專利名稱：：用銅氧還蛋白和細(xì)胞色素治療瘧疾的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及銅氧還蛋白和細(xì)胞色素以及它們單獨或組合在抑制瘧原蟲(malariaparasite)的寄生蟲血癥，特別是抑制哺乳動物紅細(xì)胞中的惡性柜原蟲(戶/osmo^Mm/a/cz^wm)的寄生蟲血癥中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及銅氧還蛋白和細(xì)胞色素的變體和衍生物，它們保留了抑制瘧原蟲的寄生蟲血癥能力。最后，本發(fā)明提供抑制昆蟲媒介中瘧疾感染的傳播的方法。
背景技術(shù)：
：世界人群的大約四分之一暴露于瘧疾的風(fēng)險中，每年超過一百萬人死于瘧疾。在感染人的四種瘧原蟲中，兩個主要的種屬是惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲^Wvox)。惡性瘧原蟲血液階段裂殖體利用多種表面蛋白結(jié)合并寄生于紅細(xì)胞中(CowmanWa/"FEBSLett.476:84-88(2000);Baum"a/"J.Biol.Chem.281:5197-5208(2006))，其主要抗原性成員被稱為裂殖體表面蛋白1(MSP1)，是一種195kDa的蛋白。MSP1存在于瘧原蟲的所有紅細(xì)胞侵入性種屬中，其通過糖基-磷脂酰肌醇鍵錨定到裂殖體表面。在紅細(xì)胞侵入過程的早期，從受感染的紅細(xì)胞釋放后不久，裂殖體MSP1蛋白經(jīng)歷蛋白水解裂解，產(chǎn)生C-末端裂解產(chǎn)物MSPl-42，其隨后經(jīng)歷第二次裂解，產(chǎn)生llkDa肽MSPl-19，其在寄生蟲進(jìn)入紅細(xì)胞時保持附著在寄生蟲表面。裂解產(chǎn)物MSP1-19的形成對于寄生蟲的成功侵入是非常重要的，因為對其蛋白水解形成的抑制或通過單克隆抗體的中和阻止了寄生蟲進(jìn)入紅細(xì)胞(Blackman"a/.，J.Exptl.，Med.180:389-393(1994))。MSP1-19肽是一種最重要的可獲得的瘧疾疫苗候選物。來自瘧疾抗性人血清的MSP1-19特異性抗體與抗原反應(yīng)，并且其包括主要紅細(xì)胞侵入抑制性部分(Holder&Riley，Parasitol.Today,12:173-174(1996);O'Donnellefa/"J.Expt.Med.193:1403-1412(2001》。來自瘧疾地方病區(qū)域的供體的血清通常表現(xiàn)對PfMSP1-19的強(qiáng)抗體反應(yīng)性。(Nwuba"a/"InfectImmun.70:5328-5331(2002))。單克隆抗體(mAb)G17.12是針對重組PfMSP1-19產(chǎn)生的，并且識別其在寄生蟲表面上的表位，表明抗原的這個區(qū)在天然MSP1多肽復(fù)合物上是可接近的(Pizarro&J.Mol.Biol.328:1091-1103(2003))。有趣地，體外紅細(xì)胞侵入實驗表明，在G17.12存在下，甚至在200pg/ml的濃度下，感染不被抑制，并且在體外G17.12不抑制MSP1的二級加工。同上。還已經(jīng)證明了阻斷侵入抑制性抗體的結(jié)合從而促進(jìn)寄生蟲存活的抗體的存在(GuevaraPatinoa/.,J,Expt.Med.186:1689-1699(1997))，該抗體的存在可能對G17.12mAb不能抑制M/a/"》w"w的紅細(xì)胞侵入負(fù)責(zé)。腦型瘧是一種由于被寄生的紅細(xì)胞的扣押而限于腦毛細(xì)管的惡性瘧原蟲侵入的罕見但致死的感染，其通常是不可治療的，因為大多數(shù)藥物不能穿越血腦屏障達(dá)到腦毛細(xì)管。惡性癥原蟲感染的紅細(xì)胞對腦毛細(xì)管的粘附由受感染紅細(xì)胞表面上表達(dá)的寄生蟲配體PfEmp-l蛋白家族與腦血管中毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的ICAM-1和CD36的相互作用介導(dǎo)。(Smithef<a/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:1766-1771(2000);Franke-Fayard&Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，11468-11473(2005))。雖然一些藥物例如靶向血紅素解毒途徑的氯喹被用于治療癥疾，但是寄生蟲對藥物的抗性和蚊媒介對殺蟲劑抗性的發(fā)生率增加。氯喹拮抗寄生蟲誘導(dǎo)的HRP(富組氨酸蛋白)所介導(dǎo)的血紅素聚合作用，因為血紅素單體對瘧原蟲是高毒性的。血紅素的聚合作用可以解毒，這被氯喹逆轉(zhuǎn)。另一種藥物青蒿素對腦型瘧中氯喹抗性惡性瘧原蟲是有效的。青蒿素與血紅蛋白中的球蛋白結(jié)合血紅素形成加合物，其結(jié)合HRP以防止血紅素聚合。對于這一在非洲和亞洲特別流行的可怕疾病，急需發(fā)現(xiàn)新的藥物。藥物開發(fā)的當(dāng)前嘗試致力于破譯完整的寄生蟲基因組序列、瘧原蟲蛋白的分子建模和對新的藥物靶點的尋找。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及銅氧還蛋白和細(xì)胞色素以及它們單獨或一起抑制哺乳動物紅細(xì)胞和瘧原蟲感染的其他組織中寄生蟲血癥，特別是惡性瘧原蟲的人紅細(xì)胞寄生蟲血癥的傳播的應(yīng)用。本發(fā)明的一個方面是分離的肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物；且其能夠抑制瘧疾感染的人紅細(xì)胞中瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本發(fā)明的另一方面是分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物；并且其能夠結(jié)合選自PfMSPl-19和PfMSPl-42的蛋白。本發(fā)明的另一方面是分離的肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，并且其能夠抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的疙疾寄生蟲血癥。特別地，所述分離的肽能夠抑制惡性瘧原蟲感染的人紅細(xì)胞中的瘧疾寄生蟲血癥。在一些實施方案中，所述銅氧還蛋白是天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白(rusticyanin)、Laz或橙綠曲撓素(auracyanin)。特別地，所述銅氧還蛋白可以是鐵硫菌藍(lán)蛋白、天青蛋白或Laz。在一些實施方案中，所述銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌(尸"wcfo/wo"as"m/g/"ora)、糞產(chǎn)堿菌(Wc"/fge"es^/^c"/fs)、氧化木糖無色桿菌(4(^romo6acfer矽/cwojaV/aw)、支氣管敗血性博德特菌(5on^ete〃a6廠o"c/^epf/ca)、甲基單胞菌屬(Afe^y/o附o"as$/.)、腦膜炎奈瑟菌(A^fssen'fl加e"/wgz力W/s)、淋病奈瑟菌(A^&sen.ago"orWzea)、熒光假單胞菌CP"^/o附o"asywomscms)、綠針假單胞菌(7^Mfifo/wo"oycWorarap/w'力、苛養(yǎng)木桿菌(Zy/e〃a/"幼AVwa)或副溶血弧菌(M6n'o戸ra/^mo/聲/c"力。特別地，所述銅氧還蛋白可以來自氧化亞鐵硫桿菌(77H'o6aci7/ws/emoxWara)、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟菌或腦膜炎奈瑟菌。在這一方面的其他實施方案中，所述細(xì)胞色素是細(xì)胞色素c或細(xì)胞色素f。特別地，所述細(xì)胞色素C可以來自人或銅綠假單胞菌。所述細(xì)胞色素f可以來自藍(lán)細(xì)菌(c戸"o6a"m'a)。在這一方面的其他實施方案中，所述分離的肽是選自SEQIDNO:1-20和22的肽的截短形式。在一些實施方案中，SEQIDNO:1-20或22與所述分離的肽的序列具有至少90%的氨基酸序列相同性。在這一方面的一些實施方案中，所述分離的肽是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的截短形式。在一些實施方案中，所述分離的肽超過約10個殘基并且不超過約100個殘基。所述分離的肽可以包含天青蛋白殘基36-89?；蛘撸龇蛛x的肽可以由天青蛋白殘基36-89組成?；蛘?，所述分離的肽可以包含銅氧還蛋白的與天青蛋白36-89等價的殘基。在這一方面的其他實施方案中，所述分離的肽與Laz的H.8區(qū)融合。在另一個實施方案中，所述分離的肽是單克隆抗體G17.12的結(jié)構(gòu)等價物。本發(fā)明的另一方面是一種組合物，其包含于藥物組合物中的至少一種銅氧還蛋白、細(xì)胞色素或分離的肽，所述分離的肽是能夠抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的瘧疾寄生蟲血癥的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。特別地，可以配制所述藥物組合物供靜脈內(nèi)給藥。所述組合物可以包含另一種抗瘧藥或抗HIV藥。在所述組合物的一些實施方案中，所述銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌或副溶血弧菌。特別地，所述銅氧還蛋白可以來自氧化亞鐵硫桿菌、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟菌或腦膜炎奈瑟菌。在所述組合物的一些實施方案中，所述細(xì)胞色素是細(xì)胞色素c或細(xì)胞色素f。特別地，所述細(xì)胞色素c可以來自人或銅綠假單胞菌。所述細(xì)胞色素f可以來自藍(lán)細(xì)菌。在一些實施方案中，所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c是SEQIDNO:1-20或22。本發(fā)明的另一方面是治療遭受瘧原蟲感染的患者的方法，其通過向所述患者給藥有效量的本發(fā)明的組合物進(jìn)行。在特定的實施方案中，所述肽抑制所述患者的瘧疾感染的人紅細(xì)胞中的瘧疾寄生蟲血癥。在一些實施方案中，所述瘧原蟲是間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲。在一些實施方案中，所述患者另外遭受HIV感染。在一些實施方案中，所述組合物與第二組合物一起給藥，所述第二組合物可以含有抗皰藥和/或抗HIV藥。在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物在給藥第二組合物的0分鐘到12小時內(nèi)給藥。在一些實施方案中，將本發(fā)明的組合物經(jīng)口服、吸入、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)注射或經(jīng)皮下給藥于所述患者；特別地，可以將所述組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給藥于所述患者。本發(fā)明的另一方面是治療疑似與瘧原蟲接觸的患者的方法，其包括向所述患者給藥有效量的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的另一方面是預(yù)防哺乳動物中的瘧疾的方法，其包括向攜帶瘧原蟲的昆蟲媒介群體中的昆蟲媒介給藥一些量的本發(fā)明的組合物。在該方法的一些實施方案中，將所述組合物經(jīng)口服給藥于所述昆蟲媒介。本發(fā)明的這些和其他方面、益處和特征從以下附圖和具體實施方式將變得清楚。附圖簡述圖1.圖1顯示表面等離子共振結(jié)合滴定，其給出天青蛋白、11.8-天青蛋白(R8-Az)、Laz和GST-天青蛋白(GST-Azu)構(gòu)建體與MSPl-19和1-42的相互作用。(A)結(jié)合曲線顯示天青蛋白和其類似物與固定化在羧基甲基葡聚糖包被的金感受器芯片上的MSP1-19(MSP1-19-CM5)的相互作用。通過在感受器表面注射不同濃度(0.05-300nM)來測定天青蛋白與MSP1-19的濃度依賴性結(jié)合，并將結(jié)合程度作為以共振單位(RU)量度的平衡共振反應(yīng)值的函數(shù)進(jìn)行評價。雖然H.S-Az和Laz比天青蛋白有些更強(qiáng)烈地結(jié)合，但是用GST或11.8-05丁未觀察到結(jié)合。(B)以與(A)中所示的用于MSP1-19的類似方式進(jìn)行固定化MSPl-42與天青蛋白和其類似物的體外結(jié)合滴定。通過將數(shù)據(jù)擬合至Req=Rmax/(l+(Kd/C))，用連接圖中的數(shù)據(jù)點的曲線擬合來測定相關(guān)的結(jié)合親和力。MSP1-19結(jié)合Kd值是:32.2±2.4nM(天青蛋白)，26.2±2.4nM(Laz)，11,8±0.3nM(H.8國Az)，對MSP1國42結(jié)合的是54.3士7.6nM(天青蛋白)，45.6±2.4nM(Laz)和14.3士1.7nM(H.8-Az)。(C)在MSP1-19-CM5傳感器表面的GST-Azu融合蛋白相互作用的結(jié)合滴定表明GST-Azu36-128和GST-Azu36-89與MSP1-19的識別。用GST或GST-Azu88-113未觀察到結(jié)合。圖2.圖2顯示如所示的不同濃度的天青蛋白、H.S-天青蛋白(H,8-Az)和Laz對惡性瘧原蟲寄生蟲血癥(RBC內(nèi)寄生蟲的生長)的抑制。在這些實驗中，在不同濃度的蛋白存在或不存在下，用裂殖體感染正常的紅細(xì)胞，溫育過夜，通過薄的血涂片和吉姆薩染色來對細(xì)胞內(nèi)寄生蟲的數(shù)量計數(shù)。圖3.圖3顯示ICAM(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和NCAM,插圖)與固定化天青蛋白的結(jié)合的表面等離子共振結(jié)合曲線。由于對裸Au-CM5芯片的大量非特異性結(jié)合，將CM5作為洗脫液加入電泳緩沖液中(lmg/mlCM5，加入HBS-EP緩沖液中)。天青蛋白與ICAM-3的選擇性識別是顯著的，結(jié)合強(qiáng)度是19.5±5.4nM，而天青蛋白不與ICAM-l或ICAM-2選擇性識別。如插圖所示，NCAM與天青蛋白結(jié)合的Kd是20士5.0nM。序列簡要說明SEQIDNO:1是來自銅綠假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:2是來自銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素c551的氨基酸序列。SEQIDNO:3是來自腦膜炎奈瑟菌MC58的Laz的氨基酸序列。SEQIDNO:4是來自層理席藻(尸/20rwWMW/a;m'/2ayww)的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。SEQIDNO:5是來自氧化亞鐵硫桿菌(嗜酸氧化亞鐵硫桿菌爿c/力Y//o^c/〃us/^roox/ofara)的鐵硫菌藍(lán)蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:6是來自裂環(huán)無色桿菌G4c/rawo6a"ercyc/oc/owfes)的假天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:7是來自糞產(chǎn)堿菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:8是來自氧化木糖無色桿菌亞種Am'^/ca"s/的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:9是來自支氣管敗血性博德特菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:10是來自甲基單胞菌屬丄的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:11是來自腦膜炎奈瑟菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:12是來自熒光假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:13是來自綠針假單胞菌的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:14是來自苛養(yǎng)木桿菌^5c的天青蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:15是來自黃瓜(0/cwm/s^ft'vw力的星形花青苷(stellacyanin)的氨基酸序列。SEQIDNO:16是來自橙色綠屈撓菌(CWora/7ejCT^a"ra"ft'acw力的橙綠曲撓素A的氨基酸序列。SEQIDNO:17是來自橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素B的氨基酸序列。SEQIDNO:18是來自夷VZX的黃瓜堿性蛋白的氨基酸序列。SEQIDNO:19是來自人類(ifomoM/7/ms)的細(xì)胞色素c的氨基酸序列。SEQIDNO:20是來自藍(lán)細(xì)菌層理席藻的細(xì)胞色素f的氨基酸序列。SEQIDNO:21是來自淋病奈瑟菌F62的H.8區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO:22是來自淋病奈瑟菌F62的Laz的氨基酸序列。SEQIDNO:23是用于PCR擴(kuò)增淋病奈瑟菌的Laz編碼基因(/az)的正向引物。SEQIDNO:24是用于PCR擴(kuò)增淋病奈瑟菌的Laz編碼基因(/az)的反向引物。SEQIDNO:25是用于PCR擴(kuò)增pUC18-/m的3.1kb片段的正向引物。SEQIDNO:26是用于PCR擴(kuò)增pUC18-/^的3.1kb片段的反向引物。SEQIDNO:27是用于PCR擴(kuò)增pUC19-戶z的0.4kb片段的正向引物。SEQIDNO:28是用于PCR擴(kuò)增pUC19-p。z的0.4kb片段的反向引物。SEQIDNO:29是pGST-azu36-128的正向引物。SEQIDNO:30是pGST-azu36-128的反向引物。SEQIDNO:31是pGST-azu36-89的正向引物。SEQIDNO:32是pGST-azu36-89的反向引物。