專利名稱：用于生產(chǎn)高效價1,3－丙二醇的生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括通過單一微生物將可發(fā)酵的碳源生物轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
1，3-丙二醇是在生產(chǎn)聚酯纖維和生產(chǎn)聚亞胺酯和環(huán)類化合物方面具有潛在用途的單體。
已知有多種生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法。例如，在有磷化氫、水、一氧化碳、氫和一種酸存在的條件下通過一種催化劑可將環(huán)氧乙烷轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇，通過丙烯醛的催化溶液相水合、然后還原，或者以諸如甘油的化合物為原料，在有一氧化碳和氫存在的條件下通過具有元素周期表中VIII組原子的催化劑轉(zhuǎn)化而成。盡管可以通過上述方法生產(chǎn)1，3-丙二醇，但其價格昂貴，并且產(chǎn)生含有環(huán)境污染物的廢物。
一個世紀(jì)以來就已經(jīng)知道可以通過甘油發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。例如，業(yè)已在檸檬酸桿菌屬、梭菌屬、腸桿菌屬、泥桿菌屬、克雷伯氏菌屬、乳桿菌和暗桿菌屬中發(fā)現(xiàn)了能產(chǎn)生1，3-丙二醇的菌株。在研究過的每一種情況下，甘油是通過兩個步驟轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇，由酶催化反應(yīng)過程。在第一個步驟中，由脫水酶催化將甘油轉(zhuǎn)化3-羥基丙醛(3-HPA)和水，公式1。在第二個步驟中，通過NAD+-連接的氧化還原酶將3-HPA還原成1，3-丙二醇，公式2。1，3-丙二醇不再進一步的代謝，其結(jié)果是在培養(yǎng)基中積累。
甘油→3-HPA+H2O(公式1)3-HPA+NADH+H+→1，3-丙二醇+NAD+(公式2)總的反應(yīng)消耗輔助因子形式的還原物還原的β-煙酰胺腺苷二核苷酸(NADH)，它被氧化成煙酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)。
在肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏梭菌中，編碼甘油脫水酶的三個結(jié)構(gòu)亞基的基因(dhaB1-3或dhaB、C和E)位于靠近編碼專一性1，3-丙二醇氧化還原酶的基因(dhaT)處(參見圖1)。盡管在這些微生物中的遺傳組構(gòu)略有不同，這些基因被歸為一類，這一類還包括orfX和orfZ(編碼甘油脫水酶的脫水酶的再活化因子基因，以及orfY和orfW(具有未知功能的基因)。已知所述微生物的專一性1，3-丙二醇氧化還原酶的基因(dhaT)屬于III型醇脫氫酶家族，各自具有一個保守的鐵結(jié)合基序，并能優(yōu)先進行1，3-丙二醇和3-HPA的NAD+/NADH關(guān)聯(lián)的相互轉(zhuǎn)化。不過，1，3-丙二醇和3-HPA的NAD+/NADH關(guān)聯(lián)的相互轉(zhuǎn)化還可以通過醇脫氫酶催化，這種酶不是專一性與脫水酶連接的(例如，馬肝和面包酵母醇脫氫酶(E.C.1.1.1.1))，不過，具有較低效果的動力學(xué)參數(shù)。甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇[1，3-丙二醇]脫水酶(E.C.4.2.1.28)是相關(guān)的但又是不同的酶，它們是由不同基因編碼的。源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的二醇脫水酶基因與甘油脫水酶基因類似，并且被歸為一類，這一類包括類似于orfX和orfZ的基因(Daniel等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)綜述22，553，1999；Toraya和Mori，生物學(xué)化學(xué)雜志，274，3372，1999；GenBank AF026270)。
用甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇通常是在厭氧條件下用甘油作為唯一的碳源并且在缺乏其他外源還原等同受體的情況下進行的。在上述條件下，在諸如檸檬酸桿菌屬、梭菌屬和克雷伯氏菌屬的菌株中，甘油操縱的一個平行途徑首先涉及通過NAD+-(NADP+-)連接的甘油脫氫酶將甘油氧化成二羥基丙酮(DHA)，公式3。dha在由dha激酶磷酸化成二羥基丙酮磷酸酯(dhaP)之后(公式4)，甘油+NAD+→dha+NADH+H+(公式3)dha+ATP→dhaP+ADP (公式4)可用于生物合成和支持ATP生成，例如，通過糖酵解。與1，3丙二醇途徑相反，該途徑能為細胞提供碳和能量，并產(chǎn)生NADH，而不是消耗NADH。
在肺炎克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌中，編碼在功能上與甘油脫水酶(dhaB)、1，3丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫氫酶(dhaD)、和二羥基丙酮激酶(dhaK)活性相關(guān)的基因包括在dha調(diào)節(jié)子范圍內(nèi)。在肺炎克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌中，dha調(diào)節(jié)子還包括編碼一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白的基因(dhaR)。來自檸檬酸桿菌和克雷伯氏菌屬的dha調(diào)節(jié)子業(yè)已在大腸桿菌中表達，并且被證實能將甘油轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇。
上述生產(chǎn)1，3丙二醇的化學(xué)方法或生物學(xué)方法都不是很適合工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，因為化學(xué)方法是能量密集型的，而生物學(xué)方法局限于來自昂貴原材料甘油的較低的效價。上述缺陷可以通過需要低的能量投入和諸如碳水化合物或糖類的廉價原材料的方法而得到克服，或者通過提高甘油加工的代謝效率而得到克服。任一種方法的開發(fā)都需要操縱決定糖類向甘油轉(zhuǎn)化和甘油向1，3丙二醇轉(zhuǎn)化的遺傳學(xué)機制。
制備甘油的生物學(xué)方法是已知的。占絕對多數(shù)的甘油生產(chǎn)菌是酵母，但某些細菌、其他真菌和藻類也是已知的。細菌和酵母是通過糖酵解中的果糖-1，6-二磷酸途徑或EMP途徑轉(zhuǎn)化葡萄糖或其他碳水化合物而產(chǎn)生甘油的，而某些藻類在葉綠體將溶解的二氧化碳或碳酸氫根轉(zhuǎn)化成卡爾文循環(huán)的3-碳中間體。在一系列步驟中，所述3-碳中間體磷酸甘油酸被轉(zhuǎn)化成甘油醛3-磷酸，它可以方便地轉(zhuǎn)化成其酮異構(gòu)體二羥基丙酮磷酸酯，并最終轉(zhuǎn)化成甘油。
具體地講，地衣形芽孢桿菌和番茄乳桿菌能合成甘油，并且甘油產(chǎn)生存在于耐鹵藻類杜氏藻和Asteromonas gracilis中，以便免受外部高鹽濃度的損害。類似地，各種耐滲透壓的酵母能合成甘油作為保護措施。酵母屬的大多數(shù)菌株在醇發(fā)酵期間能產(chǎn)生某些甘油，并且通過施加滲透壓力可以通過生理學(xué)方法提高其產(chǎn)量。在本世紀(jì)初期，甘油生產(chǎn)是通過使用酵母屬培養(yǎng)物實現(xiàn)的，向該培養(yǎng)物中添加諸如亞硫酸鹽或堿的“轉(zhuǎn)向試劑”。通過形成無活性的復(fù)合物，所述轉(zhuǎn)向試劑能阻止或抑制乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)化；因此，有過量的還原等同物(NADH)可用于或“被轉(zhuǎn)向”至DHAP，用于還原產(chǎn)生甘油。該方法的局限是亞硫酸鹽對酵母生長的部分抑制。這種局限通過使用能通過其他機制產(chǎn)生過量NADH等同物的堿而得到部分克服。在該方法中，所述堿能啟動Cannizarro汽化作用，由乙醛的兩種等同物產(chǎn)生乙醇和乙酸。
業(yè)已從S.diastaticus中克隆了編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因(DAR1，GPD1)，并進行了測序(Wang等，細菌學(xué)雜志176，7091-7095，1994)。將DAR1克隆到穿梭載體上，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過表達產(chǎn)生活性酶。Wang等(同上)認(rèn)為，DAR1是通過細胞滲透環(huán)境調(diào)控的，但沒有暗示該基因如何可用于在重組微生物中提高1，3丙二醇的產(chǎn)量。業(yè)已分離了甘油-3-磷酸脫氫酶例如，業(yè)已從釀酒酵母中克隆了sn-甘油-3-磷酸脫氫酶并進行了測序(Larason等，分子微生物學(xué)10，1101，1993)，而Albertyn等(分子細胞生物學(xué)14，4135，1994)披露了從釀酒酵母中克隆編碼甘油-3-磷酸脫氫酶GDP1。與Wang等(同上)一樣，Albertyn等和Rarason等都認(rèn)可該基因調(diào)控的滲透壓敏感性，但沒有暗示該基因如何可用于在重組微生物中生產(chǎn)1，3丙二醇。
與G3PDH一樣，業(yè)已從釀酒酵母中分離了甘油-3-磷酸酶，并確定該蛋白是由GPP1和GPP2基因編碼的(Norbeck等，生物學(xué)化學(xué)雜志271，13875，1996)，與編碼G3PDH的基因一樣，GPP2似乎也是對滲透壓敏感的。
盡管用一種微生物將除了甘油或二羥基丙酮以外的可發(fā)酵碳源轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇是理想的，但有大量證據(jù)表明，在這樣做時有很大的困難需要克服。例如，Gottschalk等(EP373230)披露，諸如果糖或葡萄糖的氫供體的存在會干擾包括弗氏檸檬酸桿菌、Clostridiumautobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌在內(nèi)的用于生產(chǎn)1，3丙二醇的大多數(shù)菌株的生長。在提供甘油作為唯一的碳源時，通過甘油和果糖和葡萄糖共發(fā)酵產(chǎn)生1，3丙二醇的短乳桿菌和布氏乳桿菌的菌株不能生長，并且盡管業(yè)已證實靜息細胞能代謝葡萄糖或果糖，但不能產(chǎn)生1，3丙二醇(Veiga DA Cunha等，細菌學(xué)雜志，174，1013，1992)。類似的，業(yè)已證實，在提供甘油和乙酸時能產(chǎn)生1，3丙二醇的多養(yǎng)型泥桿菌菌株不能用除了甘油以外的、包括果糖和葡萄糖在內(nèi)的碳底物產(chǎn)生1，3丙二醇(Steib等，Arch.Microbiol.140，139，1984)。最后，Tong等(應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)34，149，1992)披露，在缺乏外源甘油的情況下，用編碼甘油脫水酶的dha調(diào)節(jié)予轉(zhuǎn)化過的重組大腸桿菌不能利用葡萄糖或木糖產(chǎn)生1，3丙二醇。
業(yè)已報導(dǎo)了提高用甘油產(chǎn)生1，3丙二醇產(chǎn)量的嘗試，其中，該方法包括能夠提供還原性等同物，通常為可發(fā)酵的糖類的共同底物。業(yè)已報導(dǎo)了弗氏檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270靜息細胞共發(fā)酵甘油和葡萄糖的產(chǎn)量的提高(Gottschalk等，同上；和Tran-Dinh等，DE3734764)；但在生長共發(fā)酵甘油和葡萄糖的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的細胞方面沒有取得成功，這種細胞不產(chǎn)生1，3丙二醇(I-T.Tong博士論文，Wisconsin-Madison大學(xué)，1992)。業(yè)已報導(dǎo)了通過重組大腸桿菌共發(fā)酵甘油和葡萄糖或果糖可以提高產(chǎn)量；不過，在缺乏甘油的情況下不產(chǎn)生1，3丙二醇(Tong等，同上)。在上述系統(tǒng)中，單一微生物利用糖類作為產(chǎn)生NADH的來源，同時提供細胞維持或生長的能量和碳。以上文獻表明，糖類沒有進入產(chǎn)生1，3丙二醇的碳流。
不過，最近業(yè)已披露了用能表達脫水酶的單一微生物將除了甘油或二羥基丙酮以外的碳底物轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇(US5686276；Wo9821339；WO9928480；和WO9821341(US6013494))。用甘油或葡萄糖生產(chǎn)1，3丙二醇的生物學(xué)方法的一個特殊的缺陷一直是通過發(fā)酵所獲得的產(chǎn)物的低效價；因此，需要能量密集型的分離工藝從含水的發(fā)酵液中獲得1，3丙二醇。通過補料分批發(fā)酵或分批發(fā)酵用甘油生產(chǎn)1，3丙二醇的最終效價對于丁酸梭菌來說為65克/升(Saint-Amans等，生物技術(shù)通訊16，831，1994)，對于丁酸梭菌突變體來說為71克/升(Abbad-Andaloussi等，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)61，4413，1995)，對于肺炎克雷伯氏菌來說為61克/升(Homann等，應(yīng)用微生物生物技術(shù)33，121，1990)，而對于弗氏檸檬酸桿菌來說為35克/升(Homann等，同上)。還沒有披露過對葡萄糖進行發(fā)酵所產(chǎn)生的1，3丙二醇能超過通過甘油發(fā)酵所獲得的效價。
