專利名稱：：誘變方法第l/24頁誘變方法本發(fā)明涉及產(chǎn)生誘變的核酸分子的方法。特別地，本發(fā)明涉及這樣的方法中，在該方法中，誘變反應中使用的引物(誘變引物)本身是從模板核酸分子合成的。誘變反應的產(chǎn)物是誘變的環(huán)狀核酸分子，其能例如在不需要其它修飾的情況下，被轉(zhuǎn)化進入細菌。在優(yōu)選的實施方式中，本方法被運用于分子群，例如用于分子群的產(chǎn)生和篩選中。本方法也以組合方式被使用，在其中，多種誘變引物用于突變多種親代分子。涉及分子生物學技術的其中一個步驟是引導核酸分子進入載體。例如，DNA片段或DNA片段群可以被消化，并通過連接反應被引入載體。例如，DNA片段(或片段群)可從第一個載體(例如，質(zhì)粒)消化并除去，利用已知的亞克隆方法進入第二個載體。這樣，第一載體使用和第二載體相同的限制性內(nèi)切酶進行消化，以致生成用于連接的互補的突出端。然后，DNA片段和第二載體依靠其互補的突出端進行連接，結(jié)果得到包含所述DNA片段的完整的載體，其能在宿主細胞中(例如，在細菌中)復制。因此，可以產(chǎn)生大量的DNA以用于多種分子生物學應用?；蛘?，已引入DNA的載體可具有特定的目的(例如可以是表達載體)。一旦被引入這樣的表達載休，限制性片段編碼的蛋白質(zhì)可從宿主細胞中的載體表達。一旦表達，所產(chǎn)生的蛋白能被純化以用于其最終用途?；蛘呔唧w地，當本方法用來將DNA片段群引入表達載體時，表達的蛋白可用于篩選(例如，通過對靶分子的結(jié)合親和力)。引導突變進入DNA的多種方法也是已知的。從Barik的研究中已知，用基于PCR的方法引導突變進入線性DNA(5anl，MeAoA/"Mo/ecw/arFo/.尸CiC/o"/"g/Vo/oco/&ec/衍o"p/卵一"6,5.:TC/7e"朋JZ/.fTJawe;@//wma"aiV^s/c，7btowa,iV7)。依照這些方法，在PCR反應中所謂的大引物(megaprimer)己被用于引導突變進入線性模板。然而，這些方法導致線性雙鏈DNA產(chǎn)物，為了產(chǎn)生用于例如放大(scaleup)或者用于蛋白質(zhì)表達的復制型，這些產(chǎn)物本身必需被亞克隆入適當?shù)妮d體。MiyazaJd提出了一種涉及全質(zhì)粒PCR的方法(i^^^h',Me/^AMo/eciJaf5i'o/ogy:D/rec/ec/五vo/wHojiZi6njfyOeario;i:JWeAoc/scmt/JVofocok￡cfeJ/77oW朋c/Georg/叫g謂awa/Vm/wc.7bfo窗，iV7;歷orec/"一es3J:/<753-/05《)。在這種方法中，雙鏈質(zhì)粒在PCR反應中被用作模板，并將包含將被引入的突變的雙鏈PCR產(chǎn)物加入到該PCR反應用于引發(fā)PCR反應。然而，引物和模板的雙鏈性能引起引物鏈和模板鏈自退火而不是交叉退火，因此使用特定的引物與模板比率以使自退火現(xiàn)象最小化。除了由雙鏈模板導致的自退火的問題以外，當雙鏈模板用于PCR反應時，還有進一步的問題。在指數(shù)反應中，當在一輪中引入的錯配在指數(shù)基礎上被攜帶入隨后的每一輪中時，引入錯配的容量是巨大的。而且，這里PCR模板是大模板例如載體，諸如質(zhì)粒，這進一步增加了引入錯配的可能性。使用合成的寡核苷酸去突變DNA也是已知的(Kw"te/Wa/.,f/站"尸A^SPb/S2,/p"a/.,尸/zageD/印/tf少/orAe6"e/ec"o"o/iVove/別m^gP印"c^)。但是，能被化學合成的寡核苷酸的長度是有限制的。另外，為了使合成儀程序化，序列必須是己知的并且預先輸入到合成儀中以用于其產(chǎn)生。因此需要可選的誘變方法。特別地，需要產(chǎn)生能直接被轉(zhuǎn)化入細菌的產(chǎn)物的方法，準備用于下游，例如用于表達篩選中(避免需要另外的消化和連接步驟來將核酸引入恰當?shù)妮d體)。也需要快速、有效的誘變方法以及可經(jīng)改良用于擴增的方法，例如用于產(chǎn)生篩選或產(chǎn)生文庫的群。在一方面，本發(fā)明提供了引導一個或多個突變進入核酸分子的方法，所述方法包括將單鏈形式的誘變引物與親代分子退火，所述誘變引物從模板核酸分子合成并且包含相對于所述親代分子的一個或多個的突變；從所述的誘變引物合成互補的鏈，以生成包含所述突變的環(huán)形核酸分子。在一方面，本發(fā)明提供了引導一個或多個突變進入核酸分子的方法，所述方法包括下列步驟(a)從模板核酸分子合成誘變引物，其中所述的誘變引物包括一個或多個相對于親代分子的突變；(b)分離所述誘變引物的單鏈形式；(c)將所述單鏈誘變引物與所述親代分子的單鏈形式退火；以及(d)從所述的誘變引物合成互補的鏈，以產(chǎn)生包含所述突變的環(huán)形核酸分子。因此，使用適當?shù)拿负驮诒?br>技術領域：
中已知的方法，從模板核酸分子合成誘變引物。優(yōu)選地，使用基于聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，合成所述誘變引物。模板分子和親代分子可以是相同的或者包含相同的序列，其形成誘變引物合成的基礎。因此，在一些實施方式中，用于誘變引物合成的模板序列與在親代分子中發(fā)現(xiàn)的序列是相同的。在這些實施方式中，在誘變引物從模板分子的合成過程中，突變依靠錯配的引入而被引入，例如利用易錯聚合酶進行。因此，在一些實施方式中，誘變引物通過這樣的合成方法來合成，在該方法中，當由第一條鏈合成第二條鏈時，錯配被引入，優(yōu)選地，通過易錯PCR進行(適當?shù)姆椒▽Ρ绢I域的技術人員是已知的，例如Afo/ecw/a/"C/o"/"g:"Za6omto^M朋似/:2""ec/zY/ow，Saw6rooA:"fl/.，/9S9Co/dSpr/wg/Za/^OMrZtf6o尸(^o^y/Ve^w)。在本令頁域，多種試劑盒可用于施行易錯PCR，例如Diversify(BDBilsciences63070)。在另一個方法中，模板分子可被轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌菌株(在本領域中恰當?shù)木晔强色@得的，例如XL1-RED(Stratagene))，這樣將錯配引入DNA序列。當從模板產(chǎn)生誘變引物時，用于將錯配引入誘變引物的其它方法對本領域的技術人員是熟知的。模板和親代分子可以是不同的分子，即可包含在親代分子和模板分子各自序列之間具有差別的區(qū)域。因此，當誘變引物從模板合成時，其與親代分子相比較包含突變(在這種情況下，引入錯配的反應例如易錯PCR，是不需要的)。本領域的技術人員知道用于從模板合成誘變引物的適當?shù)姆磻锖头磻獥l件(見，例如Mo/ecw/a/"C/om'wg:a丄由rato7她""a/:e淑o",Sam6raoA:"a/.，/9卯CoWS/r/"g//a^ow丄0f6orato^尸^m)。當使用聚合酶鏈反應合成誘變弓I物時，本領域的技術人員可依據(jù)使用的模板選擇適當?shù)囊?。在本文中，用于產(chǎn)生誘變引物的引物被稱為初始引物。這些初始引物包括正向和反向的引物，其通?；趯⒈粩U增的序列的末端，即在將是誘變引物的序列的末端。初始引物通常是使用寡核苷酸合成儀通過標準的方法產(chǎn)生的合成的寡核苷酸。這些初始引物可以是任何適當?shù)拈L度，例如大約15到100核苷酸長度、諸如大約15到75個核苷酸長度、大約15到50個核苷酸長度和通常地18到25個核苷酸長度。技術人員依靠例如模板分子的序列、所形成的誘變引物的大小和/或方法的運用，可選擇或設計適當?shù)某跏家?。本發(fā)明的進一步的優(yōu)點源于下述事實，即誘變引物是從模板核酸分子合成的，以致誘變引物的序列可不為使用者所知。例如，當使用針對模板的已知部分的初始引物通過PCR產(chǎn)生誘變引物時，被這些初始引物擴增的區(qū)域可能是未知的。因此，在一些實施方式中，誘變引物的序列在所述退火之前是未知的。當本發(fā)明的方法運用到文庫(下面進一步討論)時，其有特定的應用，但是并不僅限于應用到文庫。當在亞克隆中的具體序列是未知的，但是包含它的載體的邊界是已知的時，還有很多其它的應用(一個實例是"鳥槍法"克隆)。技術人員能基于他的親代分子的知識選擇適當?shù)某跏家?。?yōu)選地，在步驟(b)中限定的單鏈引物通過使用分離介質(zhì)進行分離。例如，合成誘變引物的步驟可將結(jié)合部分(bondingmoiety)引入誘變引物的正鏈或負鏈，隨后，引入其正鏈和負鏈的誘變引物的分離，可通過所述結(jié)合部分與分離介質(zhì)上的其配偶體的結(jié)合而施行。