SEQIDNO:33是pGST-azu88-113的正向引物。SEQIDNO:34是pGST-azu88-113的反向引物。SEQIDNO:35是用于定點誘變以用于制備pGST-azu88-113的寡核苷酸。SEQIDNO:36是用于定點誘變以用于制備pGST-azu88-113的寡核苷酸。具體實施方式定義如本文所用，術(shù)語"細(xì)胞"包括該術(shù)語的單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非特別地描述為"單個細(xì)胞"。如本文所用，術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"可互換地使用來指代氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還適用于天然存在的氨基酸聚合物。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"還包括修飾的多肽"、"肽"和"蛋白"，其包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y羧化、羥基化和ADP核糖基化。要理解的是，多肽不總是完全線性的。例如，作為泛素化的結(jié)果多肽可以是分支的，它們可以是環(huán)形的(有或沒有分支)，一般是翻譯后事件的結(jié)果，包括天然的加工事件和由非天然存在的人工操作導(dǎo)致的事件。環(huán)形的、分支的和分支環(huán)形的多肽可以通過非翻譯的天然過程以及通過完全的合成方法來合成。如本文所用，術(shù)語"病理病癥"包括相對于正常的解剖和生理學(xué)的偏差，其構(gòu)成活體動物或其一部分的正常狀態(tài)的損害，其阻斷或改變了機(jī)體功能的性能，并且是對各種因素(例如營養(yǎng)不良、工業(yè)危害或氣候)、對特定的傳染物質(zhì)(如蠕蟲、寄生原生動物、細(xì)菌或病毒)、對生物體的固有缺陷(如遺傳學(xué)異常)或?qū)@些因素的組合的反應(yīng)。如本文所用，使用"病癥"包括相對于正常的解剖和生理學(xué)的偏離，其構(gòu)成活體動物或其一部分的正常狀態(tài)的損害，其阻斷或改變機(jī)體功能的性能。如本文所用，術(shù)語"患有"、"遭受"包括當(dāng)前表現(xiàn)病理病癥的癥狀、具有即使沒有可見癥狀的病理病癥、處于病理病癥的恢復(fù)中或已從病理病癥中恢復(fù)。如本文所用，術(shù)語"寄生蟲血癥"包括其中寄生蟲存在于血液和其他組織中的病癥，特別是指有或沒有臨床癥狀的寄生蟲存在的病癥。如本文所用，術(shù)語"寄生蟲血癥的抑制"是指在哺乳動物血液中寄生蟲存在的生長速度的降低或減低。抑制是與對照處理相比統(tǒng)計學(xué)顯著的生長速度的任何降低或減低。如本文所用，術(shù)語"治療"包括防止、降低、停止或逆轉(zhuǎn)與要治療的病癥相關(guān)的病癥或癥狀的進(jìn)展或嚴(yán)重度。因而，術(shù)語"治療"包括適當(dāng)?shù)乃幬铩⒅委熀?或預(yù)防給藥。如本文所用，"抗瘧疾活性"包括降低傳染性、繁殖或者抑制瘧原蟲生命周期的發(fā)展的任何活性。"抗瘧疾活性"包括通過用目前抗瘧藥觀察到的所有方法抑制瘧疾感染的生長。如本文所用，術(shù)語"抗瘧藥"是指具有抗瘧疾活性、可用于降低傳染性、繁殖或者抑制瘧原蟲生命周期的發(fā)展的藥物。如本文所用，術(shù)語"抗HIV藥"是指具有抗HIV活性的藥物，通過所述藥物經(jīng)任何方式哺乳動物中的HIV感染被降低或者阻止在其人體中的增加，所述任何方式包括但不限于抑制HIV基因組的復(fù)制、抑制HIV外殼蛋白的合成和/或組裝以及抑制HIV進(jìn)入未感染的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語"基本上純的"，當(dāng)用于修飾術(shù)語多肽或其他化合物時，是指一種多肽或化合物，例如分離自生長培養(yǎng)基的多肽，其形式為基本上沒有或不摻雜活性抑制試劑。術(shù)語"基本上純的"是指以干重計量為分離部分的至少約75%的化合物，或"75%基本上純的"。更具體地，術(shù)語"基本上純的"是指以干重計活性化合物為至少約85%的化合物，或"85%基本上純的"。最具體地，術(shù)語"基本上純的"是指以干重計活性化合物為至少約95%的化合物，或"95%基本上純的"。基本上純的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c551或其變體或衍生物可以與一種或多種其他基本上純的化合物或其他分離的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素組合使用。短語"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)純的"是指一種物質(zhì)，其基本上或幾乎不含如在天然狀態(tài)中存在的通常伴隨該物質(zhì)的組分。因而，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽優(yōu)選不含有在所述肽的原位環(huán)境中通常與所述肽相關(guān)的物質(zhì)。"分離的"區(qū)是指不包括多肽的整個序列的區(qū)域，所述區(qū)域來自所述多肽。"分離的"核酸、蛋白或其相應(yīng)片段已經(jīng)基本上從其體內(nèi)環(huán)境中移出，使得其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員操作，例如但不限于核酸片段的核苷酸測序、限制性消化、定點誘變和亞克隆到表達(dá)載體中，以及以基本上純的量獲得蛋白或蛋白片段。如本文對于肽所用的術(shù)語"變體"是指氨基酸序列變體，其與野生型多肽相比可以具有替代、缺失或插入的氨基酸。變體可以是野生型肽的截短形式。因而，變體肽可以通過對編碼所述多肽的基因操作來產(chǎn)生。通過改變所述多肽的基本組成或特征，但是不改變其基本活性的至少一些，可以產(chǎn)生變體。例如，天青蛋白的"變體"可以是突變的天青蛋白，其保留了它抑制瘧疾感染的人紅細(xì)胞中寄生蟲血癥的能力。在一些情況下，使用非天然氨基酸例如s-(3,5-二氮苯甲酰基)-Lys殘基來合成變體肽。(Ghadiri&Fernholz，J.Am.Chem.Soc,112:9633-9635(1990))。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過20個替代、缺失或插入的氨基酸。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過15、14、13、12或11個替代、缺失或插入的氨基酸。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過IO、9、8或7個替代、缺失或插入的氨基酸。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過6個替代、缺失或插入的氨基酸。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過5或4個替代、缺失或插入的氨基酸。在一些實施方案中，與野生型肽相比，所述變體具有不超過3、2或1個替代、缺失或插入的氨基酸。如本文所用，術(shù)語"氨基酸"是指包含任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸殘基的氨基酸部分，即包含經(jīng)一個、兩個、三個或更多碳原子，一般一個碳原子直接連接的至少一個羧基和至少一個氨基殘基的任何部分。如本文對于肽所用的術(shù)語"衍生物"是指衍生自目標(biāo)肽的肽。衍生包括肽的化學(xué)修飾形式，使得所述肽仍保留一些它的基本活性。例如，天青蛋白的"衍生物"可以是化學(xué)上修飾的天青蛋白，其保留了它抑制瘧疾感染的人紅細(xì)胞中寄生蟲血癥的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不限于肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化或糖基化。此外，衍生的肽可以是多肽或其片段與化合物的融合，所述化合物例如但不限于另一種肽、藥物分子或其他治療劑或藥物或者可檢測的探針。術(shù)語"氨基酸序列相同性百分比(％)"被定義為當(dāng)將兩個序列排比時，多肽中與候選序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了確定氨基酸相同性％，將序列排比，如果必要，引入缺口以獲得最大的序列相同性％;保守取代不被認(rèn)為是序列相同性的一部分。確定相同性百分比的氨基酸序列排比方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。使用通常公眾可獲得的計算機(jī)軟件例如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件排比肽序列。在特定的實施方案中，使用Bla鄉(xiāng)(可從國立生物技術(shù)信息中心，BethesdaMD獲得)，其使用長復(fù)雜性濾器(longcomplexityfilter)默認(rèn)參數(shù)預(yù)期10、字長3、存在11和延伸1。當(dāng)氨基酸序列被排比時，給定氨基酸序列A與、和或相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(或者其可以稱為給定氨基酸序列A，其與、和或相對于給定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列相同性％)可以計算為氨基酸序列相同性％=X/Y*100其中X是通過A和B的序列排比程序或算法的排比得分作相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且Y是B中氨基酸殘基的總數(shù)。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，則A與B的氨基酸序列相同性％將不等于B與A的氨基酸序列相同性％。當(dāng)將較長的序列與較短的序列比較時，較短的序列將是"B"序列，除非另有說明。例如，當(dāng)將截短的肽與相應(yīng)的野生型多肽比較時，截短的肽將是"B"序列。"治療有效量"是有效防止或減慢要治療的個體的特定病癥、病理或其他情況中的現(xiàn)有癥狀的發(fā)展或者部分或完全地減輕現(xiàn)有癥狀的量。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供組合物和方法，其使用銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素以抑制疙疾感染的哺乳動物紅細(xì)胞和機(jī)體組織例如腦組織和骨組織的寄生蟲血癥。以前已知，屬于稱為銅氧還蛋白的含藍(lán)銅蛋白家族或稱為細(xì)胞色素的含鐵(血紅素)蛋白家族的幾種細(xì)菌氧化還原蛋白都進(jìn)入包括癌細(xì)胞在內(nèi)的哺乳動物細(xì)胞中，并且誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡或通過細(xì)胞周期的Gl停滯引起生長抑制。(Yamada&a/.，CellCycle3:752-755(2004);Yamadae,a/.，CellCycle3:1182-1187(2004))。單個細(xì)菌蛋白，例如均由銅綠假單胞菌精巧產(chǎn)生的銅氧還蛋白天青蛋白或細(xì)胞色素0551，可以表現(xiàn)基于它們的疏水性的活性。因此，野生型(wt)天青蛋白在鼠J774細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(Yamada"a/.，InfectionandImmunity70:7054-7062(2002))，而突變體M44KM64E天青蛋白在J774細(xì)胞中在Gl期引起細(xì)胞周期抑制。(Yamada"a/.,PNAS101:4770-4775(2004))。相反，wt細(xì)胞色素c551在J774細(xì)胞中在Gl期引起細(xì)胞周期抑制，而突變體V23DI59E細(xì)胞色素c551誘導(dǎo)凋亡。(Hiraoka"a/.，PNAS101:6427-6432(2004))。根據(jù)本發(fā)明，令人驚奇地，現(xiàn)知曉，銅氧還蛋白和細(xì)胞色素在體外將押制人紅細(xì)胞中瘧原蟲惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥。特別地，銅氧還蛋白天青蛋白和Laz分別抑制惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥約50%和約75%。參見實施例6。另外，鐵硫菌藍(lán)蛋白和細(xì)胞色素c和f抑制寄生蟲血癥20-30%。參見實施例1。另外，現(xiàn)知曉，當(dāng)與惡性瘧原蟲的MSP1表面蛋白的PfMSP1-19片段復(fù)合時，天青蛋白具有與G17.12小鼠單克隆抗體的Fab片段具有可辨別的結(jié)構(gòu)同源性。參見實施例2。雖然不將抑制的方式限于任何一種方式，但是認(rèn)為，天青蛋白可以通過與寄生蟲表面的MSP1蛋白相互作用來抑制惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥。令人驚奇地，現(xiàn)在知道，天青蛋白和Laz都在體外結(jié)合PfMSPl-19和PfMSPl-42惡性瘧原蟲表面蛋白。另夕卜，現(xiàn)在知道，天青蛋白氨基酸殘基36-89是與PfMSPl-19和PfMSPl-42結(jié)合所需的。另外，現(xiàn)在知道，來自淋病奈瑟菌的Laz的H.8結(jié)構(gòu)域提高了融合的天青蛋白與PfMSPl-19的結(jié)合以及對惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥的抑制。參見實施例5和6。由于在銅氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，考慮其他的銅氧還蛋白將具有與天青蛋白、鐵硫菌藍(lán)蛋白或Laz相同的抗瘧疾活性。在一些實施方案中，所述銅氧還蛋白是但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、橙綠曲撓素、Laz或鐵硫菌藍(lán)蛋白。在特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白是Laz、天青蛋白或鐵硫菌藍(lán)蛋白。在其他實施方案中，所述銅氧還蛋白來自病原菌。在更特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白是天青蛋白。在特別特定的實施方案中，所述天青蛋白來自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌亞種^mYr折ozra/、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌Z2491、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌9a5或副溶血弧菌。在最特定的實施方案中，所述天青蛋白來自銅綠假單胞菌。在其他特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白包含SEQIDNO:1、2-18或21的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，已知道，銅綠假單胞菌細(xì)胞色素0551、人細(xì)胞色素c和層理席藻細(xì)胞色素f將抑制瘧疾感染的人紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥。在特定的實施方案中，所述細(xì)胞色素是來自銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素c551、人細(xì)胞色素c或細(xì)胞色素f。在其他特定的實施方案中，所述細(xì)胞色素包含SEQIDNO:2、19或20的氨基酸序列。由于在細(xì)胞色素c之間的結(jié)構(gòu)同源性，考慮其他細(xì)胞色素將具有與銅綠假單胞菌細(xì)胞色素c551和人細(xì)胞色素c相同的抗瘧疾活性。在一些實施方案中，所述細(xì)胞色素來自病原菌。在另一個特定的實施方案中，所述細(xì)胞色素抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥，更特別地，人紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥。在另一個特定的實施方案中，所述細(xì)胞色素抑制哺乳動物癌細(xì)胞，更特別地J774細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在一些實施方案中，所述肽是基本上純的。在其他實施方案中，所述肽是分離的。在一些實施方案中，所述肽少于全長銅氧還蛋白或細(xì)胞色素，且保留了銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的一些功能性特征。在一些實施方案中，所述肽保留了抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中寄生蟲血癥的能力，更特別地，抑制人紅細(xì)胞中惡性瘧原蟲感染的能力。在特定的實施方案中，所述細(xì)胞色素是銅綠假單胞菌細(xì)胞色素C5M、人細(xì)胞色素c或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞色素f，特別地是SEQIDNO:2、19和20。在另一個特定的實施方案中，所述肽不在哺乳動物中，更特別地不在人中引起免疫反應(yīng)。本發(fā)明還提供了包含至少一種肽的組合物，所述肽是銅氧還蛋白、細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。本發(fā)明還提供了包含至少一種肽的組合物，所述肽是銅氧還蛋白或銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。本發(fā)明還提供了包含至少一種肽的組合物，所述肽是細(xì)胞色素或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。在其他實施方案中，所述組合物基本上由所述肽組成。本發(fā)明還提供了包含于藥物組合物中的至少一種I太的組合物，所述肽是銅氧還蛋白、細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。