有待解決的問題是如何通過單一微生物用諸如葡萄糖或其他糖類的廉價碳底物通過生物學(xué)方法以高效價生產(chǎn)1，3丙二醇。1，3丙二醇的生物學(xué)生產(chǎn)需要甘油作為兩步序列反應(yīng)的底物，其中，由脫水酶(通常是輔酶B12-決定型脫水酶)將甘油轉(zhuǎn)化成一種中間體3-羥基丙醛，然后由NADH-(或NADPH)決定型氧化還原酶將其還原成1，3丙二醇。所述輔助因子要求的復(fù)雜性必須利將全細胞催化劑用于工業(yè)化生產(chǎn)中，該方法利用所述反應(yīng)序列生產(chǎn)1，3丙二醇。

發(fā)明內(nèi)容
申請人業(yè)已解決了上述問題，本發(fā)明提供了能以明顯高于以前所能達到的效價并且利用單一微生物將可發(fā)酵的碳源直接生物轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的方法。用葡萄糖作為模式底物，并用大腸桿菌作為模式宿主。在本發(fā)明的一個方面，能表達一組基因(包括編碼脫水酶活性、脫水酶再活化因子、1，3丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油-3-磷酸酶的基因)的重組大腸桿菌以接近將甘油發(fā)酵成1，3丙二醇的效價將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇。
在本發(fā)明的另一方面，在該重組大腸桿菌中，消除有功能的dhaT基因，會導(dǎo)致明顯較高的由葡萄糖產(chǎn)生1，3丙二醇的效價。效價的這種出人意料的提高導(dǎo)致了經(jīng)濟指標(biāo)的改善，因此，它是一種用于由葡萄糖生產(chǎn)1，3丙二醇的改進方法。另外，本發(fā)明可普遍應(yīng)用于任何碳底物，這些底物能方面地轉(zhuǎn)化成1)甘油，2)二羥基丙酮，3)甘油氧化狀態(tài)的C3化合物(例如，甘油3-磷酸)，或4)二羥基丙酮氧化狀態(tài)的C3化合物(例如，二羥基丙酮磷酸或甘油醛3-磷酸)。在dhaT-菌株中生產(chǎn)1，3丙二醇需要非專一性催化活性，它能將3-HPA轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇。決定將3-HPA轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性的酶和/或基因的鑒定可導(dǎo)致利用多種宿主微生物用多種含碳底物作底物生產(chǎn)1，3丙二醇。還可希望利用這種將3-HPA轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性會導(dǎo)致用甘油或二羥基丙酮生產(chǎn)1，3丙二醇的改進方法，它會導(dǎo)致改進了的效價和經(jīng)濟指標(biāo)的提高。
業(yè)已以核酸片段形式從大腸桿菌中分離了這種活性，該片段編碼將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性，該片段如SEQID NO58所示或選自下列一組(a)編碼SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分離的核酸片段；(b)基本上類似于編碼SEQ ID NO57的氨基酸序列的全部或主要部分的分離的核酸片段的分離的核酸片段；(c)編碼具有至少387個氨基酸并且與SEQ ID NO57的氨基酸序列有至少80％相同性的多肽的分離的核酸片段；(d)能在0.1XSSC、0.1％SDS，65℃的雜交條件下，并用2XSSC、0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC、0.1％SDS洗滌的條件下與(a)雜交的分離的核酸片段；和(e)互補于(a)、(b)、(c)或(d)的分離的核酸片段。另外，所述非專一性催化活性體現(xiàn)在SEQ ID NO57所示多肽上。
可以構(gòu)建包括上述分離的核酸片段的嵌合基因，所述片段可操縱地連接于合適的調(diào)控序列上。該嵌合基因可用于轉(zhuǎn)化下列一組的微生物檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基桿菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、氣桿菌屬、鏈霉菌屬、埃希氏菌屬、和假單胞菌屬，大腸桿菌是優(yōu)選的宿主。
因此，本發(fā)明提供了一種可用于生產(chǎn)1，3丙二醇的重組微生物，它包括(a)編碼一種具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的至少一個基因；(b)編碼具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的至少一個基因；(c)編碼一種具有脫水酶活性的多肽的至少一個基因；(d)編碼脫水酶再活化因子的至少一個基因；(e)編碼足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性的至少一個內(nèi)源基因，其中，不存在編碼1，3丙二醇氧化還原酶的有功能的dhaT基因。優(yōu)選的實施方案是不存在dhaT基因的重組微生物(優(yōu)選大腸桿菌)。所述重組微生物可以在選自下列一組的內(nèi)源基因上含有突變(例如缺失突變或點突變)(a)編碼具有甘油激酶活性的多肽的基因；(b)編碼具有甘油脫水酶活性的多肽的基因；和(c)編碼具有磷酸丙糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因。
在另一種實施方案中，本發(fā)明包括一種生產(chǎn)1，3丙二醇的方法，該方法包括(a)在合適條件下讓含有dha調(diào)節(jié)子并缺乏編碼1，3丙二醇氧化還原酶活性的有功能的dhaT基因的重組大腸桿菌與至少一種碳源接觸，其中，所述碳源選自下列一組單糖、寡糖、多糖、和單碳底物；和(b)可選地回收在(a)中產(chǎn)生的1，3丙二醇。
本發(fā)明還提供了一種用重組微生物生產(chǎn)1，3丙二醇的方法，該方法包括(a)讓本發(fā)明的重組微生物與選自下列一組的至少一種碳源接觸單糖、寡糖、多糖、單碳底物，以便產(chǎn)生1，3丙二醇；和(b)可選地回收在(a)中產(chǎn)生的1，3丙二醇。
類似地，本發(fā)明還提供了一種利用重組微生物生產(chǎn)1，3丙二醇的方法，該方法包括(a)讓一種重組微生物與至少一種碳源接觸，所述重組微生物包括(i)編碼一種脫水酶活性的多肽的至少一個基因；(ii)編碼脫水酶再活化因子的至少一個基因；(iii)編碼足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性的至少一個內(nèi)源基因，其中，不存在編碼1，3丙二醇氧化還原酶的有功能的dhaT基因；所述碳源選自甘油和二羥基丙酮，其中，產(chǎn)生了1，3丙二醇；和(b)可選地回收在(a)產(chǎn)生的1，3丙二醇。
本發(fā)明的另一方面提供了碳底物共飼養(yǎng)的方法。在生產(chǎn)1，3丙二醇的這種實施方案中，其步驟有(a)讓重組大腸桿菌與第一種碳源和第二種碳源接觸，所述重組大腸桿菌含有(i)至少一個編碼一種具有脫水酶活性的多肽的外源基因；(ii)至少一個編碼一種具有脫水酶再活化因子的外源基因；(iii)至少一個編碼足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3丙二醇的非專一性催化活性的外源基因，其中，在所述重組大腸桿菌中不存在編碼1，3丙二醇氧化還原酶活性的有功能的dhaT基因，并且，其中，所述第一種碳源選自甘油和二羥基丙酮，而第二種碳源選自單糖、寡糖、多糖和單碳底物，和(b)可選地回收在(a)中產(chǎn)生的1，3丙二醇。所述共飼養(yǎng)可以順序進行或同時進行。用于共飼養(yǎng)實施方案的重組大腸桿菌還可以包括(a)一組外源基因，包括(i)至少一個編碼一種甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的基因；(ii)至少一個編碼具有甘油-3-磷酸酶活性的基因；和(iii)編碼dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因產(chǎn)物的至少一小類基因，和(b)一類內(nèi)源基因，每一個基因具有使該基因失活的一個突變，這一類基因包括(i)編碼一種具有甘油激酶活性多肽的基因；(ii)編碼一種具有甘油脫氫酶活性多肽的基因；和(iii)編碼一種具有磷酸丙糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因。
有用的重組大腸桿菌菌株包括重組大腸桿菌菌株KLP23，它含有(a)兩個內(nèi)源基因構(gòu)成的一組，每一種基因具有使該基因失活的一個突變，這一類包括(i)編碼一種具有甘油激酶活性多肽的基因；和(ii)編碼一種具有甘油脫氫酶活性的多肽的基因；(b)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的外源基因；(c)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的外源基因；和(d)質(zhì)粒pKP32和重組大腸桿菌菌株RJ8，它含有(a)由三個內(nèi)源基因構(gòu)成的一類，每一個基因具有一個使該基因失活的突變，這一類包括(i)編碼一種具有甘油激酶活性的多肽的基因；和(ii)編碼一種具有甘油脫氫酶活性的多肽的基因；和(iii)編碼一種具有磷酸丙糖異構(gòu)酶活性的基因。
其他有用的實施方案包括重組大腸桿菌，這種大腸桿菌含有(a)一類外源基因，包括(i)至少一個編碼一種具有脫水酶活性的基因；(ii)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的基因；(iii)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的基因；和(iv)至少一個編碼脫水酶再活化因子的基因；和(b)至少一個編碼將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的非專一性催化活性的內(nèi)源基因，其中，在所述重組大腸桿菌中不存在編碼1，3-丙二醇氧化還原酶活性的有功能的dhaT基因。
另一種實施方案是一種重組大腸桿菌，它含有(a)一類外源基因，包括(i)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的基因；(ii)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸酶活性的基因；(iii)至少一小類編碼dhaR、orfY、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ的基因產(chǎn)物的基因，和(b)至少一個編碼將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的非專一性催化活性的內(nèi)源基因，其中，在所述重組大腸桿菌中不存在編碼1，3-丙二醇氧化還原酶活性的有功能的dbaT基因。該實施方案還包括使用一種重組大腸桿菌，該大腸桿菌還含有一類內(nèi)源基因，每一種基因具有一個使該基因失活的突變，這一類包括(a)一個編碼具有甘油激酶活性的多肽的基因；(b)一個編碼一種具有甘油脫氫酶活性的多肽的基因；和(c)一個編碼一種具有磷酸丙糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因。
該實施方案還包括一種生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括(a)在合適的條件下讓本文所披露的重組大腸桿菌與選自單糖、寡糖、多糖和單碳底物的至少一種碳源接觸，以便產(chǎn)生1，3-丙二醇；和(b)可選地回收在(a)中產(chǎn)生的1，3-丙二醇。
還包括另一種生物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括(a)讓本文所披露的重組大腸桿菌與選自甘油和二羥基丙酮的碳源接觸，所述大腸桿菌還包括(i)至少一個編碼一種具有脫水酶活性的多肽的基因；(ii)至少一個編碼一種脫水酶再活化因子的外源基因；(iii)至少一個編碼將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的非專一性催化活性的內(nèi)源基因，和(b)可選地回收在(a)中產(chǎn)生的1，3-丙二醇。


通過以下詳細說明和作為本申請組成部分的附圖、所附序列說明和生物學(xué)保藏物可以更全面的理解本發(fā)明。
圖1表示dha調(diào)節(jié)子亞克隆pHK28-26的序列上的基因組構(gòu)。
圖2表示用穩(wěn)定的維生素B12飼養(yǎng)的基本上如例7所述的兩種發(fā)酵之間的胞外可溶蛋白(克/升)比較的曲線圖。對于實線曲線來說，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。對于虛線曲線來說，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
