性區(qū)域.
IIP SLBs中的CCR7陽性區(qū)域沒有aSMA表達，困ll顯示了肺組織切片中 CCR7和aSMA的代表性免疫組化染色，所迷切片得自診斷患有UIP(困IIA-C)、 NSIP (困11D-F)和RBILD (困11G-I)的病人.如上所述，全部三組病人中， 在肺間質(zhì)區(qū)發(fā)現(xiàn)表達CCR7(困IIB,E，H)的細胞灶.但是，在連續(xù)切片中CCR7 陽性區(qū)與aSMA陽性區(qū)沒有重疊(困IIC，F(xiàn)，I).
本研究的總體目的是調(diào)查CCR7、 CXCR4、 CCL19、 CCL21和CXCL12在 IIP和正常邊緣腫瘤病人組的肺活檢樣本中的表達模式，定量轉(zhuǎn)錄物分析和定性 蛋白質(zhì)分析表明，相對于正常邊緣SLBs, CCR7 (但非CXCR4)在UIP中的表 達顯著增加，UIP SLBs以及NSIP SLBs (程度較小)顯示強表達CCR7蛋白的
灶性間質(zhì)區(qū)域(focal interstitial aeras)，但其不同時對CD34、 1型膠原或aSMA 呈陽性，在所有UIP SLBs以及較少部分的NSIP和RBILD活檢樣中見到CCR7 蛋白的灶性表達(focal expressio) 在UIP SLBs中，CCR7蛋白在間質(zhì)中的灶 性表達看來包括一些CD45陽性細胞(Salhisto et al.， Eur. J. Immunol" 28:2760-2769 (1998)),但是在NSIP和RBILD病人的活檢樣中，絕大部分CCR7 陽性細胞不表達CD45，并且CCR7與CD45的表達不重疊.雖然CCR7在UIP
al.， Mol. Med.， 1:71-81 (1994))，但是沒有證據(jù)表明這些活檢樣中的CCR7活性 區(qū)域也對纖維細胞標記物(如CD34和1型膠原)呈現(xiàn)陽性.另外，這些CCR7 陽性細胞缺乏成肌纖維細胞標記物aSMA.這些數(shù)據(jù)引發(fā)一種思考，即CCR7蛋 白的灶性表達可指示特發(fā)性損傷的位點，以及固有成纖維細胞的不當活化，而不 表示表達CCR7的纖維細胞的補充.雖然它們在人類疾病中的作用尚待確定，也 沒有鑒定出纖維細胞的特異性細胞表面標記物，但是幾種實驗性纖維化模型指出 了來源于骨號的循環(huán)細胞在皮膚(Fathke et al.， Stem CeHs, 22:812-822 (2004))及 肺(Hashimoto et al.， J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al.， J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Epper，y et al" Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 29:213-224 (2003); Schmidt et a，.， J. Immunol" 171:380-389 (2003))纖維化病變中 的作用.這些實驗性研究中大部分使用骨號嵌合體模型，其通過將轉(zhuǎn)基罔表達嵌 合綠色熒光蛋白的鼠骨髄過繼轉(zhuǎn)移入受放射的小鼠而建立.來源于綠色熒光蛋白 陽性骨鍵的細胞在形態(tài)上表現(xiàn)為巨噬細胞狀(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol" Biol" 29:213-224 (2003))和/或成纖維細胞狀(Hashimoto et al.， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et al., J, Clin. Invest" 114:438-446 (2004)), 其被顯示為組織纖維化的主要貢獻罔素.另外，這些來源于骨拔的細胞對錳超氣 化物歧化醉敏感(Epperly et al.， Am. J. Respir. Cell Mol. Bio，., 29:213-224(2003)),表達1型膠原(Hashimoto et ah, J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004); Phillips et a，" J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004); Schmidt et al.， J. Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD34 ( Schmidt et al" J, Immunol" 171:380-389 (2003)) 、 CD45 ( Phillips et al. J, Clin. Invest" 144:438-446 (2004))、端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄醉(Hashimoto et a，" J. C，in, Invest" 113:243- 252 (2004) )、CCR7( Hashimoto et al" J. Clin. Invest" 113:243-252 (2004))和CXCR4 ( Hashimoio et al" J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); PhH,ips et al" J. Clin. Invest" 144:438-446 (2004)) 然而，關(guān)于纖維細胞一旦定位于肺中，它們最終是否分化為成肌纖維細胞仍 有爭議.目前的假設(shè)是，在啄露于過敏源后補充進入支氣管組織(Schmidt etal., J. Immunol" 171:380-389 (2003))或皮膚受損部位(Abe et al" J. Immunol" 166:7556-7562 (2001))的纖維細胞分化為成肌纖維細胞，但是在博來霉素引起的 特發(fā)性纖維化期間移向肺的纖維細胞不表達aSMA,且不會被誘導(dǎo)表達這種成肌 纖維細胞標記物(Hashimoto et al， J. CHn. Invest" 113:243-252 (2004)),關(guān)于這 些細胞的另外爭論是這樣一個觀察結(jié)果，即在組織修復(fù)過程中并非所有來源于骨 鍵的細胞都有害.罔此，Ortiz和他的同亊們(Ortiz et al.， Proc. Na", Acad. Sci. USA, 100:8407-8411 (2003))展示了鼠間質(zhì)干細胞向受損的肺遷移，呈現(xiàn)上皮樣 表型，減少受博來審素攻擊的小鼠體內(nèi)的炎癥和膠原沉積.很明顯，需要進行進 一步研究來闡明來源于骨拔的細胞在臨床纖維化反應(yīng)中的作用，
HP病人的SLBs中CCR7和CXCR4進行檢測的動力來自這樣的在先研究， 其表明COL21 (CCR7趨化因子受體的配體)在體外和體內(nèi)是纖維細胞趨化性的 有效剌激物(Abe et al.， J. Immunol" 166:7556-7562 (2001));來源于CXCR4陽 性骨號的細胞有助于實驗性誘發(fā)纖維化(Hashimoto et al., J. Clin. Invest., 113:243-252 (2004); Phillips et a " J. Clin. Invest" 114:438-446 (2004)) 假定纖 維細胞能夠通過依賴于CCR7、CXCR4或者可能其它的趨化罔子受體的趨化活動 迅速進入組織損傷位點，并在肺纖維化的發(fā)病機理中發(fā)揮作用(Phillips et al.， J. Clin. Invest., 114:438-446 (2004)).在本研究中，檢查表達CCR7的病灶區(qū)是否 存在假定的纖維細胞標記物，包括CD45、CD34和1型膠原(Abe et a，， J. Immunol., 166:7556-7562 (2001); Hartlapp et al.， FASEB J.， 15:2215-2224 (2001)) . CD45 是存在于表達CCR7的病灶區(qū)的唯一標記物，CD45和CCR7的共定位僅見于UIP 內(nèi)存在的單核細胞中，在其它IIP活檢樣中沒有看到，另外，所有這些標記物均 在正常邊緣SLBs中檢測到，但是免疫組化技術(shù)在這些活檢樣中沒有檢測到 CCR7,雖然這些發(fā)現(xiàn)沒有排除在病人活檢樣中看到的CCR陽性細胞為纖維細胞 的可能性，但是有可能當纖維細胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移入肺時，這些標記物的表達被 快速降調(diào)節(jié).
CXCR4不存在于IIP SLBs的病灶區(qū)的觀察也不排除這種趨化罔子受體對于 向肺補充纖維細胞和/或制備骨拔來源細胞的膠原的重要性.在所有分析的SLBs
中看到了彌散模式(difuse pattern)的CXCR4表達，表達這種趨化因子受體的
鑒于UIP成纖維細胞的異常合成和增殖特性(組織學(xué)上突出表現(xiàn)為明顯的成 纖維細胞灶)(King et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 164:1025-1032 (2001))， 發(fā)明者假設(shè)這些細胞還可以對通常調(diào)控免疫細胞功能的趨化因子配體產(chǎn)生不當反 應(yīng).組織固有的成纖維細胞包含肺結(jié)構(gòu)的主要成分，許多研究者提出這些細胞的 不當活化是UIP (可能還有其它類型的IIP)中見到的病理性纖維化反應(yīng)的基礎(chǔ) (Suganuma et al" Thorax, 50:984-989 (1995》Hogaboarn et al" Proc. Assoc, Am. Physicians, 110:313-320 (1998); Ramos et al" Am. J. Respir. Cell Mol. BioL， 24:591-598 (2001); Selman et al" Respir. Res.， 3:3 (2002)),引起這種不當活化的 因素還有待闡明，但是幾家實驗室的數(shù)據(jù)表明趨化因子可能在這一過程中發(fā)揮作 用(van den Blink et al" Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz)， 48:539-545 (2000); Selman， Am. J. Respir. CHt. Care Med" 168:730-731 (2003)),例如，現(xiàn)在普遍 認為來自纖維化肺的UIP成纖維細胞的遷移快于來自對照肺的那些細胞 (Suganuma et al.， Thorax, 50:984-989 (1995))，小鼠試驗存在一些有關(guān)趨化因 子在這方面起主要作用的提示(Moore et aL， J. Immunol., 167:4368-4377 (2001)).
對CCR7和CXCR4在IIP中的細胞異常遷移活動中起作用的可能性進行檢 驗的另 一個動力來自腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，已文獻記栽了乳腺癌細胞上獨 特的一套趨化罔子受體的表達，這部分解釋了乳腺癌的轉(zhuǎn)移特性(Muller et al.， Nature, 410:50-56 (2001)).
因此，本研究說明了 CCR7在IIP中的灶性間質(zhì)性表達.表達這種受體的細 胞的身份有待進行全面闡明，但是含有CCR7灶性表達的區(qū)域?qū)D34和1型膠 原不呈陽性，IIP活檢樣的間質(zhì)區(qū)域中表達CCR7的細胞不表達aSMA，因此排 除了這些細胞是成肌纖維細胞的可能性.
在以下實施例3中，提供了數(shù)據(jù)以顯示IIP成纖維細胞(但不是正常邊緣成 纖維細胞)的合成和增殖特征受外源性CCL19和CCL21的不同影響.這些研究 具有潛在的治療價值，如果有可能抑制纖維細胞的遷移和/或固有肺成纖維細胞響 應(yīng)CCR7特異性趨化罔子的活化，則可防止細胞外基質(zhì)的過度生成，以利于適當 的肺修復(fù).