由于銅氧還蛋白之間的高度結(jié)構(gòu)同源性，考慮對于抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥，其他銅氧還蛋白將具有與銅綠假單胞菌天青蛋白相同的抗瘧疾活性。在一些實施方案中，所述銅氧還蛋白是但不限于天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz或橙綠曲撓素。在特別特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白來自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌亞種cfem>i/Cara/、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌Z2491、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌9a5或副溶血弧菌。在非常特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白是來自銅綠假單胞菌的天青蛋白。在其他特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白包含SEQIDNO"、3-18或22的氨基酸序列。在其他特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白是來自腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌的Laz蛋白。本發(fā)明提供了銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的氨基酸序列變體，其與野生型多肽相比具有替代、缺失或插入的氨基酸。本發(fā)明的變體可以是野生型多肽的截短形式。在一些實施方案中，所述組合物包含肽，所述^s:由銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的少于全長野生型多肽的區(qū)組成。在一些實施方案中，所述組合物包含肽，所述肽由截短的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的超過約10個殘基，超過約15個殘基或超過約20個殘基組成。在一些實施方案中，所述組合物包含肽，所述肽由截短的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的不超過約100個殘基，不超過約50個殘基，不超過約40個氨基或不超過約30個殘基組成。在一些實施方案中，組合物包含肽，所述肽與銅氧還蛋白或細(xì)胞色素，更特別地與SEQIDNO:1-20或22具有至少約90%的氨基酸序列相同性，至少約95%的氨基酸序列相同性或至少約99%的氨基酸序列相同性。在特定的實施方案中，銅氧還蛋白的變體包含銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-89。在其他實施方案中，所述銅氧還蛋白的變體由銅綠假單胞菌天青蛋白殘基36-89組成。在其他特定的實施方案中，所述變體由不同于天青蛋白的銅氧還蛋白的等價殘基組成?？紤]可以設(shè)計與天青蛋白殘基36-89具有類似活性的其他銅氧還蛋白變體。為此，使用BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)將目標(biāo)銅氧還蛋白氨基酸序列與銅綠假單胞菌天青蛋白序列進(jìn)行排比，從而鑒定位于銅綠假單胞菌天青蛋白氨基酸序列上的相關(guān)殘基、目標(biāo)銅氧還蛋白序列上存在的等價殘基以及銅氧還蛋白的等價殘基。所述變體還包括用非天然存在的合成氨基酸制成的肽。例如，可以將非天然存在的氨基酸整合到變體肽中以延長或優(yōu)化所述組合物在血流中的半衰期。這些變體包括但不限于D,L-肽(非對映體)(Futaki"a/"J.Biol.Chem.276(8):5836-40(2001);Papo&CancerRes.64(16):5779-86(2004);Miller"a/.，Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987));含有稀有氨基酸的肽(Lee"a/.,J.Pept.Res.63(2):69-84(2004)),以及摻入含烯烴的非天然的氨基酸然后碳?xì)浠衔镝斸?hydrocarbonstapling)(Schafineister&J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);WalenskiScience305:1466-1470(2004))以及包含"3，5二氮苯甲?；?-Lys殘基的肽。在其他實施方案中，本發(fā)明的肽是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的衍生物。所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的衍生物是所述肽的化學(xué)修飾形式，使得所述肽仍保留一些基本活性。例如天青蛋白的"衍生物"可以是化學(xué)上修飾的天青蛋白，其保留了它抑制哺乳動物細(xì)胞中瘧原蟲血癥的能力。感興趣的化學(xué)修飾包括但不限于肽的酰胺化、乙?；?、硫酸化、聚乙二醇(PEG)修飾、磷酸化和糖基化。此夕卜，衍生的肽可以是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物與化合物的融合，所述化合物例如但不限于另一種肽、藥物分子或其他治療劑或藥物或可檢測的探針。感興趣的衍生物包括化學(xué)修飾形式，通過其本發(fā)明的肽和組合物在血流中的半衰期可以被延長或優(yōu)化，所述化學(xué)修飾月太(Monk&a/"BioDrugs19(4):261-78，(2005);DeFreest&a/"J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))，N-和C-末端修飾(Labrie"a/.，Clin.Invest.Med.13(5》275-8，(1990))，以及摻入含烯烴的非天然的氨基酸然后碳?xì)浠衔镝斸?Schafmeister&g/"J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenski&a/.，Science305:1466-1470(2004))完成。在一個實施方案中，將所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物被融合至來自腦膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟菌的Laz的H.8區(qū)中。這些肽的一個實例是在實施例4中描述的H.8-Paz融合蛋白。在特定的實施方案中，11.8被融合至銅氧還蛋白或細(xì)胞色素，或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的C-末端。在另一個特定的實施方案中，所述H.8區(qū)是SEQIDNO:21,或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物?？紤]本發(fā)明的組合物的肽可以是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的多于一種的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物。例如，所述肽可以是已被PEG化的天青蛋白的截短形式，因而使其既是變體又是衍生物。在一個實施方案中，使用含有帶烯烴的系物的a,(x-二取代的非天然氨基酸然后通過釕催化的烯烴易位形成全烴"環(huán)鉤"來合成本發(fā)明的肽。(ScharmeisterWa/.，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);WalenskyScience305:1466-1470(2004))。此外，作為天青蛋白的結(jié)構(gòu)等價物的肽可以與其他肽融合，從而產(chǎn)生既是結(jié)構(gòu)等價物又是衍生物的肽。這些實例僅僅是例示性的而不是限制本發(fā)明。銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以結(jié)合或可以不結(jié)合銅。在另一個實施方案中，所述肽可以是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的結(jié)構(gòu)等價物。確定銅氧還蛋白和細(xì)胞色素和其他蛋白之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性的研究的實例包括Tothe/"/.(DevelopmentalCell1:82-92(2001))。特別地，通過使用VAST算法來確定銅氧還蛋白或細(xì)胞色素和其結(jié)構(gòu)等價物之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性(Gibrat"a/.,CurrOpinStructBiol6:377國385(1996);MadejProteins23:356-3690(1995))。在特定的實施方案中，來自銅氧還蛋白或細(xì)胞色素與其結(jié)構(gòu)等價物的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值是小于約10.3，小于約10'5，或小于約10'7。在其他實施方案中，銅氧還蛋白或細(xì)胞色素和其結(jié)構(gòu)等價物之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性通過使用DALI算法(Holm&Sander,J.Mol.Biol.233:123-138(1993))來確定。在特定的實施方案中，配對結(jié)構(gòu)比較的DALIZ值是至少約3.5，至少約7.0，或至少約10.0。在另一個實施方案中，銅氧還蛋白的變體或衍生物與G17.12小鼠單克隆抗體的Fab片段具有顯著的結(jié)構(gòu)同源性。如何確定這種結(jié)構(gòu)相似性的實例可以參見實施例3。特別地，銅氧還蛋白和G17.12小鼠單克隆抗體的Fab片段之間的顯著結(jié)構(gòu)同源性可以使用VAST算法來確定(Gibrat"fl/.，id,;Madej""/.,同上)。在特定的實施方案中，來自銅氧還蛋白與G17.12小鼠單克隆抗體的Fab片段的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值可以小于約10'4，小于約l(T5，小于10'6或小于約l(T7。在其他特定的實施方案中，銅氧還蛋白與G17.12小鼠單克隆抗體的Fab片段的結(jié)構(gòu)比較的VAST值可以是大于約9，大于約〗0，大于約11或大于約12。在一些實施方案中，其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物具有銅綠假單胞菌天青蛋白、銅綠假單胞菌細(xì)胞色素c^、人細(xì)胞色素c或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞色素f的一些功能特征。在特定的實施方案中，本發(fā)明的肽抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的瘧疾的寄生蟲血癥，更特別地，抑制惡性瘧原蟲感染的人紅細(xì)胞中的惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥。本發(fā)明還提供了銅氧還蛋白和細(xì)胞色素c^的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物，其保留了抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥，更特別地抑制惡性瘧原蟲感染的人紅細(xì)胞中惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥的能力。在惡性瘧原蟲感染的人紅細(xì)胞中惡性瘧原蟲的寄生蟲血癥的抑制可以通過實施例6中描述的方法來確定。由于現(xiàn)在知道銅氧還蛋白和細(xì)胞色素能夠抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥，因此現(xiàn)在可能設(shè)計保留該抗瘧疾活性的銅氧還蛋白和細(xì)胞色素的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物。例如可以通過產(chǎn)生銅氧還蛋白和細(xì)胞色素的各種變體和衍生物"庫"，然后使用本領(lǐng)域已知的許多方法中的一種，例如實施例6中例示的方法來測試每種的抗瘧疾活性，以產(chǎn)生這些變體和衍生物?？紤]所產(chǎn)生的具有抗瘧疾活性的銅氧還蛋白和細(xì)胞色素的變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物可以代替或與本文提及的銅氧還蛋白和細(xì)胞色素一起用于本發(fā)明的方法中。這一選擇變體和衍生物的方法可以適合于本文公開的銅綠假單胞菌天青蛋白、銅綠假單胞菌細(xì)胞色素c551、人細(xì)胞色素c或藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞色素f的任何的活性。在其他實施方案中，本發(fā)明的肽抑制人紅細(xì)胞中瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。測定瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的方法是本領(lǐng)域公知的，并且一種這樣的方法在實施例2中描述。在一些實施方案中，本發(fā)明的肽以統(tǒng)計學(xué)上大于非結(jié)合對照蛋白的相對結(jié)合親和力結(jié)合PfMSPl-19和/或PMSP1-42惡性瘧原蟲表面蛋白。通過使用如實施例5中描述的表面等離子共振分析可以測試肽的該活性。測定一種蛋白是否結(jié)合另一種的其他方法是本領(lǐng)域公知的，也可以使用。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽以統(tǒng)計學(xué)上大于非結(jié)合對照蛋白的相對結(jié)合親和力結(jié)合ICAM-3或NCAM。通過使用如實施例7和5中描述的表面等離子共振分析可以測試肽的該活性。測定一種蛋白是否結(jié)合另一種的其他方法是本領(lǐng)域公知的，也可以使用。在一些特定的實施方案中，本發(fā)明的肽誘導(dǎo)哺乳動物癌細(xì)胞，更特別地J774細(xì)胞中的凋亡。肽誘導(dǎo)凋亡的能力可以通過使用(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto，California,U.S.A.)用mitosensorApoAlertTM共焦顯微術(shù)、通過使用Zou"a/.(J.Biol.Chem.21A:11549-11556(1999))中描述的方法測量caspase-8、caspase-9和caspase-3活性以及通過使用例如APOLERTDNA片段試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto，California,U.S.A.)檢測凋亡誘導(dǎo)的核DNA片段來觀察。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的^:誘導(dǎo)哺乳動物癌細(xì)胞，更特別地J774細(xì)胞中的細(xì)胞生長停滯。細(xì)胞生長停滯可以通過測量細(xì)胞周期進(jìn)展的抑制程度，例如通過YamadaW(PNAS101:4770-4775(2004))中的方法來測定。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的肽抑制哺乳動物癌細(xì)胞，更特別地J774細(xì)胞中的細(xì)胞周期進(jìn)展。銅氧還蛋白這些小的藍(lán)銅蛋白(銅氧還蛋白)是參與細(xì)菌電子傳遞鏈的電子傳遞蛋白(10-20kDa)或未知功能的蛋白。銅離子由蛋白基質(zhì)單獨地結(jié)合。對銅的兩個組氨酸和一個半胱氨酸配體的特殊扭曲的三角平面排列產(chǎn)生了金屬位點的非常特異的電子性質(zhì)和強(qiáng)烈的藍(lán)色。已經(jīng)在中到高分辨率下從結(jié)晶學(xué)上表征了大量的銅氧還蛋白。所述銅氧還蛋白一般具有低的序列同源性，但具有高的結(jié)構(gòu)同源性。(Gough&Clothia,Structure12:917-925(2004);DeRienzoProteinScience9:1439-1454(2000),)。例如，天青蛋白的氨基酸序列與橙綠曲撓素B有31c/。的相同性，與鐵硫菌藍(lán)蛋白有16.3%的相同性，與質(zhì)體藍(lán)素有20.3%的相同性以及與假天青蛋白有17.3%的相同性。見表l。然而，這些蛋白的結(jié)構(gòu)相tl性是更顯著的。天青蛋白與橙綠曲撓素B的結(jié)構(gòu)比較的VASTp值是10，天青蛋白與鐵硫菌藍(lán)蛋白的是10'5,天青蛋白與質(zhì)體藍(lán)素的是l(T56，而天青蛋白與假天青蛋白的是10'41。所有的銅氧還蛋白都具有八鏈的希臘鑰匙(Greekkey)|3-桶狀或p-夾心折疊，并且具有高度保守的位點結(jié)構(gòu)。(DeRienzo"a/.，ProteinScience9:1439-1454(2000).)。在天青蛋白、花青苷、藍(lán)細(xì)菌質(zhì)體藍(lán)素、黃瓜堿性蛋白的銅位點的周圍存在著因許多長鏈脂肪族殘基例如甲硫氨酸和亮氨酸的存在而顯著疏水性補(bǔ)片(patch)，而在假天青蛋白和真核的質(zhì)體藍(lán)素周圍存在較少程度的疏水性補(bǔ)片。同上。在星形花青苷和鐵硫菌藍(lán)蛋白銅位點中也較小程度地發(fā)現(xiàn)疏水性補(bǔ)片，但具有不同的特征。同上。表1:使用VAST算法的來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(1JZG)與其他蛋白的序列和結(jié)構(gòu)排比。