分離介質(zhì)可是任何適當?shù)墓腆w相介質(zhì)，例如珠子或柱子(例如連接有結(jié)合配偶體的珠子或柱子)。更具體而言，結(jié)合部分可被引導進入誘變引物的正鏈(例如，通過在整合結(jié)合部分的誘變反應中使用初始的正向引物)，然后在正鏈形式結(jié)合到分離介質(zhì)后，誘變引物的負鏈被洗脫。優(yōu)選地，結(jié)合部分是生物素，所述的結(jié)合配偶體是鏈霉親和素。其它適當?shù)慕Y(jié)合部分和結(jié)合配偶體對本領域技術人員是熟知的，其包括熒光素和地高辛，以及抗體(包括片段和衍生物)和抗原。技術人員完全知道能被使用的其它結(jié)合部分和結(jié)合配偶體。例如，除鏈親和素以外，與生物素結(jié)合的其它結(jié)合配偶體是可獲得的，例如抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白。技術人員能選擇適當?shù)慕Y(jié)合部分和結(jié)合配偶體，以用于涉及鏈分離的捕獲步驟。另外，生物素和/或鏈親和素的類似物也可被使用(參見，例如JMolBiol(1994)Sep30:242(4):559-65)。生物素和鏈親和素是最優(yōu)選的。例如，用與在上述生物素實例中描述的方式相似的方式，特定的抗原部分在合成過程中可以被引入誘變引物的其中一條鏈中。然后，使用包含針對抗原的抗體的柱子，一條鏈可與另一條鏈分離。另一種方法是使用包含結(jié)合到特定DNA序列的蛋白質(zhì)的分離系統(tǒng)。例如，在本領域中已知，HaeIII甲基化酶與特定的5'DNA序列結(jié)合，與特定的DNA序列結(jié)合的另一個蛋白質(zhì)例子是P2A。對于這種方法的論述，可見BertschingerandNeri"Protein,Engineering,DesignandSelection(2004),Volume17，page699。結(jié)合配偶體和結(jié)合部分之間應該有足夠的親和力去抵擋用于DNA鏈分離的處理。對于鏈分離，可以使用高或低的pH。當使用低pH時，優(yōu)選地^，更優(yōu)選地S2，甚至更優(yōu)選地51。鹽酸和擰檬酸是優(yōu)選的酸。高pH是更優(yōu)選地。當使用高pH時，優(yōu)選地^11，更優(yōu)選地212，甚至更優(yōu)選的^13。優(yōu)選地堿試劑包括氫氧化鈉以及組I的其他氫氧化物例如LiOH或KOH。除了Be(OH)2和Ba(OH)2外，也能使用組II的氫氧化物。最優(yōu)選地，使用氫氧化鈉來分離鏈(例如，0.1NNaOH，其pH為13)。恰當?shù)脑噭┖蜅l件能被本領域的普通技術人員所選擇。最優(yōu)選的是使用生物素和鏈親和素和/或它們的類似物以及前面描述的高pH鏈分離處理?；瘜W基團也可以被用于將其中一條鏈在化學上連接到支持物。例如，合成寡核苷酸以引入特定的化學基團例如胺或硫醇基團是可行的。實際上，這些寡核苷酸能從供應商處購買。當在本發(fā)明的反應中這些寡核苷酸被用作初始引物中的一條時，那么相關的化學基團將被引入所形成的誘變引物的相關的鏈。然后，作為示例，通過將這些化學試劑(其現(xiàn)在被整合入DNA鏈)偶聯(lián)到胺連接試劑或硫醇連接試劑，鏈的分離能得以實現(xiàn)，并且適當?shù)脑噭Ρ绢I域的技術人員是可獲得的。在誘變引物的單鏈形式按前面描述產(chǎn)生以后，其被引導到親代分子以施行退火步驟(c)。這樣，誘變引物的單鏈形式被加到親代分子中用于退火反應。025]在步驟(c)中，依賴于例如誘變引物的大小，誘變引物與親代分子的退火可使用任意適當?shù)臈l件和試劑。適當條件的選擇被本領域的技術人員所理解。作為實例，誘變引物與模板的摩爾比3:l可被使用。適當?shù)姆磻獥l件是在90'C下溫育2分鐘、在50'C下溫育3分鐘以及在20'C下溫育5分鐘。如果需要，本領域的技術人員可以改變條件。在本文，從步驟(d)產(chǎn)生的環(huán)形核酸分子也稱為"誘變引物的產(chǎn)物"(或者，以簡單形式，稱為"產(chǎn)物")。優(yōu)選地，反應產(chǎn)物是可復制的，這意味著一旦轉(zhuǎn)化進入宿主細胞，其能復制以產(chǎn)生本身的拷貝。其優(yōu)點是誘變反應的產(chǎn)物可不需要進一歩的操作而直接轉(zhuǎn)化進入宿主細胞(例如，以從核酸表達蛋白為目的的宿主細胞)，例如不需要用限制性內(nèi)切酶切除相關的核酸部分，也不需要連接入進一步的質(zhì)粒?？蛇x地，或另外地，優(yōu)選的誘變反應的產(chǎn)物是雙鏈的，以允許用限制性內(nèi)切酶進行消化。最優(yōu)選地，環(huán)形分子(誘變反應的產(chǎn)物)是共價閉合的環(huán)狀DNA，優(yōu)選地為雙鏈。如前面談到的，步驟(d)從親代分子產(chǎn)生環(huán)狀反應產(chǎn)物。這種反應涉及從退火的誘變引物起始互補鏈的合成，這樣所形成互補鏈包含了來自誘變引物的突變。通常，反應混合物將包含適當數(shù)量的核苷酸堿基、DNA聚合酶、DNA連接酶和適當?shù)木彌_液(實例給出適當?shù)臄?shù)量)。其在適當?shù)臈l件下溫育以完成第二條鏈的合成。這樣的方法對本領域的技術人員是熟知的。優(yōu)選地，這種反應是非擴增類型的(即非PCR類型的反應)，這樣它不涉及連續(xù)循環(huán)的擴增，因此其被描述為線性反應(即，每親代分子的單鏈產(chǎn)生一條互補鏈)。例如，在本發(fā)明的方法中，對于單鏈親代分子的誘變反應產(chǎn)生了與親代分子的單鏈反義的第二條鏈。因此，當單鏈親代分子是正鏈時，在誘變反應中合成的第二條鏈將是負鏈。通過在誘變反應中使用單鏈模板和單鏈引物，和自退火相關的問題被消除了。而且，誘變反應的產(chǎn)物為雙鏈，同樣地轉(zhuǎn)化細菌比單鏈分子更有效。因此，當轉(zhuǎn)化入細菌宿主時，突變的雙鏈形式將優(yōu)先于單鏈模板轉(zhuǎn)化細菌(有效地，突變形式的選擇優(yōu)先非突變模板的選擇)。本發(fā)明的方法包含前面列出的步驟(在本文中，術語"包含(comprise)"被用作"包括(include)"的意思，即允許一個或多個進一步特征的存在，例如，反應步驟)。因此本發(fā)明的方法可包括進一步的步驟，包括但不限定于本文其它地方提到的那些步驟?？蛇x地，本發(fā)明的方法可以由前面列出的步驟或者本文提到的步驟組成。反應的各個步驟可被組合到單一反應容器中，不需要每一步在分離的容器中施行。例如，將誘變引物與親代分子退火的步驟和合成互補鏈的步驟可以在一個容器中施行。優(yōu)選地，單鏈親代分子是單鏈環(huán)狀DNA。例如，單鏈親代分子可以是從噬菌體顆粒提取的單鏈環(huán)狀DNA。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在所述退火步驟(c)之前，具有將單鏈親代分子加到單鏈引物的分開的步驟。更優(yōu)選地，在步驟(c)之前，所述方法進一步包括分離所述單鏈親代分子的步驟。分別涉及誘變引物和親代分子的步驟的順序是不需要連續(xù)的。因此，在親代分子的單鏈形式被分離之前，誘變引物的單鏈形式可進行分離。或者，在誘變引物的單鏈形式行分離之前，親代分子的單鏈形式可被分離?；蛘?，單鏈誘變引物的分離和單鏈親代分子的分離各自并排進行或同時進行。優(yōu)選地，在步驟(C)之前，本發(fā)明的方法進一步包括對所述單鏈親代分子施行的尺寸排阻步驟。例如，使單鏈親代分子通過多孔樹脂，任何小片段被捕獲在樹脂中，而較大的親代分子則通過。這步驟除去了短的線性DNA片段(被認為是與模板共凈化的降解產(chǎn)物)。通過消除由并不導致誘變的短片段所致的引發(fā)事件，這些片段的除去提高了誘變效率。親代分子將含有用于本方法產(chǎn)物的下游使用所必需的序列元件。用作親代分子的適當?shù)妮d體，在本領域是可獲得的或者可被技術人員使用傳統(tǒng)的技術所構(gòu)建。這些載體包括適當?shù)恼{(diào)控序列，其包括啟動子序列、終止子序列、增強子序列和標記基因等。載體可以是任何適當?shù)念愋?，例如質(zhì)粒、噬菌體和噬菌粒等。例如，當本方法的產(chǎn)物被用于蛋白表達(例如，用于表達產(chǎn)物的篩選)時，親代分子將包括用于在宿主細胞中蛋白質(zhì)表達的必要的序列。適當?shù)谋磉_系統(tǒng)在本領域是充分熟知的，并且許多宿主細胞可被使用。