實施例3:靶向(targeting) CCL19或CCL21用于治療慢性纖維化疾病本實施例具體說明了在肺的慢性纖維化過程中靶向CCL19和/或CCLM的新 穎潛在方法，已知的特發(fā)性慢性肺纖維化具有非常大的臨床挑戰(zhàn)性，各種治療選 擇顯示出效力有限或有毒性(Flaherty et al" Am. J. Med" 110:278-282 (2001); (Hampton et al.， Am. J. Respir. Crit. Care Med" 149:A878 (1994)),診斷后的中 位存活率幾乎沒有變化(Ryu et al" Mayo Clin. Proc.， 73:1085-1101 (1998); Lasky et al" Environ. Health Perspect" 108 Suppl 4:751-762 (2000)) 已知的促纖維化 刺激罔素包括放射、吸入的礦物質(zhì)及有機粒子、氣態(tài)氣化刑、藥物和感染性微生 物，然而對于引發(fā)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎(IIP)的臨床病理實體的致病因素的確認一 直存在著爭議.HP是一組多種形式的疾病，與遠端肺實質(zhì)有關(guān)，其有許多共同 的特征，但是很難為命名為單獨的疾病(Travis et al.， Am. J. Surg. Path., 24:19-33 (2000)).它們的發(fā)病機理仍不清楚，但集中認為是與肺部受到創(chuàng)傷(或多重損 傷)后試困治愈該創(chuàng)傷有關(guān).成纖維細胞灶是活躍增殖的成纖維細胞的小聚集體， 被認為是創(chuàng)傷的優(yōu)先細胞灶(prior foci)的組織化，顯示纖維化處于活動和進行 狀態(tài).現(xiàn)在的假設(shè)是，人成纖維細胞對CCL19和CCL21的響應(yīng)(由于它們對 CCR7的升調(diào)節(jié))引起這些細胞的不當活化，從而導(dǎo)致IIP中所見的極度纖維化 反應(yīng)，
令人感興趣的是，纖維化病人肺中的細胞罔子環(huán)境可能有利于CCL19和 CCL21的異常反應(yīng)，罔為已經(jīng)有其他研究者文獻記栽了 TNF-a蛋白水平的升高 (Ziegenhagen et al" J, Investig, Med.， 46:223-231 (1998》Kapanci et al" Am, J. Respir. Crit. Care Med" 152:2163-2169 (1995))和IL-10的降低(Martinez et al.， Am. J. Physiol., 273:L676-683 (1997)),這兩種細胞因子均調(diào)控與這些配體結(jié)合 的受體.來自嚴重肺纖維化病人的成纖維細胞明顯對CCL19和CCL21有反應(yīng)，
發(fā)明者已致力于研究在將人成纖維細胞系經(jīng)靜脈引入免疫缺陷小鼠后是否有 可能引起肺纖維化.利用這一模型，發(fā)明者檢驗了靜脈內(nèi)注射的人成纖維細胞能 否在無炎癥反應(yīng)能力的體內(nèi)系統(tǒng)中引發(fā)纖維化反應(yīng)，
數(shù)據(jù)還顯示，在肺纖維化起始時期或其發(fā)展之后可對該模型實施靶向CCR7 或其配體的效力試驗.看起來C.B-17-bg SCID小鼠對于人成纖維細胞的過繼轉(zhuǎn)移 研究是理想的，罔為C.B-17-bg小鼠缺乏T細胞和B細胞(與C.B-17和ICR SCIDs 相似)并且?guī)в忻咨?beige)突變，這種突變可引起細胞毒性T細胞、巨噬細胞
和NK細胞功能的損傷.
將生長自人纖維化活檢樣的成纖維細胞經(jīng)靜脈引入C.B-17-bg，基于Masson 三色染色，看到組織學(xué)表現(xiàn)和明顯的肺纖維化.
在其他研究中，在注射成纖維細胞后第35天，使用羥脯氨酸測定法對SCID 小鼠的肺組織進行檢驗，發(fā)現(xiàn)與接受正常的人成纖維細胞的小鼠相比，接受生長 自人纖維化活檢樣的成纖維細胞的小鼠的肺部樣本中羥脯氛酸的水平顯著升高. 因此，來自人源化SCID模型的數(shù)據(jù)表明，通過人IIP成纖維細胞有可能"轉(zhuǎn)移" 纖維化疾病，這種人源化SCID模型應(yīng)允許對在維持肺纖維化中起作用的閎素進 行檢查，
人體研究顯示，與患有其他類型的非纖維化疾病的那些人相比，患有各種慢 性肺纖維化的病人的外科肺活檢樣中CCL21轉(zhuǎn)錄物(圖12)和蛋白質(zhì)(圖13) 表達顯著增加.數(shù)據(jù)表明，得自具有肺纖維化跡象的病人(但非得自無異常纖維 化跡象的病人)的肺成纖維細胞對外源性CCL19或CCL21表現(xiàn)遷移反應(yīng)(困14) 和增殖(困15)反應(yīng).CCL19和CCL21引起肺成纖維細胞遷移(困14)的發(fā)現(xiàn) 令人興奮，因為這一反應(yīng)在增殖性成纖維細胞灶(UIP的主要組織病理學(xué)特征之 一)的發(fā)展中起作用.
最后，使用以間質(zhì)性纖維化和成纖維細胞灶為特征的纖維化鼠SCID模型證 實了把向CCL21在肺纖維化的起始中的作用已經(jīng)通過加以
實施例4:靶向CCL21或CCR7有效消除通過在免疫缺陷小鼠中過繼轉(zhuǎn)移人 肺成纖維細胞而引起的肺纖維化
如上所討論的，CC趨化因子受體7 (CCR7)在HP活檢樣本和原代成纖維 細胞系中表達。在本實施例中提供了用肺纖維化模型研究CCR7的體內(nèi)作用的細 節(jié).簡而言之，將1.0 x 106個生長自特發(fā)性肺纖維化/普通型間質(zhì)性肺炎(IPF/UIP) 活檢樣、非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP)活檢樣或組織學(xué)上正常的活檢樣的原代成 纖維細胞靜脈注射入C.B.-17 SCID/米色(bg)小鼠.在注射IPF/UIP成纖維細胞后 第35天和第63天，免疫缺陷小鼠的肺中出現(xiàn)補丁型間質(zhì)性纖維化(patchy interstitial fibrosis)和羥脯氨酸含量升高.在所述兩時間處，過繼轉(zhuǎn)移的NSIP 成纖維細胞均引起更彌散的間質(zhì)性纖維化并提高羥脯氨酸水平，但是注入的正常 人的成纖維細胞不在C.B.-17 SCID/bg小鼠中引起問質(zhì)重塑變化，人CCR7或 CCL21及其配體的全身治療性免疫中和可顯著緩解接受任一種IIP成纖維細胞的C.B.-17SCID/bg小鼠的肺纖維化.因此，本研究表明，經(jīng)靜脈向免疫缺陷小鼠注 入原代人成纖維細胞系引發(fā)肺纖維化，且這種纖維化反應(yīng)取決于CCL21和CCR7 之間的相互作用.
肺纖維化小鼠模型已經(jīng)提供了的實驗性范例，用于研究呼吸系統(tǒng)中異常組織 的重塑和結(jié)疤(Gharee-Kermani et al" Meths. Mol. Med" 2005， 117:251-259) 已采用許多途徑來誘發(fā)肺纖維化，其包括轉(zhuǎn)基因和基閎轉(zhuǎn)移、放射、無機剌激物 (例如二氧化硅)以及促進氣化刑引起的炎性損傷的藥物(例如博來審素)(Chua et al.， Am. J. Resp. Cell Mol. Bio，.， 2005， 33:9-13 ).在這些模型中，博來審素模 型的應(yīng)用最為廣泛，因為其具良好的再現(xiàn)性以及與人肺纖維化的病理學(xué)相似性 (Chua et al" Am. J. Resp. Cell Mol. Biol" 2005， 33:9-13 ),因此，博來審素模型 已被用于評價許多在IPF/UIP中感興趣的靶標(Kaminski et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 200, 97:1778-1783; Pardo et al.， PLoS Med 2005， 2e251 ).
不幸的是，尚不存在完全重現(xiàn)IPF/IJIP的臨床病理學(xué)特征的動物模型，關(guān)于 正在進行中的炎性損傷(用于誘導(dǎo)實驗性纖維化的主要模式)對于末期UIP的相 對重要性仍然存在爭議(Gauldie， Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1205-1206; Sorter Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2002， 165:1207-1208 ),
本實驗通過使用另一種誘導(dǎo)實驗性肺纖維化的策略來解決這個領(lǐng)域內(nèi)問趙. 由于重度聯(lián)合免疫缺損基因突變(scid)或重組嗥激活基因1 (rag-1)敲除，基 因免疫缺陷小鼠已經(jīng)被廣泛用作過繼轉(zhuǎn)移正?；蚧疾〉娜思毎乃拗?本實施例 中顯示，經(jīng)靜脈(i.v.)將IPF/UIP或非特異性間質(zhì)性肺炎(NSIP;另一種較不 嚴重的HP)而非正常的成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移入具有scid-米色(C.B-17SCID/bg) 突變的C.B-17小鼠，引發(fā)并維持肺纖維化.在注入成纖維細胞后笫35天，兩個 IIP成纖維細胞組的C.B-17SClD/bg小鼠均首次表現(xiàn)出纖維化的組織學(xué)和生物化 學(xué)跡象，在第63天達到顯著.看起來細胞因子和趨化因子在IIP的發(fā)病機理中都 發(fā)揮主要作用，對接受IPF/UIP或NSIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠全肺 樣本的ELISA分析表明，與較早時間點所測定的全肺水平或未接受成纖維細胞的 小鼠肺組織中測定的全肺水平相比，鼠的IL-13、 CCL6和CCL21水平在第63 天顯著升高.
IL-13和CCL6是肺纖維化的介質(zhì)，但是CCL21在肺重塑亊件(events)中 的作用尚不知曉.對CCL21和CCR7在由人IIP成纖維細胞引起(precipitated) 的肺重塑事件中的作用進行檢驗的動力來自以上報道的發(fā)現(xiàn)，即在IIP活檢樣中
提高了 CCR7表達，以及CCL21顯著增強HP成纖維細胞的遷移、合成及增殖 性質(zhì)(EMP和CMH，未發(fā)表的發(fā)現(xiàn)).在單獨的免疫中和研究中，在將IIP成 纖維細胞注射入C.B-17SClD/bg小鼠后笫35天至63天，對人CCL21或CCR7
(CCL21的受體)進行靶向，相比于接受IIP成纖維細胞和IgG的C.B^17SCID/bg 小鼠組，顯著降低了肺纖維化的所有參數(shù).這些數(shù)據(jù)合起來強調(diào)了通過對 C.B-17SCID/bg小鼠靜脈注入IIP成纖維細胞引發(fā)并維持肺纖維化的新的鼠棋型 的創(chuàng)造性，并證明了在此模型中，CCL21和CCR7在維持纖維化中的新穎作用.
小鼠雌性，lCR-scid( ICRSCID)、 C.B-17-scid( C.B-17SCID )和C.B-17-scid-米色(C.B-17SCID/bg )小鼠(6-8周齡)，購自Taconic Farms( Germantown， NY), 所有SCID小鼠被安置在密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(University of Michigan Medial School)的悉生屏陣(gnotobiotic barrier facility )設(shè)施內(nèi).開始兩組小鼠有重度 聯(lián)合免疫缺損(scid)突變，由于V(D)J重組缺陷導(dǎo)致同時缺乏T淋巴細胞和B 淋巴細胞，而C.B-17SCID/bg小鼠有兩種突變第一種是scid突變，第二種是米 色突變，主要引起細胞毒性T細胞和巨噬細胞功能的缺陷以及NK細胞功能的選 擇性損傷.所有小鼠隨意采食高壓滅菌水和小鼠顆粒鉤料.下面所迷的所有步錄 均在無菌的層流環(huán)境中進行，并得到密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院的動物護理與使用委員會
(animal care and use committee)批準，
人成纖維細胞培養(yǎng)從機械解離的IPF/UIP和NSIP外科肺活檢樣獲得混合 的細胞群，按先前在其它文獻(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol., 2004 164:1989-2001)所述的詳細方法得到純凈的人成纖維細胞培養(yǎng)物，用同樣的方法
究中，在本文所描述的起始、模型表征以及治療發(fā)明研究的第四傳代(passage) 之后，總共使用10個IPF/UIP成纖維細胞系，6個NS1P成纖維細胞系和4個正 常的成纖維細胞系.