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>1IUZ741KGYE901PMY7520.310e-5.610.32.35.610e-4.610.13.417,310e-4.19.82.3質(zhì)體藍(lán)素Ephrinb2假天青蛋白'排比長度在兩個結(jié)構(gòu)之間重合的等價C-a原子對的數(shù)目，即多少殘基己被用于計算3D重合。2P-VAL:VASTp值是比較的顯著性的量度，表示為概率。例如，如果p值是0.001，則純偶然看到這種質(zhì)量的配對的幾率為1000:1。對多重比較的效果，使用該假設(shè)即MMDB數(shù)據(jù)庫中的500種獨立和無關(guān)的結(jié)構(gòu)域類型來調(diào)整VAST的p值。因此，所示的p值相應(yīng)于除以500的每個結(jié)構(gòu)域?qū)Φ某蓪Ρ容^的p值。3分值VAST結(jié)構(gòu)相似性分值。這個數(shù)字與重合的二級結(jié)構(gòu)元件的數(shù)目和重合的質(zhì)量相關(guān)。更高的VAST分值與更高的相似相關(guān)。4RMSD:單位為埃的均方根重合余數(shù)。在兩個結(jié)構(gòu)的最佳重合之后，將該數(shù)計算作等價的C-a原子之間的均方距離的平方根。注意到，RMSD值與結(jié)構(gòu)排比的程度成比例，并且當(dāng)使用RMSD作為總體結(jié)構(gòu)相似性的描述符時，必需考慮這個大小。5秀麗線蟲(Ce/eg"m)主要精子蛋白被證明是卵母細(xì)胞成熟中的ephrin拮抗齊U(Kuwabara,2003"ThemultifacetedC.elegansmajorspermprotein:anephrinsignallingantagonistinoocytematuration"C7eweyawe/Deve/o/we/^，17:155-161。天青蛋白天青蛋白是128個氨基酸殘基的含銅蛋白，其屬于參與植物和某些細(xì)菌中電子傳遞的銅氧還蛋白家族。天青蛋白包括來自銅綠假單胞菌(PA)(SEQIDNO:1)、氧化木糖無色桿菌和反硝化產(chǎn)堿菌04.tfew/n;/7ca"力(SEQIDNO:8)的天青蛋白。(MurphyWa/.，J,Mol.Biol.315:859-871(2002))。天青蛋白之間的氨基酸序列相同性在60-90%之間變動，這些蛋白顯示了強(qiáng)的結(jié)構(gòu)同源性。所有的天青蛋白都具有帶希臘鑰匙基序的特征性p-夾心結(jié)構(gòu)，單個銅原子總是位于蛋白的相同區(qū)域。此外，天青蛋白具有圍繞銅位點的基本上中性的疏水性補(bǔ)片。同上。質(zhì)體藍(lán)素質(zhì)體藍(lán)素是藍(lán)細(xì)菌、藻類和植物的可溶性蛋白，其每個分子含有一分子銅且其氧化形式是藍(lán)色的。它們存在于葉綠體中，其中它們作為電子載體起作用。自在1978年確定白楊質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)以來，通過結(jié)晶學(xué)或NMR方法已經(jīng)確定了藻類(斜生柵藻(&e"eJ^mw力、滸苔屬(￡"terawor//w)、衣藻(CWaw;^(7/wcway))和植物(法國菜豆)質(zhì)體藍(lán)素的結(jié)構(gòu)，白楊的結(jié)構(gòu)已經(jīng)精細(xì)到1.33埃分辨率。SEQIDNO:4顯示來自嗜熱藍(lán)細(xì)菌層理席藻的質(zhì)體藍(lán)素的氨基酸序列。盡管在藻類和脈管植物的質(zhì)體藍(lán)素之間存在序列差異性(例如在衣滴蟲屬(CW"m^o附o""力和白楊蛋白之間有62%的序列相同性)，但是三維結(jié)構(gòu)是保守的(例如在衣滴蟲目和白楊蛋白之間的Ca位置有0.76埃的均方根偏差)。結(jié)構(gòu)特征包括在八鏈反向平行P-桶的一末端的扭曲的四面體銅結(jié)合位點、明顯的負(fù)片段以及平坦的疏水性表面。為其電子轉(zhuǎn)移功能銅位點被優(yōu)化，認(rèn)為負(fù)性、疏水性補(bǔ)片參與了生理反應(yīng)配偶體的識別。化學(xué)修飾、交聯(lián)和定點誘變實驗已經(jīng)證實了負(fù)性、疏水性補(bǔ)片在與細(xì)胞色素f的結(jié)合相互作用中的重要性，并且證實了涉及質(zhì)體藍(lán)素的兩個功能上顯著的電子轉(zhuǎn)移途徑的模型。一個推定的電子轉(zhuǎn)移途徑是相對短的(大約4埃)，涉及疏水性補(bǔ)片中溶劑暴露的銅配體His-87，而另一個是較長的(約12-15埃)，涉及負(fù)性片段中的近保守殘基Tyr-83,Redinbo，J.Bioenerg.Biomembr.26:49-66(1994)。鐵硫菌藍(lán)蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白是從硫桿菌(現(xiàn)在稱為酸硫桿狀菌(^cW^o6ac!7/i^))獲得的含藍(lán)銅的單鏈多肽。通過多波長異常衍射已經(jīng)確定了來自氧化亞鐵硫桿菌的極為穩(wěn)定和高度氧化的銅氧還蛋白鐵硫菌藍(lán)蛋白(SEQIDNO:5)的氧化形式的X射線晶體結(jié)構(gòu)，并精細(xì)到1.9埃的分辨率。鐵硫菌藍(lán)蛋白由核心P-夾心折疊構(gòu)成，所述核心卩-夾心折疊由六鏈和七鏈的P-片層組成。與其他銅氧還蛋白一樣，銅離子由一簇按扭曲四面體排列的四個保守殘基(His85、Cysl38、Hisl43、Metl48)配位。Walter,R丄."a/.,J.Mol.Biol"vol.263，pp-730-51(1996)。假天青蛋白假天青蛋白是含藍(lán)銅的單鏈多肽家族。來自裂環(huán)無色桿菌的假天青蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:6中示出。假天青蛋白的X射線結(jié)構(gòu)分析表明，它與天青蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)，但在這些蛋白之間具有低的序列同源性。假天青蛋白和天青蛋白的整體結(jié)構(gòu)之間存在兩個主要差異。相對于天青蛋白，在假天青蛋白中存在由兩個a螺旋構(gòu)成的羧基末端延伸。在中間肽區(qū)中，天青蛋白含有延伸的環(huán)，在假天青蛋白中被縮短，其形成含有短a-螺旋的瓣片(flap)。銅原子位點的唯一的主要差異是MET側(cè)鏈的構(gòu)象和Met-S銅鍵長度，其在假天青蛋白中比在天青蛋白中顯著小。植物花青苷(Phytocyanin)可鑒定為植物花青苷的蛋白包括但不限于黃瓜堿性蛋白、星形花青苷、mavicyanin、umecyanin、黃瓜皮銅氧還蛋白、豌豆莢內(nèi)推定的藍(lán)銅蛋白和來自擬南芥(血^說，戸&仏^Vm")甲硫氨酸配體被谷氨酰胺替代。橙綠曲撓素已經(jīng)從嗜熱綠色滑行光合細(xì)菌橙色綠屈撓菌中分離出來三種稱為橙綠曲撓素A、橙綠曲撓素B-1和橙綠曲撓素B-2的小的藍(lán)銅蛋白。兩個B形式是糖蛋白，其彼此具有幾乎相同的性質(zhì)，但不同于A形式。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳表明表觀單體分子量是14(A)、18(B-2)和22(B曙l)kDa。已經(jīng)確定了橙綠曲撓素A的氨基酸序列，并證明橙綠曲撓素A是139個殘基的多肽。(VanDreisscheefProteinScience8:947-957(1999).)。如果它們是已知的小銅蛋白質(zhì)體藍(lán)素和天青蛋白中進(jìn)化保守的金屬配體，則His58、Cysl23、Hisl28和Metl32以預(yù)期的方式間隔。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測也表明，橙綠曲撓素具有類似于來自銅綠假單胞菌的天青蛋白和來自白楊葉的質(zhì)體藍(lán)素的一般P-桶狀結(jié)構(gòu)。然而，橙綠曲撓素看起來具有兩種小銅蛋白序列種類的序列特征。與天青蛋白的共有序列的總體相似性大致與同質(zhì)體藍(lán)素的共有序列的總體相似性相同，即30.5%。橙綠曲撓素的N-末端序列區(qū)l-18顯著富含甘氨酸和羥基氨基酸。同上。參見來自橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素A鏈的例示性氨基酸序列SEQIDNO:16(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫編號No.AAM12874)。橙綠曲撓素B分子具有標(biāo)準(zhǔn)的銅氧還蛋白折疊。已經(jīng)研究了來自橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素B的晶體結(jié)構(gòu)。(Bondeffl/.，J.MotBiol.306:47-67(2001).)。除另外的N-末端鏈之外，該分子與細(xì)菌銅氧還蛋白、天青蛋白的結(jié)構(gòu)非常相似。如在其他銅氧還蛋白中一樣，一個Oi配體在多肽的鏈4上，而其它三個配體位于鏈7和8之間的大環(huán)上。參考后三個配體之間的氨基酸間隔討論Cu位點的幾何結(jié)構(gòu)。晶體學(xué)表征的橙綠曲撓素B的Cu結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能通過N-末端尾部系到細(xì)胞質(zhì)膜的胞漿側(cè)，所述N-末端尾部表現(xiàn)與一些其他的膜相關(guān)電子傳遞蛋白中已知的系物(tether)顯著的序列相同性。B形式的氨基酸序列在McManus"a/.(J.BiolChem.267:653l-6540(1992))中描述。參見來自橙色綠屈撓菌的橙綠曲撓素B鏈的例示性氨基酸序列SEQIDNO:17(NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫編號No.IQHQA)。星形花青苷星形花青苷是植物銅氧還蛋白的遍在家族植物花青苷的亞類。星形花青苷的例示性的序列本文包括SEQIDNO:15。來自辣根的星形花青苷豆藍(lán)蛋白(Koch^a/.，J.Am.Chem.Soc.127:158-166(2005))和黃瓜星形花青苷(Hartelal,ProteinScience5:2175-2183(1996))的晶體結(jié)構(gòu)。該蛋白具有與其他植物花青苷相tl的所有折疊。ephrinB2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)具有與星形花青苷顯著的相似性。(TothW<DevelopmentalCell1:83-92(2001).)。星形花青苷的例示性的氨基酸序列參見國立生物技術(shù)信息中心蛋白數(shù)據(jù)庫中的編號No.1JER，SEQIDNO:15。黃瓜堿性蛋白來自黃瓜堿性蛋白的例示性的氨基酸序列本文包括SEQIDNO:18。為I型藍(lán)銅蛋白的黃瓜堿性蛋白(CBP)的晶體結(jié)構(gòu)已精細(xì)到1.8埃分辨率。該分子類似于其他藍(lán)銅蛋白，具有希臘鑰匙P-桶狀結(jié)構(gòu)，只是桶在一側(cè)開口，更好地稱作"|3-夾心"或"|3-巻"。(Guss&a/.,J.Mo1Biol.262:686-705(1996).)。ephrinB2蛋白胞外結(jié)構(gòu)域三級結(jié)構(gòu)與黃瓜堿性蛋白具有高度的相似性(50個a碳的均方根偏差1.5埃)。(Toth"a/.,DevelopmentalCell1:83-92(2001).)。Cu原子具有通常藍(lán)銅NNSS共配位，鍵長Cu-N(His39)=1.93埃、Cu-S(Cys79)=2.16埃、Cu-N(His84)=1.95埃、Cu-S(Met89"2.61埃。二硫鍵(Cys52)-S-S-(Cys85)在穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)中看起來起到重要作用。多^:折疊是藍(lán)銅蛋白亞家族(植物花青苷)以及非金屬蛋白質(zhì)豚草過敏原Ra3所典型具有的，豚草過敏原Ra3與CBP具有高度的序列相同性。目前被鑒定為植物花青苷的蛋白是CBP、星形花青苷、mavicyanin、umecyanin、黃瓜皮銅氧還蛋白、豌豆莢內(nèi)推定的藍(lán)銅蛋白以及來自擬南芥的藍(lán)銅蛋白。在除了CBP和豌豆莢蛋白之外的所有蛋白中，通常存在于藍(lán)銅位點的軸性甲硫氨酸配體被谷氨酰胺替代。黃瓜堿性蛋白的例示性序列見NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫編號No.2CBP,SEQIDNO:18。細(xì)胞色素細(xì)胞色素C^來自銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素C551(Pa-C^)是82個氨基酸殘基的單體氧化還原蛋白(SEQIDNO:2)，其作為亞硝酸還原酶的生理電子供體參與異化反硝化作用。Pa-C551的功能性質(zhì)己經(jīng)被廣泛地研究。與非生理的小的無機(jī)氧化還原反應(yīng)物以及與其他大分子如藍(lán)銅蛋白、真核的細(xì)胞色素c和生理配偶體亞硝酸還原酶的反應(yīng)提供了對蛋白-蛋白電子轉(zhuǎn)移的測試。作為細(xì)菌I類細(xì)胞色素的成員的Pa-C551的三維結(jié)構(gòu)顯示了具有His-Met連接的單個低自旋血紅素和典型的多肽折疊，不過其留下暴露的血紅素吡咯環(huán)II和III邊緣(CutruzzolaeZa/.,J.Inorgan.Chem.88:353-61(2002))。哺乳動物I類細(xì)胞色素中存在的20殘基w環(huán)的缺乏在丙酸鹽水平下引起血紅素邊緣的進(jìn)一步暴露。Pa-C^表面的帶電殘基分布是非常各向異性的一側(cè)富含酸性殘基，而另一側(cè)具有主要是賴氨酸的陽性側(cè)鏈的環(huán)，其位于圍繞血紅素裂隙的疏水性補(bǔ)片的邊界。這個片段包含殘基Glyll、Vall3、Alal4、Met22、Val23、Pro58、Ile59、Pro60、Pro62、Pro63和Ala65。各向異性的電荷分布產(chǎn)生大的偶極矩，其對于電子轉(zhuǎn)移復(fù)合物形成是重要的。以上對Pa-C551描述的電荷分布已經(jīng)在其他電子轉(zhuǎn)移蛋白和它們的電子受體中報道。此外，疏水性或帶電片段內(nèi)的殘基的定點誘變修飾已表明對于不同的蛋白而言表面互補(bǔ)性對于結(jié)合和電子轉(zhuǎn)移的重要性。例如。疏水性補(bǔ)片對于來自銅綠假單胞菌的天青蛋白的電子轉(zhuǎn)移性質(zhì)的相關(guān)性的證據(jù)來自對殘基Met44和Met64轉(zhuǎn)變?yōu)閹д姾拓?fù)電氨基酸的突變體進(jìn)行的研究。同上。細(xì)胞色素c型結(jié)構(gòu)域具有由用來包圍疏水性口袋內(nèi)共價結(jié)合的血紅素的一系列a螺旋和反向轉(zhuǎn)角構(gòu)成的折疊。這個結(jié)構(gòu)域可以在單結(jié)構(gòu)域細(xì)胞色素c蛋白例如細(xì)胞色素c6、細(xì)胞色素c552、細(xì)胞色素C459和線粒體細(xì)胞色素c中發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞色素c型結(jié)構(gòu)域存在于許多其他蛋白中，例如在細(xì)胞色素cdl-亞硝酸還原酶中作為N-末端血紅素c結(jié)構(gòu)域，在醌蛋白乙醇脫氫酶中作為C-末端結(jié)構(gòu)域，在醌血紅素蛋白胺脫氫酶A鏈中作為結(jié)構(gòu)域1和2，以及在細(xì)胞色素bCl復(fù)合物中作為細(xì)胞色素bCl結(jié)構(gòu)域。VAST算法的結(jié)構(gòu)分析(來自銅綠假單胞菌的細(xì)胞色素c551作為查詢物)顯示僅對細(xì)胞色素類具有顯著的結(jié)構(gòu)鄰近(P值在10—1()'3到10-4'5之間)。使用方法本發(fā)明提供了治療具有瘧疾感染或存在獲得感染風(fēng)險的患者的方法，或抑制瘧原蟲的傳播的方法。這些方法包括向患者或昆蟲媒介給藥抑制瘧疾感染的哺乳動物細(xì)胞的寄生蟲血癥的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。寄生蟲血癥的抑制可以通過本領(lǐng)域公知的許多方法來測定。在實施例6中描述了一種方法，測定了瘧疾感染的人紅細(xì)胞中寄生蟲血癥的抑制。在其他實施方案中，所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物抑制人紅細(xì)胞中瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，并且將其給藥于患者或昆蟲媒介。測定瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的方法是本領(lǐng)域公知的，一種這樣的方法在實施例2中描述。本發(fā)明的方式不限于任何特定的機(jī)制，寄生蟲血癥的抑制可以由許多因素引起，所述因素包括但不限于抑制感染的血細(xì)胞中寄生蟲的復(fù)制、抑制寄生蟲感染未感染的血細(xì)胞、抑制寄生蟲生長周期的抑制以及抑制寄生蟲進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明提供通過給藥有效量的至少一種蛋白治療遭受瘧原蟲感染的患者的方法，所述蛋白是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。可以通過該方法治療的患者是可能被瘧原蟲感染的任何哺乳動物，特別是人患者。已知感染哺乳動物的瘧原蟲包括但不限于惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、伯氏瘧原蟲(P&^/^/)(嚙齒動物特異性的)、約氏瘧原蟲(P"e///)(鼠特異性的)、食蟹猴瘧原蟲(PC"O膨/g0和諾氏瘧原蟲(P^70WW)(猴特異性的)。還已知,銅氧還蛋白和細(xì)胞色素C55,針對HIV-1感染也是有效的，如在共同提交的申請"CompositionsAndMethodsForTreatingHIVInfection>VithCupredoxinAndCytochromec"美國臨時專利申i青_中所公開的，將其公開內(nèi)容明確地引入本文作為參考。另外，HIV和瘧疾的共感染在世界的許多區(qū)域，特別是亞撒哈拉非洲是非常常見的。在一些實施方案中，遭受瘧原蟲感染的患者也遭受HIV感染。在一些實施方案中，本發(fā)明的治療方法還包括給藥抗HIV藥。在一些實施方案中，將抗HIV藥聯(lián)合給藥。本發(fā)明還提供通過給藥有效量的至少一種肽治療疑似已經(jīng)接觸瘧原蟲的患者的方法，所述肽是銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物。