圖3表示用穩(wěn)定的維生素B12飼養(yǎng)的基本上如例7所述的兩種發(fā)酵之間的細胞活力[(活細胞/毫升)/OD550]比較的曲線圖。在一種情況下(實線)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。在另一種情況下(虛線)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
圖4表示在缺乏維生素B12或輔酶B12的條件下，基本上如例7所述的兩種發(fā)酵之間的由葡萄糖產(chǎn)生甘油的產(chǎn)量的比較曲線圖。在一種情況下(實線)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pKP32。在另一種情況下(虛線)，所使用的菌株是KLP23/pAH48/pDT29。
圖5是表示葡萄糖向1，3-丙二醇代謝轉(zhuǎn)化的流程圖。
圖6是從在天然凝膠上表現(xiàn)出內(nèi)源大腸桿菌氧化還原酶活性(非專一性催化活性)的帶上提取的可溶蛋白級份的2D-PAGE膜印跡。
68個序列說明以及所附的序列表符合在37C.F.R.§1.821-1.825中所規(guī)定的專利申請的核苷酸和/或氨基酸序列公開的要求(含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求-序列規(guī)則)，并符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)的標(biāo)準(zhǔn)ST2.5(1998)和EPO和PCT的序列表要求(5.2和49.5(a-bis)條，和208節(jié)和管理指南的附錄C)。序列說明包括與披露于核酸研究13，3021-3030，1985和生物化學(xué)雜志219，345-373，1984中的IUPAC-IYUB的標(biāo)準(zhǔn)一致的核苷酸序列的一字母代碼和氨基酸的三字母代碼，以上文獻被收作本文參考。
SEQ ID NO1含有由來自pKP1(含有源于肺炎克雷伯氏菌的DNA的粘粒)的12.1kb EcoRI-SalI片段測定的核苷酸序列，所述片段被亞克隆到pIBI31(IBI生物系統(tǒng)，New Haven，CT)，并被稱為pHK28-26。表1還列舉了在SEQ ID NO1上所確定的基因、相應(yīng)的堿基對和相關(guān)的功能。還可以參見例1。
SEQ ID NO57含有測定的yqhD的氨基酸序列。
SEQ ID NO58含有測定的YqhD的核苷酸序列。
保藏者提供的資料國際保藏編號保藏日期含有編碼甘油脫氫酶的一部分 ATCC69789 1995年4月18日肺炎克雷伯氏菌屬基因組的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α包括含有編碼二醇脫水酶的一 ATCC69790 1995年4月18日部分肺炎克雷伯氏菌屬基因組的粘粒pKP4的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α大腸桿菌MSP33.6ATCC985981997年11月25日glpK突變體大腸桿菌RJF10m ATCC985971997年11月25日這些保藏物將在所指定的國際保藏機構(gòu)保藏至少30年，并且在披露它的專利被授權(quán)以后向公眾提供。可以獲得保藏物并不意味著許可以損害由政府行為所授予的專利權(quán)來實施本發(fā)明。
在本文中“ATCC”是指美國典型培養(yǎng)物保藏中心國際保藏處，該保藏機構(gòu)位于10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209美國?！癆TCC No.”是由ATCC保藏的培養(yǎng)物的保藏號。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種利用單一微生物將可發(fā)酵的碳源直接生物轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的改進方法。該方法的特征是具有改進的效價、產(chǎn)量和細胞生活力以及在發(fā)酵期間細胞裂解的降低。
本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)包括1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)在內(nèi)的1，3-丙二醇發(fā)酵過程的特征是在培養(yǎng)基中有高含量的3HPA和其他醛和酮，這些化合物與細胞生活力的降低有關(guān)。本發(fā)明還部分基于出人意料的發(fā)現(xiàn)模式宿主大腸桿菌通過能夠?qū)?-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的內(nèi)源非專一性催化活性可以將3-HPA轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。本發(fā)明還部分基于出人意料的發(fā)現(xiàn)包括這種非專一性催化活性并缺乏有功能的dhaT的大腸桿菌發(fā)酵過程會導(dǎo)致在發(fā)酵期間細胞生活力的提高，并能產(chǎn)生比含有有功能的dhaT的發(fā)酵過程更高的1，3-丙二醇的效價和/或產(chǎn)量。
在一方面，甘油是模式底物，宿主微生物在野生型dhaT上有一個突變，因此沒有1，3-丙二醇氧化還原酶活性，并包括足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的非專一催化活性。在另一方面，葡萄糖是模式底物，而重組大腸桿菌是模式宿主。在這一方面，大腸桿菌包括足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的內(nèi)源非專一性催化活性。在一種實施方案中，所述非專一性催化活性是醇脫氫酶。
在一方面，本發(fā)明提供了能表達一組基因的重組大腸桿菌，這一組基因包括(a)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸脫氫酶活性的多肽的基因；(b)至少一個編碼一種具有甘油-3-磷酸酶活性的多肽的基因；(c)至少一個編碼具有脫水酶活性的多肽的基因；(d)至少一個編碼一種脫水酶再活化因子的基因；和(e)至少一個編碼足于將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的非專一性催化活性的內(nèi)源基因；利用該微生物以高效價將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。在本發(fā)明的另一方面，在這種重組大腸桿菌中消除有功能的dhaT基因可以由葡萄糖產(chǎn)生高于以前所能達到的出人意料的高效價的1，3-丙二醇。
本發(fā)明提供了一種在單一微生物中由可發(fā)酵的碳源生物學(xué)生產(chǎn)1，3-丙二醇的改進方法。在本發(fā)明的一個方面，用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的一種改進方法是通過利用重組微生物而實現(xiàn)的，這種微生物包括用肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ轉(zhuǎn)化過的宿主大腸桿菌，以上所有基因的排列方式與在野生型肺炎克雷伯氏菌中的遺傳組構(gòu)相同。這種發(fā)酵方法所獲得的效價明顯高于以前所報導(dǎo)的類似發(fā)酵的所有效價。如在例6和例7中所披露的，這種改進取決于質(zhì)粒pDT29的利用。
在本發(fā)明的另一方面，用于從葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇的另一種改進方法是利用含有編碼G3pdh、G3p磷酸酶、脫水酶、和脫水酶再活化因子的基因重組大腸桿菌實現(xiàn)的，這種改進是相對使用含有編碼G3pdh、G3p磷酸酶、脫水脫水酶再活化因子以及有功能的dhaT的基因的重組大腸桿菌的方法而言的。明顯改進的方法取決于編碼一種非專一性催化活性-預(yù)計為醇脫氫酶的內(nèi)源基因，它存在于大腸桿菌中。
如在例7和例9中所述，該方法的明顯改進表現(xiàn)在1，3-丙二醇效價提高。該方法的改進還表現(xiàn)在細胞裂解的減弱，這種減弱是通過發(fā)酵液中胞外可溶蛋白的濃度而確定的。本發(fā)明的這一方面如圖2所示。另外，該方法的改進還表現(xiàn)在在發(fā)酵過程中延長了的細胞生活力。本發(fā)明的這一方面如圖3所示。另外，該方法的改進還表現(xiàn)為產(chǎn)量的提高。在表達1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的大腸桿菌中(例如，用質(zhì)粒pDT29轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌KLP23)，甘油可以代謝成除了3-HPA以外的產(chǎn)物。相反，在不表達1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的大腸桿菌中(例如，用質(zhì)粒pKP32轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌KLP23)，甘油不被代謝成除了3-HPA以外的產(chǎn)物。這種神秘的途徑是由于有功能的dhaT的存在或不存在，這一點可以通過由葡萄糖產(chǎn)生甘油的較低產(chǎn)量證實，如圖4所示。
在本文中，下面的術(shù)語可用于解釋權(quán)利要求書和說明書。
術(shù)語“甘油-3-磷酸脫氫酶”和“G3PDH”是指一種決定催化二羥基丙酮磷酸酯(dhaP)向甘油-3-磷酸(G3P)轉(zhuǎn)化的酶活性的多肽。在體內(nèi)，G3PDH可以是NADH；NADPH；或FAD-決定型的。在專門用于表示輔助因子專一性甘油-3-磷酸脫氫酶時，可以使用術(shù)語“NADH-決定型甘油-3-磷酸脫氫酶”、“NADPH-決定型甘油-3-磷酸脫氫酶”和“FAD-決定型甘油-3-磷酸脫氫酶”。一般來說，NADH決定型和NADPH決定型甘油-3-磷酸脫氫酶可以交換使用NADH和NADPH(例如，由gpsA所編碼的基因)，術(shù)語NADH決定型和NADPH決定型-3-磷酸脫氫酶可以交互使用。例如，NADH決定型酶(EC1.1.1.8)是由若干基因編碼的，包括GPD1(GenBankZ74071X2)，或GPD2(GenBankZ35169X1)，或GDP3(GenBankG984182)或dhaR(GenBankZ74071X2)。NADPH決定型酶(EC1.1.1.94)是由gpsA編碼的(GenBankU321643，(cds197911-196892)G466746和L45246)。FAD決定型(EC1.1.99.5)是由GUT2(GenBankZ47047X23)，或glpD(GenBankG147838)，或glpABC(GenBankM20938)編碼的(參見WO9928480及其參考文獻，被收作本文參考)。
術(shù)語“甘油-3-磷酸酶”、“sn-甘油-3-磷酸酶”、或“d，1-甘油-3-磷酸酶”、和“G3P”磷酸酶是指一種決定催化將甘油-3-磷酸和水轉(zhuǎn)化成甘油和無機磷酸的酶活性的多肽。例如，G3P磷酸酶是由GPP1(GenBankZ47047X125)，或GPP2(GenBankU18813X11)編碼的(參見WO9928480及其參考文獻，被收作本文參考)。
術(shù)語“甘油激酶”是指一種決定將甘油和ATP轉(zhuǎn)化成甘油-3-磷酸和ADP的酶活性的多肽。高能磷酸供體ATP可以被生理學(xué)取代物(例如，烯醇丙酮磷酸)所代替。例如，甘油激酶是由GUT1(GenBankU11583X19)和glpK(GenBankL19201)編碼的(參見WO9928480及其參考文獻，被收作本文參考)。
術(shù)語“甘油脫氫酶”是指一種決定催化將甘油轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮的酶活性(E.C.1.1.1.6)或?qū)⒏视娃D(zhuǎn)化成甘油醛的酶活性(E.C.1.1.1.72)的多肽。決定催化將甘油轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮的酶活性的多肽又被稱為“二羥基丙酮還原酶”。甘油脫氫酶可取決于NADH(E.C.1.1.1.6)、NADPH(E.C.1.1.1.72)、或其他輔助因子(例如，E.C.1.1.99.2 2)。例如，NAPH決定型甘油脫氫酶是由gldA(GenBankU00006)編碼的(參見WO9928480及其參考文獻，被收作本文參考)。
術(shù)語“脫水酶”是指能催化將甘油分子轉(zhuǎn)化成3-羥基丙醛產(chǎn)物的任何酶活性。對于本發(fā)明來說，脫水酶包括甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)，它們分別以甘油和1，3-丙二醇為優(yōu)選底物。業(yè)已在肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、巴氏梭菌、鼠傷寒沙門氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌中鑒定了編碼脫水酶的基因。在任一種情況下，脫水酶是由三個亞基組成的大的或α亞基，中等的或β亞基，以及小的或γ亞基。由于在文獻中基因的命名有很大不同，在表1中給出了一個對照表，以便于識別。例如，所述基因還披露于Dniel等(FEMS微生物學(xué)綜述22，553，1999)和Toraya和Mori(生物學(xué)化學(xué)雜志，274，3372，1999)的文獻中。參見表1，編碼甘油脫水酶大的或α亞基的基因包括dhaB1、gldA和dhaB；編碼中等或β亞基的基因包括dhaB2、gldB、和dhaC；編碼小的或γ亞基的基因包括gldC、dhaE。同樣參見表1，編碼二醇脫水酶的大的或α亞基的基因包括pduC和pddA；編碼中等或β亞基的基因包括pduD和pddB；編碼小的或γ亞基的基因包括pduE或pddC。