將人肺成纖維細胞靜脈引入SCID小鼠對150 cn^燒瓶中的組織培養(yǎng)物進 行胰酶消化，得到IPF/UIP、 NSIP和正常成纖維細胞的單細胞制刑，按生產(chǎn)商 (Sigma Co.， St. Louis, MO)的說明用PKH26染料標記.將每種標記的成纖維細 胞系稀釋至1 x 1os細胞/m，PBS，取lml這種懸浮液，經(jīng)尾靜脈注射入每組5只 的SCID小鼠.其它每組5只SCID小鼠只靜脈注射PKH26和PBS標記溶液(即
為對照組).靜脈注射人肺成纖維細胞后第7天、21天、35天、49天和63天用 過量麻醉劑對小鼠施行安樂死，并在這些時間切除全肺組織，用于分子分析、組 織學(xué)分析、生物化學(xué)分析和/或蛋白質(zhì)組學(xué)分析(見下文).
人肺成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移后，評價C.B-17SCID/bg小鼠中CCL21和CCR7 的作用為了說明靜脈過繼轉(zhuǎn)移人成纖維細胞后，CCL21及其受體CCR7在肺重 塑反應(yīng)中的作用，各C.B-17SCID/bg小鼠組接受IPF/UIP ( n-35只小鼠)、NSIP (n-20只小鼠)、正常成纖維細胞(n=15只小鼠)或單獨的栽體(即PBS) ( n=15 只小鼠).35天后，所有C.B-17SCID/bg小鼠組(5只/組)從笫35天至笫63 天每隔一天接受鼠IgG或鼠抗人CCL21單克隆抗體或鼠抗人CCR7單克隆抗體 (全部為10pg/ml， R&D Systems, Minneapolis, MN)，在笫63天，所有動物 用過量麻醉劑施行安樂死，并切除全肺組織，用于分子分析、組織學(xué)分析、生物 化學(xué)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)分析(見下文)
分子分析如先前(Jak由ick et al" J. Immunol. 2003， 171:2684- 2693)所 詳細描述的，從全肺樣品中分離總RNA,并生成cDNA.根據(jù)生產(chǎn)商(SuperArray， Inc.， Bethesda， MD )的說明書，用非放射性GEArray基因分析膜分析合并樣 (n-5)中人及鼠趨化因子和趨化因子受體的基因概況變化，并如先前(Jakubzick etal.， Am. J. Pathol.， 162:1475-1486(2003))詳細描述的，測定信號強度.如先前 所述(Jakubzick et al.， J. Immunol. 2003, 171:2684-2693 )，通過實時定量RT-PCR 程序，使用7500實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City, CA )對各個 全肺cDNA樣品(n>5)分析人CCR7、 1型膠原、組織蛋白酶E、基質(zhì)金屬蛋 白酶(MMP)-2、 MMP-9、 MMP-19、纖維粘連蛋白、金屬蛋白酶的組織抑制刑 (TIMP) -1和GAPDH的表達.
組織學(xué)分析用麻醉劑施行安樂死之后，切取每只小鼠的右肺葉，用10%福 爾馬林溶液完全充脹，在新鮮福爾馬林中放置24小時，利用標準的組織學(xué)技術(shù)， 用石蠟包埋每個肺葉，制作5nm切片，用H&E和Mason三色染色，進行組織 學(xué)分析.借助熒光顯微鏡對其它的未染色的全肺組織切片進行分析，
生化分析使整個左肺樣品在lxPBS中勻漿，并離心沉淀，取不含細胞的 上清液進行ELISA分析，真空干燥沉淀，并重懸浮于0.5M冰醋酸中.然后按先 前所述的方法(Zhang et al.， J. Immunol. 1994， 153:4733-4741 )對組織進行羥脯 氨酸濃度測定.
蛋白質(zhì)組學(xué)分析從全肺樣品勻漿中取50 pl不含細胞的上清液，用標準的 夾心酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)技術(shù)(R&D Systems, Miimeapolis， MN)分析 鼠IL-13、 CCL6、 CCL21、 IFN個IL>12、 IL-4、 CCL2、 CCL7、 CCL17、 CCL3、 CXCL13、 TNF-a、 CXCLIO、 CXCL9和CXCL2蛋白，所述分析方法如先前所 詳述的(JakubzicketaL， 3. Immunol. 2003， 171:2684-2693),
統(tǒng)計學(xué)分析所有結(jié)果用平均值土SEM表示.用單因素方差(one-way ANOVA )分析和Tukey-Kramer或Dunnett，s多重比較試驗來確定UIP、 NSIP、 正常和對照組SC1D小鼠之間的統(tǒng)計學(xué)差異.顯著性設(shè)定為p<0.05.
靜脈過繼轉(zhuǎn)移IPF/UIP或NSIP(但非正常)肺成纖維細胞引起C.B-17SCID/bg 小鼠的肺組織病理學(xué)和重塑.起初進行研究，以評價過繼轉(zhuǎn)移的正常成纖維細胞 和IIP成纖維細胞對各種品系的SCID小鼠肺部結(jié)構(gòu)的影響，包括ICRSCID、 C.B-17SCID和C.B-17SCID/bg (每個時間點n=5).使用3個IPF/UIP成纖維細 胞系和2個正常人成纖維細胞系開展這些最初的研究.用PKH2G標記所有的人 成纖維細胞系，然后注射入各SCID小鼠組，這樣可以在組織切片中檢測標記的 細胞.注射后笫7天和21天，對每個SCID組肺血管中的人成纖維細胞進行檢測. 但是，21天后這一標記物的強度減弱(來源于Sigma提供的信息表)，因此，在 注射成纖維細胞后第35天我們未能在各組織切片中檢測到PKH16熒光(未顯 示).其它器官(即肝臟、脾臟和腎臟)可能含有人肺成纖維細胞，但是我們在 這些器官中未觀察到肉眼可見的變化.由于IIP是一種肺特異性疾病，不在任何 其它器官中表現(xiàn)纖維化，在本研究中未對其它器官進行詳細的組織學(xué)分析，
在后面的時間點對各組SCID小鼠的全肺切片進行檢測，結(jié)果表明標記的肺 重塑只存在于C.B-17SClD/bg小鼠中.特別是，在將IPF/UIP成纖維細胞注入 ICRSCID小鼠(n-5只小鼠，未顯示)后笫49天未見纖維增生.同樣地，將IPF/UIP
細胞后第7天(n-5只小鼠)、21天(n-10只小鼠)、35天(n-5只小鼠)或
假設(shè)C，B-17SCID/bg組中存在標記的肺組織病理跡象，下面所述的后續(xù)研究 涉及正常成纖維細胞和HP成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移入C.B-17SCID/bg小鼠.在模型 表征研究中，將4個1PF/U1P成纖維細胞系、4個NSIP成纖維細胞系和1個正 常成纖維細胞系過繼轉(zhuǎn)移入各別的C.B-17SCID/bg小鼠組，在轉(zhuǎn)移成纖維細胞后
C.B-17SCID小鼠，未能在靜脈注射IPF/UIP成纖維第35天和63天進行肺組織病理學(xué)、基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)變化分析.
接受正常肺成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠中少見或未見肺組織病理學(xué). 但是，靜脈注射NSIP或IPF/UIP成纖維細胞系的C.B-17SCID/bg小鼠在其后笫 35天表現(xiàn)明顯的肺組織病理學(xué)跡象.注入NSIP或IPF/UIP肺成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺組織病理學(xué)表征為肺泡腔破裂、纖維增生明顯和存在嗜 酸性粒細胞.
過繼轉(zhuǎn)移正常的、NS1P或IPF/UIP人肺成纖維細胞后第35天， C.B-17SCID/bg小鼠的肺組織切片的Mason三色染色顯示，接受IIP (但非正常 的)成纖維細胞的C.B-17SCID/bg組的重塑區(qū)域內(nèi)存在細胞外基質(zhì)(淡藍色染色).
后來對各C.B-17SCID/bg組的組織切片的分析揭示了通過引入IPF/UIP或 NSIP成纖維細胞而引起的肺部重塑的程度和外觀的主要差異.63天前接受 IPF/UIP成纖維細胞的CB-17SCID/bg小鼠肺部呈現(xiàn)異質(zhì)外觀，外觀相對正常的 肺組織區(qū)域與發(fā)生嚴重的間質(zhì)破裂與重塑的區(qū)域相鄰.另外，接受IPF/UIP成纖 維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠有明顯的人成纖維細胞病灶，但是這些病灶是在血 管中檢測到的，而不像臨床UIP那樣在間質(zhì)區(qū)域(Am. J. Resp. Crit. Care Med 2002， 165:277-304) , 63天前接受NSIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全 肺組織切片的組織學(xué)格局表征為間質(zhì)增厚和明顯的病灶區(qū)，這些小鼠中的重塑看 來涉及大部分肺.這些數(shù)據(jù)合起來表明將人IIP成纖維細胞引入C.B-17SCID/bg 小鼠可導(dǎo)致這些小鼠中的纖維化損害.
將IIP成纖維細胞引入C.B-17SCID/bg小鼠后，雍脯氨酸水平以時間依賴方 式發(fā)生顯著變化在涉及肺重塑的實驗?zāi)Ｐ椭?，羥脯氨酸是膠原從頭合成的常用 標記物(Jakubzick et al.， Am. J. Pathol" 2004， 165:1222-1221 ) 在本研究中， 在之后笫35天或63天，對沒有接受人肺成纖維細胞、或者接受正常的人肺成纖 維細胞、NSIP或IPF/UIP人肺成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠的全肺樣品中 的祭脯氨酸水平進行測定.引入正常成纖維細胞后，在這些時間點的羥脯氨酸水 平?jīng)]有變化.這些C.B-17SCID/bg組的幾脯氨酸水平在第35天和第63天分別為 4.7 ± 0.3 ng/mg蛋白質(zhì)和5.6 ± 0.5 ng/mg蛋白質(zhì)，與未接受人成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小組中測到的水平(4.5 ± 1.3 pg/mg蛋白質(zhì))相似.但是，與正 常成纖維細胞組相比，在靜脈轉(zhuǎn)移NSIP ( 11.4 ± 3.7 pg/mg蛋白質(zhì))或IPF/UIF (8.2士2fig/mg蛋白質(zhì))成纖維細胞后第35天，小鼠肺部的羥脯氨酸含量更高.
同樣，在靜脈過繼轉(zhuǎn)移后第63天，NSIP和IPF/UIP成纖維細胞組的羥脯氨酸水 平分別進一步提高3倍(M ± 11 fig/mg蛋白質(zhì))和2.5倍(22 ± 4 pg/mg蛋白質(zhì)) 在第63天的時間點，與接受正常成纖維細胞的CB-17SCID/bg組相比，接受NSIP 或IPF/UIP人成纖維細胞的CB-17SCID/bg組中幾脯氨酸水平的提高達到統(tǒng)計顯 著.因此，靜脈注射人IIP成纖維細胞，在過繼轉(zhuǎn)移后第35天提高了幾脯氨酸水 平，在第63天，顯著提高羥脯氛酸水平.