這些宿主細胞包括細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞(例如HeLa、CHO或BHK細胞)。細菌細胞是優(yōu)選地，最優(yōu)選地為大腸桿菌。用于這些宿主每一個的適當?shù)妮d體在本領域是可獲得的，或者可以用常規(guī)方法所構(gòu)建。病毒表達系統(tǒng)也可使用，例如桿狀病毒系統(tǒng)或植物病毒表達系統(tǒng)。用于操作DNA的技術在本領域是充分熟知的(例如克隆、測序、表達和分析等)。已知的方法的進一步細節(jié)可在例如e&77cw,Jwsw6e/"o/e必.Jo/w附/eySo"j,J9P2中找至ll。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法進一步包括轉(zhuǎn)化誘變處理的核酸分子進入宿主細胞的步驟?？墒褂萌魏芜m當?shù)姆椒ㄟM行轉(zhuǎn)化，這些方法對技術人員是熟知的。實例包括熱激法。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化用電穿孔施行。轉(zhuǎn)化誘變處理的產(chǎn)物的步驟可在步驟(d)后直接施行，或者在步驟(d)和轉(zhuǎn)化進入宿主細胞之間也可有中間步驟。下面討論的優(yōu)選的實施方式中，轉(zhuǎn)化入宿主細胞被用于優(yōu)先選擇突變的互補鏈，優(yōu)于未突變的親代分子。本發(fā)明的方法可包括在包含突變的互補鏈被優(yōu)先選擇的條件下施行的步驟。在宿主細胞中，這樣的互補鏈的優(yōu)先選擇可由親代分子的優(yōu)先消化產(chǎn)生，或由互補鏈的優(yōu)先存活產(chǎn)生。親代分子可包含修飾，這樣互補鏈被優(yōu)先選擇。本發(fā)明的方法可進一步包括引入所述修飾的步驟。在優(yōu)選的實施方式中，在親代分子中的修飾包括引入dU代替dT。當所述方法進一步包括引入如此的突變的步驟時，可理解的是，這包括這樣的實施方式在其中親代分子最初包含如此的修飾，并且進一步的修飾在該步驟中被引入；以及也包括這樣的實施方式其中最初沒有修飾，并由該步驟引入任何如此的修飾。dU代替dT的情況可以按下述進行解釋。親代分子在支持尿嘧啶引入的大腸桿菌菌株中生長，例如^"fm"^菌株如CJ236"a/.,(7卵"iWJSM""/ocfe/"￡wz>wo/ogy2000，K)/wwe_33-3(53)。《衣,照、這些方案，親代分子在大腸桿菌中以噬菌粒的形式增殖。單鏈含尿嘧啶的DNA經(jīng)標準的方法進行提取(例如QiagenM13SpinPrepKit)。在誘變引物與單鏈含尿嘧啶的DNA退火之后，互補鏈被合成(在合成反應中使用dT而不是dU)。這導致異源雙鏈DNA分子，在其中，一條鏈(親代鏈)包含dU且不包含需要的突變，第二條鏈(在步驟(d)合成的互補的鏈)包含dT且包含突變。然后所形成的分子被轉(zhuǎn)化進入不支持尿嘧啶存在的大腸桿菌宿主，例如^fwwg+宿主如JM101。因此包含突變的互補鏈優(yōu)先于不包含突變的親代分子進行復制(在""g+宿主中含dU鏈親代被尿嘧啶糖基化酶水解)。其它選擇方法包括甲基化的使用。親代分子將在幾乎所有的大腸桿菌菌株中被甲基化。在步驟(d)，互補鏈能在體外合成，其沒有被甲基化，導致包含甲基化親代鏈和非甲基化互補鏈的異源雙鏈體，該甲基化的親代鏈不包含突變，非甲基化的互補鏈包含突變。然后使用Z)p"l限制性內(nèi)切酶消化異源雙鏈體，該內(nèi)切酶在位點5'-Gn^ATC-3'切割雙鏈DNA且該內(nèi)切酶對甲基化和半甲基化的DNA具有特異性。因此親代鏈被消化，而包含突變的互補鏈沒有被消化?？梢允褂美缰獾目蛇x擇的酶。其它適合的系統(tǒng)和選擇的酶可被使用，只要它們涉及異源雙鏈體親代鏈的降解。實例包括核酸內(nèi)切酶和內(nèi)切糖苷酶。因此，在優(yōu)選的實施方式中，方法涉及包括對核苷酸修飾(例如dU代替dT)的單鏈親代分子的使用。由誘變引物引發(fā)的互補鏈合成產(chǎn)生了新合成的突變鏈，其不包括這種修飾(例如，在合成反應中，使用dTTP而不是dUTP)。未修飾、新合成的突變鏈被優(yōu)選(例如，通過將異源雙鏈體分子轉(zhuǎn)化入宿主細胞，該宿主細胞僅僅支持未修飾的、新合成的突變鏈的復制，或通過使用選擇性酶消化親代鏈)。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了如此方法，其中所述優(yōu)先選擇通過將來自步驟(d)的所述環(huán)形分子轉(zhuǎn)化入宿主細胞來施行，所述宿主細胞對互補的、未修飾的鏈(新合成的、未修飾的突變鏈)具有選擇性。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了將一種或多種突變引入核酸分子的方法，其包括下述步驟(a)從模板核酸分子合成(優(yōu)選通過PCR合成)誘變引物，其中所述的誘變引物包括一種或多種相對于親代分子的突變；(b)分離所述誘變引物的單鏈形式；(c)將所述單鏈誘變引物與所述親代分子的單鏈形式退火，其中所述親代分子包含一種或多種可選擇的修飾；(d)合成所述誘變引物的互補鏈，以制造不包含所述修飾的環(huán)形核酸分子；(e)采取選擇步驟，這樣互補鏈優(yōu)先于親代分子而被選擇。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的方法可被運用到分子群。因此，分子群可使用上述的方法進行突變，或者序列群可被插入到適當載體進行篩選(例如表達篩選)?！?49]例如，本方法可用來生成分子文庫。這樣，多種誘變引物可被用來突變適當?shù)妮d體以產(chǎn)生產(chǎn)品文庫。使用多種誘變引物和多種親代分子的組合誘變也可被用于產(chǎn)生含有大量變換(pernuitation)的文庫。例如在那個分子的第一位置上具有變異的多種親代分子，可以和在第二個位置引入突變的多種誘變引物一起被使用在誘變反應中，因此作為在第一和第二位置的變異的組合和變換的結(jié)果，產(chǎn)生了大量的文庫。這被實施例1所例證，并且被示意性地闡述在圖6中。本方法也可被用于幫助篩選分子群。例如誘變引物群可衍生自模板分子群。然后該群可被引入例如普通載體，諸如表達載體進行篩選。這在實施例2中被例證。因此，在優(yōu)選的實施方式中，本方法被運用于分子群，例如用于篩選分子群或分子群的亞克隆,以產(chǎn)生文庫。因此，可有多種誘變引物、模板和/或親代分子。該群在大小上可至少是1000個分子，更優(yōu)選地至少104個分子，更優(yōu)選地至少105個分子，更優(yōu)選地至少106個分子，更優(yōu)選地至少107個分子，更優(yōu)選地至少108個分子，更優(yōu)選地至少109個分子，更優(yōu)選地至少101()個分子，更優(yōu)選地至少10"個分子，更優(yōu)選地至少1012個分子以及更優(yōu)選地至少1013個分子。與本發(fā)明的方法應用到群特別是文庫相關聯(lián)的優(yōu)點，部分基于如此的事實，即誘變引物的序列在試驗方案開始的時候不需要知道。對模板分子中的短區(qū)域或共同區(qū)或的知識(例如毗鄰可變區(qū)的己知序列或者包含模板分子的載體中的已知序列)使得能夠設計出初始引物。因此，這些初始引物可被用于擴增整個分子群，其具有可變區(qū)以及初始引物所針對的共同區(qū)。同樣地，分子群可被插入到共同的親代分子(例如載體)用于篩選，例如表達篩選，只要在誘變引物和親代分子之間有一個互補區(qū)。該互補區(qū)可以與模板分子中初始引物所針對的區(qū)相同或部分相同。因此，在本發(fā)明的方法中，可有多種模板或模板的多種形式。例如，模板可以是被包括在載體例如質(zhì)粒內(nèi)的不同分子的文庫。因此，然后從這種文庫產(chǎn)生的多種誘變引物被用來產(chǎn)生大量的環(huán)形誘變處理的產(chǎn)物，原因是當互補鏈在步驟(d)中被合成時，多種誘變引物中的每一個將不同突變引入親代分子。當這些多種產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化進入適當?shù)妮d體，例如細菌載體諸如大腸桿菌時，每一個所形成的菌群包含由多種誘變引物中的每一個產(chǎn)生的產(chǎn)物?？蛇x地或另外地，有多種親代分子。因此，在步驟(c)中誘變引物可以與多種不同的親代分子退火。當有多種如先前描述的誘變引物的情況下，其也可以與多種親代分子退火。