表1基因名稱和脫水酶及相關(guān)功能的GenBank資料的比較表基因功能

基因功能

通過甘油和某些其他底物對甘油和二醇脫水酶進行基于機制的自殺失活(Daniel等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)綜述22，553，1999)。術(shù)語“脫水酶再活化因子”是指決定再活化脫水酶活性的蛋白。術(shù)語“脫水酶再活化活性”、“再活化脫水酶活性”或“再生脫水酶活性”是指將不能催化底物的脫水酶轉(zhuǎn)化成能夠催化底物的脫水酶的現(xiàn)象，或者是指抑制脫水酶失活的現(xiàn)象或者延長脫水酶在體內(nèi)的有用的半衰期的現(xiàn)象。業(yè)已鑒定了作為脫水酶再活化因子的兩種蛋白(參見WO9821341(US6013494)以及其中的參考文獻，被收作本文參考；Daniel等，同上；Toraya和Mori，生物學(xué)化學(xué)雜志274，3372，1999；和Tobimatsu等，細菌學(xué)雜志181，4110，1999)。參見表1，編碼上述一種蛋白的基因包括orfZ、dhaB4、gdrA、pduZ和ddrA。同樣參見表1，編碼上述兩種蛋白的另一種的基因包括orfX、orf2B、gdrB、pduH和ddrB。
術(shù)語“1，3丙二醇氧化還原酶”、“1，3丙二醇脫氫酶”或“dhaT”是指決定能夠催化3-HPA和1，3丙二醇相互轉(zhuǎn)化的酶活性的多肽，其前提是，編碼所述活化的基因在其天然狀態(tài)下(即野生型)在物理學(xué)方面或轉(zhuǎn)錄方面與脫水酶相關(guān)；例如，發(fā)現(xiàn)所述基因存在于dha調(diào)節(jié)子上，如源于肺炎克雷伯氏菌的dhaT。參見表1，編碼1，3丙二醇氧化還原酶的基因包括源于肺炎克雷伯氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和巴氏梭菌的dhaT。上述每一種基因編碼一種屬于III型醇脫氫酶家族的多肽，具有一個保守的鐵結(jié)合基序，并對NAD+/NADH關(guān)聯(lián)的3-HPA和1，3丙二醇的相互轉(zhuǎn)化有優(yōu)勢(Johnson和Lin，細菌學(xué)雜志，169，2050，1987；Daniel等，細菌學(xué)雜志177，2151，1995；和Leurs等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊154，337，1997)。業(yè)已從短乳桿菌和布氏乳桿菌中分離了具有類似物理學(xué)特性的酶(Veiga da Dunha和Foster，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)58，2005，1992)。
術(shù)語“dha調(diào)節(jié)子”是指編碼各種生物學(xué)活性的一組相關(guān)的基因或開放讀框，包括，但不限于脫水酶活性、再活化活性、和1，3丙二醇氧化還原酶。通常，dha調(diào)節(jié)子包括本文所披露的開放讀框dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ。
術(shù)語“非專一性催化活性”是指決定足于催化3-HPA和1，3丙二醇的相互轉(zhuǎn)化的酶活性的多肽，并且特別排除了1，3丙二醇氧化還原酶。通常，這種酶是醇脫氫酶。這種可以利用除了NAD+/NADH以外的輔助因子，包括，但不限于諸如FAD或FMN的黃素。例如業(yè)已發(fā)現(xiàn)編碼非專一性醇脫氫酶的基因是內(nèi)源編碼的，并且能在微生物大腸桿菌KLP23中進行有功能的表達。
術(shù)語“功能”或“酶功能”是指一種酶在改變完成特定化學(xué)反應(yīng)所需要的能量方面的催化活性。已經(jīng)了解到，這種活性可用于平衡的反應(yīng)，產(chǎn)物或底物的產(chǎn)生可以在合適的條件下完成。
術(shù)語“多肽”和“蛋白”可以交換使用。
術(shù)語“碳底物”和“碳源”是指能夠被本發(fā)明的宿主微生物代謝的碳源，并且特別是選自下列一組的碳源單糖、寡糖、多糖和單碳底物或其混合物。
術(shù)語“宿主細胞”或“宿主微生物”是指能夠接收外源或異源基因并且能夠表達這些基因以便產(chǎn)生有活性的基因產(chǎn)物的微生物。
術(shù)語“外源基因”、“外源dha”、“異源基因”和“異源DNA”是指通過各種方法放入宿主微生物中的為一種生物所天然擁有的遺傳材料。感興趣的基因可以是天然存在的基因、突變基因、或合成基因。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指在整合核酸之后使細胞獲得新的基因。所獲得的基因可以整合到染色體DNA上或作為染色體外復(fù)制系列導(dǎo)入。術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”是指轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。
術(shù)語“遺傳學(xué)改變的”是指通過轉(zhuǎn)化或突變改變遺傳材料的過程。
術(shù)語“重組微生物”和“轉(zhuǎn)化過的宿主”是指業(yè)已用異源或外源基因或額外拷貝的同源基因轉(zhuǎn)化過的微生物。本發(fā)明的重組微生物能表達甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脫水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)脫水酶再活化因子(orfZ和orfX)以及可選地1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的基因，以便由合適的碳底物生產(chǎn)1，3-丙二醇。一種優(yōu)選的實施方案是用缺乏有功能的dhaT的上述基因轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌。除了大腸桿菌以外的宿主微生物還可轉(zhuǎn)化成含有所披露的基因和編碼催化3-HPA和1，3-丙二醇的相互轉(zhuǎn)化的非專一性催化活性的基因，特別排除了1，3-丙二醇氧化還原(dhaT)。
“基因”是指表達一種特殊蛋白的核酸片段，包括位于編碼區(qū)前面的調(diào)控序列(5’非編碼區(qū))和隨后的序列(3’非編碼區(qū))。術(shù)語“天然”和“野生型”是指與其調(diào)控序列一起天然存在的序列。
術(shù)語“編碼”一個基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯機制產(chǎn)生一種氨基酸序列的過程?？梢岳斫獾氖?，編碼一種特定氨基酸序列的過程包括可能涉及不會導(dǎo)致所編碼的氨基酸改變的堿基改變的DNA序列，或者可能改變或多個氨基酸，但不會影響由該DNA序列所編碼的蛋白的功能特性的堿基改變。因此，可以理解的是，本發(fā)明包括除了特定代表性序列以外的序列。
術(shù)語“分離的”是指除去了與它天然相關(guān)的至少一種成分的蛋白或DNA序列。
“分離的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是單鏈的或雙鏈的。可選地含有合成的、非天然的或改變了的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可以包括cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個以上的片段。
“基本上相似的”指這樣的核酸分子，其中，一個或多個核苷酸堿基的改變，會導(dǎo)致一個或多個氨基酸的取代，但不會影響由該DNA序列編碼的蛋白的功能特性?！盎旧舷嗨频摹边€表示這樣的核酸分子，其中，一個或多個核苷酸堿基的改變，不會影響該核酸分子通過反義或共抑制技術(shù)介導(dǎo)基因表達的改變的能力?！盎旧舷嗨频摹边€表示本發(fā)明核酸分子的修飾(如一個或多個核苷酸堿基的缺失或插入)，這種修飾不會明顯影響所得到的轉(zhuǎn)錄物的功能特性以及通過反義或共抑制技術(shù)介導(dǎo)基因表達改變的能力或改變所得到的蛋白分子的功能特性。本發(fā)明包括除了特定代表性序列以外的序列。
例如，本領(lǐng)域眾所周知的是，基因的改變會導(dǎo)致在特定位點上產(chǎn)生化學(xué)上等同的氨基酸，但不會影響所編碼的蛋白的功能特性。對于本發(fā)明來說，取代被定義為發(fā)生在下列5組內(nèi)部的交換1.小的脂族、非極性或弱極性殘基丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(脯氨酸、甘氨酸)；2.極性、帶負(fù)電荷的殘基及其酰胺天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺；3.極性、帶正電荷的殘基組氨酸、精氨酸、賴氨酸；4.大的脂族、非極性殘基甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸(半胱氨酸)；和5.大的芳族殘基苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
因此，編碼一種疏水性氨基酸丙氨酸的密碼子可以被編碼另一種疏水性較弱的殘基(如甘氨酸)或疏水性較強的殘基(如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子所取代。類似地，會導(dǎo)致一種帶負(fù)電荷的殘基取代另一種帶負(fù)電荷的殘基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一種帶正電荷的殘基取代另一種帶正電荷的殘基(如賴氨酸取代精氨酸)的變化預(yù)計會產(chǎn)生在功能上等同的產(chǎn)物。
在很多場合下，會導(dǎo)致蛋白分子的N-末端或C-末端部分改變的核苷酸變化也不一定會改變該蛋白的活性。
所推薦的每一種修飾為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，對所編碼的產(chǎn)物的生物學(xué)活性的保留的測定也是公知的。另外，技術(shù)人員了解的是，本發(fā)明所包括的基本上類似的序列還可以根據(jù)其在嚴(yán)格條件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃，用2XSSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1XSSC，0.1％SDS，洗滌)與本發(fā)明代表性序列雜交的能力確定。本發(fā)明的優(yōu)選的基本上類似的核酸片段是這樣的核酸片段，其DNA序列與本發(fā)明所報導(dǎo)的核酸片段的DNA序列的相同性至少為80％。更優(yōu)選的核酸片段與本發(fā)明所報導(dǎo)的核酸片段的DNA序列的相同性至少為90％，最優(yōu)選的核酸片段與本發(fā)明所報導(dǎo)的核酸片段的DNA序列的相同性至少為95％。
如果一種單鏈形式的核酸片段在合適的溫度和溶液離子強度條件下與其他核酸片段退火的話，則認(rèn)為該核酸片段與另一種核酸片段是“可以雜交的”，如cDNA、基因組DNA或RNA。雜交和洗滌條件是眾所周知的，并且披露于以下文獻中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，1989，特別是該書的第11章和表11.1(被全文收作本文參考)。由溫度和離子強度條件決定雜交的“嚴(yán)格性”。為了初步篩選同源核酸，可以使用低嚴(yán)格雜交條件，相當(dāng)于Tm為55℃，例如，5XSSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，無甲酰胺；或30％甲酰胺，5XSSC，0.5％SDS。中等嚴(yán)格的雜交條件相當(dāng)于較高的Tm，例如，40％甲酰胺，5X或6XSSC。雜交要求兩種核酸含有互補的序列，盡管取決于雜交的嚴(yán)格性，但堿基之間的錯配是可能的。雜交核酸的合適的嚴(yán)格性取決于核酸的長度和互補程度，以及本領(lǐng)域眾所周知的變數(shù)。兩種核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越高，具有這些序列的核酸的雜合體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(相當(dāng)于較高的Tm)按以下順序降低RNARNA、DNARNA、DNADNA。對于長度超過100個核苷酸的雜合體來說，業(yè)已推導(dǎo)出了計算Tm的公式(參見Sambrook等，同上，9.50-9.51)。對于較短核酸，即寡核苷酸的雜交來說，錯配的位置變得更重要，而寡核苷酸的長度決定其專一性(參見Sambrook等，同上，11.7-11.8)。在一種實施方案中，可雜交核酸的長度至少為大約10個核苷酸?？呻s交核酸的最小長度優(yōu)選為至少大約15個核苷酸，更優(yōu)選至少大約為20個核苷酸，最優(yōu)選至少30個核苷酸。另外，技術(shù)人員可以理解的是，溫度和洗滌溶液的鹽濃度可以是根據(jù)需要按照諸如探針長度的因素進行調(diào)整。