全肺細胞因子分析表明，接受HP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中的 鼠1L-13、 CCL6和CCL21水平明顯升高在i.v.過繼轉(zhuǎn)移人正常或IIP成纖維細 胞后第35天和63天，用EL1SA對全肺分析數(shù)種細胞因子、CC配體和CXC配 體趨化因子進行分析，結(jié)果表明在鼠1L-13、 CCL6和CCL21發(fā)生許多統(tǒng)計顯著 的變化.雖然接受正常成纖維細胞的C.B-17SCID/bg組的全肺IL-13水平低于 ELISA檢測水平，但是與注射正常成纖維細胞的C.B-17SCID/bg組相比，注射 NSIP或IPF/UIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg組在之后笫35天和/或63天的全 肺IL13水平顯著更高.另外，對于接受IPF/UIP成纖維細胞的C.B-17SClD/bg 小鼠，成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移后第63天在其肺中檢測到的IL-13水平顯著高于笫 35天的水平.注射成纖維細胞后笫63天，接受1PF/U1P或NS1P成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg組的全肺CCL6水平顯著高于接受正常成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg組，對于接受IPF/UIP或NSIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小 鼠，成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移后第63天在其肺中檢測到的CCL6水平顯著高于第35 天的水平.通過將人成纖維細胞引入C.B-17SCID/bg小鼠而發(fā)生變化的其他鼠 CC配體只有CCL21.在第63天，這種趨化因子在NSIP和IPF/UIP成纖維細胞 C.B-17SCID/bg組中的水平明顯高于正常成纖維細胞C.B-17SCID/bg組，另外， 在成纖維細胞轉(zhuǎn)移后笫63天，IPFAHP成纖維細胞組的全肺鼠CCL21水平明顯 高于NSIP成纖維細胞組.最后，對于HP成纖維細胞C.B-r7SCID/bg組，過繼 轉(zhuǎn)移后第63天其全肺樣品中的CCL21存在水平的的顯著高于過繼轉(zhuǎn)移后第35 天的水平.因此，綜合以上數(shù)據(jù)可知，在C.B-17SCID/bg小鼠中存在IIP成纖維 細胞(但非正常成纖維細胞)，顯著改變了鼠細胞因子以及在肺中具有確定的促 纖維化作用的趨化因子(即IL-13和CCL6)和假定的促纖維化作用(即CCL21 ) 的全肺水平.
35天前接受人肺成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠肺中存在人CCR7和
CCL21基因轉(zhuǎn)錄物對接受NSIP或IPF/UIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠 中鼠CCL21的全肺水平變化的興趣來自在先研究，其說明這些CC配體在腎臟 (Barias et al" 3, ImmunoL， 2002 168:430 1- 4307)和肝臟(Bonacogi et al. Gastroenterology, 2003， 125:1060-1076)中的重要重塑作用.這促使進一步分析 人IIP成纖維細胞引起的肺重塑反應(yīng)過程中的這種CC配體及其受體CCR7.用 SuperArray基因分析檢測CCR7和CCL21的人轉(zhuǎn)錄物，在三個C.B-17SCID/bg 組中，CCR7和CCL21的最高轉(zhuǎn)錄物表達存在于IPF/UIP成纖維細胞組的肺樣本 中.另外，TAQMAN分析證實了 CCR7的存在，并在各C.B-17SCID/bg組中， IPF/UIP組再次顯示出最高的CCR7轉(zhuǎn)錄物表達，對鼠CCR7和CCL21的 SuperArray和TAQMAN分析也證實了在接受人成纖維細胞的全部三個 C.B-17SClD/bg組中均存在這些轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)品，且兩種轉(zhuǎn)錄物的最高水平存在于接 受IPF/UIP成纖維細胞的C.B-17SClD/bg組中.因此，靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移正常或IIP 成纖維細胞導(dǎo)致存在CCR7和CCL21的人基罔轉(zhuǎn)錄物.
人成纖維細胞過繼轉(zhuǎn)移入C.B-17SCID/bg小鼠后，對鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)基因 進行定量TAQMAN PCR分析使用定量PCR法分析肺部鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)基 罔的變化.63天前接受正常人成纖維細胞、NSIP和IPF/UIP人成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中存在1型膠原、組織蛋白醉E、 MMP-19和TIMP-1的表 達.更為重要的是，將成纖維細胞攻擊的小鼠中這些基因的轉(zhuǎn)錄物水平與對照 C.B-17SCID/bg小鼠中的轉(zhuǎn)錄物水平進行比較，接受任一類型IIP成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中1型膠原和組織蛋白酶的轉(zhuǎn)錄物表達的增加，以及接受 IPF/UIP成纖維細胞的小鼠中MMP-19和TIMP-1的轉(zhuǎn)錄物表達的増加相比于接 受正常人成纖維細胞的C.B-17SClD/bg小鼠中這些基因轉(zhuǎn)錄物的增加達到統(tǒng)計顯 著.用TAQMAN分析其他細胞外基質(zhì)基因，并證實存在MMP-2、 MMP-9和 纖維粘連蛋白.各組C.B-17SCID/bg小鼠的這些轉(zhuǎn)錄物的水平之間未見顯著差異， 但IPF/UIP C.B-17SCID/bg組中觀察到MMP-2和纖維粘連蛋白的增加最大，而 MMP-9在該相同C.B-17SClD/bg組中的增加最小.因此，這些數(shù)據(jù)說明在 C.B-17SCID/bg小鼠中因存在人成纖維細胞而使鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物 水平發(fā)生變化.
人CCR7或人CCL21免疫中和消除接受人HP成纖維細胞的C.B-17SClD/bg 小鼠的肺重塑在后面的一系列實驗中，評價了人CCR7和CCL21在接受人正
常成纖維細胞(n-l個細胞系)或IIP成纖維細胞(n-3個IPF/UIP細胞系，n=2 個NSIP細胞系)的C.B-17SCID/bg小鼠中的作用.雖然測定全肺樣本中人CCL21 的嘗試沒有成功(大概罔為該CC配體的存在水平低于ELISA檢測限)，但是先 前的研究已經(jīng)說明鼠CCL21和人CCL21都能通過人CCR7促進細胞鈣流動 (Jenh et al.， J. Immunol" 1999 ，62:3765-3769 ).另外，已經(jīng)證明使用多克隆抗 體免疫中和鼠CCL21可消除塵螨誘發(fā)的過敏性氣道疾病(house dust mite-induced allergic airway disease )的人源化模型中人樹突狀細胞的遷移和人T 細胞的啟動(Hammad et al. J. Immunol. 2002, 169:1524-1534) 基于報道的鼠 CCL21和人CCL21的交叉反應(yīng)性，實施這樣的治療方案其中在過繼轉(zhuǎn)移成纖 維細胞后第35-63天，施用單克隆抗體對人CCL21或人CCR7進行靶向治療.在 第63天，對采用試驗的三種治療方式的三個C.B-17SCID/bg組進行全肺組織學(xué) 調(diào)查，結(jié)果表明，正常成纖維細胞C.B-17SCID/bg組中，任何治療組(IgG治療、 抗CCL21抗體治療、抗CCR7抗體治療)均未見間質(zhì)性肺重塑跡象.但是這些 C.B-17SCID/bg組中，出現(xiàn)組織學(xué)明顯的正常成纖維細胞的血管積累.沒有一種 治療能改變接受正常成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠的這一特征.接受IgG的 NSIP成纖維細胞C.B-17SCID/bg組中間質(zhì)重塑明顯，但是通過在過繼轉(zhuǎn)移后第 35-63天施用抗CCL21抗體或抗CCR7抗體可消除這種重塑反應(yīng).同樣，接受 IPF/UIP成纖維細胞的IgG C.B-17SCID/bg組出現(xiàn)明顯間質(zhì)重塑，在過繼轉(zhuǎn)移 IPF/UIP成纖維細胞后笫35-63天施用抗CCL21抗體或抗CCR7抗體的 C.B-17SCID/bg組小鼠中則消失了 .罔此，CCL21或CCR7靶向治療(therapeutic targeting)可消除接受IIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠的間質(zhì)重塑的組織 學(xué)跡象.
接受人正常成纖維細胞或HP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠進行人 CCL21或CCR7靶向治療后，對鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)基因進行定量TAQMAN PCR 分析對抗體治療組的定量TAQMAN分析也證明抗CCL21和抗CCR7治療可 明顯改變MMP-2和MMP-19的轉(zhuǎn)錄物水平.將抗體治療的對照C.B-17SClD/bg 小鼠中這些MMPs的轉(zhuǎn)錄物水平與抗體治療的成纖維細胞攻擊的C.B-17SCID/bg 小鼠中的這些轉(zhuǎn)錄物水平進行比較.與接受IgG的C.B-17SCID/bg組中的轉(zhuǎn)錄物 水平的倍數(shù)増加相比，抗CCL21抗體治療顯著降低了接受正常成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg組中MMP-2轉(zhuǎn)錄物水平的倍數(shù)增加.與適當?shù)腎gG組相比，抗
CCR7抗體治療顯著降低了 MMP-2轉(zhuǎn)錄物水平的倍數(shù)增加.對MMP-19的定量 TAQMAN分析表明，抗CCR-7顯著增加了接受正常成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg組中的倍數(shù)變化，但是與適當?shù)腎gG組相比，兩種抗體治療都顯 著增加這種轉(zhuǎn)錄物的倍數(shù)變化.因此，對抗體治療顯著改變了用人成纖維細胞攻 擊的C.B-17SCID/bg小鼠的細胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物表達.
人CCR7或CCL21的免疫中和顯著降低接受人IIP成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小鼠的全肺幾脯氨酸水平對來自IgG治療、抗CCL21治療或 CCR7治療的對照CB-17SCID/bg小鼠(即未接受人成纖維細胞的小鼠)以及接 受正常成纖維細胞、NSIP或IPF/UIP成纖維細胞的各組治療小鼠的全肺樣本進 行羥脯氦酸水平測定.接受正常成纖維細胞和IgG的C.B-17SCID/bg小鼠全肺樣 本中的羥脯氨酸水平升高，但是兩種抗體治療均沒有改變這些水平.NSIP成纖維 細胞C.B-17SCID/bg組中，輕脯氨酸水平顯著高于對照C.B-17SCID/bg組中測定 的水平，并且與IgG治療組相比，抗CCL21抗體和抗CCR7抗體治療分別使羥 脯氨酸水平顯著降低了 52 ± 6.7%和51 ± 5.6%.在接受IgG的IPF/UIP成纖維細 胞C.B-17SCID/bg組中，羥脯氨酸水平顯著高于對照C.B-17SCID/bg組中測定的 水平.另外，與IgG治療的C.B-17SCID/bg IPF/U1P成纖維細胞組相比，抗CCL21 抗體和抗CCR7抗體治療組中，IPF/UIP成纖維細胞攻擊小鼠的羥脯氨酸水平分 別顯著降低了 66 ± 7.2%和59 ± 7.1%,因此，這些數(shù)據(jù)證明CCL21或CCR7把 向治療顯著降低C.B-17SCID/bg小鼠中過繼轉(zhuǎn)移NS1P或IPF/UIP成纖維細胞所 引起的肺重塑.