因此能產(chǎn)生組合效應，在其中，多種誘變引物與多種親代分子退火，產(chǎn)生誘變引物和親代分子的組合。因此，本發(fā)明的方法可包括多種親代分子和/或多種誘變引物分子。這樣的優(yōu)點是其能被用于獲得宏大的所有的親代分子和/或模板，例如組合宏大的所有的親代分子和/或模板。優(yōu)選所有組分的大小為至少100種親代分子和/或模板，更優(yōu)選地至少1000種，甚至更優(yōu)選地至少2500種。使用組合的方法，可產(chǎn)生宏大的所有的親代分子和/或模板，例如在多種親代分子和多種誘變引物組合之后，可以至少有IOOO種所形成的產(chǎn)物，更優(yōu)選地至少104種，更優(yōu)選地至少105種，更優(yōu)選地至少106種，更優(yōu)選地至少107種，更優(yōu)選地至少108種，更優(yōu)選地至少109種，更優(yōu)選地至少101()種，更優(yōu)選地至少IO"種，更優(yōu)選地至少1012種，更優(yōu)選地至少10"種?？捎眠@種方法引入的突變包括取代、缺失和添加。突變可以是多個核苷酸(但是也可僅是單個核苷酸)。例如，在親代分子中可以由誘變引物產(chǎn)生多個取代，或者大量核苷酸可以被缺失或加入。不同突變類型的組合也是可能的。因此，可有取代和缺失的組合、取代和添加的組合、添加和缺失的組合，或者添加、缺失和取代的組合。也可有多個突變區(qū)，例如兩個區(qū)域中，一個或多個核苷酸被取代，并且被誘變引物沒有產(chǎn)生變化的區(qū)域所分開(因為在這個中間區(qū)(脈間區(qū)，interstitialregion),在誘變引物和親代分子之間具有互補性)。進一步的可能性包括在其中一個或多個核苷酸被取代的多個區(qū)域被互補區(qū)分開；在其中一個或多個核苷酸被添加的多個區(qū)域被互補區(qū)分開；在其中一個或多個核苷酸被缺失的多個區(qū)域被互補區(qū)分開。組合也是可能的。因此可以有核苷酸被取代的一個或多個區(qū)域和核苷酸被添加的一個或多個區(qū)域被互補區(qū)隔開；核苷酸被取代的一個或多個區(qū)域和核苷酸被缺失的一個或多個區(qū)域被互補區(qū)隔開；核苷酸被缺失的一個或多個區(qū)域和核苷酸被添加的一個或多個區(qū)域被互補區(qū)隔開；核苷酸被取代的一個或多個區(qū)域、核苷酸被添加的一個或多個區(qū)域和核苷酸被缺失的一個或多個區(qū)域被互補區(qū)隔開。突變的性質(zhì)和數(shù)量被親代分子和誘變引物之間錯配的數(shù)目和性質(zhì)所決定。因此，當與親代分子相比在誘變引物上有單核苷酸的添加時，那么單核苷酸將經(jīng)由誘變反應而被添加。當與親代分子相比在誘變引物上有分散的錯配區(qū)(例如，前述的分散的添加區(qū)、缺失區(qū)和取代區(qū))時，作為誘變反應的結(jié)果將產(chǎn)生分散的相應突變區(qū)。誘變引物可以替代親代分子上的一段核苷酸。例如，誘變引物可包含與親代分子具有例如70%互補性的區(qū)域，這樣在誘變反應之后，該親代分子上的區(qū)域被來自誘變引物的70%互補區(qū)所替代。為了誘變引物退火，在誘變引物和親代分子之間必須有一定程度的互補性。典型地在誘變引物的末端具有最小的互補區(qū)域。當誘變引物已經(jīng)通過PCR產(chǎn)生，初始引物(前面定義的)與親代分子互補時，那么在誘變引物的末端提供具有18到25個堿基對互補性的最小區(qū)域。相對于整個誘變引物的互補程度優(yōu)選地為至少60%,更優(yōu)選地至少70%，更優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地至少90%,更優(yōu)選地至少95%，更優(yōu)選地至少97%，更優(yōu)選地至少98%和更優(yōu)選地至少99°/。。作為實例，至少97%互補性與在830個核苷酸長的誘變引物中有20個錯配相對應(810個互補)。至少60%互補性與在730個核苷酸長的誘變引物中的錯配區(qū)域相對應，且在830個核苷酸長的誘變引物中與親代分子具有70%的同一性("70%區(qū)域"的兩個末端之一與親代分子完全互補)。誘變引物的非限制性的實例在圖中顯示。誘變引物可以為100到4000個核苷酸長度，優(yōu)選地200到3000個核苷酸，更優(yōu)選地300到2000個核苷酸，更優(yōu)選地400到1500個核苷酸，更優(yōu)選地400到1000個核苷酸，甚至更優(yōu)選地400到850個核苷酸長度或800到1500個核苷酸長度。誘變引物的大小可取決于親代分子的大小。例如，當親代分子為5.5kb，誘變引物優(yōu)選地最長為lkb。因此，誘變引物優(yōu)選地為親代分子大小的大約1/50到1/5，更優(yōu)選地1/25，更優(yōu)選地為親代分子大小的3/10，最優(yōu)選地在核苷酸長度上為親代分子大小的大約1/5。優(yōu)選地，在步驟(c)中，誘變引物與親代分子的摩爾比為大約2:1到5:1，最優(yōu)選地大約3:1。本發(fā)明方法的優(yōu)選運用包括文庫的篩選和產(chǎn)生，特別是抗體文庫。例如，親代分子可以是用于抗體或抗體結(jié)構(gòu)域表達的載體。在引導突變進入親代分子之后(例如通過從包含抗體結(jié)構(gòu)域文庫的模板產(chǎn)生誘變引物)，所形成的突變親代分子能在適當?shù)乃拗髦羞M行表達，并可針對適當?shù)目乖M行篩選(關于進一步的信息，見&Mg//flw"a/.，(7鄉(xiāng)，脂廳5/0,e由o/ogy'^)/,e",pp/〃五^wAe/"/.,(2W".乂Mo/.3M,/;/W-7/S)。其它抗體相關的實例包括抗體結(jié)構(gòu)域亞克隆進入免疫球蛋白受體質(zhì)粒，例如IgG受體質(zhì)粒(例如pEUIgG表達載體，見尸era/ce^/(7M7)/S7.'9-/S)。術語抗體描述了免疫球蛋白并且包括天然和合成的類型。該術語包括具有抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，該多肽是抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基本上與抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源。實例包括Fab(VL,VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域)；scFv(被連接體例如(Gly-Gly-Gly-GIy-Ser)3連接的VH結(jié)枸域和VL結(jié)構(gòu)域，例如Birdetal(1988),Science,242,423-426,Hustonetal.(1988),PHASUSA,85pp5879-5883;Fv(單個抗體的Vl和VH結(jié)構(gòu)域)；Fd(VH和CHl結(jié)構(gòu)域)；dAb(Holtetal(2003),TrendsinBiotech.21pp484-490)和雙抗體(WO94/13804)。因此，在優(yōu)選的實施方式中，親代分子、模板或誘變引物包含編碼抗體可變結(jié)構(gòu)域的序列?？贵w可變結(jié)構(gòu)域可以是Vh或V^結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，親代分子包含scFv。本方法也可用來改組抗體結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生所有抗體類型。因此，親代分子可包含抗體VH結(jié)構(gòu)域，誘變引物可包含抗體VL結(jié)構(gòu)域，或者親代分子可包含抗體VL結(jié)構(gòu)域，誘變引物可包含抗體VH結(jié)構(gòu)域?？贵wVH結(jié)構(gòu)域的文庫可以與抗體VL結(jié)構(gòu)域的文庫組合(改組)，反之亦然。因此兩個文庫之一可被用作模板以形成多種誘變引物，另一個文庫可作為在多種親代分子中的文庫而存在。因此，本發(fā)明提供了方法，在其中親代分子包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域，誘變引物分子包含抗體VL結(jié)構(gòu)域以突變親代分子的VL結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明也提供了方法，在其中，親代分子包含抗體VL結(jié)構(gòu)域和抗體VH結(jié)構(gòu)域，誘變引物分子包含抗體VH結(jié)構(gòu)域以突變親代分子上的抗體VH結(jié)構(gòu)域。