“實質(zhì)性部分”是指氨基酸或核苷酸序列，它包括一種多肽的足夠的氨基酸序列或一種基因的足夠的核苷酸序列以便對所述多肽或基因進行推測性鑒定，這種鑒定是由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過進行序列的人工評估完成的，或者使用諸如BLAST的程序通過計算機自動化序列比較和鑒定完成的(基礎(chǔ)局部排比檢索工具；Altschul等，分子生物學(xué)雜志215403-410，1993；還可參見www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。一般，為了推測性地鑒定一種多肽或核酸序列是否與已知蛋白或基因同源需要10或10個以上連續(xù)的氨基酸序列或40或40個以上的核苷酸序列。另外，對于核苷酸序列來說，可將包括20個或30個連續(xù)核苷酸的基因?qū)Ｒ恍怨押塑账崽结樣糜诨蜩b定(例如，Southern雜交)和分離(例如，細菌菌落或噬菌體噬斑的原位雜交)的序列決定型方法中。另外，可將12-15個堿基的短的寡核苷酸用作PCR的擴增引物，以便獲得含有該引物的特定的核酸分子。因此，核酸序列的“實質(zhì)性部分”包括足夠的序列來完成含有該序列的核酸分子的具體鑒定和/或分離。本說明書披露了編碼一種或多種特定蛋白的部分或完整氨基酸和核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在可以利用本發(fā)明所報導(dǎo)的序列，將所披露序列的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的目的。因此，本發(fā)明包括在所附序列表中所報導(dǎo)的完整的序列，以及如上文所定義的這些序列的實質(zhì)性部分。
術(shù)語“互補”表示能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如，對于DNA序列來說，腺苷與胸苷互補，而胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此，本發(fā)明還包括互補于所附序列表中所報導(dǎo)的完整序列以及基本上類似的核酸序列的分離的核酸分子。
術(shù)語“百分相同性”正如本領(lǐng)域所公知，是兩種或兩種以上多肽序列或兩種或兩種以上多核苷酸序列之間的關(guān)系，這種關(guān)系是通過比較這些序列而確定的。在本領(lǐng)域中，“相同性”還表示多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，可以根據(jù)所述序列之間的匹配程度確定?！跋嗤浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^已知方法方便地計算出來，包括，但不限于披露于以下文獻中的方法計算分子生物學(xué)；Lesk，A.M.著；牛津大學(xué)出版社紐約，1988；生物計算信息和基因組工程；Smith，D.W.等；學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計算機分析，第1部分；Griffin，A.M.和Griffin，H.G.著；Humana出版社新澤西，1994；分子生物學(xué)的序列分析；von Heinje，G.著；學(xué)術(shù)出版社，紐約，1987；和序列分析引物；Gribskov，M.和Devereux，J.著；Stockton出版社紐約，1991。用于測定相同性的優(yōu)選方法被設(shè)計成能在測定的序列之間產(chǎn)生最大的匹配。
測定相同性和相似性的方法被編輯成公眾可以獲得的計算機程序。用于測定兩個序列之間的相同性和相似性的優(yōu)選的計算機編程方法包括，但不限于GCG程序包中所提供的GCGPileup程序，使用Needleman和Wunsch算法，及其標(biāo)準(zhǔn)預(yù)設(shè)值，缺口產(chǎn)生罰金＝12，而缺口延伸罰金＝4(Devereux等，核酸研究12387-395，1984)，BLASTP、BLASTN和FNSTA(Pearson等，美國科學(xué)院院報852444-2448，1988)。BLASTX程序可以從NCBI和其他來源公開獲得(BLAST手冊，Altschul等，國家生物技術(shù)信息中心，國家醫(yī)學(xué)文庫(NCBINLM)NIH，Bethesda，Md.20894；Altschul等，分子生物學(xué)雜志215403-410，1990；Altschul等，缺口BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白數(shù)據(jù)庫檢索程序，核酸研究253389-3402，1997)。測定百分相同性的另一種優(yōu)選方法是利用Jotun-Hein算法的DNASTAR蛋白排比方案的方法(Hein等，酶學(xué)方法183626-645，1990)。用于排比的Jotun-Hein方法的預(yù)設(shè)參數(shù)為對于多重排比來說，缺口罰金＝11，缺口長度罰金＝3；對于成對的排比來說，ktuple＝6。作為一種說明，與參考核苷酸序列至少有95％的核苷酸序列“相同性”的多核苷酸被認(rèn)為該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，所不同的是，該多核苷酸序列可以包括在每100個參考核苷酸序列中最多可以有5個點突變。換句話說，包括與參考核苷酸序列有至少95％核苷酸序列相同的多核苷酸。參考序列中的最多5％的核苷酸可以缺失或被其他核苷酸所取代，或者在參考序列上插入占總核苷酸的最多5％的核苷酸。參考序列的突變可以出現(xiàn)在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置上或兩個末端部分之間的任何位置上，單獨分布在參考序列的核苷酸之間或者在參考序列上形成一個或多個連續(xù)的組。類似的，與參考氨基酸序列至少有95％的氨基酸序列“相同性”的多肽被認(rèn)為該多肽的氨基酸與參考序列相同，所不同的是，該多肽的序列可以包括在每100個參考氨基酸序列中最多可以有5個點突變。換句話說，包括與參考氨基酸序列有至少95％氨基酸序列相同的多肽。參考序列中的最多5％的氨基酸可以缺失或被其他氨基酸所取代，或者在參考序列上插入占總氨基酸殘基的最多5％的氨基酸。參考序列的突變可以出現(xiàn)在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上或兩個末端部分之間的任何位置上，單獨分布在參考序列上的殘基之間或在參考序列上形成一個或多個連續(xù)的組。
術(shù)語“同源的”是指一種特定宿主細胞天然存在的蛋白或多肽。本發(fā)明包括通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)同源蛋白的微生物。
術(shù)語“百分同源性”是指多肽之間氨基酸序列相同性的程度。如果第一種氨基酸與第二種氨基酸序列相同，那么第一種和第二種氨基酸序列就具有100％的相同性。任何兩種多肽之間的同源性是在任意一個序列上的測定位點上匹配的氨基酸的總數(shù)的直接函數(shù)，例如，如果兩個序列的任一個上的氨基酸總數(shù)的一半是相同的，那么這兩個序列就被說成具有50％的同源性。
“密碼子簡并性”是指容許核苷酸序列的變化但又不影響所編碼多肽的氨基酸序列的遺傳密碼的差異。因此，本發(fā)明涉及編碼SEQ IDNO57所示氨基酸序列的全部或?qū)嵸|(zhì)性部分的所有核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的是特定宿主細胞在利用核苷酸密碼編碼特定氨基酸時所表現(xiàn)出的“密碼子偏倚性”。因此，在合成用于改善宿主細胞表達的基因時，需要對該基因進行設(shè)計，以便其密碼子使用頻率接近該宿主細胞優(yōu)選的密碼子使用頻率。
還涉及對所述序列的修飾，如缺失、插入或取代，這種修飾能產(chǎn)生不會明顯影響所得到的蛋白分子的功能特定的沉默變化。例如，包括在基因序列上所發(fā)生的能反映遺傳密碼簡并性的改變或會導(dǎo)致在特定位點產(chǎn)生化學(xué)上等同的氨基酸的改變。因此，編碼疏水性氨基酸丙氨酸的密碼子可以用編碼另一種疏水性較弱的殘基，如甘氨酸的密碼所取代，或用疏水性更強的殘基，如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的密碼所取代。類似的，能導(dǎo)致一種帶負(fù)電荷的殘基取代另一種帶負(fù)電荷的殘基的變化，如天冬氨酸取代谷氨酸，或帶正電荷的殘基取代另一種帶正電荷的殘基，如賴氨酸取代精氨酸，也有可能產(chǎn)生生物學(xué)上等同的產(chǎn)物。預(yù)計會導(dǎo)致蛋白分子的N-末端和C-末端部分改變的核苷酸變化也會改變蛋白的活性。在某些場合下，實際上可能需要產(chǎn)生序列的突變體，以便研究改變對蛋白的生物學(xué)活性的影響。所推薦的每一種修飾都是本領(lǐng)域所熟知的，對所編碼產(chǎn)生的生物學(xué)活性保留的測定也是熟知的。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明所包括的序列還可以根據(jù)其在嚴(yán)格條件下(0.1XSSC，0.1％SDS，65℃)與本文所列舉的序列雜交的能力確定。
術(shù)語“表達”是指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因進行的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯。
術(shù)語“質(zhì)?！薄ⅰ拜d體”和“框”是指染色體外因子，它通常具有不作為該細胞中心代謝的一部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子序列形式的。所述因子可以是自主復(fù)制的序列、基因整合序列、噬菌體或核苷酸序列、單鏈或雙鏈線性或環(huán)狀的DNA或RNA，可源于任何來源，其中，多個核苷酸序列業(yè)已連接或重組到一種特殊結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)能夠?qū)幼悠魏吞囟ɑ虍a(chǎn)物的DNA序列連同合適的3’非翻譯序列一起導(dǎo)入細胞?！稗D(zhuǎn)化框”是指含有外源基因的特殊載體，除了外源基因之外還具有有利于轉(zhuǎn)化特定宿主細胞的因子。“表達框”是指含有外源基因的特殊載體，除了所述外源基因之外還具有能增強該基因在外源宿主中表達的因子。
重組生物的構(gòu)建可以用本領(lǐng)域所公知的技術(shù)構(gòu)建重組生物，該重組生物含有編碼將碳底物轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的酶促途徑的必要基因。從諸如克雷伯氏菌屬或酵母菌屬的天然宿主中分離編碼甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脫水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)、脫水酶再活化因子(orfZ和orfX)和1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的基因，并用于轉(zhuǎn)化宿主菌株，如大腸桿菌dha5α、ECL707、AA200、或KLP23。
分離基因從細菌基因組中獲得目的基因的方法是常用的，并且為分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。例如，如果該基因的序列是已知的話，可以通過限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生合適的基因組文庫，并可以用互補于目的基因序列的探針篩選。一旦分離了所述序列，就可以用諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的標(biāo)準(zhǔn)引物指導(dǎo)的擴增方法擴增所述DNA(US4683202)，以便獲得適合用合適的載體進行轉(zhuǎn)化的量的DNA。
另外，可以制備粘粒文庫，其中，將基因組DNA的大的片段(35-45kb)包裝到載體中，并用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。粘粒載體在容納大量DNA的能力方面是獨一無二的。常見的粘粒載體至少具有一個拷貝的cosDNA序列，它是外源DNA的包裝以及隨后的環(huán)化所必需的。除了cos序列之外，所述載體還含有一個諸如ColE1的復(fù)制起點，以及諸如抗氨芐青霉素或新霉素的基因的抗藥性標(biāo)記。利用粘粒載體轉(zhuǎn)化合適的細菌宿主的方法披露于以下文獻中Sambrook，J.等，分子克隆實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室出版社，被收作本文參考。
通常為了克隆粘粒，利用合適的限制性內(nèi)切酶分離外源DNA，并連接到靠近粘粒載體的cos部分。然后讓含有線性化的外源DNA的粘粒載體與諸如噬菌體的DNA包裝載體起反應(yīng)。在包裝過程中，cos位點被裂解，并且外源DNA被包裝到細菌顆粒的頭部。然后將所述顆粒用于轉(zhuǎn)染諸如大腸桿菌的合適宿主。一旦注射到細胞中，所述外源DNA就在cos粘性末端的影響下環(huán)化。這樣，即可將外源DNA的大片段導(dǎo)入重組宿主細胞，并在其中表達。
編碼甘油脫水酶(dhaB1、dhaB2和dhaB3)、脫水酶再活化因子(orfZ和orfX)和1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的基因的分離和克隆在本發(fā)明中使用粘粒載體和粘粒轉(zhuǎn)化方法，以便克隆來自已知具有能夠?qū)⒏视图庸こ?，3-丙二醇的基因的細菌屬的基因組DNA的大片段。具體地講，用本領(lǐng)域所熟知的方法從肺炎克雷伯氏菌中分離基因組DNA，并用限制酶Sau3A消化，以便插入粘粒載體Supercosl，并用GigapackII包裝提取物進行包裝。在構(gòu)建載體之后，用粘粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue MR細胞。通過在有甘油的條件下生長細胞并分析培養(yǎng)基中1，3-丙二醇的形成，根據(jù)將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的能力篩選轉(zhuǎn)化體。