全肺細胞因子分析表明，接受IPF/UIP成纖維細胞和抗CCR7抗體治療的 C.B-17SCID/bg小鼠的肺中鼠CCL21水平顯著降低NSIP和IPF/UIP成纖維細 胞在C.B-17SCID/bg小鼠中的存在改變和/或升高了鼠IL-13、 CCL6和CCL21 的全肺水平，因此在第63天評價IgG和單克隆抗體治療對這些介質(zhì)的效果.抗 CCR7抗體和抗CCL21抗體治療對任何C.B-17SCID/bg成纖維細胞組的IL-13 或CCL6全肺水平都沒有影響.但是，與接受IPF/UIP成纖維細胞+lgG的 C.B-17SClD/bg組相比，抗CCR7抗體治療顯著降低接受IPF/UIP成纖維細胞 C.B-17SCID/bg組中鼠CCL21的全肺水平.因此，CCR7靶向治療降低鼠CCL21 水平，但是對其他兩種在IIP成纖維細胞模型中升高的介質(zhì)沒有影響.
討論本研究致力于以下兩個問題l)過繼轉(zhuǎn)移的人肺成纖維細胞是否重塑
SCID小鼠的肺結(jié)構(gòu)？ 2) CCL21和CCR7在過繼轉(zhuǎn)移人成纖維細胞引起的重塑 反應(yīng)中發(fā)揮什么作用？第一個問題的答案是肯定的，因為將lxio6 IPF/UIP或 NSIP成纖維細胞靜脈內(nèi)過繼轉(zhuǎn)移入缺乏適應(yīng)性及先天性免疫特征的 C.B-17SClD/bg小鼠可引起纖維化，所述纖維化經(jīng)組織學(xué)分析、分子分析和生物 化學(xué)分析證實.通過治療性施用定向抗人CCL21或CCR7的單克隆抗體消除這 種纖維化，由此證明這種配體及其受體在肺纖維化中起主要作用，這與它們在腎 纖維化(Banas et al.， J. Immonul.， 2002， 168:4301-4307 )和肝纖維化(Bonacchi at a，.， Gastroenterology 2003， 125:1060-1076 )中的作用相似，
雖然已知和假設(shè)的促纖維化介質(zhì)的鼠的等價物在接受IPF/UIP或NSIP成纖 維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠中水平提高，但是這些介質(zhì)在纖維化過程中的作用 仍有疑問，因為顯示顯著降低肺重塑的多組C.B-17SCID/bg小鼠中，其水平?jīng)]有 變化.因此，本研究在過繼轉(zhuǎn)移IIP成纖維細胞促進C.B-17SCID/bg小鼠的纖維 化方面提供了證據(jù)，并確立了新的IIP治療靶標.
臨床肺纖維化的建模一直是實驗室的重大挑戰(zhàn)(Chua et al.， Am J. Resp. Cell M"Biol.， 2005 33:9-13).雖然疏酸博來審素是誘導(dǎo)實驗性纖維化中選擇的一種 藥刑，但是博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化已經(jīng)被批評為不理想的IPF/UIP模型(Chua et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol.， 2005 33:9-13 ).我們意識到更新的肺纖維化棋 型應(yīng)體現(xiàn)盡可能多的臨床IIP特征，本研究利用這樣的觀察在這些疾病中成纖 維細胞主要負責嚴重且常常是致命的重塑(Zisman et al.， Meth. Mol. Med. 2005， 117:3-44). IPF/UIP或NSIP成纖維細胞的過繼轉(zhuǎn)移引發(fā)間質(zhì)重塑，并在靜脈內(nèi) 過繼轉(zhuǎn)移這些細胞系后第35天(但是不會更早)觀察到組織學(xué)明顯的纖維化.不 容易解釋纖維化的延遲顯現(xiàn)，但是這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究是一致的，在先前的研 究中，將人上皮細胞過繼轉(zhuǎn)移入(:.8-178€: )/&經(jīng)小鼠，需要大約30-40天才能顯 現(xiàn)清晰的血管(Skovsethetal.， Am. J. Pathol.， 2002， 160:1629-1637 ).因此，本 研究強調(diào)通過過繼轉(zhuǎn)移人肺成纖維細胞在免疫缺陷小鼠中建立臨床相關(guān)的肺纖維 化模型.
本文所述的IPF/UIP和NSIP成纖維細胞C.B-17SCID/bg模型的明顯好處在 于其在試驗這些疾病的新療法中的實用性.本研究致力于人CCL21和CCR7的 作用，我們已經(jīng)觀察到兩者在IIP活檢樣本(Choi et al" J. C,in. Pathol. 2006， 59:28-39 )和培養(yǎng)的IIP成纖維細胞中有顯著表達.我們現(xiàn)在的假設(shè)是，抗人CCL21抗體和抗人CCR7抗體治療的療效與其否定CCL21對IPF/UIP和NSIP成纖維 細胞的促增殖效果有關(guān).但是這里所用的單克隆抗體不可能對靜脈注射的成纖維 細胞的遷移產(chǎn)生影響，因為抗體治療被延遲到C.B-17SCID/bg小鼠出現(xiàn)組織學(xué)明 顯的纖維化的時間點.可以想象，如果用于其它肺纖維化模型，這種治療手段可 能影響對肺的纖維細胞補充.CCR7在纖維細胞上顯著表達(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563; Hashimoto et al" <! Clin. Invest., 2004 113:243-252 ) , CCL21促進纖維細胞向各種組織位點的補充(Abe et al.， J. Immunol" 2001， 166:7556-7563 ).目前正在進行的研究使用CCR7野生型和基罔 缺陷小鼠來閑明CCR7陽性纖維細胞在博來莓素誘發(fā)的肺纖維化中的作用.
過繼轉(zhuǎn)移的人IIP成纖維細胞和與小鼠相關(guān)的纖維化成分(即細胞和介質(zhì)) 對C.B-17SCID/bg小鼠中觀察到的整體肺重塑反應(yīng)的確切作用尚待確定.在本研 究中，轉(zhuǎn)移的人成纖維細胞和小鼠成分之間看起來具有相互作用，其證振是在 C.B-17SCID/bg小鼠(最顯著的是接受了兩種IIP成纖維細胞中的任一種)的肺 中，鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物以及鼠可溶性促纖維化蛋白質(zhì)發(fā)生了動力學(xué)變化. 雖然在這點上，對C.B-17SCID/bg小鼠的纖維化反應(yīng)中檢測到的可溶性鼠蛋白質(zhì) 的相對重要性仍有疑問，但是相對于正常成纖維細胞C.B-17SClD/bg組的IIP成 纖維細胞C.B-17SCID/bg組中的組織蛋白醉E、 MMPs、細胞外基質(zhì)成分(即膠 原和纖維粘連蛋白)和MMPs抑制劑的變化可能說明小鼠相關(guān)的纖維化成分積極 參與重塑反應(yīng).定量TAQMAN PCR證實了，相對于在接受正常成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg小鼠中的這些基因的轉(zhuǎn)錄物水平變化，在接受HP成纖維細胞的 C.B-17SCID/bg組中的1型膠原、組織蛋白酶E、 MMP-19和TIMP-1轉(zhuǎn)錄物水 平顯著增加.這些轉(zhuǎn)錄物變化與臨床肺纖維化相關(guān)，因為組織蛋白醉(Kimuraet al.， J. Med. Invest 2005， 52:93-100; Wattiez et al" Electrophoresis 2000， 21:2703-2712 )、MMPs和TIMPs(綜述于Pardo et al. Proc, Am, Thorac Soc.， 2006， 3:383-388)、以及細胞外基質(zhì)(Kuhii and Mason, Am, J, Pathol. 1995j Adachi Am J. Pathol 1988， 133: 193-203 )在較嚴重的IIP類型(例如IPF/UIP和NSIP )中得 到增多，MMP-19在接受IPF/UIP成纖維細胞的C.B-17SCID/bg小鼠中增加最顯 著，雖然這種蛋白酶看起來在皮膚損傷康復(fù)反應(yīng)中起主要作用(Mauch J. Invest. Dermatol. 2003， 121注釋)，但是其在肺纖維化中的作用仍不知曉.幾乎沒有例 外地，使用定量TAQMAN PCR分析下，抗CCL21抗體和抗CCR7抗體治療減
少了所有上述鼠細胞外基質(zhì)相關(guān)的基罔產(chǎn)物.MMP-19是一個例外，對MMP-19 在過繼轉(zhuǎn)移人IIP成纖維細胞后引起的肺纖維化反應(yīng)中的相對重要性的深入研究 證明了這一點以及我們的其它發(fā)現(xiàn).
總之，本實例證明，通過靜脈過繼轉(zhuǎn)移IPF/UIP或NSIP原代成纖維細胞系 可將肺纖維化轉(zhuǎn)移至C.B-17SCID/bg小鼠.該模型在試驗新型治療策略中的實用 性已得到證明，所述發(fā)現(xiàn)進一步支持CCL21-CCR7相互作用可能為臨床NSIP和 IPF/U1P的重要把標.
實施例5:特發(fā)性肺纖維化成纖維細胞的遷移以及CC趨化因子配體-21的增殖
本實施例的目的是檢驗生長自IPF/UIP和正常外科肺活檢樣的原代成纖維細 胞表達CCR7的功能和信號顯著性，從IPF/UIP和正常病人的外科肺活檢樣本培 養(yǎng)原代成纖維細胞.使用免疫細胞化學(xué)分析、基罔陣列、T叫man實時PCR、遷 移、增殖和蛋白質(zhì)印跡分析對經(jīng)過或未經(jīng)CC趨化罔子配體(CCL) 21治療的成 纖維細胞進行功能、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析.
CCR7由IPF/UIP成纖維細胞(但非正常成纖維細胞)表達.當漆露于CCL21 時，IPF/UIP成纖維細胞(但非正常成纖維細胞)表現(xiàn)出明顯的遷移和增殖反應(yīng)， 其受百日咳毒素或CCR7的中和抗體的抑制.將IPF/UIP成纖維細胞曝露于 CCL21，改變了這些細胞中MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK的磷酸化狀態(tài)，該改 變被百日咳毒素或CCR7特異性小干擾RNA消除.這些數(shù)據(jù)合起來證明CCL21 調(diào)控IPF/UIP成纖維細胞的功能特性，但不調(diào)控非常成纖維細胞，
假設(shè)CCR7在HP SLBs的間質(zhì)中表達，發(fā)明者相信這種趨化因子受體可在來 源于SLB的原代成纖維細胞中表達并具有活躍的功能.在本研究中，當曝露于 CCL21時，1PF/U1P成纖維細胞(但非正常成纖維細胞)中觀察到遷移和增殖活 動.IPF/UIP成纖維細胞膝露于CCL21引起IPF/UIP成纖維細胞中與胞外信號調(diào) 節(jié)激酶(ERK 1/2)信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)的磷酸化發(fā)生改變，這種改變可 被百日咳毒素或CCR7 siRNA阻滯.因此，這些數(shù)據(jù)說明IPF/UIP成纖維細胞與 CCR7依賴型活化有關(guān)，由此CCR7成為IPF/1JIP中有吸引力的靶標.
病人所有病人在進行纖維支氣管鏡檢之前接受臨床評價，包括胸片、肺功 能測試和薄切片電腦斷層掃描(thin-section computed tomography),在這些病 人中，綜合癥狀、生理癥狀和放射影像結(jié)果來確定疑患IIP者，招入本研究的病 人之前沒人經(jīng)歷過活檢手術(shù)或接受過HP治療.由密執(zhí)安大學(xué)醫(yī)學(xué)院IIP?？蒲?br> 究中心(IIP Specialized Center of Research)附屬的臨床中心(Clinical Core) 自2000年5月至2003年5月從疑患UIP或NSIP的病人獲得SLBs. SLBs得自 進行SLB用于診斷IIP(如前所詳述)的所有病人的至少兩片肺葉(通常在左側(cè)). 組織學(xué)正常的肺得自經(jīng)受胸切除的病人的切除樣本獲得.在層流通風(fēng)櫥中用無菌 技術(shù)單獨處理每份活檢樣本，進行原代成纖維細胞系的培養(yǎng)(見下文).