例如，如果患者生活在或旅游過其它患者的瘧疾感染是常見的世界區(qū)域，則患者可以疑似己經(jīng)與瘧原蟲接觸。該方法的治療可以在患者將要或已經(jīng)與瘧原蟲接觸時開始。與瘧原蟲的接觸最常見通過與昆蟲媒介例如蚊的接觸發(fā)生，因而認(rèn)為這些昆蟲和瘧原蟲豐富的區(qū)域?qū)儆诨颊邔⒂懈吒怕式佑|瘧原蟲的區(qū)域。世界上這些區(qū)域包括但不限于非洲、亞洲和拉丁美洲的部分。另外，如果患者與被瘧原蟲感染的血液接觸，或有意地暴露于瘧原蟲，或偶然地注射了被寄生蟲污染的血液或藥物，則患者可以疑似已經(jīng)與瘧原蟲接觸。銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多途徑和許多方式給藥于患者。在特定的實施方案中，所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物經(jīng)口服、局部、通過吸入、通過注射給藥，更具體地，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥。在一個實施方案中，所述方法可以包括向患者聯(lián)合給藥一個單位劑量的包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物和一個單位劑量的包含抗瘧藥和/或抗HIV藥的組合物，以任何順序。這些組合物可以在大約相同的時間或在給藥另一個之后的大約給定時間內(nèi)給藥，例如，另一個后的約1分鐘到約60分鐘，或約1小時到約12小時。本發(fā)明還提供通過向所述群體中的昆蟲媒介給藥銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物中的至少一種來抑制攜帶瘧原蟲的昆蟲媒介群體中瘧原蟲傳播的方法，其量為有效降低共存哺乳動物群體中寄生蟲傳染性的量。在特定的實施方案中，所述昆蟲媒介是蚊，更特別地是來自瘧蚊(^zc;p^/^gam^e)屬的蚊。在該方法中，銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的給藥可伴隨有將所述肽置于所述昆蟲媒介將要消費的組合物中，不過使所述肽與昆蟲媒介中的瘧原蟲的腸道接觸的任何方式都被考慮。向產(chǎn)生該消費的昆蟲群體給藥化學(xué)物質(zhì)的許多方法是本領(lǐng)域已知的。在另一個實施方案中，從一只蚊傳到另一只的可傳播遺傳元件將可操作地連接到與組成型啟動子可操作地連接的銅氧還蛋白編碼序列，銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物將在被惡性瘧原蟲感染的瘧蚊內(nèi)產(chǎn)生，并將干擾惡性瘧原蟲在蚊中的復(fù)制/存活。向昆蟲媒介給藥所述肽的其他方式包括但不限于將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或者銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物基因融合到來自通常被所述昆蟲消費的其他蛋白的基因上。給藥于昆蟲媒介的肽的量應(yīng)當(dāng)是當(dāng)所述昆蟲媒介與哺乳動物接觸時有效降低哺乳動物中瘧原蟲傳染性的量。在特定的實施方案中，給藥量應(yīng)當(dāng)是當(dāng)所述昆蟲媒介與人接觸時有效降低瘧原蟲傳染性的量。蚊幼蟲適用于本發(fā)明，優(yōu)選地，所使用的啟動子是強(qiáng)啟動子?？色@得兩種替換性的啟動子供使用可誘導(dǎo)的和組成型啟動子?？烧T導(dǎo)的啟動子包括例如熱休克啟動子。優(yōu)選地，所述熱休克啟動子是昆蟲熱休克啟動子，例如黑腹果蠅CDraso;/n7ame/a"ogmfw)hsp70啟動子，其能夠驅(qū)動基因在包括地中海果蠅在內(nèi)的異源生物體中的表達(dá)。本發(fā)明還涵蓋使用地中海果蠅hsp70啟動子(Papadimitrioueffl/.，InsectMolBiol7:279-90(1998))?？蛇x擇的系統(tǒng)可以基于使用抗生素四環(huán)素誘導(dǎo)。(HeinrichandScott,PNAS97:8229-8232，(2000))。熱休克啟動子可以通過提高地中海果蠅培養(yǎng)的條件的溫度來誘導(dǎo)。例如，在23-25'C下，hsp70啟動子是低水平活性的或根本沒有活性。這容許昆蟲幼蟲發(fā)育，而沒有由異源蛋白生成所誘導(dǎo)的應(yīng)激。然而，在高的溫度下，例如37-42'C下，hsp70啟動子被誘導(dǎo)并且以高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)?？筛鶕?jù)已知的可誘導(dǎo)基因控制元件構(gòu)建可誘導(dǎo)啟動子。例如，可以通過組合對藥物或激素反應(yīng)的元件構(gòu)建可誘導(dǎo)啟動子，所述藥物或激素可以在膳食中給藥。在優(yōu)選的實施方案中，人雌激素反應(yīng)元件(ERE)可以用于調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，條件是用表達(dá)人雌激素受體的第二編碼序列轉(zhuǎn)化昆蟲。組成型啟動子也可以用于表達(dá)昆蟲幼蟲中需要的該蛋白和/或其他蛋白。例如，組成型啟動子可以是細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白啟動子。已經(jīng)克隆出了黑腹果蠅細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白啟動子(Act5C)，并且在蚊中是高活性的(HuynhandZieler，J.Mol.Biol.288:13-20(1999))。細(xì)胞質(zhì)肌動蛋白基因和它們的啟動子也可以從包括地中海果蠅在內(nèi)的其他昆蟲中分離。其他實例包括細(xì)胞質(zhì)微管蛋白啟動子，例如地中海果蠅細(xì)胞質(zhì)微管蛋白啟動子?？梢允褂每刂品置诙嚯牡膯幼?，任選與合適的信號序列一起使用，以指導(dǎo)蛋白向血淋巴的分泌。例如，可以采用幼蟲的血清蛋白啟動子(Benes"a/"Mol.Gen.Genet249(5):545畫556(1995))。蚊的大規(guī)模繁殖技術(shù)被高度開發(fā)。對于蛋白質(zhì)生產(chǎn)，在不同時間啟動的幼蟲培養(yǎng)物可以通過合適的溫度變化方案來同步。由于生長速度取決于環(huán)境的溫度，因此這是可能的；在18'C下幼蟲的生長速度降低約50%。包含銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物的藥物組合物包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的藥物組合物可以以任何常規(guī)的方式例如通過常規(guī)的混合、溶解、制粒、制錠、乳化、包囊、包埋(entrapping)或凍干方法制備。基本上純的銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體、衍生物和結(jié)構(gòu)等價物可以容易地與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受的載體組合。這些載體使得制品被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿、漿液、混懸劑等。適合的載體或賦形劑還可以包括例如填充劑和纖維素制品。其他賦形劑可以包括例如調(diào)味劑、著色劑、防粘劑、增稠劑和其他可接受的添加劑、助劑或粘合劑。在一些實施方案中，所述藥物制劑基本上不含防腐劑。在其他實施方案中，所述藥物制劑可以含有至少一種防腐劑。藥物劑型的一般性方法參見Anselefa/.，PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(LippencottWilliams&Wilkins，BaltimoreMD(1999))。本發(fā)明中使用的包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物可以以各種方式包括通過注射(例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)等)、通過吸入、通過局部給藥、通過栓劑、通過使用經(jīng)皮貼劑或通過口服給藥。關(guān)于藥物遞送系統(tǒng)的一般信息可以參見Ansel同上。在一些實施方案中，可以配制包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物并直接作為注射劑使用，特別是用于皮下和靜脈內(nèi)注射使用。特別地，可注射的制劑可以有益地用于治療存在瘧疾感染風(fēng)險、可能有瘧疾感染或已經(jīng)有瘧疾感染的患者。包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物也可以在與保護(hù)劑例如聚丙二醇或類似包衣劑混合后口服給藥。當(dāng)通過注射給藥時，可以將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物配制在水性溶液中，特別是在生理學(xué)相容的緩沖液例如Hanks液、林格液或生理鹽水緩沖液中。該溶液可包含配制劑例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物可以是粉未形式用于在使用前用適合的賦形劑例如無菌無熱原水配制。在一些實施方案中，所述藥物組合物不含被添加以增強(qiáng)肽刺激的免疫反應(yīng)的佐劑或任何其他物質(zhì)。在一些實施方案中，所述藥物組合物包含抑制對肽的免疫反應(yīng)的物質(zhì)。當(dāng)通過靜脈內(nèi)液體給藥時，用于給藥所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的靜脈內(nèi)液體可以由晶體或膠體組成。本文所用的晶體是無機(jī)鹽或其他水溶性分子的水溶液。本文所用的膠體含有大的不溶性分子例如明膠。靜脈內(nèi)液體可能是無菌的?？梢杂糜陟o脈內(nèi)給藥的晶體液體包括但不限于生理鹽水(濃度為0.9%的氯化鈉溶液)、林格乳酸液或林格液以及于水中的5%葡萄糖溶液(有時稱為D5W)，如表2中所述。表2.常見的晶體溶液的組成溶液其他名稱[ci-][葡萄糖]D5W5%葡萄糖002522/3&1/33.3%葡萄糖/0.3%鹽水5151168半生理鹽水0.45%NaCl77770生理鹽水0.9%NaCl1541540林格乳酸液*林格溶液1301090*林格乳酸液還具有28mmol/L乳酸、4mmol/LK+和3mmoI/LCa2+。當(dāng)通過吸入給藥時，可以使用適合的拋射劑例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲垸、二氧化碳或其他適合的氣體將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物從加壓的包裝或噴霧器中以氣霧噴霧劑的形式遞送。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過提供閥門以遞送計量的量來確定。例如，用于吸入器或吹入器中的如明膠的膠囊和藥筒可以配制為含有蛋白和適當(dāng)?shù)姆勰┗|(zhì)如乳糖或淀粉的粉末混合物。當(dāng)通過局部給藥來給藥時，可以將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物配制為溶液劑、凝膠劑、軟膏劑、乳膏劑、混懸劑等，如本領(lǐng)域公知的那些。在一些實施方案中，通過經(jīng)皮貼劑的方式給藥。當(dāng)通過栓劑(例如直腸或陰道)給藥時，還可以將銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素c和其變體和衍生物組分配制在含有常規(guī)栓劑基質(zhì)的組合物中。當(dāng)口服給藥時，可以通過將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)可接受的載體組合而容易地配制所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物?？梢圆捎霉腆w載體，例如甘露糖醇、乳糖、硬脂酸鎂等；這些載體能夠使銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、漿液劑、混懸劑等，用于要治療的個體口服攝取。對于口服固體制劑，例如粉未、膠囊和片劑，適合的賦形劑包括填充劑例如糖、纖維素制品、成粒劑和粘合劑。本領(lǐng)域公知的其他方便的載體還包括多價載體，例如細(xì)菌莢膜多糖、葡聚糖或遺傳工程化載體。此外，包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的緩釋制劑允許在長的時間內(nèi)釋放銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，使得沒有所述緩釋制劑時，則所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物將在引發(fā)或增強(qiáng)治療效果之前從個體的系統(tǒng)清除和/或被例如蛋白酶和簡單的水解作用降解?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一些方法延長或優(yōu)化本發(fā)明的組合物在血流中的半衰期，所述方法包括但不限于環(huán)化的月太(Monkef"/.，BioDrugs19(4):261-78,(2005);DeFreestd"/.,J.Pept.Res.63(5):409-19(2004))，D，L-肽(非對映體)，(FutakiefW.，J.Biol.Chem.Feb23;276(8):5836-40(2001);Papo"a/"CancerRes.64(16):5779-86(2004);Miller"a/.,Biochem.Pharmacol.36(1):169-76,(1987》；含有稀有氨基酸的肽(Lee"J.P印tRes.63(2):69-84(2004))，N-和C畫末端修飾(LabrieWa/.，Clin.InvestMed.13(5):275-8，(1990))，以及碳?xì)浠衔镝斸?Schafineister"a/.，J.Am.Chem.Soc.122:5891-5892(2000);Walenski"a/.，Science305:1466-1470(2004))。特別感興趣的是經(jīng)D-取代或L-氨基酸取代的d-異構(gòu)化(取代)和肽穩(wěn)定性修飾以及碳?xì)浠衔镝斸?。在各種實施方案中，所述藥物組合物包括載體和賦形劑(包括但不限于緩沖劑、碳水化合物、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸，例如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑、助懸劑、增稠劑和/或防腐劑)、水、油、鹽水溶液、含水葡萄糖和甘油溶液，近似生理條件所需的其他藥學(xué)可接受的輔助物質(zhì)例如緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑等。要認(rèn)識到，雖然可以采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何適合的載體給藥本發(fā)明的組合物，但是載體的類型將取決于給藥的方式而變化。化合物也可以使用公知的技術(shù)包封在脂質(zhì)體內(nèi)。也可以采用可生物降解的微球作為載體用于本發(fā)明的藥物組合物。例如，在美國專利4，897，268;5,075,109;5,928,647;5,811,128;5,820,883;5,853,763;5，814，344和5，942，252中公開了適合的可生物降解的微球。所述藥物組合物可以通過常規(guī)的公知滅菌技術(shù)來滅菌，或可以無菌過濾。獲得的水溶液可以被包裝原樣使用，或被凍干，凍干制劑在給藥之前與無菌溶液混合。銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物的給藥可以將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物配制為藥物組合物來給藥，并通過任何適合的途徑例如通過口服、口含、吸入、舌下、直腸、陰道、經(jīng)尿道、鼻、局部、經(jīng)皮或胃腸外(包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和冠狀動脈內(nèi))給藥。其藥物制劑可以以有效實現(xiàn)其目的的任何量給藥。更特別地，所述組合物以治療有效量給藥。在特定的實施方案中，治療有效量一般是約0.01-20mg/日/kg體重。包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物單獨地或與其他活性劑組合用于治療和/或預(yù)防瘧疾感染。適合的劑量當(dāng)然將取決于例如所采用的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物、主體、給藥方式和要治療的病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重度而變化。然而，一般地，指示約0.01-20tng/kg體重的日劑量在人中獲得令人滿意的結(jié)果。人中指示的日劑量為約0.7mg至約1400mg銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c^或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的化合物，其以例如日劑量、周劑量、月劑量和/或連續(xù)給藥來方便給予。日劑量可以是每日1至12次的不連續(xù)劑量。或者，劑量可以每隔一日、每三日、每四日、每五日、每六日、每周，和類似地天數(shù)增加至31日給藥?；蛘?，給藥可以是持續(xù)的，其通過使用貼劑、靜脈內(nèi)給藥等進(jìn)行。在一些實施方案中，向患者引入銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的方法通過銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物與其他用于瘧疾治療的藥物的聯(lián)合給藥進(jìn)行。這些方法是本領(lǐng)域中公知的。在特定的實施方案中，銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素c是含有其他瘧疾治療劑的雞尾酒(cocktail)或與其他瘧疾治療劑的聯(lián)合給藥的一部分。