對兩個1，3-丙二醇陽性轉(zhuǎn)化體進行分析，并將粘粒命名為pKP1和pKP2。DNA測序發(fā)現(xiàn)了與源于弗氏檸檬酸桿菌的甘油脫水酶基因的高度的同源性，表明這些轉(zhuǎn)化體含有編碼甘油脫水酶基因的DNA。對其他1，3-丙二醇陽性轉(zhuǎn)化體進行了分析，將粘粒命名為pKP4和pKP5。DNA測序發(fā)現(xiàn)這些粘粒具有編碼二醇脫水酶基因的DNA。
盡管本發(fā)明利用的是源于克雷伯氏菌屬粘粒的分離的基因，脫水酶基因和脫水酶再活化因子基因的其他來源包括，但不限于檸檬酸桿菌屬、梭菌屬和沙門氏菌屬(參見表1)。
編碼G3PDH和G3P磷酸酶的基因本發(fā)明提供了適合于在宿主細胞中表達G3PDH和G3P磷酸酶活性的基因。
編碼G3PDH的基因是已知的。例如，業(yè)已從酵母屬中分離了G3PD1，并具有SEQ ID NO53所示的堿基序列，編碼SEQ ID NO54所示的氨基酸序列(Wang等，同上)。類似地，業(yè)已從酵母屬中分離了由GPD2編碼的G3PDH活性(Eriksson等，分子微生物學(xué)17，95，1995)。
對于本發(fā)明來說，希望編碼決定NADH決定型G3PDH活性的多肽的任何基因都是合適的，其中，所述活性能夠催化二羥基丙酮磷酸(dhap)向甘油-3-磷酸(G3P)的轉(zhuǎn)化。另外，希望編碼NADH-決定型G3PDH’s的氨基酸序列的任何基因，相當(dāng)于基因DAR1、GPD1、GPD2、GPD3和gpsA都能在本發(fā)明中起作用，其中，所述氨基酸序列可以包括不會改變有關(guān)酶的功能的氨基酸取代、缺失或添加。技術(shù)人員可以理解的是，從其他來源分離的編碼G3PDH的基因同樣適用于本發(fā)明。編碼G3P磷酸酶的基因是已知的。例如，業(yè)已從釀酒酵母中分離了GPP2，它具有SEQ ID NO5所示的堿基序列，該序列編碼SEQ ID NO56所示的氨基酸序列(Norbeck等，生物學(xué)化學(xué)雜志271，13875，1996)。
對于本發(fā)明來說，編碼G3P磷酸酶活性的任何基因都能適用于本發(fā)明，其中，所述活性能夠催化將甘油-3-磷酸和水轉(zhuǎn)化成甘油和無機磷酸。另外，編碼G3P磷酸酶的氨基酸序列的任何基因，相當(dāng)于基因GPP2和GPP1都能在本發(fā)明中起作用，包括含有不會影響G3P磷酸酶的功能的氨基酸取代、缺失或添加的任何氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，從其他來源分離的編碼G3P磷酸酶的基因同樣適用于本發(fā)明中。
宿主細胞適用于重組生產(chǎn)1，3-丙二醇的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，并且僅受宿主細胞表達1，3-丙二醇途徑的有活性的酶的能力限制。合適的宿主細胞可以是細菌，如檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷伯氏菌屬、氣桿菌屬、乳桿菌屬、曲霉屬、酵母屬、裂殖酵母屬、接合酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、甲基桿菌屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、氣桿菌屬、鏈霉菌屬、埃希氏菌屬、和假單胞菌屬。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌、E.blattae、克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬和氣桿菌屬。
利用以下通用方法可以將微生物轉(zhuǎn)化成高效價1，3-丙二醇的生產(chǎn)菌。
1.確定潛在的宿主生物中內(nèi)源dhaT-樣活性的存在，這種活性容許在存在1-2M 1，3-丙二醇的條件下具有穩(wěn)態(tài)濃度的毒性或抑制含量的3-HP。
2.如果在潛在的宿主生物中存在這種活性的話，實施合適的誘變，以便使該活性缺失或失活。通過在存在1-2M 1，3-丙二醇的條件下檢測到缺乏3-HPA的積累，證實無功能的或缺失的dhaT-樣活性。
3.表達合適的基因，以便a)產(chǎn)生甘油，如果甘油不是碳源的話，b)甘油脫水酶和相關(guān)的維持系統(tǒng)，和c)yqhD。
對某些微生物來說需要考慮的因素與內(nèi)源dhaT-樣酶在1，3-丙二醇生產(chǎn)的條件下的表達或抑制有關(guān)。這些因素還可以包括甘油、葡萄糖或厭氧生活的存在。
載體和表達框本發(fā)明提供了多種適用于向合適的宿主細胞中克隆、轉(zhuǎn)化和表達G3PDH、G3P磷酸酶、脫水酶和脫水酶和脫水酶再活化因子的載體和轉(zhuǎn)化和表達框。合適的載體是與所采用的微生物兼容的載體。例如，合適的載體可源于細菌、病毒(如噬菌體T7或M-13衍生的噬菌體)、粘粒、酵母或植物。獲得和使用所述載體的方法為本領(lǐng)域所公知(Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，1、2、3卷，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)。通常，所述載體或框含有指導(dǎo)合適的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記、以及能夠進行自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包括所述基因的5’區(qū)，它具有轉(zhuǎn)錄起始控制作用，以及所述DNA片段的3’區(qū)，它控制轉(zhuǎn)錄的終止。最優(yōu)選的是，這兩個控制區(qū)源于與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源的基因。所述控制區(qū)不一定源于被選作生產(chǎn)宿主的特定物種所天然擁有的基因。
有眾多可用于在目的宿主細胞中啟動G3PDH和G3P磷酸酶基因(分別為DAR1和GPP2)表達的起始控制區(qū)或啟動子，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實際上，能夠啟動這些基因表達的任何啟動子都是適用于本發(fā)明的，包括，但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(用于在酵母屬中表達)；AOX1(用于在畢赤酵母中表達)；和1ac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大腸桿菌中表達)。
終止控制區(qū)還可源于優(yōu)選的宿主所天然具備的各種基因?？蛇x地包括一個非必要終止位點；不過，最后包括這么一個位點。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的酶的表達，將編碼這種酶的DNA通過起始密碼子可操作地連接在特定表達控制區(qū)上，以便表達能導(dǎo)致合適的mRNA的形成。本發(fā)明中特別有用的是載體pDT29和pKP32，這些載體被設(shè)計成與pAH48結(jié)合使用。pDT29和pKP32的必要因子源于從肺炎克雷伯氏菌中分離的dha調(diào)節(jié)子。pDT29含有開放讀框dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2和dhaB3、其序列包含在SEQ ID NO1中的核苷酸。pKP32含有與pDT29上相同的一組開放讀框，這些讀框來自相同的來源，所不同的pKP32缺乏dhaT。PAH48是用于將DAR1和GPP2基因?qū)胨拗骷毎妮d體，更具體地講，包括從釀酒酵母中分離的dhaR1和GPP2基因。
合適宿主的轉(zhuǎn)化和基因的表達，以便生產(chǎn)1，3-丙二醇一旦構(gòu)建了合適的框，就將其用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞。將含有編碼G3PDH、G3P磷酸酶、脫水酶和脫水酶再活化因子的框?qū)胨拗骷毎梢酝ㄟ^已知方法完成，如通過轉(zhuǎn)化(例如，使用鈣透化細胞、電穿孔)，或通過用重組噬菌體病毒進行轉(zhuǎn)染，Sambrook等，同上)。
在本發(fā)明中，完全按照一般方法和實施例中所披露的方案用框轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
突變體除了所列舉的細胞之外，希望本發(fā)明可以利用具有一個或多個突變的細胞，這些突變是為了提高1，3-丙二醇的產(chǎn)量而專門設(shè)計的。可以對在正常情況下會將碳飼養(yǎng)母液引向非生產(chǎn)途徑的細胞或表現(xiàn)出明顯的分解代謝物阻抑的細胞進行誘變，以避免這種表型缺陷。例如，很多野生型細胞會受到培養(yǎng)基中的葡萄糖和副產(chǎn)品的分解代謝產(chǎn)物阻抑，并且希望這種野生型生物的突變菌株能夠產(chǎn)生1，3-丙二醇，它是抗葡萄糖阻抑的，因此特別適用于本發(fā)明。
產(chǎn)生突變體的方法是常見的并且為本領(lǐng)域所熟知。例如，可以用各種試劑，如射線或化學(xué)誘變劑處理野生型細胞，然后篩選所需要的表型。當(dāng)通過輻射產(chǎn)生突變時，可以使用紫外線或離子化射線。用于遺傳誘變的合適的短波紫外線波長落在200-300納米范圍內(nèi)，優(yōu)選254納米。在這種波長范圍內(nèi)的紫外線輻射主要會導(dǎo)致核酸序列上的鳥嘌呤和胞嘧啶改變成腺苷和胸苷。由于所有細胞都具備修復(fù)大多數(shù)紫外線誘導(dǎo)的突變的DNA修復(fù)機制，可以添加諸如咖啡因和其他抑制劑的試劑，以便阻止該修復(fù)過程，并增加有效突變的數(shù)量。使用300-400范圍內(nèi)的光線的長波紫外線誘變也是可行的，但通常不如短波紫外線有效，除非與各種活化劑結(jié)合使用，如能與DNA相互作用的補骨脂素染料。
通過化學(xué)試劑進行的誘變也可用于產(chǎn)生突變體，并且常用的物質(zhì)包括能影響非復(fù)制DNA的化合物，如HNO2和NH2OH，以及能影響復(fù)制DNA的試劑，如丫啶染料，以能引起移碼突變而著稱。利用輻射或化學(xué)試劑產(chǎn)生突變體的具體方法在本領(lǐng)域有大量報導(dǎo)。例如，參見ThomasD.Brock，生物技術(shù)工業(yè)微生物學(xué)教科書，第2版，1989，SinauerAssociates公司，Sunderland，MA，或Deshpande，Mukund V，應(yīng)用生物化學(xué)生物技術(shù)36，227，1992，收作本文參考。
在發(fā)生誘變之后，可以通過多種方法篩選具有所需表型的突變體。隨機篩選是最常用的，其中，選擇誘變細胞產(chǎn)生所需產(chǎn)物或中間物的能力。另外，可以通過在選擇培養(yǎng)基上生長誘變的群體對突變型進行選擇性分離，其中，只有抗性菌落能夠發(fā)育。突變體篩選方法是高度發(fā)達的，并且為工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域所熟知。例如，參見Brock，同上；DeMancilha等，食品化學(xué)14，313，1983。
還可以通過破壞編碼不需要的酶的基因達到消除不需要的酶活性的目的。所述方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且在例4和例8中加以說明。
改變1，3-丙二醇生產(chǎn)途徑代表性酶途徑。由葡萄糖生產(chǎn)1，3-丙二醇可以通過下面的一系列步驟完成。這一系列步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的多種途徑的代表，并且示于圖5中。葡萄糖在糖酵解途徑的酶的作用下通過一系列步驟轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮磷酸(dhaP)和3-磷酸-甘油醛(3-PG)。然后通過將dhaP水解成二羥基丙酮(dha)然后還原，或者將dhaP還原甘油-3-磷酸(G3P)然后水解而產(chǎn)生甘油。所述水解步驟可以通過多種細胞磷酸酶中的任一種催化，已知這些酶對其底物是非專一性的，或者通過重組將所述活性導(dǎo)入宿主。所述還原步驟可以由NAD+(或NADP+)連接的宿主酶催化，或者通過重組將該活性導(dǎo)入宿主?？梢岳斫獾氖?，DAH調(diào)節(jié)子含有能催化公式3的可逆的反應(yīng)的甘油脫氫酶(E.C.1.1.1.6)。
甘油-→3一HPA+H20 (公式1)3-HPA+NADH+H+→1，3-丙二醇+NAD+(公式2)甘油+NAD+→DHA+NADH+H+(公式3)正如上文所詳細披露的，通過中間體3-羥基丙醛(3-HPA)將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇。中間體3-HPA是在脫水酶的作用下由甘油產(chǎn)生的，公式1，這種酶可以由宿主編碼或者通過重組導(dǎo)入宿主。這種脫水酶可以是甘油脫水酶(E.C.1.1.1.30)、二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)或任何能催化這種轉(zhuǎn)化的酶。甘油脫水酶，而不是二醇脫水酶是由dha調(diào)節(jié)子編碼的，1，3-丙二醇是在NAD+(或NADP+)連接的宿主酶的作用下由3-HPA產(chǎn)生的，公式2，或者可以通過重組將該活性導(dǎo)入宿主。在生產(chǎn)1，3-丙二醇中的最終反應(yīng)可以由1，3-丙二醇脫氫酶(E.C.1.1.1.202)或其他醇脫氫酶催化。