分離和培養(yǎng)成纖維細胞如先前所迷(Hogaboam et al.， Meths. Mol. Med.， 2005， 117:209-221 ),對來源于IPF/UIP或組織學(xué)正常的SLBs的成纖維細胞進行 機械解離和培養(yǎng).
收集蛋白質(zhì)和提取RNA:以2.5M()S細胞/ml將原代成纖維細胞接種于12 孔組織培養(yǎng)板中，并允許貼壁過夜.用PBS洗滌成纖維細胞一次.在孔中加入500 pi含0.5% FBS的Dulbecco，s改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM-0.5)，或加入500 p， 含有10 ng/ml CCL19或CCL21重組蛋白的DMEM-0.5 —式四份，培養(yǎng)24小時. 收集不含細胞的上清液，儲存于-80lC直至進行可溶性蛋白質(zhì)含量檢測.除去上清 液后，每孔加入250 pi Trizol，根據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen， Carlsbad, CA)的說明 提取RNA.
抗體Western抗體包括抗人CCR7單克隆抗體(R&D systems. Minneapolis, MN ) 、 Phospo-p44/42 Map激酶(Thr202/Tyr204 ) 、 Phospho-MEKl/2 (Ser217/221 ) 、 Phospho畫p90RSK ( Thr573 ) 、 Phospho畫SEKl/MKK4 (Ser257/Thr261 ) 、 Phospho-SAPK/JNK ( Thrl83/Tyr185 ) 、 Phospho-c-Jun (Ser63 ) II、 Phospho-p38 MAP激醉(Thrl80/Tyr182 ) 、 Phospho-MKK3/MKK6 (serl89/207)(全部來自Cell Signaling, Danvers， MA);抗P肌動蛋白、抗 -GAPDH、兔抗a平滑肌肌動蛋白多克隆抗體(Abcam， Cambridge, MA ) 所用 的其他抗體有Anti-rabbit， HRP conjugated, Anti-mouse, HRP conjugated, anti-biotin， HRP conjugated (Cell Signaling, Danvers， MA),
基罔陣列用購自SuperArray (Carlsbad, CA)的特異性趨化因子和趨化因 子受體基因陣列分析人CCR7、 CCL19和CCL21基因的表達.
TAQMan分析如前所述(19)，通過實時定量RT-PCR程序，使用7500 實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems， Foster City, CA)對IPF/UIP和正常成纖 維細胞中的CCR7和GAPDH表達進行分析.所有抗體和探針均購自Applied Biosystems (Foster City, CA),在計算表達變化之前用GAPDH對CCR7的表
達進行標化，在計算表達的倍數(shù)變化之前，將CCR7的表達歸一化至GAPDH.
免疫細胞組織化學(xué)(Imiminocytohistochemistry):按生產(chǎn)商(R & D Systems, Minneapolis, MN )的說明，使用HRP-AEC細胞和組織染色試刑盒，通過免疫細 胞化學(xué)方法對人CCR7蛋白的表達進行分析.
成纖維細胞遷移測定在存在或沒有10ng/ml CCL19或CCL21的條件下， 將原代IPF/UIP和正常成纖維細胞加到6孔培養(yǎng)板中的8 pm transwell inserts中， 培養(yǎng)24小時，將遷移至底孔中的成纖維細胞固定、蘇木精染色并計數(shù).為了測試 受體或配體的特異性，每孔加入5時/m，抗人CCR7、 CCL19或CCL21抗體. 加入5pg/m，IgG或10plPBS，作為對照.
增殖分析如前所述(9)，在24孔培養(yǎng)板中用卩H1胸腺嘧啶脫氣核苷摻入 法分析成纖維細胞的增殖能力.
Sircol膠原分析用Biocolor Sircol膠原分析(Accurate Chemical & Scientific Corp， Westbury， NY )測定可溶性膠原的含量.分析時，將100 pl不含細胞的上 清液樣品加到1 ml Sircol染料中，室溫振搖30分鐘，然充后以10,000 x g離心 試管10分鐘.除去染料，在每個試管中加入l m，堿溶液，分混勻.分析讀數(shù) 每份溶液取200 pl，連同200 pl標準品轉(zhuǎn)移至96孔光學(xué)平底板(optical flat-bottom plate).用讀板儀在540nm處讀板，將濃度歸一化至Bradford分析確定的總蛋 白含量.
Bioplex蛋白測定用細胞外抗體試劑盒(Invitrogen BioSource， Carlsbad, CA)和Bio-Rad Luminex Bio-Plex 200 System ( Hercules, CA)分析不含細胞的 上清液樣品中的人RANTES/CCL5.簡而言之，50 pi不含細胞的上清液樣品和標 準品與50 pi multiplex珠子在振蕩器中辨育30分鐘.用洗滌緩沖液洗滌珠子3次， 每次100 pi.然后與25nl檢測抗體溶液在振蕩器中孵育30分鐘.再洗滌3次后， 加入鏈審親和素-PE ( str印tavidin-PE)，珠子在振蕩器中孵育10分鐘，再洗滌 3次.將珠子重懸浮于分析緩沖液中，用上述系統(tǒng)讀數(shù).
Western Blot分析以5><105細胞/孔，將成纖維細胞接種于6孔板中，并允 許貼壁過夜.然后使成纖維細胞在不含血清的DMEM中饑俄M小時.成纖維細 胞用0.5%小牛血清DMEM或摻加10 ng/ml CCL19或CCL21重組蛋白的相同培 養(yǎng)基處理0.5、 2、 5、 30分鐘. 一些成纖維細胞在處理前舉露于200nM百曰咳毒 素(Sigma，St. Louis，MO) 2小時.然后用水冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌成纖維細胞，用500 pl冰冷的裂解緩沖液裂解，所述裂解緩沖液的由1% Triton X-IOO、 50mMNaF、 2 mM EDTA、 (U5MNaCI、 0.01 M褲酸鈉、200pM原釩酸鈉、5 pg/ml胃蛋白酶、5 pg/m，亮抑酵肽和100 nM花萼海綿誘癌素組成.在冰上醉育 5分鐘后，刮下成纖維細胞裂解物，轉(zhuǎn)移至試管中.用Bradford分析測定總蛋白 含量，將含有20 pg總蛋白質(zhì)的樣品與4 pl 4xLDS樣品緩沖液(Invitrogen， Carlsbad, CA)和雙重去離子水(ddH20)混合，90X:煮沐5分鐘，然后在4-12% NuPage Bis-Tris凝膠(Invitrogen， Caiisbad， CA)中通過SDS-PAGE分離.將 蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Invitrogen, Carlsbad， CA)上.用含5% NFDM的1 x TBS/T封閉后，用原發(fā)性phospho-抗體印跡膜、經(jīng)去除(RestoreTM Western Blot Stripping Buffer, Pierce, Rockford， IL )、洗滌和GAPDH (加樣對照)再印跡.
siRNA的轉(zhuǎn)染為了阻斷CCR7的表達，用Qiagen custom synthesis site制 備小干擾RNA (siRNA),用Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 將兩個候選siRNA轉(zhuǎn)染至lPF/UlP肺成纖維細胞中，用Taqman分析CCR7，以 測試其有效性.將更有效的 siRNA (約 70%敲減， AGCGGACATCAGCTGGTCAA )用于Erk 1/2途徑磷酸化的Western蛋白質(zhì)印 跡分析，
生長自正常及IPF/UIP SLBs的成纖維細胞中存在CCR7、 CCL19和CCL21 基因表達.用特異性人趨化因子和趨化閎子受體SuperArray對3個正常SLB來 源的成纖維細胞系和3個IPF/UIP來源的成纖維細胞細進行RNA分析.該分析 表明，在兩組細胞中都存在CCR7、 CCL19和CCL21，但是CCR7在IPF/UIP 成纖維細胞系中的表達明顯高于在正常成纖維細胞系中的表達.用TAQMAN實 時PCR對基因表達進行進一步分析，證實了在用于本研究的所有成纖維細胞系中 均存在CCR7、 CCL19和CCL21的轉(zhuǎn)錄物.因此，這些數(shù)據(jù)證明CCR7、 CCL19 和CCL21基因轉(zhuǎn)錄物存在于正常成纖維細胞和IPF/UIP成纖維細胞中.
標記的CCR7蛋白表達存在于IPF/UIP成纖維細胞中，但在正常成纖維細胞 中不存在.發(fā)明者已經(jīng)表明接近100%的UIP SLBs在間質(zhì)區(qū)既有灶性CCR7蛋 白表達又有彌散性CCR7蛋白表達.而且，CCR7局灶區(qū)似乎與組織學(xué)明顯的成 纖維細胞灶一致，為了測定生長自正常SLBs和IPF/UIP SLBs的原代成纖維細胞 是否表達CCR7，對CCR7進行了免疫細胞化學(xué)染色.IPF/UIP成纖維細胞呈現(xiàn) 強的CCR7陽性，然而正常成纖維細胞很少表達或不表達CCR7. CCL21定向IPF/UIP成纖維細胞的遷移，但不定向正常成纖維細胞，CCR7 的表達在成熟樹突狀細胞上受到升調(diào)節(jié)，從而使這些細胞遷移至淋巴結(jié)，用于免 疫激活(Sozzani et al.， J. ImmunoL， 1998， 161(3):1083-1086)),在某些乳腺癌細 胞(Muller et al" Nature, 2001， 410(6824):50-56 )和黑素瘤細胞(Murakam et al" J. Dermatol. Sci" 2004， 36(2):71-78 )上，已證明CCR7和CCL21的相互作用對 于轉(zhuǎn)移有重要作用，在本研究中，CCL19和CCL21都促進IPF/UIP成纖維細胞 的遷移，但對正常成纖維細胞不促進.但是，CCL21是IPF/UIP成纖維細胞遷移 的更有效的誘導(dǎo)劑，將這些細胞的遷移增強到比只接觸單獨的DMEM的IPF/UIP 成纖維細胞培養(yǎng)物高約7倍，為了檢驗這種遷移是否依賴于CCR7，在三份孔中 分別加入IgG、抗人CCR7抗體或抗人CCL21抗體(全部為5 pg/ml).雖然IgG 的存在不改變IPF/UIP成纖維細胞的遷移，但是抗CCR7抗體或抗CCL21抗體 顯著抑制了 IPFAJIP成纖維細胞的遷移反應(yīng).用200 ng/ml百日咳毒素預(yù)處理成 纖維細胞也抑制了由CCL21誘導(dǎo)的IPF/UIP成纖維細胞的遷移反應(yīng)，閎此，這 些數(shù)據(jù)表明CCR7活化促進IPF/UIP成纖維細胞(但非正常成纖維細胞)的遷移.