這樣，抗體VH結(jié)構(gòu)域的文庫可與抗體VL結(jié)構(gòu)域的文庫相組合(被改組)，反之亦然?？善谕氖?，親代分子的VL和VH結(jié)構(gòu)域中的僅僅一個被突變，或者可期望的是，親代分子的Vl和VH結(jié)構(gòu)域都被突變。也可以設想單結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)，例如其中構(gòu)建物包含VL結(jié)構(gòu)域(但是沒有VH結(jié)構(gòu)域)，且該VL結(jié)構(gòu)域被VL誘變引物所突變，或者例如，其中構(gòu)建物包含VH結(jié)構(gòu)域(但是沒有Vt結(jié)構(gòu)域)，且該VH結(jié)構(gòu)域被VH誘變引物所突變。本發(fā)明提供了所有這些可能性。因此，本發(fā)明包括親代分子上的VH和VL結(jié)構(gòu)域?qū)⒈话恳粋€這些結(jié)構(gòu)域的誘變引物所突變的情況。因此，VH誘變引物將誘變親代分子上的VH結(jié)構(gòu)域，VL誘變引物將誘變親代分子上的VL結(jié)構(gòu)域。包含這兩種結(jié)構(gòu)域的單一誘變引物也能被使用。因此，本發(fā)明提供了方法，其中第一和第二誘變引物被用于突變親代分子，包含抗體VH結(jié)構(gòu)域的第一誘變引物突變親代分子上的VH結(jié)構(gòu)域，包含抗體VL結(jié)構(gòu)域的第二誘變引物突變親代分子上的V^結(jié)構(gòu)域。第一和第二誘變引物可被用在獨立的誘變反應步驟中，在這些情形中，第一和第二誘變引物可以以任何順序參加獨立的誘變反應(即，第一誘變引物能在涉及第二誘變引物的誘變反應之前或之后被用于誘變反應中)。另一個可能性是所述的第一和第二誘變引物被用在相同的誘變反應步驟中。在前面描述的方面中，在抗體上下文中，本發(fā)明的方法被用來組合(或改組)VH結(jié)構(gòu)域的文庫與V^結(jié)構(gòu)域的文庫，該方面能被運用到結(jié)構(gòu)域的組合改組被需要的其他系統(tǒng)中，例如通常涉及免疫球蛋白和多結(jié)構(gòu)域蛋白的其它分子。因此，本發(fā)明提供結(jié)合第一結(jié)構(gòu)域的文庫和第二結(jié)構(gòu)域的文庫的方法，如前面對抗體方面所描述的(在其中，第一結(jié)構(gòu)域是VH結(jié)構(gòu)域，第二結(jié)構(gòu)域是VL結(jié)構(gòu)域，反之亦然)。在一些優(yōu)選的實施方式中，親代分子包含編碼scFv的核酸。本發(fā)明也提供了實施上述方法的試劑盒。例如，這樣的試劑盒可包括適合從模板分子合成單鏈引物分子的初始引物、單鏈親代分子和使用說明書。親代分子可按本文描述地進行修飾。也可以包括適當?shù)脑噭┖途彌_液，例如本文涉及的那些試劑和緩沖液。也可包括在本發(fā)明方法的任何實施方式中所限定的進一步的試劑盒成分。如前面談到的，本發(fā)明的方法和試劑盒具有大量的應用，包括下列應用。本方法能被用于亞克隆，例如核酸區(qū)能通過步驟(a)產(chǎn)生，并通過誘變反應被引入適當?shù)妮d體，這樣消除了核酸消化和連接的需要。例如靶抗原能被克隆到表達載體。本方法可被運用于前述文庫的產(chǎn)生和篩選。更具體的使用在下面進行了概述。本文描述的方法能被用于將單鏈Fv(scFv)片段(通過連接體，VH和VL結(jié)構(gòu)域作為單肽而被連接)轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG分子。因此Vh和VL結(jié)構(gòu)域可被引入IgG一VH和IgG一VL受體質(zhì)粒。對所謂的通用寡核苷酸的初始引物的使用，涉及包含scFv的載體的不可變部分，或者涉及兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接體(例如一個初始引物涉及每個結(jié)構(gòu)域上游或下游的序列，第二個初始引物涉及兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接體)。例如，如果使用Vaughan等描述的scFvs，其中一個初始引物能涉及pCantab6中VH結(jié)構(gòu)域上游的序列，另一個涉及連接體(即涉及編碼(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3的序列的部分)。本發(fā)明的方法也能被用以產(chǎn)生天然文庫(即來自非免疫的人類供體的文庫)。目前這些文庫通過對來自非免疫人類供體的天然抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域進行PCR來產(chǎn)生，然后被限制性消化并連接入受體質(zhì)粒。使用本發(fā)明的方法，誘變引物可從這些衍生自非免疫供體的PCR產(chǎn)物中分離出來。而且，上述方法的使用去除了對限制性消化和連接的需要。適當?shù)囊锟苫谥劓湹拿恳欢撕洼p鏈的每一端的序歹U(見，例如Vaughanetal，)。本發(fā)明的方面和實施方式將通過實施例并參考下列的圖進行說明，在其中附圖簡述圖1表示在本發(fā)明的方法中使用的誘變引物。在每一情況下中，數(shù)字是近似的堿基數(shù)目，錯配區(qū)用灰色表示。圖la表示在實施例l中(VhA^重組)使用的誘變引物1。圖lb表示在用于VHCDR3變體的實施例2中(核糖體展示亞克隆)中使用的誘變引物2a。圖lc表示在用于V^DR3變體的實施例2中使用的誘變引物2b。圖ld表示用于產(chǎn)生VH或Vt變體的誘變引物?；疑珔^(qū)域與實施例2的模板有大約70%同一性。圖le表示用于克隆入IgG受體質(zhì)粒的誘變引物。圖lf表示用于克隆入Vh和V!^受體質(zhì)粒以創(chuàng)建天然文庫的誘變引物。圖2表示用于誘變引物合成的初始引物的位置，該誘變引物用于VH/VL重組實施方式(例如實施例l)。A和B分別表示正向和反向引物。圖3表示用于誘變引物合成的初始引物的位置，該誘變引物用于核糖體展示方面(例如實施例2)。A和B分別表示正向和反向引物。圖4表示實施例1的誘變過程的結(jié)果。圖5是表示本發(fā)明的誘變過程的示意圖。在該示意圖中，來自在VHCDR3中包含特定突變的含scFv質(zhì)粒的VHCDR3(用星號表示)通過PCR擴增，并且依靠在PCR反應中利用引物而引入的生物素被分離入單鏈形式。單鏈DNA被從包含scFv的質(zhì)粒純化，其在VLCDR3中包含特定的突變(也用星號表示)。在包含該VHCDR3突變的單鏈PCR產(chǎn)物和包含該VHCDR3突變的單鏈質(zhì)粒之間的誘變反應中，兩個突變組合以產(chǎn)生包含scFv的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含這兩個突變。圖6表示本發(fā)明的組合實施方式。在圖的頂部顯示了包括突變a、b和c的多種模板分子。包含突變的這些分子區(qū)域通過PCR進行擴增并且使用生物素被分離進多種單鏈誘變引物。在圖的底部顯示了包含突變X、y和z的多種親代分子。單鏈DNA被從這些分子產(chǎn)生，以產(chǎn)生多種親代分子，每一種親代分子包含突變x、y或z。在誘變反應中，包含突變a、b和c的誘變引物被用以突變多種親代分子。這產(chǎn)生了表示在圖的右部的產(chǎn)物組合。實施例實施例1:重組最優(yōu)化的Vh和Vl區(qū)域的誘變方法L灘祭述已經(jīng)表明，在體外抗體親和成熟期間，最優(yōu)化的VH和Vt區(qū)的重組，能導致效價(potency)增加(Osbourne/"/"(1996)，Immunotechnology,Vol2,pp181-196)。在本實施例中，本發(fā)明的誘變方法被用于將VHCDR3己被隨機化的一個變體文庫和V《DR3已被隨機化的另一個變體文庫重組。這兩個變體文庫含有同源的抗體序列，除了在VhCDR3和V^CDR3中的短隨機化區(qū)域之外。在隨機化以后，Vh和V^文庫各自經(jīng)歷了兩輪噬菌體展示選擇，以提高親合力。兩輪選擇的Vh和Vi產(chǎn)物——其中每一種包含估計的105到106不同的變體序列——形成了本實施例描述的重組方法的起始點。在該實施例的方法中，通過在5，端使用生物素化的PAMA-IN寡核苷酸，3'端使用H-LINK寡核苷酸，經(jīng)PCR擴增VH文庫(見圖2)。