能影響碳通道的突變和轉(zhuǎn)化。含有在1，3-丙二醇生產(chǎn)途徑上發(fā)生了變異的多種突變微生物可用于本發(fā)明中。例如，將磷酸丙糖異構(gòu)酶突變(tpi-)導(dǎo)入本發(fā)明微生物中就是利用突變改善碳通道性能的一個例子。磷酸丙糖異構(gòu)酶是決定DAHP轉(zhuǎn)化成3-磷酸甘油醛的酶，并因此使得碳流偏離由葡萄糖產(chǎn)生甘油和1，3-丙二醇的主要通道(圖5)。因此，缺失突變(tpi-)能提高所需途徑的代謝效率，這種提高是相對現(xiàn)有技術(shù)而言的。類似地，可以抑制通向1，3-丙二醇生產(chǎn)途徑的其他途徑的突變也可用于本發(fā)明。例如，消除甘油激酶，能夠抑制在G3P磷酸酶的作用下由G3P產(chǎn)生甘油，避免以消耗ATP為代價將其再轉(zhuǎn)化成G3P(圖5)。另外，消除甘油脫氫酶(例如，gldA)能抑制在NADH決定型甘油-3-磷酸脫氫酶的作用下由dhaP產(chǎn)生甘油，避免其轉(zhuǎn)化成二羥基丙酮(圖5)。突變可以是針對結(jié)構(gòu)基因的，以便損害或提高一種酶促活性，或者可以是針對調(diào)控基因的，包括啟動子區(qū)和核糖體結(jié)合位點，以便調(diào)節(jié)酶促活性的表達水平。
因此，需要對轉(zhuǎn)化和突變進行組合，以便控制特定酶的活性，從而提高1，3-丙二醇的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的范圍包括會導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量提高對完整細胞催化劑的預(yù)期的修飾。
本發(fā)明利用一種優(yōu)選途徑由糖底物生產(chǎn)1，3-丙二醇，其中，碳流從葡萄糖向dhaP、G3P、甘油、3-HPA轉(zhuǎn)移，并最終形成1，3-丙二醇。業(yè)已對本發(fā)明的生產(chǎn)菌株進行了工程改造，以便提高所述途徑的代謝效率，這一目的是通過整合各種能抑制碳形成非生產(chǎn)化合物的缺失突變而實現(xiàn)的。如上文所述，通過甘油脫氫酶或甘油激酶將甘油轉(zhuǎn)化成dha或G3P，可以使其不被轉(zhuǎn)化成3HPA(圖5)。因此，本發(fā)明的生產(chǎn)菌株在gldA和glpK基因含有缺失突變。類似地，通過磷酸丙糖異構(gòu)酶可將dhaP轉(zhuǎn)化成3-PG，因此，本發(fā)明的生產(chǎn)微生物還含有在該基因上的缺失突變。本發(fā)明的方法還采用了一種可將甘油轉(zhuǎn)化成3HPA的脫水酶，這種酶與由dha調(diào)節(jié)子的orfX和orfZ所編碼的再活化因子協(xié)調(diào)作用(圖5)。盡管3HPA向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化通常是通過1，3-丙二醇氧化還原酶完成的，本發(fā)明的方法采用了一種非專一性催化活性，它能產(chǎn)生更高效價和產(chǎn)量的最終產(chǎn)物1，3-丙二醇(圖5)。在這種方法中，1，3-丙二醇的效價至少可達到10克/升，其中，預(yù)計其效價為200克/升。
另外，一種生產(chǎn)1，3-丙二醇的改進方法可以用甘油或二羥基丙酮作底物，其中，該途徑僅包括最后的三種底物，甘油→3HPA-→1，3-丙二醇。在這種方法中，再次消除了氧化還原酶以便有利于非專一性催化活性(預(yù)計為醇脫氫酶)，不過，對缺失突變的需要被向培養(yǎng)物中添加甘油的能量因素所抵消。在這種方法中，1，3-丙二醇的效價至少可達到71克/升，其中，預(yù)期效價為200克/升。
類似地，本發(fā)明的范圍還包括提供通過dhaT活性的缺失或突變而修飾過的野生型微生物的突變體，以便產(chǎn)生改進的1，3-丙二醇生產(chǎn)菌。例如，可以對天然含有dha調(diào)節(jié)子的所有因子的微生物進行操作，以便使編碼1，3-丙二醇氧化還原酶活性的dhaT基因失活。預(yù)計這些微生物能產(chǎn)生更高效價和產(chǎn)量的1，3-丙二醇。這種效果是由于一種內(nèi)源催化活性的存在介導(dǎo)的，這種活性預(yù)計為醇脫氫酶。
所述微生物的例子包括，但不限于克雷伯氏菌、檸檬酸桿菌和梭菌。
培養(yǎng)基和碳底物本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的碳底物可以包括，但不限于單糖，如葡萄糖和果糖，寡糖，如乳糖或蔗糖，多糖，如淀粉或纖維素或其混合物以及源于可再生飼料的未純化過的混合物，如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿和大麥麥芽。另外，所述碳底物還可以是單碳底物，如二氧化碳，或甲醇，業(yè)已證實了可將其代謝轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵的生物化學(xué)中間體。業(yè)已報導(dǎo)了在甲基營養(yǎng)酵母(K.Yamada等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)53(2)，541-543，1989)和細菌(Hunter等，生物化學(xué)，24，4148-4155，1985)中由單碳源(例如，甲醇、甲醛或甲酸)生產(chǎn)甘油。所述微生物可以同化單碳化合物，在氧化狀態(tài)下將甲烷轉(zhuǎn)化成甲酸，并產(chǎn)生甘油。所述碳同化途徑可以通過核酮糖單磷酸，通過絲氨酸，或通過木酮糖單磷酸(Gottschalk，細菌代謝，第2版，Springer-Verlag紐約，1996)。核酮糖單磷酸途徑包括甲酸與核酮糖-5-磷酸縮合成六碳糖，由它形成果糖和最終的三碳產(chǎn)物甘油醛-3-磷酸。類似地，絲氨酸途徑通過亞甲基四氫葉酸將單糖化合物同化到糖酵解途徑。
除了單碳和二碳底物之外，已知甲基營養(yǎng)微生物還可利用多種其他含碳化合物，如甲胺、葡糖胺和代謝活性的多種氨基酸。例如，已知甲基營養(yǎng)型酵母能利用來自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion等，微生物生長C1化合物，[國際會議]，7th，1993，415-342。作者Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.出版Intercept，Andover，UK)。類似地，各種甲絲酵母能代謝丙氨酸或油酸(Sulter等，Arch.Microbiol.153，5，485-489，1990)。因此，預(yù)計用于本發(fā)明的碳源可以包括多種含碳底物，并且僅僅局限于微生物或方法的選擇。
盡管預(yù)計上述所有碳底物及其混合物(共飼養(yǎng))都適用于本發(fā)明，但優(yōu)選的碳底物是葡萄糖、果糖、蔗糖、或甲醇，其中，該方法目的是生產(chǎn)內(nèi)源甘油，以及甘油或二羥基丙酮，其中，該方法預(yù)期甘油或二羥基丙酮飼養(yǎng)。
除了合適的碳源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔助因子、緩沖物和本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的其他成分，這些成分適合于培養(yǎng)物的生長，并且能促進1，3-丙二醇生產(chǎn)的必需酶促途徑。特別重要的是Co(II)鹽和/或維生素B12或其前體。
腺苷鈷胺(輔酶B12)是脫水酶活性的必要輔助因子。輔酶B12的合成出現(xiàn)在原核細胞中，某些原核細胞能夠從頭合成該化合物，例如，蟑螂埃希氏菌、克雷伯氏菌、檸檬酸桿菌、和梭菌，而其他的細菌能進行部分反應(yīng)。例如，大腸桿菌不能產(chǎn)生咕啉環(huán)結(jié)構(gòu)，但能夠催化鈷胺向類咕啉的轉(zhuǎn)化，并引入5’-脫氧腺苷基團。因此，本領(lǐng)域眾所周知的是，需要在大腸桿菌發(fā)酵中提供輔酶B12前體，如維生素B12。
向大腸桿菌發(fā)酵液中添加維生素B12可以以恒定的速度連續(xù)添加，或者與細胞團的產(chǎn)生一致分階段添加，或者可以一次或多次集中添加。添加到細胞團(OD550)中的維生素B12的優(yōu)選比例(毫克)為0.06-0.60。添加到細胞團(OD550)中的維生素B12的最優(yōu)選比例(毫克)為0.12-0.48。
盡管將維生素B12添加到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌，但可以理解的是，能夠從頭合成B12的其他微生物也是合適的生產(chǎn)細胞，并且沒有必要向這種微生物中添加B12。
培養(yǎng)條件通常細胞是在35℃下在合適的培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明的優(yōu)選生長培養(yǎng)基是常用的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，如LB營養(yǎng)液，SD營養(yǎng)液或YM營養(yǎng)液。還可以使用其他確定的或合成的生長培養(yǎng)基，特定微生物的合適的生長培養(yǎng)基為微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。可以用已知制劑直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝產(chǎn)物抑制，例如，環(huán)化腺苷2’3’單磷酸，可將其添加到反應(yīng)培養(yǎng)基中。類似地，還可將已知能調(diào)節(jié)酶促活性(例如，甲基viologen)導(dǎo)致1，3-丙二醇產(chǎn)量提高的制劑用于與遺傳操作結(jié)合或者取代遺傳操作。
發(fā)酵的合適pH范圍在pH5.0-9.0之間，其中，pH6.0-8.0是優(yōu)選的起始條件。
反應(yīng)可以在有氧或厭氧條件下進行，其中，優(yōu)選厭氧或微生物厭氧條件。
補料分批發(fā)酵可以通過添加碳進行，例如有限的或過量的葡萄糖。
分批和連續(xù)發(fā)酵本發(fā)明的工藝采用分批發(fā)酵方法。典型的分批發(fā)酵是一種封閉的系統(tǒng)，其中，培養(yǎng)基的組成是在發(fā)酵開始時確定的，并且在發(fā)酵期間不進行認(rèn)為的改變。因此，在發(fā)酵開始時，用需要的微生物接種所述培養(yǎng)基，并且在不向該培養(yǎng)基中添加任何東西的情況下進行發(fā)酵。不過，分批發(fā)酵通常是相對添加碳源的批次，并且通常試圖控制諸如pH和氧氣濃度的因素。在分批系統(tǒng)中，到發(fā)酵停止為止，分批系統(tǒng)中分解代謝產(chǎn)物和該系統(tǒng)的生物物質(zhì)組成都是一直在變化的。有分批培養(yǎng)中，細胞通過靜態(tài)置后期向高生長對數(shù)期調(diào)節(jié)，并最終達到穩(wěn)定期，此時，生產(chǎn)速度降低或停止。如果不進行處理，穩(wěn)定期的細胞會最終死亡。對數(shù)期的細胞通常決定著最終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的大量產(chǎn)生。
標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一個變量是補料分批系統(tǒng)。補料分批發(fā)酵方法也適用于本發(fā)明中，并且包括一種典型的分批系統(tǒng)，所不同的是，隨著發(fā)酵的進行逐漸增加所添加的底物。當(dāng)分解代謝產(chǎn)物抑制能夠抑制細胞的代謝并且希望在培養(yǎng)基中有有限數(shù)量的底物時，補料分批系統(tǒng)是有用的。要測定補料分批系統(tǒng)中的實際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)諸如pH、溶解氧和諸如二氧化碳的廢氣的分壓力的可測定的因素的變化進行估算。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵是常用的，并且為本領(lǐng)域所公知，其例子見Brock，同上。
盡管本發(fā)明是以分批形式進行的，可以理解的是，本方法適用于連續(xù)的發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵是一個開放系統(tǒng)，向一個生物反應(yīng)器中連續(xù)添加確定的發(fā)酵培養(yǎng)基，與此同時，取出等量的條件培養(yǎng)基進行加工。連續(xù)發(fā)酵通常將培養(yǎng)物保持在穩(wěn)定的高密度，其中，細胞主要是處在對數(shù)期生長。
連續(xù)發(fā)酵可以對能影響細胞生長或最終產(chǎn)物濃度的一個因素或多種因素的任一種進行調(diào)節(jié)。例如，一種方法可以將諸如碳源或氮含量的有限的養(yǎng)分保持在固定的比例，并容許對所有其他參數(shù)降低。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)改變多種影響生長的因素，而通過培養(yǎng)基濁度衡量的細胞濃度保持穩(wěn)定。連續(xù)系統(tǒng)要盡量保持穩(wěn)態(tài)生長條件，因此，由于排放培養(yǎng)基所導(dǎo)致的細胞減少必須與發(fā)酵中的細胞生長速度平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵方法的養(yǎng)分和生長因素的方法以及提高產(chǎn)物形成速度的技術(shù)為工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且，Brock(同上)詳細披露了多種方法。