CCR7活化刺激原代IPF/UIP成纖維細胞的增殖.IPF/UIP表征為肺泡和肺 間質(zhì)的嚴重結(jié)疤，這部分由極度纖維増生所致.在本研究中觀察到了增強的 IPF/UIP成纖維細胞系增殖反應(yīng)，其中所有三個IPF/UIP細胞系顯示約3倍高于 所研究的正常成纖維細胞系的基線(即單獨DMEM)增殖速度.另外，加入10 ng/ml CCL21 (但非CCL19)顯著提高了所有三個原代IPF/UIP成纖維細胞系的 增殖特性，高于只暴露于DMEM的培養(yǎng)物.CCL19或CCL21的存在不改變正 常成纖維細胞的増殖特性.
CCR7活化促進原代IPF/UIP成纖維細胞產(chǎn)生CCL5 (但非從頭產(chǎn)生膠原). 先前的研究已經(jīng)表明，趨化因子可驅(qū)動各種細胞中其它趨化因子的表達.例如， 在IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物中加入CCL5顯著增強CCL7的表達，CCL7為公 認的IPF/UIP生物標記物.為了測定經(jīng)由CCL21的CCR7活化是否改變IPF/UIP 和正常成纖維細胞產(chǎn)生趨化閎子的特性，在進行多重可溶性蛋白質(zhì)分析之前，將
胞的培養(yǎng)物中，CCL21顯著提高了 IPF/UIP (但非正常成纖維細胞)中的CCL5 水平.令人驚訝的是，如用Sircol膠原分析法所測定的，CCL21在IPFAJIF成纖 維細胞培養(yǎng)物中存在24小時，并未改變其對可溶性膠原的合成.該數(shù)據(jù)連同先前
CCL21 24小時.CCL5存在于IPF/U1P和正常成纖維細 研究的數(shù)據(jù)表明，CCR7活化增強了 IPF/UIP成纖維細胞合成趨化因子的能力.
a平滑肌肌動蛋白(aSMA)在原代IPF/UIP成纖維細胞和原代正常成纖維 細胞中的表達不受CCL21的影響.
aSMA是用于高合成性成纖維細胞亞型(稱為成肌纖維細胞)的蛋白質(zhì)標記 物(White et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(l):112-1121 ) 假設(shè) CCL21對IPF/UIP成纖維細胞合成趨化罔子有重大的影響，我們接下來研究 CCR7配體是否改變aSMA在這些細胞中的表達.蛋白質(zhì)印跡分析表明，IPF/UIP 成纖維細胞培養(yǎng)物中表達的aSMA水平比正常成纖維細胞培養(yǎng)物高，這與 IPF/UIP細胞更高的合成特性是吻合的.但是，CCL21的存在不影響aSMA的表 達.雖然aSMA陽性IPF/UIP成纖維細胞表達CCR7 (基于免疫細胞化學(xué)分析)， 但是在這些細胞中加入CCL21看起來并沒有進一步提高這種蛋白的水平，說明 CCR7活化不是成纖維細胞分化為成肌纖維細胞的主要剌激因素，
CCL21激活CCR7后，IPF/UIP成纖維細胞的P44/p42胞外信號相關(guān)激蘇 (ERK 1/2)信號傳導(dǎo)途徑被激活.許多重要的細胞功能受到合稱為促分裂原活 化蛋白激酶(MAPK)途徑的一組信號蛋白的調(diào)控.每種途徑對細胞周期、生長 和遷移有獨特的影響，這部分因為每種途徑由獨特的剌激物激活，包括生長因子、 應(yīng)激和炎性細胞因子.這些刺激物引發(fā)的級聯(lián)激活涉及MAPKK激蘇、MAPK激 酶和MAPK的順序磷酸化.最后一步使MAPK進入細胞核，激活一種或數(shù)種下 游轉(zhuǎn)錄因子，從而引起生物學(xué)反應(yīng)，例如細胞的增殖、遷移和存活.為了確定活 化的CCR7對MAPK途徑的影響，分別在30秒以及2、 5和30分鐘收集未經(jīng)處 理且經(jīng)CCL21激活的成纖維細胞相關(guān)蛋白質(zhì)，對ERK 1/2、 p38和c-Jun N-末 端激酶(JNK) MAPK途徑進行蛋白質(zhì)印跡分析.在IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物 中加入CCL21后，雖然與p38和JNK途徑相關(guān)的信號蛋白的褲酸化沒有變化， 但是ERK 1/2途徑顯示出罅酸化變化的跡象.另外，該途徑?jīng)]有c-RAF和 MAPKKK轔酸化的跡象.
暴露于CCL21后，IPF/UIP成纖維細胞中的促分裂原活化蛋白激酶激醉 (MEK 1/2)發(fā)生褲酸化.未經(jīng)處理(即血清饑俄)的原代正常成纖維細胞系和 原代IPF/UIP成纖維細胞系未顯示組成性激活的MEK 1/2.正常成纖維細胞中單 獨加入DMEM-0.5,導(dǎo)致MEK1/2的褲酸化呈時間依賴性增加，5分鐘時達到最 離.但是，存在10 ng/ml的CCL21不改變這種磷酸化概況.雖然單獨加入
DMEM-0,5促進IPF/UIP成纖維細胞中MEK 1/2的時間依賴性活化，5分鐘達到 峰值，但是加入CCL21 (10 ng/ml)在2分鐘和5分鐘引起褲酸化的增加，MEK 1/2磷酸化水平在30分鐘終點回到培養(yǎng)基水平.這些數(shù)據(jù)合起來說明IPF/UIP成 纖維細胞漆露于CCL21時加快MEK 1/2的活化.
CCL21加速IPF/UIP成纖維細胞中ERK 1/2的活化.未經(jīng)處理的原代正常 成纖維細胞和原代IPF/UIP成纖維細胞顯示組成性ERK 1/2轔酸化，但是該 MAPK在正常成纖維細胞中的基線活性看來比在IPF/UIP成纖維細胞中高，這說 明組成性ERKl/2褲酸化很少。正常成纖維細胞中單獨加入DMEM-0.5，在5分 鐘時ERK 1/2活化達到頂峰.在暴露于摻加10 ng/ml CCL21的DMEM-0.5的正 常成纖維細胞中觀察到類似的ERK 1/2活化模式，但是這些培養(yǎng)物中的總體ERK 1/2褲酸化水平較低.在IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物中單獨加入DMEM-0.5所產(chǎn) 生的ERK 1/2磷酸化模式與正常成纖維細胞培養(yǎng)物中觀察到的相似，但是， IPF/UIP成纖維細胞中的活化程度比正常成纖維細胞中的高得多.相比于只啄露 于DMEM-0.5的那些成纖維細胞培養(yǎng)物中的ERK 1/2褲酸化，舉霧于CCL21和 DMEM-0.5的IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物中的ERK 1/2褲酸化在2分鐘時顯著増 加.由于IPF/UIP成纖維細胞中的低組成性ERK 1/2鱗酸化，這些細胞啄露于 DMEM-0.5或DMEM-0.5+10 ng/ml CCL21后的磷酸化水平比含有未經(jīng)處理的 IPF/UIP成纖維細胞的培養(yǎng)物高60-125倍.
CCL21促進IPF/UIP成纖維細胞中的核糖體56激醉(p90RSK)磷酸化.已 經(jīng)顯示，在拔細胞生成方面，p90RSK被趨化因子CXCL12激活(Lee et a，.， 2002， Blood 99(12):4307-4317 ).本研究對p90RSK的分析顯示，這種轉(zhuǎn)錄罔子(位于 ERK 1/2的下游)以褲酸化狀態(tài)存在于未處理的正常和IPF/UIP成纖維細胞中. 正常成纖維細胞培養(yǎng)物中p90RSK活化的變化相似，與CCL21是否存在無關(guān)， 相反，CCL21在IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物中的存在，在各測試時間點都加強了 這種轉(zhuǎn)錄罔子的褲酸化，大約比未處理的培養(yǎng)物中見到的高2.5倍.這些數(shù)據(jù)合 起來表明CCR7是IPF/UIP成纖維細胞中的一種活性受體，該受體看來至,部分 通過ERK 1/2途徑進行信號傳導(dǎo).雖然正常成纖維細胞表現(xiàn)出ERK 1/2途徑的活 化，這種活化看起來與CCL21的存在無關(guān).
百曰咳毒素抑制G-蛋白或小干擾RNA靜默CCR7基罔削弱CCL21介導(dǎo)的 ERKl/2活化.為了驗證CCR7在IPF/U1P成纖維細胞活化中的作用，進行其它
研究來檢驗百日咳毒素(Gi和Go蛋白抑制劑)或siRNA介導(dǎo)的CCR7基因沉默 是否消除CCL21對ERKl/2活化的作用.轉(zhuǎn)染24小時后，特異性CCR7 siRNA 的加入將該受體的蛋白質(zhì)表達減少約70%.在這些研究期間，這種對CCR7蛋白 表達的抑制持續(xù)30分鐘.Lamin A/C特異性siRNA和隨機siRNA對IPF/UIP成 纖維細胞的CCR7蛋白表達都沒有任何影響.因此，這些數(shù)據(jù)表明使用特異性 siRNA在體外成功定向CCR7.在IPF/UIP成纖維細胞培養(yǎng)物中存在百日咳毒素 或CCR7siRNA，將MEK1/2、 ERK 1/2和p90RSK褲酸化水平降低至與暴露于 單獨的DMEM-0.5的培養(yǎng)物相同的水平.幾項研究已經(jīng)表明，原代人肺成纖維細 胞對趨化因子產(chǎn)生促纖維化活化反應(yīng)(Atamas et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol" 2003， 29(6):743-9; Keane et al.， J. Immunol" 1997, 159(3):1437-1443; Prasse et al" Am. J. Respir. Crit. Care Med" 2006， 173(7)781-792; Puxeddu et a，" J. AHergy CHn. Immunol., 2006， 117(1): 103-110),并且是趨化因子的穩(wěn)固來源 (Keane et al" J* Immunol" 1997， 159(3): 1437-14化Prasse et al" Am, J, Respir, Crit. Care Med.， 2006， 173(7)781-79).
本研究致力于來自疾病診斷時取得的SLBs的原代IPF/UIP成纖維細胞表達 CCR7的作用.與來源于切除的肺部腫癌的正常邊緣的原代正常成纖維細胞不同， IPF/UIP成纖維細胞和aSMA陽性成肌纖維細胞表達CCR7 (被認為是局限于造 血源細胞的一種受體).通過CCL21 (CCL19較少)的CCR7活化促進和/或顯 著加強IPF/UIP成纖維細胞的遷移、增殖和趨化罔子合成特征.外源性CCL21 通過CCR7依賴的方式激活Erk 1/2 MAPK途徑.罔此，本研究提示IPF/UIP成 纖維細胞具有響應(yīng)CCR7配體的能力，CCR7配體在肺中有豐富表達，不管病情 如何(Choi et a，., J. C，in. Pathol" 2006 59(l):28-39)，這種反應(yīng)性可能在表征 IPF/UIP的過度纖維増生中發(fā)揮主要作用.
總之，本實施例說明來源于IPF/UIP SLBs的原代人成纖維細胞表達功能性 CCR7.由其配體(特別是CCL21)活化CCR7，誘導(dǎo)IPF/UIP成纖維細胞的遷 移、增殖和趨化因子合成.通過CCR7的CCL21誘導(dǎo)活化是G-蛋白依賴性的， 與ERK1/2MAPK途徑的激活有關(guān).根據(jù)該數(shù)據(jù)和其他證據(jù)，對CCL21定向抑 制實驗性腎小球(Banas et al" J. Immunol" 2002， 168(9):4301-4307 )和肝 (Bonacchi et a，. Gastroenterology, 2003， 125(4): 1060-1076)結(jié)疤，認為CCR7 代表IPF/UIP的新靶標.此外，數(shù)據(jù)表明CCL21誘導(dǎo)的MEK 1/2、 ERK 1/2和
p90RSK褲酸化依賴于功能性G-蛋白偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)和CCR7.