感興趣的瘧疾治療劑包括但不限于氯胍、氯丙胍、三甲氧芐二氨嘧啶、氯喹、甲氟喹、苯芴醇、阿托伐醌、乙胺嘧啶-磺胺多辛、乙胺嘧啶-氨苯砜、鹵泛群、奎寧、奎尼丁、氨酚喹、阿莫吡喹、磺胺、青蒿素、阿替夫林、蒿甲醚、青蒿琥酯、伯氨喹、咯萘啶、氯胍、氯喹、甲氟喹、乙胺嘧啶-磺胺多辛、乙胺嘧啶-氨苯砜、鹵泛群、奎寧、氯胍、氯喹、甲氟喹、1，16-十六亞甲基(N-甲基吡咯烷鎗)二溴化物和其組合。在一些實施方案中，向患者引入銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c551或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的方法與目前用于引入抗HIV藥例如含蛋白酶抑制劑的雞尾酒的方法相同。這些方法是本領(lǐng)域公知的。在特定的實施方案中，銅氧還蛋白或細(xì)胞色素C5M或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物是具有抗HIV治療劑的雞尾酒或與抗HIV治療劑聯(lián)合給藥的部分?？笻IV藥包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT(齊多夫定[Retrovir])、ddC(扎西他濱[Hivid]，雙脫氧肌苷)、d4T(司他夫定[Zerit])和3TC(拉米夫定[Epivir])、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS):地拉韋啶(Rescriptor)和奈韋拉平(Viramune)、蛋白酶抑制劑利托那韋(Norvir)、洛匹那韋和利托那韋組合(Kaletra)、沙奎那韋(Invirase)、茚地那韋硫酸鹽(Crixivan)、安潑那韋(Agenerase)和奈非那韋(Viracept)。在一些實施方案中，將稱為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)的幾種藥物的組合用于治療所述患者。由主治醫(yī)師根據(jù)患者的病癥來確定正確的制劑、給藥途徑和劑量。可以單個地調(diào)節(jié)給藥量和間隔以提供足以維持治療效果的活性銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的血漿水平。一般地，將期望的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物在與藥物載體的混合物中給藥，所述藥物載體根據(jù)欲意的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實踐來選擇。一方面，將所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物作為DNA遞送，使得多肽在原位產(chǎn)生。在一個實施方案中，如例如在Ulmer&a/.，(Science259:1745-1749(1993))中所述和Cohen(Science259:1691-1692(1993))所綜述的，所述DNA是"裸露的"?？赏ㄟ^將DNA包被在載體例如可生物降解的珠上來增加裸DNA的攝取，然后所述載體被有效地轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中。在這些方法中，DNA可以存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種遞送系統(tǒng)的任何中，所述系統(tǒng)包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng)。將DNA摻入到這些表達(dá)系統(tǒng)中的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。參見例如WO90/11092、WO93/24640、WO93/17706和美國專利5,736,524。可以將用于將遺傳物質(zhì)從生物體傳梭到生物體的載體分為兩種一般類型克隆載體是復(fù)制質(zhì)?；蚴删w，其具有在適合的宿主細(xì)胞中增殖所必需的區(qū)域，外源DNA可以插入其中；外源DNA被復(fù)制和增殖，如同它是載體的組分一樣。使用表達(dá)載體(例如質(zhì)粒、酵母或動物病毒基因組)將外源遺傳物質(zhì)引入宿主細(xì)胞或組織以轉(zhuǎn)錄并翻譯外源DNA例如銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素的DNA。在表達(dá)載體中，導(dǎo)入的DNA被可操作地與元件例如啟動子連接，所述元件給宿主細(xì)胞信號以高度轉(zhuǎn)錄插入的DNA。一些啟動子是特別有用的，例如可誘導(dǎo)的啟動子，其對特定因子反應(yīng)以控制基因轉(zhuǎn)錄。將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素和其變體和衍生物多核苷酸可操作地與可誘導(dǎo)啟動子連接可以對特定因子反應(yīng)以控制銅氧還蛋白或細(xì)胞色素和其變體和衍生物的表達(dá)。典型的可誘導(dǎo)啟動子的實例包括對(x-干擾素、熱應(yīng)激、重金屬離子和類固醇例如糖皮質(zhì)激素(Kaufinan，MethodsEnzymol.185:487-511(1990))和四環(huán)素起反應(yīng)的那些。其他期望的可誘導(dǎo)啟動子包括對其中構(gòu)建體引入的細(xì)胞而言不是內(nèi)源的那些，不過當(dāng)外源提供誘導(dǎo)劑時在這些細(xì)胞中是反應(yīng)的。一般地，有用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。然而，其他形式的表達(dá)載體如病毒載體(例如復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)也考慮。通過所用的生物體或細(xì)胞以及所用載體的期望結(jié)局來指導(dǎo)載體選擇。一般地，載體包含信號序列、復(fù)制起點、標(biāo)記基因、多接頭位點、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。例如，可以將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素基因克隆到可在攜帶瘧原蟲的蚊中傳遞的載體中，以防止寄生蟲在蚊體內(nèi)復(fù)制。載體的可傳遞性將容許銅氧還蛋白/細(xì)胞色素傳播到也感染了瘧原蟲的鄰近的蚊中。由主治醫(yī)師根據(jù)患者的病癥來確定正確的制劑、給藥途徑和劑量。可以單個調(diào)節(jié)給藥量和間隔以提供足以治療患者和/或維持治療效果的活性銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物的血漿水平。一般地，期望的銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物可以在與藥物載體的混合物中給藥，所述藥物載體根據(jù)欲意的給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實踐選擇?？梢允褂冒x形劑和助劑的一種或多種生理學(xué)可接受的載體按常規(guī)方式配制本發(fā)明所用的藥物組合物，所述載體有利于銅氧還蛋白和域細(xì)胞色素和其變體和衍生物活性劑的加工、用于抑制或刺激銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物的分泌，或者將它們的混合物制成治療學(xué)上可使用的制劑。包含銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素c和其變體和衍生物的試劑盒一方面，本發(fā)明提供試劑盒，其含有于包裝或容器中的一種或多種以下物質(zhì)(1)包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的生物學(xué)活性組合物；(2)藥學(xué)可接受的助劑或賦形劑；(3)用于給藥的裝置，例如注射器;(4)給藥說明書。還考慮其中組分(1)-(4)中的兩個或多個存在于同一容器中的實施方案。另一方面，本發(fā)明提供試劑盒，其含有于包裝或容器中的一種或多種以下物質(zhì)(1)包含銅氧還蛋白或細(xì)胞色素或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的生物學(xué)活性組合物；(2)瘧疾治療劑，其包括但不限于氯胍、氯丙胍、三甲氧芐二氨嘧啶、氯喹、甲氟喹、苯芴醇、阿托伐醌、乙胺嘧啶-磺胺多辛、乙胺嘧啶-氨苯砜、鹵泛群、奎寧、奎尼丁、氨酚喹、阿莫吡喹、磺胺、青蒿素、阿替夫林、蒿甲醚、青蒿琥酯、伯氨喹、咯萘啶、氯胍、氯喹、甲氟喹、乙胺嘧啶-磺胺多辛、乙胺嘧啶-氨苯砜、鹵泛群、奎寧、氯胍、氯喹、甲氟喹、1，16-十六亞甲基(N-甲基吡咯垸鐵)二溴化物；(3)藥學(xué)可接受的助劑或賦形劑；(4)用于給藥的裝置，例如注射器;(5)給藥說明書。還考慮其中組分(1)-(5)中的兩個或多個存在于同一容器中的實施方案。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含于包裝或容器中的抗HIV治療劑。感興趣的抗HIV治療劑包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT(齊多夫定[Retrovir])、ddC(扎西他濱[Hivid]，雙脫氧肌苷)、d4T(司他夫定[Zerit])和3TC(拉米夫定[Epivir])、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS):地拉韋啶(Rescriptor)和奈韋拉平(yiramune)、蛋白酶抑制劑利托那韋(Norvir)、洛匹那韋和利托那韋組合(Kaletra)、沙奎那韋(Invirase)、茚地那韋硫酸鹽(Crixivan)、安潑那韋(Agenerase)和奈非那韋(Vimcept)。在一些實施方案中，將稱為高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(HAART)的幾種藥物的組合用于治療所述患者。當(dāng)提供試劑盒時，可以將所述組合物中的不同組分包裝在單獨的容器中，并在使用前即刻混合。這些組分的單獨包裝可以允許長期保存而沒有活性組分的功能損失。試劑盒中包含的試劑可以在任何類型的容器中提供，所述容器使得不同組分的壽命被保持并且不被容器的材料吸附或改變。例如，密封的玻璃安瓿可以包含在中性、非反應(yīng)性氣體例如氮氣下包裝的銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素C和其變體和衍生物凍干多肽或多核苷酸或緩沖劑。安瓿可以由任何適合的材料例如玻璃、有機(jī)聚合物如聚碳酸酯、聚苯乙烯等、陶瓷、金屬或通常采用的容納類似試劑的任何其他材料構(gòu)成。適合的容器的其他實例包括可以從與安瓿類似的物質(zhì)制造的簡單的瓶以及可以包含箔例如鋁或合金襯內(nèi)部的包殼。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等。容器可以具有無菌的進(jìn)入孔，例如具有塞子的瓶子，所述塞子可以由皮下注射針刺穿。其他容器可以具有由容易移去的膜分隔的兩個室，所述膜當(dāng)移去時允許各部分混合?？梢迫サ哪た梢允遣ＡА⑺芰?、橡膠等。試劑盒還可以配有說明材料。說明書可以打印在紙或其他基質(zhì)上，和/或可以作為電子可讀介質(zhì)如軟磁盤、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盤、錄象磁帶、錄音磁帶、閃速存儲器設(shè)備等來提供。詳細(xì)的說明書可以與試劑盒不物理上相聯(lián)；而是，可以指引使用者使用廠家或試劑盒的分銷商指定的因特網(wǎng)網(wǎng)站或作為電子郵件提供。銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素的修飾可以將銅氧還蛋白或細(xì)胞色素從化學(xué)上修飾或進(jìn)行遺傳學(xué)改變以產(chǎn)生如上所述的變體和衍生物。這些變體和衍生物可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。除了銅氧還蛋白和細(xì)胞色素的天然存在的等位變體之外，還可以通過突變向銅氧還蛋白或細(xì)胞色素編碼序列中弓I入變化，所述突變導(dǎo)致編碼的銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的氨基酸序列的改變，該改變不顯著地改變銅氧還蛋白或細(xì)胞色素抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中的寄生蟲血癥的能力。"非必需"氨基酸殘基是可以在野生型銅氧還蛋白序列中改變而不改變生物學(xué)活性的殘基，而"必需"氨基酸殘基是該生物學(xué)活性所必需的。例如，預(yù)測銅氧還蛋白之間保守的氨基酸殘基尤其是不接受改變的，因而是"必需"的?？梢赃M(jìn)行不改變多肽的活性的保守性取代的氨基酸是本領(lǐng)域公知的。有用的保守性取代在表3，"優(yōu)選的取代"中示出。其中一種類型的氨基酸被相同類型的另一個氨基酸替代的保守性取代落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要所述取代不實質(zhì)性地改變所述化合物的生物學(xué)活性。表3.優(yōu)選的取代原始?xì)埢拘匀〈频娜〈鶤la(A)Val、Leu、HeValAig(R)Lys、Gln、AsnLysAsn(N)Gln、His、Lys、ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGIn(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro、AlaAlaHis(H)Asn、Gln、Lys、AigArgHe(I)Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸LeuLeu(L)正亮氨酸、De、Val、Met、Ala、PheHeLys(K)Ai^g、Gln、AsnArgMet(M)Leu、Phe、HeLeuPhe(F)Leu、Val、Ile、Ala、TyrLeuPro(P)AlaAlaSer(S)ThrThrThrOOSerSerTip(W)Tyr、PheTyrTyr(Y)Trp、Phe、Thr、SerPheVal(V)He、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸Leu影響(l)多肽骨架的結(jié)構(gòu)例如P-片層或a螺旋構(gòu)象、(2)電荷、(3)疏水性或(4)耙位點的側(cè)鏈的主體的非保守性取代能夠修飾細(xì)胞毒因子的功能?；诔Ｒ妭?cè)鏈的性質(zhì)將殘基分成組，如表4中所示。非保守性取代使得將這些類別之一的成員交換成另一類別的?？梢詫⑷〈氡Ｊ匦匀〈稽c或更特別地引入非保守性位點。表4.氨基酸類別類別氨基酸疏水的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie中性親水的Cys、Ser、Thr酸性的Asp、Glu堿性的Asn、Gln、His、Lys、破壞鏈構(gòu)象Gly、Pro芳香性的Trp、Tyr、Phe可以使用本領(lǐng)域已知的方法例如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變來制備變體多肽?？梢栽诳寺〉腄NA上進(jìn)行定點誘變(Carter，BiochemJ.237:l畫7(1986);ZollerandSmith,MethodsEnzymol.154329-350(1987))、盒誘變、限制選擇誘變(WellsWa/.，Gene34:315-323(1985))或其他已知的技術(shù)，以產(chǎn)生銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c^變體DNA。也可以使用銅氧還蛋白和細(xì)胞色素C5M的已知突變來產(chǎn)生在本發(fā)明的方法中使用的變體銅氧還蛋白和細(xì)胞色素c^。例如，已知天青蛋白的C112D和M44KM64E突變體具有不同于天然天青蛋白的細(xì)胞毒活性和生長停滯活性，該改變的活性可以用于本發(fā)明的治療方法中。本發(fā)明的方法的一個實施方案利用保留抑制哺乳動物細(xì)胞中瘧疾感染的生長的能力的銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素和其變體和衍生物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法利用具有引起細(xì)胞生長停滯的能力的銅氧還蛋白變體例如M44KM64E突變體。本發(fā)明的更完整的理解可以通過參考以下具體實施例來獲得。為了例示的目的而不是限制本發(fā)明的范圍，單獨地描述了實施例。因為環(huán)境可以提示或使得適宜，因此本發(fā)明考慮形式變化和等價物的替換。雖然本文采用了特定的術(shù)語，但是這些術(shù)語意圖是描述性的意義，而不是為了限制的目的。在不背離本發(fā)明的精神和范圍前提下，可以進(jìn)行前述的本發(fā)明的修飾和變體，因而僅如所附的權(quán)利要求所示加以這些限制。實施例實施例1:銅氧還蛋白和細(xì)胞色素對惡性瘧原蟲寄生蟲血癥的體外抑制銅氧還蛋白細(xì)菌wt天青蛋白、M44KM64E天青蛋白、鐵硫菌藍(lán)蛋白和藍(lán)細(xì)菌質(zhì)體藍(lán)素以及細(xì)胞色素銅綠假單胞菌細(xì)胞色素c551、人細(xì)胞色素c和層理席藻細(xì)胞色素f在200ng/ml濃度下在溫育后30小時于正常的紅細(xì)胞(RBC)測定中測試。在這些實驗中，將正常的RBC用無血清培養(yǎng)基洗滌兩次，并用完全RPMI重懸至10%血細(xì)胞比容。將200^10%HctRBC添加至24孔的每一孔中(最終2%Hct,lmL)，此外添加30nl完全RPMI，其含有666,終濃度為200的重組銅氧還蛋白或細(xì)胞色素蛋白。通過Percoll臺墊在3200rpm下離心晚期培養(yǎng)物10分鐘來制備裂殖體階段的寄生蟲。為感染，在tN)小時時添加500nl體積的4xl(^個寄生蟲/孔。將板溫育30小時，在此時通過薄的血涂片和吉姆薩染色來計分。對照顯示9.5%的寄生蟲血癥(標(biāo)準(zhǔn)誤1.30/。)、wt天青蛋白6.9%(s.e.L4。/o)、M44KM64E天青蛋白9.1%(s.e.1.0%)、鐵硫菌藍(lán)蛋白7.2%(s.e.0.7%)、細(xì)胞色素c5517.5%(s.e.1.5%)、人細(xì)胞色素c8.4%(s.e.0.4%)、質(zhì)體藍(lán)素8.1。