在捕獲在鏈親和素珠子上之后，非生物素化的鏈被洗脫，這樣形成了誘變引物。在從w"g-大腸桿菌菌株CJ236獲得噬菌體顆粒之后，Vt文庫作為單鏈質(zhì)粒被制備。通過將編碼誘變引物的Vh和代表VL文庫的單鏈質(zhì)粒放置在一起，Vh和VL區(qū)的重組發(fā)生了。2^^穿麼游沒伊從M13分離的dU-ssDNA模板是正鏈，所以誘變引物與正鏈互補(即，誘變引物是負鏈)。通過生物素化正向引物，在捕獲在鏈親和素上之后，負鏈能被洗脫。使用如下的寡核苷酸(5'到3'):Bio-PAMA-IN:生物素-GCGGCCCAGCCGGCCATGGH-LINK:ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCJ伊為cfeP/flS附WZ)iVv4游F丄產(chǎn)欽游劍吝1.在小錐形瓶中，將100pil在pCantab6(Vaughanetal.)中的所有Vj勺甘油原液接種到50ml2XTYA中。2.培養(yǎng)物在37°C、300rpm下生長2小時。3.細胞在50mlFalcon管中3200rpm下離心10分鐘沉淀下來。4.在lml水中，施行QiagenHiSpeedPlasmidMidiKit試驗方案以分離雙鏈質(zhì)粒DNA(dsPlasmidDNA)。5.DNA濃度用UV光譜或瓊脂糖凝膠進行檢査。4rfC7-M"7VJ漠嫌劍吝然后，得自第三部分的dsPlasmidDNA被用在下列的流程中試劑在pCantab6(Vaughanetal.)中所有VL的質(zhì)粒Midiprep于乙醇中的10mg/ml的氯霉素(CAM),儲存在-20'C在水中的0.25mg/ml的尿苷(SigmaU-6381)，儲存在4'C2XTYAG(+10jug/mlCAM)平板(TY如Sambrooketal，supra所描述的，加入100ng/ml的氨節(jié)青霉素(A)和2%葡萄糖(G)，氯霉素(CAM)以原液加入到8(^1乙醇中，并且在平板上鋪開)。CaCl2感受態(tài)CJ236的制備1.用大腸桿菌CJ236細胞(例如，由Biorad供應)的單菌落接種5ml2XTY培養(yǎng)基(加10pg/mlCAM)。細胞在37°C、300ipm下生長過夜。在CJ236中CAM選擇F'游離體。2.用5ml過夜的培養(yǎng)物接種500ml2XTY，并且在37'C下?lián)u動培養(yǎng)。3.當在600nm的OD達到0.9時，通過在4'C下離心(5分鐘、5,000rpm)收獲培養(yǎng)物。上清液被到出，細胞沉淀被排干。細胞被輕輕地重新懸浮于100mllOOmM的冰冷MgCb中。4.通過離心(在4。C下離心)，再一次收獲細胞，并且沉淀被排干。細胞被輕輕地重新懸浮于20mllOOmM的冷CaCl2中，直到獲得平穩(wěn)的懸浮液。加入200ml100mM的冷CaCl2并混合。細胞被置于冰上30-90分鐘。5.在低溫離心機中通過離心收獲細胞，并排干沉淀。細胞被重新懸浮在20ml85mM的冷CaCl2禾Q15%甘油中。6.立刻等分細胞懸浮液(如果需要，將整分試樣冷藏于干冰/乙醇中)。轉(zhuǎn)化模板進入CJ2361.來自前面的CJ236CaCl2感受態(tài)細胞在冰上解凍(整個試驗方案中都保持在冰上)。2.在PCR管中，將5pl包含得自第三部分的所有Vl的pCantab6質(zhì)粒加入到ioow感受態(tài)細胞中。3.在PCR儀模塊上運行下列程序0.rC下30分鐘42'C下45秒0.rc下2分鐘4.在0.5ml的2XTY中，將細胞轉(zhuǎn)移到15ml的Falcon管。5.在37°C、200rpm的搖動下細胞被培養(yǎng)45-60分鐘。6.將0.5ml細胞鋪于2XTYAG(+10嗎/mlCAM)的平板上，并在37'C溫育該平板。從CJ236獲得噬菌體以及DNA制備1.從前面步驟6的CJ236轉(zhuǎn)化子獲得的菌苔被刮入lml的2XTY中。500pl被接種入50ml的2XTYCAG中(即2%葡萄糖、100嗎/mlAMP禾H10]ig/mlCAM)并且在37。C，300rpm下溫育，直至ijOD6(K)=0.5至ij1。2.通過OD讀數(shù)(OD^為1對應于5Xl()s個細胞/ml)計算細胞密度，加入野生型K07輔助噬菌體(AmershamBiosciencesM13K07輔助噬菌體)以確保10噬菌體1細胞的感染復數(shù)(MOI)(野生型K07原液通常在0.33)al中包含10ie噬菌體)。然后細胞在37t:下溫育10分鐘(不搖動)以便能夠進行感染。3.將lml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到30ml補充了25pg/mlKAN(用來選擇K07)和0.25ng/ml尿苷(允許包含尿苷的模板合成)的2XTYAC中。其在37'C、300rpm下溫育過夜。4.在SS-34轉(zhuǎn)子中，細胞在15000rpm、2'C下離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的管中，并且加入1/5體積的PEG-NaCl(20%PEG8GG()，2.5MNaCl)。其在室溫下溫育5分鐘，然后在SS-34中在10000rpm、2。C下離心10分鐘。5.成生小的白色噬菌體沉淀。上清液被輕輕倒出，并在薄紗(tissue)上倒轉(zhuǎn)管以排干。噬菌體沉淀被重新懸浮在0.5ml的PBS中(沖洗管壁以獲得盡可能多的噬菌體)。轉(zhuǎn)移噬菌體到離心管(eppendorf)，在15,000rpm下于微型離心機中離心5分鐘以沉淀剩余的不溶物。上清液被轉(zhuǎn)移到新的離心管中。6.使用QiagenQiaprepSpinM13試劑盒純化dU-ssDNA模板，以加入QiagenMP緩沖液(錢wWa/,為開始。在lOO^il10mMpH8.0的Tris-HCl中洗脫DNA，并在1%瓊脂糖凝膠上檢査。ssDNA制備物在2.5kb的位置上跑出一條清晰的帶，并被用在第6部分的誘變反應中。5.來房^f,F//(^/^e/^to/^J游mZ)A^4誘變歹/激游劍吝使用寡核苷酸bio-PAMA-IN和H-LINK通過PCR從pCantab6擴增代表所有不同Vh序列的區(qū)域。標準的PCR條件可被用于在第3部分制備的中量制備(midiprep)模板的連續(xù)稀釋物。Abgene(2X)Mastermix中量制備模板Bio-PAMA-INH-LINK水在"/。瓊脂糖凝膠上運行每個PCR5^1的產(chǎn)物(這樣確定了產(chǎn)物的大小，顯示了產(chǎn)量等)。1.將microMACS柱(MiltenyiBiotec:130-042-701)放置在磁性支架中。2.使250^1IX結(jié)合緩沖液(2X結(jié)合緩沖液10mMTrispH7.5、2MNaCl、lmMEDTA和0.1%Tween20)流過柱子。3.將45|xlPCR反應物與105^1microMACS鏈親和素珠子(MiltenyiBiotec:130-074-101)和150pl2X結(jié)合緩沖液混合，并溫育兩分鐘。4.DNA+珠子被施用到microMACS柱，并流過柱子。5.用2XlmllX結(jié)合緩沖液洗滌柱子。6.用20(^10.INNaOH(新制的)將DNA洗脫到離心管中。7.向洗脫的DNA，加入20(xlpH5.2的醋酸鈉、550|_il乙醇和1^1糖原。8.在-70'C下溫育30分鐘。9.在13,000rpm下離心10分鐘以沉淀DNA。除去上清液，并替換以500W70%乙醇。10.在13,000rpm下進一步離心5分鐘，除去上清液，在37'C熱模塊下風干2分鐘。DNA被重新懸浮于水中。^艘《應試劑TM緩沖液(10X):500mMTris-HCl，100mMMgCl2，pH7.5lOmMATP:(通過將0.6052gATP溶解于1ml水中并且用0.1MNaOH調(diào)節(jié)pH為7.0，制成1M原液。原液按l:IOO的比例稀釋以制成10mMATP——能被儲存于-7(TC)lOOmMDTT:(通過將0.1542gDTT溶解于lml0.01M醋酸鈉(pH5.2)制成1M原液。原液按1:10的比例稀釋以制成lOOmMDTT——能被儲存于-20'C)酶得自NewEnglandBiolabs(NEB)的T4多核苷酸激酶、T4DNA連接酶和T7DNA聚合酶。25mMdNTPsQiagenQi叫uickPCR純化試劑盒(Qiagen)誘變f/鍵纖眾下列物質(zhì)被加入到離心管ssDNA誘變引物l.Ong(1.0嗎/132000道爾頓=7.6皮摩爾)TM緩沖液(IOX)5.5nllOmMATP5^1簡mMDTT2.5pl加水至總體積為53pl。