貫穿本說明書中以及在隨附的權(quán)利要求書中，除非上下文另有要求，詞語"包 含"或其變化，如"comprises"或"comprising"應(yīng)被理解為暗示包括聲明的整 數(shù)或步樣，或一組整數(shù)或步驟，但是不排除其它整數(shù)或步騍，或整數(shù)或步驟組.
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權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動物慢性纖維化疾病的方法，其包括降低纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量或活性，所述纖維細胞和/或成纖維細胞存在于所述纖維化疾病的纖維化損害處。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述方法進一步包括降低與所述纖維化疾病 有關(guān)的成纖維細胞中CCL19的存在量或活性.
3. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳動物與從成纖維細胞去除CCL21的藥劑接觸，所述藥刑的量為有效減輕 所述慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀的量.
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中所述藥劑是與CCL21發(fā)生特異性免疫反應(yīng) 的抗體，
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中與其它趨化因子相比，所述抗體優(yōu)先識別 CCL21上的表位.
6. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述降低CCL21的存在量或活性包括使所 述哺乳動物與咸少CCL21在成纖維細胞中的表達的藥刑接觸，所述藥刑的量為 有效減輕所迷慢性纖維化疾病的一種或多種癥狀的量.
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其中所述藥劑是定向抗CCL21的siRNA分子.
8. 權(quán)利要求l所述的方法，其中所述纖維化疾病選自肺纖雉化、慢性阻塞性 肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力表竭、慢性腎病、過敏性肺炎、呼 吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病、曼氏血吸蟲感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動脈 高壓、皰疹病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰疹病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙瘩、 狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫性疾 病、致病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、卵 巢纖維化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、開 角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述纖維化疾病為慢性肺纖維化.
10. 權(quán)利要求3或6所迷的方法，其包括在纖維化損害位點局部施用所述藥劑.
11. 權(quán)利要求10所述的方法，其中所述纖維化損害在肺內(nèi)，且所述組合物與 所述損害局部接觸.
12. 權(quán)利要求3或6所迷的方法，其中所述藥刑包含將所述藥刑特異性定但 于纖維化損害位點的靶向部分.
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述纖維化損害在肺內(nèi)，且所述組合物與 所述損害局部接觸.
14. 權(quán)利要求3所述的方法，其中使用選自以下的給藥方式施用所述抗體， 包括局部給藥、注射、吸入、儲庫式或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合.
15. 抑制成纖維細胞和/或纖維細胞増殖的方法，其包括使所迷成纖維細胞和 /或纖維細胞與組合物接觸，所述組合物包含抗CCL21抗體或設(shè)計為抗CCL21 的siRNA分子，
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其進一步包括使所述成纖維細胞與組合物接觸， 所述組合物包含抗CCL19抗體或設(shè)計為抗CCL19的siRNA分子.
17. 權(quán)利要求15或16所述的方法，其進一步包括使所述成纖維細胞與組合 物接觸，所述組合物包含抗CCR7抗體或設(shè)計為抗CCR7受體的siRNA分子.
18. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所迷纖維細胞和/或成纖維細胞位于體外.
19. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述纖維細胞和/或成纖維細胞位于體內(nèi).
20. 權(quán)利要求15所述的方法，其中所述纖維細胞和/或成纖維細胞位于體內(nèi) 肺組織中.
21. 抑制纖維細胞遷移和/或成纖維細胞活化的方法，其包括使所述纖維細胞 和/或成纖維細胞與抑制CCL21活性的組合物接觸.
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述纖維細胞位于哺乳動物體內(nèi)，且所述 方法抑制纖維細胞向所述哺乳動物的肺組織遷移，由此防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn) 生.
23. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述成纖維細胞為位于哺乳動物肺組織中 的固有肺成纖維細胞，且所述方法抑制所述哺乳動物肺組織中的所述成纖維細胞 的活化，由此防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生.
24. 治療肺纖維化的方法，其包括通過抑制所述纖維細胞和/或所述成纖維細 胞中CCL21的活性或表達來抑制罹患纖維化肺病的哺乳動物的纖維細胞的遷移 和/或位于肺組織中的固有肺成纖維細胞的活化，由此防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生 并改善肺纖維化癥狀，
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中CCL21的存在量或活性的藥刑，其中所述藥刑可在放射治療之前、和/或期間、 和/或之后施用.
26. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述方法進一步包括施用降低與所述纖維 化疾病有關(guān)的成纖維細胞中CCL19的存在量或活性的藥刑，
27. 對受試者治療或抑制藥物誘發(fā)的肺纖維化發(fā)展的方法，其包括對所述受 試者施用降低所述受試者肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量 或活性的藥刑，其中所述藥刑可在給藥之前、和/或期間、和/或之后施用.
28. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述方法進一步包括施用降低與所述纖維 化疾病有關(guān)的成纖維細胞中CCL19的存在量或活性的藥劑.
29. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述藥物選自細胞毒素刑、抗生素、抗心 律失常藥、消炎藥和違禁藥.
30. 權(quán)利要求27所述的方法，其中所述藥物選自兩性霉素B、博來審素、溴 麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡因、環(huán)磷跣胺、苯妥英、麥角 胺、象卡尼、海洛罔、美法侖、美沙新、甲氛蝶呤、哌甲醋、美西麥角、礦物油、 呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅稱、柳氳磺吡啶、妥卡尼和長春花生物堿 類藥刑.
31. 權(quán)利要求24~30中任一項所述的方法，其中所述藥刑與皮質(zhì)類閨醇、免 疫抑制劑、抗凝刑、利尿劑、強心式、鈣通道阻斷劑、血管擴張劑、前列環(huán)素類 似物、內(nèi)皮素拮抗劑、褲酸二酯酶抑制刑、p2激動劑、抗毒革械劑、內(nèi)肽酶抑制 刑、降血脂藥和血栓素抑制劑，或其組合聯(lián)合施用.
32. 用于降低纖維化損害處的纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量 或活性的藥劑以及任選的降低纖維化損害處的纖維細胞和/或成纖維細胞中 CCL19的存在量或活性的藥刑在制備治療哺乳動物慢性纖維化疾病的藥物中的 用途.
33. 權(quán)利要求32所迷的用途，其中所述藥劑是與CCL21發(fā)生特異性免疫反 應(yīng)的抗體.
34. 權(quán)利要求33所述的用途，其中所述抗體與其它趨化罔子相比優(yōu)先識別 CCL21上的表位.
35. 權(quán)利要求32所述的用途，其中所述的藥刑是定向抗CCL21的siRNA分子.
36. 權(quán)利要求32所述的用途，其中所述纖維化疾病選自肺纖維化、慢性阻塞 性肺病、肝纖維化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、充血性心力衰竭、慢性腎病、過敏性肺炎、 呼吸性細支氣管炎/間質(zhì)性肺病、曼氏血吸蟲感染、由叢狀損害引起的原發(fā)性肺動 脈高血壓、皰疹病毒相關(guān)疾病的肺表現(xiàn)、皰滲病毒相關(guān)疾病的皮膚表現(xiàn)、瘢痕疙 瘩、狼瘡、腎源性纖維化皮膚病、日本血吸蟲感染相關(guān)的纖維化損害、自身免疫 性疾病、致病性纖維化、萊姆病、胰腺炎中的基質(zhì)重塑和基質(zhì)纖維化、子宮肌瘤、 卵巢纖維化、角膜纖維化、充血性心力衰竭和其他缺血后遣癥、術(shù)后腹部結(jié)疤、 開角型青光眼小梁切除術(shù)后結(jié)疤，及其任意組合.
37. 權(quán)利要求36所述的用途，其中所述纖維化疾病為慢性肺纖維化.
38. 權(quán)利要求l所述的用途，其中使用選自以下的給藥方式施用所迷藥刑包 括局部給藥、注射、吸入、儲庫式或泵式持續(xù)釋放，或其任意組合，
39. 包含抗CCL21抗體或設(shè)計為抗CCL21的siRNA分子，以及任選的抗 CCL19抗體或設(shè)計為抗CCL19的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細胞和 /或纖維細胞增殖的藥物中的用途，
40. 權(quán)利要求39所述的用途，其中所述用途進一步包括包含抗CCR7抗體 或設(shè)計為抗CCR7受體的siRNA分子的組合物在制備抑制成纖維細胞和/或纖維 細胞增殖的藥物中的用途.
41. 抑制CCL21活性的組合物在制備抑制纖維細胞遷移和/或成纖維細胞活 化的藥物中的用途.
42. 抑制纖維細胞中CCL21的活性或表達，和/或抑制國有肺成纖維細胞活 化的組合物在制備藥物中的用途，所述藥物通過防止細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生并改 善肺纖維化癥狀來治療肺纖維化.
43. 降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量或活性的藥 刑或任選的降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL19的存在量或活性的
44.降4氐肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL21的存在量或活性的藥 刑或任選的降低肺組織中纖維細胞和/或成纖維細胞中CCL19的存在量或活性的 藥刑在制備治療藥物誘發(fā)的肺纖維化的藥物中的用途.
45. 權(quán)利要求43或44所述的用途，其中所述藥物選自細胞毒素刑、抗生素、 抗心律失常藥、消炎藥和違禁藥.
46. 權(quán)利要求43或44所述的用途，其中所迷藥物選自兩性審素B、博來審 素、溴麥角隱亭、白消安、卡馬西平、苯丁酸氮芥、可卡罔、環(huán)磷酰胺、苯妥英、 麥角胺、氟卡尼、海洛因、美法侖、美沙嗣、甲氨蝶呤、哌甲酯、美西麥角、礦 物油、呋喃妥因、亞硝基脲類、丙卡巴肼、硅嗣、柳氣磺吡啶、妥卡尼和長春花 生物堿類藥刑.
47. 權(quán)利要求32~46中任一項所述的用途，其中所述藥物與皮質(zhì)類閨醇、免 疫抑制劑、抗凝刑、利尿刑、強心式、鈣通道阻斷刑、血管擴張刑、前列環(huán)素類 似物、內(nèi)皮素拮抗刑、褲酸二醋酶抑制刑、P2激動劑、抗毒覃堿刑、內(nèi)肽醉抑制 刑、降血藥和血栓素抑制刑，或其組合聯(lián)合.
48. 權(quán)利要求2所迷的方法，其中所述降低所述纖維細胞和/或成纖維細胞中 CCL21和CCL19的存在量或活性包括使所述哺乳動物與從所述成纖維細胞去除 CCL21和CCL19的藥劑接觸，所述藥劑的重為有效減輕所述慢性纖維化疾病的 一種或多種癥狀的量.
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療纖維化疾病的方法和組合物。更具體地，本發(fā)明論證了對單獨的CCL21活性或其與CCL19結(jié)合的活性的抑制或其它形式的降低，能有效減少纖維化損害，并改善纖維化疾病的癥狀。
文檔編號C12Q1/68GK101351545SQ200680048342
公開日2009年1月21日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者C·M·霍加博亞姆, S·L·昆克爾 申請人:密執(zhí)安大學(xué)評議會