/。(s.e.1.3。/。)以及細(xì)胞色素f6.6%(s.e.1.0%),這表明銅氧還蛋白例如wt天青蛋白和鐵硫菌藍(lán)蛋白，以及細(xì)胞色素例如細(xì)胞色素c551表現(xiàn)出抑制寄生蟲血癥20至30%。當(dāng)在寄生蟲生命周期的各個階段(0-24小時，環(huán)狀體(ringformation);24-36小時，滋養(yǎng)體；36-48小時，裂殖體)測試銅氧還蛋白時，對照物顯示平均0.1%的環(huán)狀體和9.4%滋養(yǎng)體形成，而wt天青蛋白顯示沒有環(huán)狀體，而6.9%的滋養(yǎng)體形成；細(xì)胞色素f顯示0.2%環(huán)狀體，而具有顯著低的(6.3%)滋養(yǎng)體形成。顯著地，鐵硫菌藍(lán)蛋白表現(xiàn)出非常高的(2.0°/。)環(huán)狀體，以及顯著降低的(5.2%)滋養(yǎng)體形成。其他的沒有顯著作用。鐵硫菌藍(lán)蛋白處理的樣品組中的寄生蟲與其余樣品組的相比看起來有病且是垂死的，這表明鐵硫菌藍(lán)蛋白對寄生蟲發(fā)育具有顯著抑制和毒性作用。實施例2:鐵硫菌藍(lán)蛋白對惡性瘧原蟲細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的體外抑制為確定細(xì)菌氧化還原蛋白是否能夠抑制瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，使用低滲的血影制品將紅細(xì)胞加載到200ng/ml的細(xì)胞內(nèi)重組蛋白濃度。如實施例1中所述，然后洗滌細(xì)胞、重懸、并用裂殖體階段的寄生蟲(惡性瘧原蟲)感染。將紅細(xì)胞血影溫育19小時和40小時，制成吉姆薩涂片。與實施例1中正常紅細(xì)胞的感染相比，在加載的細(xì)胞血影培養(yǎng)物中，僅鐵硫菌藍(lán)蛋白降低總寄生蟲血癥。在19小時時，在侵入和環(huán)形成中沒有顯著差異，空血影為5.0士0.4%，鐵硫菌藍(lán)蛋白加載血影為4.5±1.0%。然而，在40小時時，鐵硫菌藍(lán)蛋白加載血影具有更低水平的感染。使用任何細(xì)菌蛋白在19小時時沒有見到主要效果。然而，在40小時時，對照未處理血影顯示4.6±0.3%的寄生蟲血癥，而鐵硫菌藍(lán)蛋白處理血影具有2.7±0.8%的寄生蟲血癥，幾乎降低50%。參見表5。Wt天青蛋白、M44KM64E突變體天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、細(xì)胞色素CsM、人細(xì)胞色素c和藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞色素f蛋白顯示從4.2到5.4%的寄生蟲血癥。表5.銅氧還蛋白和細(xì)胞色素對紅細(xì)胞血影的惡性瘧原蟲感染的抑制處理在40小時時的平均寄生蟲血癥標(biāo)準(zhǔn)誤空4.6%0.3%野生型天青蛋白5.4%1.0%M44KM64E天青蛋白4.7%0.5%鐵硫菌藍(lán)蛋白2.7%0.8%細(xì)胞色素C5514.2%0.4%人細(xì)胞色素c4.6%0.8%質(zhì)體藍(lán)素4.3%0.3%細(xì)胞色素f4.5%0.9%實例3:天青蛋白和與PfMSP1-19復(fù)合的G17.12單克隆抗體的Fab片段之間的結(jié)構(gòu)同源性以前的研究已經(jīng)表明，銅氧還蛋白顯示與免疫球蛋白超家族成員的可變區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性。(Gough&Chothia,Structure12:917-925(2004);Stevens"a/.，J.Mol.Recognit.18:150-157(2005))。使用DALI算法(Holm&Park,Bioinformatics16:566-567(2000))。在3D數(shù)據(jù)庫中搜索來自銅綠假單胞菌的天青蛋白(IJZG)的結(jié)構(gòu)相似性。天青蛋白表現(xiàn)出和與惡性瘧原蟲的MSPl裂殖體表面蛋白的PfMSP1-19片段G17.12單克隆抗體的Fab片段復(fù)合的G17.12單克隆抗體的Fab片段的結(jié)構(gòu)相似性。(Pizarroa/.，J.Mol.Biol.328:1091-1103(2003))。(表6)天青蛋白還表現(xiàn)出與ICAM-1的結(jié)構(gòu)相似性(表6)，ICAM-1參與腦型瘧并可能涉及作為腦和其他組織的微血管培養(yǎng)物中用于扣押惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞上的受體。(SmithW"/，Proc,Natl.Acad,Sci,USA97:1766-1771(2000);Franke-Fayardfl/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11468-11473(2005))。這一實施例表明包括天青蛋白在內(nèi)的銅氧還蛋白表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)相似性具有兩個面對面組裝并由二硫鍵連接的反向平行P片層，其與免疫球蛋白超家族成員的可變區(qū)以及細(xì)胞間粘附分子(ICAM)的細(xì)胞外域和它們的配體連接。表6.銅綠假單胞菌天青蛋白與多種病因相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)相似性<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>使用DALI(16)進(jìn)行與天青蛋白的結(jié)構(gòu)排比。DALIz分值々的結(jié)構(gòu)對被認(rèn)為不相似。實施例4:Laz和H.S-天青蛋白融合基因的克隆和表達(dá)淋病奈瑟菌的基因根據(jù)其已知序列(SEQIDNO:22)來克隆。使用稱為的銅綠假單胞菌天青蛋白基因(SEQIDNO:l)和淋病奈瑟菌(Mgo打"m^o^^的的H.8表位的序列(SEQIDNO.'21)按閱讀框架將H.8表位基因克隆到的5'-末端表7.癌細(xì)胞、細(xì)菌菌株和基因構(gòu)建體細(xì)胞/菌株/質(zhì)粒相關(guān)的特征*參考文獻(xiàn)銅綠假單胞菌原養(yǎng)型，F(xiàn)P-(性因子缺PAOl陷)￡.co/z'JM109克隆和天青蛋白表達(dá)株五,co//BL21(DE3)淋病奈瑟菌F62pUC18pUC19GST表達(dá)株Hollowy,"a/.，Microbiol.Rev.43:73-102(1979)Yaniseh-Perron,"a/"Gene33:103-119(1985)NvagenpUC19-pazpUC18-H.8陽p。zpGEX-5X-3pET29apET29a-gWpGEX-5X-3-H.8pET29a-,H.8用于DNA分離的原養(yǎng)型AmericanTypeCultureCollection通用克隆載體，A,通用克隆載體，A,克隆到pUC18中的來自淋病奈瑟菌F62的基因組DNA的lkbPCR片段克隆到7//^////和Pw/消化的pUC19中的來自銅綠假單胞菌PAOl的0.55kb片段，Apf編碼來自淋病奈瑟菌H.8和來自銅綠假單胞菌PAOl的天青蛋白的融合質(zhì)粒，A,GST基因融合載體，A,￡.^//表達(dá)載體，Kmf含有基因的pET29a衍生物，Kmf含有H.8編碼區(qū)的pGEX-5X-3衍生物，Apr含有g(shù)st-H.8基因的pET29a衍生物，KmfYaniseh-Perron,"a/"同上Yaniseh-Perron,"a/.,同上此處Yamada,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Yamada，etal,.Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:4770-4775(2004)此處AmershamNovagen此處此處此處*Ap,氨芐青霉素；Km，卡那霉素；GST，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(pz和/az基因的克隆和表達(dá)已經(jīng)描述了天青蛋白基因的克隆和超量表達(dá)。(Yamada，"Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj，aa/"Oncogene23:2367-2378(2004))。通過PCR使用淋病奈瑟菌株F62的基因組DNA作為模板DNA來擴(kuò)增淋病奈瑟菌的Laz編碼基因(/oz)。使用的正向和反向引物是5'-CCGGAATTCCGGCAGGGATGTTGTAAATATCCG-3，(SEQIDNO:23)和5'-GGGGTACCGCCGTGGCAGGCATACAGCATTTCAATCGG-3，(SEQIDNO:24)，其中另外引入的5coi^/和限制性位點分別用下劃線標(biāo)出。將用五c^/和尺/w/消化的1.0kb的擴(kuò)增DNA片段插入到pUC18載體(Yanisch-Perron，Gene33:103-119(1985))的相應(yīng)位點中，使得基因位于lac啟動子的下游，以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒1^18-/^(表7)。用pUC19-;az和pUC18-/az作為模板通過PCR構(gòu)建表達(dá)淋病奈瑟菌Laz的H.8和銅綠假單胞菌的天青蛋白(Paz)融合體的質(zhì)粒。對于R8-Paz融合體，使用pUC18-^作為模板和以下引物擴(kuò)增3.1kb片段5'-(磷酸化的)GGCAGCAGGGGCTTCGGCAGCATCTGC-3，(SEQIDNO:25)和5'-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCG-3，(SEQIDNO:26)，其中^//位點用下劃線標(biāo)出。PCR擴(kuò)增的0.4kb片段從作為模板的pUC19-;^z和以下引物獲得5'-(磷酸化的)GCCGAGTGCTCGGTGGACATCCAGG-3，(SEQIDNO:27)和5'-TACTCGAGTCACTTCAGGGTCAGGGTG-3，(SEQIDNO:28)，其中JV7w/位點用下劃線標(biāo)出?？寺?amp;//消化的來自pUC18-/m的PCR片段和屈o/消化的來自pUC19-戸z的PCR片段以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pUC18-H,8-paz(表7)。將五.c^JM109用作用于表達(dá)天青蛋白和其衍生物基因的宿主菌株。重組￡.co"菌株在含有100pg/ml氨節(jié)青霉素、0.1mMIPTG和0.5mMCUS04的2XYT培養(yǎng)基中在37。C下培養(yǎng)16h以產(chǎn)生天青蛋白蛋白質(zhì)。當(dāng)攜帶這些質(zhì)粒的￡.Coa菌株在IPTG存在下培養(yǎng)時，裂解細(xì)胞和如對天青蛋白所述(Yamada，"Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:14098-14103(2002);Punj，WOncogene23:2367-2378(2004);Yamada，""/.,Cd1.Microbiol.7:1418-1431(2005》純化蛋白，各種天青蛋白衍生物在SDS-PAGE上作為單個組分遷移，不過如之前注意到的(Cannon,Clin.Microbiol.Rev.2:S1-S4(1989);Fisette，Wa/.，J.Biol.Chem.278:46252-46260(2003))，含有H.8的蛋白(約17kDa)顯示出異常遷移。融合GST蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建通過使用校正DNA聚合酶的聚合酶鏈反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)融合體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-截短的wt天青蛋白(azu)衍生物的質(zhì)粒。對于pGST-azu36-128，將擴(kuò)增的PCR片段引入商業(yè)的GST表達(dá)載體pGEX-5X(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)的B"附歷禾口五coi7位點中。使用pUC19-azu作為模板和以下引物擴(kuò)增片段5'-CGGGATCCCCGGCAACCTGCCGAAGAACGTCATGGGC-3'(SEQIDNO:29)和5'-CGGAATTCGCATCACTTCAGGGTGAGGG-3，(SEQIDNO:30)，其中另外引入的Bam/fJ和￡coW限制性位點分別用下劃線標(biāo)出。基因的羧基末端截短形式通過使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene,LaJolla，CA)引入終止密碼子累積地進(jìn)行。對于pGST-azu36-89，將終止密碼子引入Gly90中。使用攜帶pGST-azu36-128的質(zhì)粒作為模板DNA。用于定點誘變的三組寡核苷酸顯示如下。對于pGST-azu36-89:5'-CCAAGCTGATCGGCTCGTGAGAGAAGGACTCGGTGACC-3，(SEQIDNO:31)，和5'-GGTCACCGAGTCCTTCTCTCACGAGCCGATCAGCTTGG-3，(SEQIDNO:32)。對于pGST-azu88-113，mM基因的羧基末端截短形式通過使用QuickChange定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla,CA)引入終止密碼子累積地迸行。對于pGST-azu88-113，將終止密碼子引入Phel14中。使用攜帶pGST-azu88-128的質(zhì)粒作為模板DNA。對于pGST-azu88-128，將擴(kuò)增的PCR片段引入商業(yè)的GST表達(dá)載體pGEX-5X(AmershamBiosciences)的5aw丑7和位點中。使用pUC19-azu作為模板和以下引物擴(kuò)增片段5'-CGGGGATCCCCGGCTCGGGCGAGAAGGAC-3，(SEQIDNO:33)和5'-CGGGAATTCTCCACTTCAGGGTCAGGGTG-3，(SEQIDNO:34)，其中另外引入的Sam//7和&o;^限制性位點分別用下劃線標(biāo)出。對于pGST-azu88-113的制備，一組用于定點誘變的寡核苷酸顯示如下5'畫GTTCTTCTGCACCTAGCCGGGCCACTCCG國3，(SEQIDNO:35)和5'-CGGAGTGGCCCGGCTAGGTGCAGAAGAAC-3，(SEQIDNO:36)。使用pGST-azu88-113轉(zhuǎn)化￡.co"XL-1Blue菌株。使用商業(yè)試劑盒(Qiagen,Venlo,TheNetherlands)進(jìn)行質(zhì)粒提取，進(jìn)行PCR測序來評價質(zhì)粒插入和轉(zhuǎn)染。使用Eco//BL21(DE3)作為用于表達(dá)gst和其融合體衍生物的宿主菌株。用pGST-azu質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的￡.co/!'菌株XL1-Blue在具有氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中在37。C下培養(yǎng)三小時，此時進(jìn)行IPTG(0.4mM)誘導(dǎo)，隨后在37"C下溫育2-4h以使表達(dá)水平最大化。通過離心分離細(xì)胞，并重懸在25mLlxPBS緩沖液中。隨后的細(xì)胞裂解包括超聲處理細(xì)胞懸液(冰上20分鐘)和丙酮-干冰浴中的熱-冷休克(使用合適的蛋白酶抑制劑)兩個連續(xù)處理。分離細(xì)胞裂解混合物的上清液，并將其通過新鮮裝填和PBS平衡的1mL谷胱甘肽-瓊脂糖4B(AmershamBiosciences)柱。在柱洗滌和隨后的使用于20mMTris-HClpH8.中的10mM谷胱甘肽洗脫GST-azu產(chǎn)物之后，使用用考馬斯亮藍(lán)R試劑染色的10%SDS-PAGETris-Gly凝膠通過電泳測試GST-Azu88-113純度。使用Bradford方法測定蛋白濃度。實施例5:天青蛋白與惡性瘧原蟲裂殖體表面蛋白MSP1的C-末端片段MSP1-19和MSP1-42結(jié)合?？紤]到天青蛋白和與PfMSP1-19復(fù)合的單克隆抗體G17.12的Fab片段之間的結(jié)構(gòu)相似性(表6)(PizarmW"/.，同上)，測定天青蛋白與PfMSP1-42或PfMSP1-19形成復(fù)合物的能力。測試天青蛋白的兩種衍生物L(fēng)az和其中Laz的H.8表位按閱讀框架融合到銅綠假單胞菌天青蛋白的N-末端部分(如實施例4中所述)的R8-天青蛋白，所述Laz是來自奈瑟球菌(go朋ococcO和腦膜炎球菌(mem'"gococc/)如腦膜炎奈瑟菌的具有另外的稱為H.8表位的39氨基酸表位(Gotschlich&Seiff，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.43:253-255(1987);Kawulaa/"Mol.Microbiol.1:179-185(1987)的天青蛋白樣蛋白。使用來自BiacoreABInternational的BiacoreX光譜儀評價體外蛋白-蛋白相互作用。所有實驗使用Au-CM5傳感器芯片(Biacore)在HBS-EP電泳緩沖液(0.01MHEPES,pH7.4，0.15MNaCl，3mMEDTA,0.005%v/v表面活性劑P20)中在25'C下進(jìn)行。根據(jù)胺偶聯(lián)步驟進(jìn)行蛋白在CM5芯片上的固定化。在CM5表面的NHS/EDC預(yù)活化之后固定化蛋白注射50^天青蛋白(510mM)。隨后用乙醇肢(1M,pH8.8)處理CM5表面以除去未交聯(lián)的蛋白。以30pl/分鐘的流速在蛋白-CM5表面上注射蛋白洗脫液(50pi),注射結(jié)束時120秒的時間延遲，來進(jìn)行結(jié)合研究。蛋白洗脫液包括GST-天青蛋白融合蛋白(GST、GST-Azu36-128、GST-Azu36-89和GST-Azu88-113，如實施例4中所述)。在蛋白注射之間使用100mMNaOH(10pl注射脈沖)再生傳感器芯片表面。所有的結(jié)合研究相對于使用裸Au-CM5傳感器表面的陰性流體通道來平行進(jìn)行，以校正與芯片的非特異結(jié)合。