加入2pl(20U)T4多核苷酸激酶(10U/pl)，并且在37。C下溫育1小時。"J,/游比率，遂變f/激與漠叛返乂下列物質(zhì)被加入到離心管dU-ssDNA模板(得自第4部分)4.4jag(4.4嗎/1，750,000道爾頓=2.5皮摩爾)磷酸化的誘變引物l.O嗎(l.O嗎/132,000道爾頓=7.6皮摩爾)TM緩沖液(10X)25|^1加水至總體積25(^1。該250^x1在90'C下溫育2分鐘、5(TC下3分鐘以及2(TC下5分鐘，以使誘變引物與模板退火。為了混合退火的寡核苷酸/模板，被加入下列物質(zhì)10mMATP10|il25mMdNTP，s,lOOmMDTT，30韋氏(Weiss)單位的T4DNA連接酶(6U/pl"5pl30單位的T7DNA聚合酶(10U/ul)3^1*標記在酶管上的單位不是韋氏單位——6U/pl是酶活性的正確濃度。反應物在2(TC下溫育3小時。使用QiagenQiaquickPCRPurification試劑盒，將每一個反應物親和純化到35jil水中。lpl的每個反應物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，并且與用和不用誘變引物的反應產(chǎn)物相比較。在"沒有引物"的電泳泳道上，觀察到強的ssDNA帶(2.5kb為pCantab6)。在"具有引物，，的電泳泳道中，該ssDNA帶在強度上降低，并且被一條或多條對應于cccDNA的較大的帶所代替(共價閉合環(huán)形DNA)(對于pCantab6大于3kb)。7冶魏yUr厲嫌r。，s根據(jù)下列流程，制備新的電穿孔感受態(tài)TG1細胞(Stmtagene):1.使用來自TG1基礎培養(yǎng)基平板的菌落接種適當體積的2TY培養(yǎng)基。細胞在25'C、300rpm下培養(yǎng)過夜。2.使用10ml(每瓶)過夜培養(yǎng)物接種5個每個包含500ml2TY的瓶。其在25°C、300-350rpm下生長，直到00600為約0.5-0.6[通常進行大約2-3小時]。3.6X500ml離心瓶和SorvalSLA3000轉(zhuǎn)子被預冷到2°C。4.一旦達到最適宜的OD，細胞在冰上于離心瓶中冷卻30分鐘并且在2t:、4,000rpm下離心30分鐘。5.上清液被倒出，沉淀被重新懸浮在小體積冰冷的高壓蒸汽處理過的MilliQ水中。用水增大至300ml，并且在2°C、4，000rpm下離心15分鐘。6.倒出上清液并且重新懸浮在小體積的剩余水中，然后加入300ml水并按照前述離心。7.在-20。C預冷8X50mlFalcon管。Sorvall臺式離心機(benchtopcentrifuge)被預冷到2'C。8.倒出上清液，且沉淀被重新懸浮在剩余水中。9.一旦重新懸浮，懸浮液被倒入Falcon管，并且加水到50ml。然后在3200rpm下離心IO分鐘。10.除去上清液，每一個沉淀被重新懸浮在少量的水中，細胞被組合入一個50ml的Falcon管，加水至50ml，然后按上面所述離心。11.除去上清液，并且在剩余體積的水中重新懸浮細胞。為了進行電穿孔，使用連續(xù)稀釋的細胞(僅細胞)以確定適當?shù)臐舛?例如細胞以100%、80%、60%和50%稀釋)。僅僅用細胞作為對照，被鋪在2TYAG上，用于證實在感受態(tài)細胞制備中沒有氨芐青霉素抗性細胞。使用下列設施，在單個小池(cuvette)(Bio-Rad大腸桿菌Pulser小池0.2cm電極間隙(electrodegap);目錄編號165-2086)中，全部35ml完整的誘變反應物被直接電穿孔進入400W電穿孔感受態(tài)TG1細胞2.5kV場強200Q電阻25pF電容時間常數(shù)4.2ms在電穿孔之后，lml2TYG立刻被加到小池中，并且將細胞轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中。小池用另外的lml2TYG沖洗，以將細胞從小池的底部(用伸長的P200移液管尖端)轉(zhuǎn)移到Falcon管。然后轉(zhuǎn)移到37'C、大約150-250rpm的培養(yǎng)器中，使細胞恢復l小時。每一個文庫的連續(xù)稀釋物(每個Falcon管)被鋪在小的2XTYAG平板上用來估計文庫大小，和在大的2XTYAG平板上的剩余細胞。在鋪于大的平板之前，剩余的細胞被離心(3200卬m，IO分鐘)并重新懸浮于lml2TYG。該平板在30°C下溫育過夜。然后，將文庫從大的平板上刮入到5ml2XTY中，然后補充2.5ml50%甘油。通過檢測1:IOO稀釋液的0D6W(OD卿為1等于5X1()S細胞/ml)，可計算細胞密度。對于儲存，每個文庫的多個整分試樣被儲存于-7(TC，每個整分試樣包含超過文庫大小10倍的細胞。然后，解凍一個整分試樣并且加入到500ml培養(yǎng)物中用于獲得作為噬菌體的文庫，例如，用于通過親和結(jié)合選擇噬菌體(/7"wA:/mW"/(7卯"該方法的結(jié)果如下，并且也顯示在圖4中:<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實施例2:核糖體展示產(chǎn)物的亞克隆本實施例涉及源自核糖體展示的產(chǎn)物的亞克隆。在本亞克隆方法中，模板是scFv，描述為親代scFv。使用的方法如實施例l。初始的PCR步驟，其通過使用初始引物產(chǎn)生誘變引物，施行在核糖展示文庫的產(chǎn)物上(即，RT-PCR產(chǎn)物)，見JeAvww/M"fl/f20W」iW^S,w/9&"o/,在圖3里，展示了用作初始PCR引物的寡核苷酸。因此，使用生物素化的正向引物和反向引物mycRestore，從核糖體展示產(chǎn)物，經(jīng)PCR擴增不同的scFv序列的全部組分(JermutusetalP.N.A.S2001，Volume98pp75to80)，其中正向引物在Vh幵始端退火，反向引物mycRestore在myc標記處引發(fā)，myc標記就在V^末端的下游(見圖3)。根據(jù)在重鏈開始端的氨基酸序列，使用Bio-EVQ或者Bio-QVQ。使用標準的PCR條件(見實施例1以獲得詳細內(nèi)容)。將所得到的PCR產(chǎn)物分離成單鏈形式，以形成如在實施例1中描述的誘變引物，并且在誘變反應中使用。用于誘變反應的親代分子是于pCantab6中的單鏈scFv(^wg/uweM/.,(7卯"A^ww5/Wec/wo/ogMfe/wme"/7/JW/oW)。在這個實施例中，僅使用單一序列的scFv親代pCantab6。因此，單一的親代分子被多種誘變引物所誘變，并因此將來自核糖體展示的多種產(chǎn)物亞克隆入親代質(zhì)粒。單鏈親代分子的制備，用以誘變反應和細胞轉(zhuǎn)化的試驗方案如實施例1。在電穿孔后，誘變反應的產(chǎn)物產(chǎn)生大于10,000轉(zhuǎn)化子。相反，沒有誘變引物和酶的對照產(chǎn)生大約io個轉(zhuǎn)化子。上述實施例的結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>上面涉及的誘變引物展示在圖中。通過對比，當合成的寡核苷酸被用于誘變(典型地，18個堿基錯配的任意一邊，有18個互補的堿基)時，平均的誘變效率為64%(n-350序列)。實施例3:尺寸排阻程序通過在誘變反應之前，對在實施例2中的單鏈親代分子施行尺寸排阻步驟，進一步提高了誘變效率。這導致誘變效率提高1.5倍(通過序列分析測量，計算成功突變序列的數(shù)目)。權(quán)利要求1.一種將一個或多個突變引入核酸分子的方法，所述方法包括下列步驟(a)從模板核酸分子合成誘變引物，其中所述誘變引物包含相對于親代分子的一個或多個突變；(b)分離所述誘變引物的單鏈形式；(c)將所述單鏈誘變引物與所述親代分子的單鏈形式退火；以及(d)從所述誘變引物合成互補鏈，以產(chǎn)生包含所述突變的環(huán)形核酸分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述退火步驟(c)之前，所述單鏈引物被與所述單鏈親代分子混合。3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(b)的所述單鏈引物利用分離介質(zhì)進行分離。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，在步驟(c)之前，進一步包括分離所述單鏈親代分子的步驟。