為產(chǎn)生結(jié)合常數(shù)數(shù)據(jù)，通過注射增加濃度的蛋白洗脫液(0.05-2000nM)來設(shè)計滴定實驗。如Biacore軟件中所說明，將SPR數(shù)據(jù)擬合到Langmuir(l:l)平衡結(jié)合模型[Req-Rmax/(1+Kd/C]，從中外推結(jié)合常數(shù)(Kd)。通過表面等離子共振(SPR)分析測定PfMSPl-19和PfMSPl-42蛋白與天青蛋白、R8-天青蛋白和Laz的特異性相互作用，數(shù)據(jù)在圖1中示出。用于固定化PfMSPl-19和PfMSP1-42與天青蛋白和其衍生物的結(jié)合的SPR感應(yīng)圖表明這些蛋白之中的選擇性識別。雖然天青蛋白的納摩爾濃度允許與固定化MSPl-19(附圖IA)或MSPl-42(附圖1B)顯著結(jié)合，但是H.S-天青蛋白和Laz表現(xiàn)出與裂殖體表面蛋白MSP1裂解產(chǎn)物的更高的結(jié)合親和力，天青蛋白和MSPl-19之間的特征性Kd值為32.2nM，天青蛋白和MSPl-42之間為54.3nM。H.8-天青蛋白與MSPl-19和MSPl-42之間的Kd值是11.8nM和14.3nM，而在Laz與MSPl-19和MSPl-42之間的這些值分別是26.2nM禾口45.6nM。為檢査H.8表位是否可以促進(jìn)H.S-天青蛋白或Laz與PfMSPl-19或PMSP1-42部分的結(jié)合，測試了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)與其中H.8表位融合到GST的N-末端(參見實施例4)的融合衍生物H.8-GST與MSPl-19或MSPl-42結(jié)合的能力。GST或H.8-GST都不結(jié)合PfMSPl-19(附圖IA)或MSPl-42(附圖IB),不過H.8-GST顯示出與MSPl-42的弱結(jié)合。測試了谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和其中天青蛋白的部分與GST融合的一些融合蛋白(Yamada"Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005)和實施例4)與MSPl-19結(jié)合的能力。單獨的GST或其中天青蛋白的128個氨基酸中的天青蛋白氨基酸序列88到113按閱讀框架與GST融合的GST-Azu88-113未顯示任何結(jié)合(附圖1C),而具有氨基酸序列36到89的GST-Azu36-89以及具有氨基酸36到128的GST-Azu36-128顯示出與MSP1-19的顯著結(jié)合，Kd值分別為20.9nM和24.5nM。實施例6:天青蛋白、H,8-天青蛋白和Laz對惡性瘧原蟲的抑制使用裂殖體階段寄生蟲和正常的紅細(xì)胞(RBC)測定寄生蟲血癥的程度。將正常的紅細(xì)胞(RBC)在無血清培養(yǎng)基中洗滌兩次，并用完全RPMI重懸至10%血細(xì)胞比容。將200^10。/。血細(xì)胞比容的RBC添加至24孔的每一孔中，此外添加含或不含不同濃度的天青蛋白、H.8-天青蛋白或Laz的300ni完全RMPI。通過Perco11臺墊在3200rpm下離心晚期培養(yǎng)物10分鐘來制備裂殖體階段的惡性瘧原蟲寄生蟲。為感染，在零時間點添加500^體積的4><106個寄生蟲/孔。將板溫育過夜(約16h)，在此時通過薄血涂片和吉姆薩染色來計分。盡管在相對高的濃度(約50^M)下，但天青蛋白、H.S-天青蛋白或Laz都表現(xiàn)出劑量依賴性方式的顯著的寄生蟲血癥抑制(附圖2)。推測這種高濃度反映了瘧原蟲侵入紅細(xì)胞的多種途徑(Cowman&"/.,FEBSLett.476:84-88(2000);BaumWa/"J.Biol.Chem.281:5197-5208(2006))，高濃度的天青蛋白或Laz是干擾侵入過程所必需的。如它們對MSP1-19的增強(qiáng)的結(jié)合親和力所表明，H,8-天青蛋白和奈瑟Laz蛋白與天青蛋白相比顯示出較高水平的惡性疙原蟲寄生蟲血癥的抑制(附圖2)。當(dāng)用紅色熒光染料Alexafluor568標(biāo)記天青蛋白并在侵入測定中使用時，在RBC內(nèi)幾乎檢測不到紅色熒光，這表明天青蛋白似乎不進(jìn)入RBC作為結(jié)合的MSP1-19的一部分，更可能地，顯示裂殖體存在的RBC是其中天青蛋白不能與MSP1-19結(jié)合的那些。這些數(shù)據(jù)完全符合我們以前的觀察(Yamada"a/.，Cell.Microbiol.7:1418-1431(2005))，即天青蛋白不進(jìn)入正常細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，天青蛋白、R8-天青蛋白或Laz的作用是在侵入水平上而不是寄生蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制上?？傊?，圖2中的數(shù)據(jù)表明天青蛋白、H.8-天青蛋白和Laz的潛在抗瘧疾作用是通過干擾寄生蟲對RBC的侵入。實施例7:天青蛋白結(jié)合ICAM天青蛋白和已知作為惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞的受體參與的ICAM之間令人感興趣的結(jié)構(gòu)相4以性(表6)(WassmerWPloSMed.2:885-890(2005);Dormeyer"a/.，Antimicrob.AgentsChemotherap.50:724-730(2006))促使進(jìn)行天青蛋白和ICAM之間如SPR所測量的蛋白-蛋白相互作用的測試分析，所述ICAM例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和NCAM。使用在CM5芯片上固定化的天青蛋白，ICAM-3(附圖3，Kd-19.5+5.4nM)和NCAM(附圖3，插圖)顯示了強(qiáng)結(jié)合，但是有趣的是，ICAM-l和ICAM-2沒有顯示。雖然不限于本發(fā)明起作用的方式，但是天青蛋白對于抑制惡性瘧原蟲寄生蟲血癥的部分作用也可能是通過其與ICAM-3或NCAM的相互作用所介導(dǎo)。實施例8:可能暴露于或已暴露于瘧疾的患者的治療將用于預(yù)防瘧疾的臨床使用的包含一種或多種銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素的藥物給予患者。沒有對血液階段惡性瘧原蟲寄生蟲的先存抗體史(如免疫熒光測定所測定)但居住在瘧疾為地方病的地區(qū)中的年齡22-50歲的十五位健康男性志愿者將接受注射純化的銅氧還蛋白和純化的細(xì)胞色素的藥物制劑。兩個這樣的人將作為未治療的對照。無菌的藥物制劑是設(shè)計用于靜脈內(nèi)給藥的藥物制劑中的無菌銅綠假單胞菌天青蛋白的0.5ml單個劑量安瓿的形式，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。將藥物制劑保存在4i:下，在給藥前避光保存。在一個臨床試驗中，將天青蛋白制備成五個不同濃度10嗎、30嗎、100jig、300嗎和800嗎天青蛋白/0.5ml劑量。經(jīng)靜脈內(nèi)向十三位志愿者給藥該藥物制劑，每位10個劑量。志愿者在0日接受初次治療，隨后三周每隔一日接受相同的劑量。注射后二十分鐘觀察志愿者的即時毒性作用。二十四和四十八小時后，檢査它們的發(fā)燒、局部壓痛、紅斑、發(fā)熱、硬化和淋巴結(jié)病變的證據(jù)，詢問關(guān)于頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、不適、局部疼痛、惡心和關(guān)節(jié)疼痛的主訴。在每次給藥之前，采集血液和尿液樣品用于完整的實驗室檢査。在每次給藥后兩天重新檢查全血計數(shù)和血清化學(xué)特征。通過染色的血涂片的光學(xué)顯微鏡檢(ME)或ICT瘧疾P/ZRv.測試試劑盒(Binax，Inc.,Portland,ME)來檢測瘧原蟲的存在。結(jié)果表明治療的有效性。實施例9:昆蟲的瘧疾感染的控制將從一只蚊傳到另一只蚊的可傳播遺傳元件可操作地連接于與組成型啟動子可操作地連接的銅氧還蛋白編碼序列。因而銅綠假單胞菌天青蛋白將在被惡性瘧原蟲感染的瘧蚊內(nèi)產(chǎn)生，并將干擾惡性瘧原蟲在蚊中的復(fù)制/存活。然后將該蚊引入地方病地區(qū)，使得攜帶天青蛋白的遺傳元件將傳播到其他惡性瘧原蟲感染的瘧蚊中，抑制惡性瘧原蟲生長或存活。實施例10:瘧疾感染的患者的治療將包含一種或多種銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素的瘧疾治療臨床使用藥用于治療人中的瘧疾感染。具有血液階段惡性瘧原蟲寄生蟲的先存抗體史(如免疫熒光法分析所測定)的年齡22-50歲的十五位健康的男性志愿者用純化的銅綠假單胞菌天青蛋白的藥物制劑注射。兩個這樣的人作為未治療的對昭。無菌的藥物制劑是設(shè)計用于靜脈內(nèi)給藥的藥物制劑中的無菌銅綠假單胞菌天青蛋白的0.5ml單個劑量安瓿的形式，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。將藥物制劑保存在4'C下，給藥之前避光保存。在一個臨床試驗中，將銅綠假單胞菌天青蛋白制備成五個不同的濃度10嗎、30昭、100嗎、300昭和800嗎天青蛋白/細(xì)胞色素c^(以分子基礎(chǔ)計1:1)/0.5ml劑量。經(jīng)靜脈內(nèi)向十三位志愿者給藥該藥物制劑，每位10劑。志愿者在0日接受初次治療，隨后三周每隔一日接受相同的劑量。注射后二十分鐘觀察志愿者的即時毒性作用。二十四和四十八小時后，檢查它們的發(fā)燒、局部壓痛、紅斑、發(fā)熱、硬化和淋巴結(jié)病變的證據(jù)，詢問關(guān)于頭痛、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、不適、局部疼痛、惡心和關(guān)節(jié)疼痛的主訴。在每次給藥之前，采集血液和尿液樣品用于完整的實驗室檢查。在每次給藥后兩日重新檢査全血計數(shù)和血清化學(xué)特征。通過染色的血涂片的光學(xué)顯微鏡檢(ME)或ICT瘧疾7V:/Pv.測試試劑盒(Binax，Inc.，Portland,ME)來測定瘧原蟲的存在。結(jié)果表明治療的有效性。權(quán)利要求1.一種分離的肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，且其能夠抑制瘧疾感染的紅細(xì)胞中瘧疾的寄生蟲血癥。2.權(quán)利要求1的分離的肽，其能夠抑制惡性瘧原蟲(戶/a/c^www)感染的人紅細(xì)胞中瘧疾的寄生蟲血癥。3.—種分離的肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，且其能夠抑制瘧疾感染的人紅細(xì)胞中瘧原蟲的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。4.一種分離的肽，其是銅氧還蛋白的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物，且其能夠結(jié)合選自PfMSPl-19和PfMSPl-42的蛋白。5.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白選自天青蛋白、假天青蛋白、質(zhì)體藍(lán)素、鐵硫菌藍(lán)蛋白、Laz和橙綠曲撓素。6.權(quán)利要求5的分離的肽，其中所述銅氧還蛋白選自鐵硫菌藍(lán)蛋白、天青蛋白和Laz。7.權(quán)利要求1的分離的月太，其中所述銅氧還蛋白來自生物體，所述生物體選自銅綠假單胞菌(戶sei^omowasam^7iosaJ、糞產(chǎn)堿菌(y4/ca//gewas々eca/z》、氧化木糖無色桿菌(Jc/wwwoZa"er:qy/oso;dc/—、支氣管敗血性博德特菌(5onfefeZ/"Zvw7c/2&e;^c")、甲基單胞菌屬(Afe^y/o/wowfls■$■/)、!0膜炎奈瑟菌(A^/5"J^7'OW^2/wg^/(i/j)、淋病奈瑟菌(A^s5^n'ago"o/r/^(3)、熒光假單胞菌(尸seMcfo附o"asyZMomscem)、綠針假單胞菌(尸sewcfo附o"asc/2/orora//n.s)、苛養(yǎng)木桿菌(^>/6//"々"/力Vwa)禾口畐1」溶血弧菌(F6n'opara/2ae附o/"/cMS)。8.權(quán)利要求6的分離的肽，其來自生物體，所述生物體選自氧化亞鐵硫桿菌(77z/o^d//^/mwOTV/(ms)、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌。9.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述細(xì)胞色素選自細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素f。10.權(quán)利要求9的分離的肽，其中所述細(xì)胞色素c來自生物體，所述生物體選自人和銅綠假單胞菌。11.權(quán)利要求9的分離的肽，其中所述細(xì)胞色素f來自藍(lán)細(xì)菌12.權(quán)利要求1的分離的肽，其中肽的截短形式選自SEQIDNO:1-20和22。13.權(quán)利要求1的分離的肽，其與選自SEQIDNO:1-20和22的序列具有至少90%的氨基酸序列相同性。14.權(quán)利要求1的分離的肽，其是銅氧還蛋白或細(xì)胞色素的截短形式。15.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽超過約10個殘基，且不超過約100個殘基。16.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽包含天青蛋白殘基36-89。17.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽由天青蛋白殘基36-89構(gòu)成。18.權(quán)利要求1的分離的肽，其中所述肽包含銅氧還蛋白的與天青蛋白36-89等價的殘基。19.權(quán)利要求1的分離的肽，其融合到Laz的H.8區(qū)。20.權(quán)利要求1的分離的肽，其是單克隆抗體G17.12的結(jié)構(gòu)等價物。21.—種組合物，其包含于藥物組合物中的至少一種銅氧還蛋白、細(xì)胞色素或權(quán)利要求1的分離的肽。22.權(quán)利要求21的組合物，其中配制所述藥物組合物供靜脈內(nèi)給藥。23.權(quán)利要求21的組合物，其另外包含另一種抗癥藥。24.權(quán)利要求21的組合物，其另外包含抗HIV藥。25.權(quán)利要求21的組合物，其中所述銅氧還蛋白來自生物體，所述生物體選自銅綠假單胞菌、糞產(chǎn)堿菌、氧化木糖無色桿菌、支氣管敗血性博德特菌、甲基單胞菌屬、腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、苛養(yǎng)木桿菌和副溶血弧菌。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述銅氧還蛋白來自生物體，所述生物體選自氧化亞鐵硫桿菌、銅綠假單胞菌、淋病奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌。27.權(quán)利要求21的組合物，其中所述細(xì)胞色素選自細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素f。28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述細(xì)胞色素c來自生物體，所述生物體選自人和銅綠假單胞菌。29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述細(xì)胞色素f來自藍(lán)細(xì)菌。30.權(quán)利要求21的組合物，其中所述銅氧還蛋白或細(xì)胞色素選自SEQIDNO:1-20和22。31.—種治療遭受瘧原蟲感染的患者的方法，其包括向所述患者給藥有效量的權(quán)利要求21的組合物。32.—種治療疑似與瘧原蟲接觸的患者的方法，其包括向所述患者給藥有效量的權(quán)利要求21的組合物。33.—種預(yù)防哺乳動物中的瘧疾的方法，其包括向攜帶瘧原蟲的昆蟲媒介群體中的昆蟲媒介給藥一些量的權(quán)利要求21的組合物。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述肽抑制所述患者的瘧疾感染的人紅細(xì)胞中瘧疾的寄生蟲血癥。35.權(quán)利要求31的方法，其中所述瘧原蟲選自間日瘧原蟲(尸/oywo^wwv/vox)和惡性疙原蟲。36.權(quán)利要求31的方法，其中所述患者另外遭受HIV感染。37.權(quán)利要求31的方法，其中所述組合物與第二組合物一起給藥，所述第二組合物包含選自抗瘧藥和抗HIV藥的活性成分。38.權(quán)利要求37的方法，其中在給藥第二組合物0分鐘到12小時之內(nèi)給藥權(quán)利要求21的組合物。39.權(quán)利要求31的方法，其中通過選自口服、吸入、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和皮下注射的方法向所述患者給藥所述組合物。40.權(quán)利要求39的方法，其中經(jīng)靜脈內(nèi)向所述患者給藥所述組合物。41.權(quán)利要求33的方法，其中經(jīng)口服向所述昆蟲媒介給藥所述組合物。全文摘要本發(fā)明涉及銅氧還蛋白和細(xì)胞色素以及它們單獨或一起抑制哺乳動物紅細(xì)胞和瘧原蟲感染的其他組織中寄生蟲血癥，特別是惡性瘧原蟲的人紅細(xì)胞寄生蟲血癥的傳播的應(yīng)用。本發(fā)明提供作為銅氧還蛋白或細(xì)胞色素c的變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的分離的肽，以及包含銅氧還蛋白和/或細(xì)胞色素c或其變體、衍生物或結(jié)構(gòu)等價物的組合物，它們可用于治療或預(yù)防哺乳動物中瘧疾感染的生長。另外，本發(fā)明提供治療哺乳動物患者以防止或抑制哺乳動物中瘧疾感染的生長的方法。本發(fā)明還提供防止昆蟲媒介中瘧疾感染的生長的方法。文檔編號C12P21/04GK101223283SQ200680025440公開日2008年7月16日申請日期2006年5月19日優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日發(fā)明者A·喬杜里,A·查克拉巴蒂,A·菲亞略,T·D·古普塔,山田亨,洪昌秀申請人:伊利諾斯大學(xué)理事會