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，在步驟(c)之前，進一步包括對所述單鏈親代分子施行的尺寸排阻步驟。6.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述單鏈親代分子是單鏈環(huán)狀DNA。7.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述親代分子是表達載體或噬菌體展示載體。8.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述環(huán)形分子是共價閉合的環(huán)狀DNA。9.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，進一步包括將所述誘變的核酸分子轉(zhuǎn)化入宿主細胞的步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化使用電穿孔施行。11.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其包括在包含突變的所述互補鏈被優(yōu)先選擇的條件下施行的步驟。12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述互補鏈的優(yōu)先選擇由所述親代分子的優(yōu)先消化所致。13.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述親代分子包含修t市，這樣所述互補鏈被優(yōu)先選擇。14.權(quán)利要求13所述的方法，進一步包含引入所述修飾的步驟。15.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的方法，其中所述修飾是引入dU代替dT。16.權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的方法，其中修飾是甲基化作用或者引入條件致死基因。17.權(quán)利要求11到16任意一項所述的方法，其中所述優(yōu)先選擇通過將來自步驟(d)的所述環(huán)形分子轉(zhuǎn)化入宿主細胞來施行，所述宿主細胞對互補的未修飾鏈具有選擇性。18.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述誘變引物通過基于PCR的方法所合成。19.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述誘變引物通過這樣的合成方法所合成，在該合成方法中，當從第一條鏈合成第二條鏈時，錯配被引入。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述方法是易錯PCR。21.根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的方法，其中用于所述誘變引物合成的模板的序列與在所述親代分子中找到的序列相同。22.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中合成所述誘變引物的步驟將結(jié)合部分引入所述誘變引物的正鏈或負鏈，并且所述分離是通過將所述結(jié)合部分結(jié)合至所述分離介質(zhì)上的其結(jié)合配偶體而進行的。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述結(jié)合部分被引入所述誘變引物的正鏈，并且所述誘變引物的負鏈被從所述分離介質(zhì)中洗脫。24.根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的方法，其中所述結(jié)合部分是生物素，并且所述結(jié)合配偶體是鏈霉親和素。25.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述突變包括取代。26.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述突變包括缺失。27.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述突變包括添加。28.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述突變是多個核苷酸的突變。29.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述誘變引物與所述親代分子具有至少80%的互補性。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述誘變引物與所述親代分子具有至少90%的互補性。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述誘變引物與所述親代分子具有至少95%的互補性。32.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述誘變引物的大小為從100個核苷酸到4000個核苷酸。33.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(c)中，誘變引物與親代分子的摩爾比是大約3:1。34.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中有多種親代分子和/或多種誘變引物分子。35.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其中所述親代分子、模板或誘變引物包含抗體可變結(jié)構(gòu)域。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗體可變結(jié)構(gòu)域是抗體VL結(jié)構(gòu)域。37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述抗體可變結(jié)構(gòu)域是抗體VH結(jié)構(gòu)域。38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述親代分子包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體Vt結(jié)構(gòu)域，并且所述誘變引物分子包含抗體VL結(jié)構(gòu)域以突變所述親代分子的VL結(jié)構(gòu)域。39.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述親代分子包含抗體VL結(jié)構(gòu)域和抗體VH結(jié)構(gòu)域，并且所述誘變引物分子包含抗體VH結(jié)構(gòu)域以突變所述親代分子上的抗體VH結(jié)構(gòu)域。40.權(quán)利要求38或權(quán)利要求39所述的方法，其中第一和第二誘變引物用來突變所述親代分子，所述第一誘變引物包含抗體VH結(jié)構(gòu)域以突變所述親代分子上的VH結(jié)構(gòu)域，并且所述第二誘變引物包含抗體VL結(jié)構(gòu)域以突變所述親代分子上的VL結(jié)構(gòu)域。41.權(quán)利要求40所述的方法，其中所述第一和第二誘變引物被用在分開的誘變反應步驟中。42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述第一和第二誘變引物被用在同一個誘變反應步驟中。43.權(quán)利要求38或權(quán)利要求39所述的方法，其中同時包含所述Vh和所述V^結(jié)構(gòu)域的單個誘變引物，被用于突變所述親代分子上的所述VH和所述VL結(jié)構(gòu)域。44.根據(jù)權(quán)利要求34到43中任意一項所述的方法，其中所述親代分子包含編碼scFv的核酸。全文摘要本發(fā)明涉及用于引導突變進入分子的誘變方法，特別地涉及可以運用于分子群以產(chǎn)生或篩選涉及多個分子突變的文庫的方法。文檔編號C12Q1/68GK101103110SQ200680002045公開日2008年1月9日申請日期2006年1月9日優(yōu)先權(quán)日2005年1月10日發(fā)明者M·A·T·格羅韋斯,R·G·E·霍爾蓋特,R·R·明特,S·G·萊恩申請人:劍橋抗體技術有限公司