可以理解的是，本發(fā)明可以用分批、補料分批或連續(xù)方法完成，并且任何已知的發(fā)酵方法都是適用的。另外，還可以將細胞固定在一種基質(zhì)上作為全細胞催化劑，并在發(fā)酵條件下生產(chǎn)1，3-丙二醇。
1，3-丙二醇的鑒定和純化從發(fā)酵培養(yǎng)基中純化1，3-丙二醇的方法在本領(lǐng)域中所公知的。例如，通過用有機溶劑提取反應(yīng)混合物、蒸餾和柱層析可以從細胞培養(yǎng)基中獲得丙二醇(US5356812)。用于這種方法的一種特別好的有機溶劑是環(huán)己烷(US50008473)。
可以通過對所述培養(yǎng)基進行高壓液相層析(HPLC)分析直接鑒定1，3-丙二醇。本發(fā)明優(yōu)選的方法是在分析離子交換柱上對發(fā)酵培養(yǎng)基進行分析，使用0.01N硫酸的移動相，以等度洗脫方式洗脫。
實施例一般方法磷酸化、連接和轉(zhuǎn)化方法為本領(lǐng)域所公知。適用于以下實施例中的技術(shù)可以參見Sambrook，J.等，分子克隆實驗室手冊，第2版，1989，冷泉港實驗室出版社，1989。
適用于細菌培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法為本領(lǐng)域所公知。適用于以下實施例中的技術(shù)可以參見以下文獻普通細菌學(xué)方法手冊(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，EugeneW.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips(著)，美國微生物學(xué)協(xié)會，華盛頓特區(qū)，1994，或Thomas，D.Brock，生物技術(shù)工業(yè)微生物學(xué)教材，第2版，1989，Sinauer Associates公司，Sunderland，MA。用于細菌細胞生長和維持的所有試劑和材料均獲得Aldrich化學(xué)公司(Milwaukee，WI)，DI FCO實驗室(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma化學(xué)公司(St.Louis，MO)，除非另有說明。
縮略語的含義如下“h”表示小時，“min”表示分鐘，“sec”表示秒，“d”表示天數(shù)，“mL”表示毫升，“L”表示升，50amp是50微克/毫升氨芐青霉素，而LB-50amp是含有50微克/毫升氨芐青霉素的LB營養(yǎng)液。
在表中使用了以下縮略語“Con.”是轉(zhuǎn)化，“Sel.”是碳的選擇性，而“nd”是未檢測。使用和構(gòu)建的菌株和載體在下面的表中示出

酶測定脫水酶測定用甘油或1，2-丙二醇作底物測定無細胞提取物中的脫水酶活性。
通常，無細胞提取物是通過用弗氏壓碎器破壞細胞，然后對細胞碎片進行離心而制備的。Forage和Foster業(yè)已披露基于醛與甲基苯并-2-噻唑酮hydrazone的反應(yīng)的上述測定(生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報，569，249，1979) 。
Honda等(細菌雜志143，1458，1980)披露了一種測定脫水酶再活化的方法。脫水酶性是用甘油或1，2-丙二醇作底物在有或沒有ATP的條件下在甲苯化全細胞中測定的。再活化是通過在添加或不添加ATP的條件下所形成的產(chǎn)物的比例測定的。產(chǎn)物生成(在用甘油或1，2-丙二醇作底物時產(chǎn)物分別為3-HPA或丙醛)是用HPLC直接測定的，或者用甲基苯并-2-噻唑酮hydrazone試劑間接測定的。另外，產(chǎn)物形成還可以這樣測定將醛向其相應(yīng)醇的轉(zhuǎn)化與NADH連接的醇脫氫酶聯(lián)系在一起，并監(jiān)測NADH的消失。
測定1，3-丙二醇氧化還原酶業(yè)已披露了(Johnson和Lin，細菌學(xué)雜志169，2050，1987)用1，3-丙二醇和NAD+作底物在溶液或板凝膠中測定無細胞提取物的1，3-丙二醇氧化還原酶活性，有時稱之為1，3-丙二醇脫氫酶。另外，通過NADH的消失測定3-HPA和NADH向1，3-丙二醇和NAD+的轉(zhuǎn)化。板凝膠測定具有通過大小分離1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)活性和非專一性醇脫氫酶的潛在優(yōu)點。源于弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和巴氏梭菌的1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)的天然分子量通常較大，在330000-440000道爾頓的數(shù)量級上。短乳桿菌和布氏乳桿菌含有與1，3-丙二醇氧化還原酶相關(guān)的脫水酶，其特性類似于已知的1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)。
測定甘油-3-磷酸脫氫酶活性采用由Bell等所披露的方法(生物學(xué)化學(xué)雜志250，7153，1975)的改進方法。該方法包括在30℃下在樣品槽中培養(yǎng)無細胞提取物樣品，該樣品槽含有0.2mM NADH，2.0mM二羥基丙酮磷酸，和存在于0.1MTris-HCl，pH7.5緩沖液中的酶，以及5mM DTT，總體積為1.0毫升。首先在340納米下測定酶和NADH反應(yīng)的背景速度至少3分鐘。然后添加第二種底物dhaP，并繼續(xù)監(jiān)測吸收值隨時間的變化至少3分鐘。通過從總速度中扣除背景速度確定G3PDH活性。
測定甘油-3-磷酸酶活性
酶活性的測定是通過在Bis-Tris或MBS和鎂緩沖液，pH6.5中與一種有機磷酸底物一起培養(yǎng)所述提取物而進行的。所使用的底物是1-α-甘油磷酸或d，1-α-甘油磷酸。在該測定中有關(guān)試劑的最終濃度為緩沖物(20mM Bis-Tris或50mM MES)；氯化鎂(10mM)；和底物(20mM)。如果該樣品中的總蛋白很少，并且在用酸冷卻時沒有可見的沉淀出現(xiàn)，就在樣品槽中對該樣品進行常規(guī)測定。該方法包括在含有20mM底物(50微升，200mM)，50mM MES，10mM氯化鎂，pH6.5緩沖液的樣品槽中培養(yǎng)一種酶樣品。最終的磷酸酶測定體積為0.5毫升。將含有酶的樣品添加到反應(yīng)混合物中；混合樣品槽中的內(nèi)含物，然后將樣品槽放入37℃的循環(huán)水浴中5-120分鐘，時間的長度取決于該酶樣品中磷酸酶活性是否在2-0.02U/毫升范圍內(nèi)。通過添加鉬酸(0.4毫升)終止該酶促反應(yīng)。在添加Fiske SubbaRow試劑(0.1毫升)和蒸餾水(1.5毫升)之后，混合該溶液，并讓其顯影。10分鐘之后，使顏色顯現(xiàn)充分，在660納米下用Cary219UV/vis分光光度計讀出該樣品的吸收值。將所釋放的無機磷酸的量與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，標(biāo)準(zhǔn)曲線是用無機磷酸母液(0.65mM)制備的，并制備六種最終無機磷酸濃度為0.026-0.130微摩爾/毫升的標(biāo)準(zhǔn)物。
測定甘油激酶活性將適量的酶，通常為無細胞粗制提取物添加到25℃的反應(yīng)混合物中，該混合物含有40mM ATP，20mM硫酸鎂，21mM13C均勻標(biāo)記的甘油(99％，劍橋同位素實驗室)，和0.1M Tris-HCl，pH9，培養(yǎng)75分鐘。通過13C-NMR(125MHz)檢測甘油向甘油-3-磷酸的轉(zhuǎn)化甘油(63.11ppm，σ，J＝41Hz和72.66ppm，t，J＝41Hz)；甘油-3-磷酸(62.93ppm，σ，J＝41Hz；65.31ppm，brd，J＝43Hz；和72.66ppm，dt，J＝6，41Hz)。
NADH連接的甘油脫氫酶測定在通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白之后測定來自大腸桿菌菌株的無細胞提取物中的NADH連接的甘油脫氫酶活性(gldA)。甘油和NAD+向二羥基丙酮和NADH的轉(zhuǎn)化與3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)向深顏色的甲*的轉(zhuǎn)化相關(guān)聯(lián)，使用PMS作介體(Tang等，細菌學(xué)雜志140，182，1997)。
電泳是用天然凝膠通過標(biāo)準(zhǔn)方法重復(fù)進行的(8％-16％TG，1.5毫米，15泳道凝膠，購自Novex，San Diego，CA)。通過用50mM Tris或碳酸鉀緩沖液pH9洗滌三次10分鐘除去凝膠中的殘余甘油。在有和沒有甘油的條件下(大約0.16M最終濃度)在15毫升測定溶液中對重復(fù)的凝膠進行顯影，所述測定溶液含有50mM Tris或碳酸鉀，pH9，60毫克硫酸銨，75毫克NAD+，1.5毫克MTT和0.5毫克PMS。
在聚丙烯酰胺凝膠電泳之后還測定了大腸桿菌菌株中NADH連接的甘油脫氫酶活性(gldA)的存在與否，是通過與抗純化的肺炎克雷伯氏菌甘油脫氫酶(dhaD)的多克隆抗體起反應(yīng)測定的。
1，3-丙二醇的分離和鑒定通過HPLC監(jiān)測甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化。分析是用層析領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和材料進行的。一種合適的方法使用Waters Maxima820HPLC系統(tǒng)，使用UV(210納米)和RI檢測。將樣品注射到裝有Shodex SH-1011P預(yù)柱(6毫米X50毫米)的ShodexSH-1011P柱(8毫米X300毫米，購自Waters，Milford，MA)上，將溫度控制在50℃，用0.01N硫酸作移動相，流速為0.5毫升/分鐘。在需要定量分析時，用已知量的三甲基乙酸作外部標(biāo)準(zhǔn)物制備樣品。通常，葡萄糖(RI檢測)、甘油、1，3-丙二醇(RI檢測)和三甲基乙酸(UV和RI檢測)分別為15.27分鐘，20.67分鐘，36.08分鐘和35.03分鐘。通過GC/MS證實1，3-丙二醇的產(chǎn)生。分析是使用GC/MS領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和材料進行的。一種合適的方法使用與Hewlett Packard5971系列質(zhì)量選擇檢測儀(EI)和HP-INNOWax柱(長度30米，內(nèi)徑0.25毫米，膜厚度0.25微米)連接的HewlettPackard5890系列II氣相層析。將所產(chǎn)生的1，3-丙二醇的保留時間和質(zhì)譜與正規(guī)1，3-丙二醇的結(jié)果進行比較(m/e57，58)。
GC/MS的另一種方法涉及樣品的衍生化。向1.0毫升樣品(例如，培養(yǎng)上清液)中添加30微升濃縮的(70v/v)過氯酸，混合之后，冷凍樣品并凍干。將bis(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺吡啶的1∶1的混合物(300微升)添加到凍干的材料中，劇烈攪拌并在65℃下放置1小時。通過離心使該樣品中的不溶性材料澄清。所得到的液體分成兩種相，將上部相用于分析。在DB-5柱(48米，內(nèi)徑0.25毫米，膜厚度0.25微米；購自J&W Scientific)上對樣品進行層析，并將由培養(yǎng)上清液所獲得的1，3-丙二醇衍生物的保留時間和質(zhì)譜與用真正的標(biāo)準(zhǔn)物所獲得的結(jié)果進行比較。TMS衍生的1，3-丙二醇的質(zhì)譜含有205、177、130和155AMU的特有離子。
細胞裂解通過測定發(fā)酵液中胞外可溶蛋白的濃度估算細胞裂解。在臺式離心機上對發(fā)酵樣品進行離心(通常在Eppendorf，5415C型微型離心機上以12000rpm的速度離心3-5分鐘，以便分離細胞。然后用市場上銷售的試劑(Bio-Rad蛋白測定，Bio-Rad，Hercules，CA)通過Bradford方法分析所得到的上清液的蛋白濃度。
生活力通過以合適的稀釋比例將從發(fā)酵罐中獲得的細胞鋪平板到非選擇性LB瓊脂平板上測定細胞生活力。比較不同發(fā)酵實驗之間的細胞生活力，用每毫升發(fā)酵液的生活細胞除以O(shè)D550(AU)的比例。
例1用粘粒DNA克隆并轉(zhuǎn)化大腸桿菌速度細胞，以便表達1，3-丙二醇培養(yǎng)基將合成的S12培養(yǎng)基用于篩選具有產(chǎn)生1，3-丙二醇的能力的細菌轉(zhuǎn)化體。S12培養(yǎng)基含有10mM硫酸銨，50mM磷酸鉀緩沖液，pH7.0，2mM氯化鎂，0.7mM氯化鈣，50μM氯化錳，1μM三氯化鐵，1μM氯化鋅，1.7μM硫酸銅，2.5μM氯化鈷，2.4μM鉬酸鈉和2μM鹽酸硫胺素。
用于生長和發(fā)酵的培養(yǎng)基A包括10mM硫酸銨，50mM MOPS/KOH緩沖液，pH7.5；5mM磷酸鉀緩沖液，pH7.5；2mM氯化鎂；0.7mM氯化鈣；50μM氯化錳；1μM三氯化鐵；1μM氯化鋅；1.72μM硫酸銅；2.53μM氯化鈷；2.42μM鉬酸鈉；2μM鹽酸硫胺素；0.01％酵母提取物；0.01％酪蛋白氨基酸；0.8微克/毫升維生素B12；和50微克/毫升氨芐青霉素。根據(jù)需要向培養(yǎng)基A補充0.2％甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖。
細胞肺炎克雷伯氏菌ECL2106(Ruch等，細菌學(xué)雜志124，348，1975)(在文獻中又被稱為K.aerogenes或Aerobacter aerogehes)是從E.C.C.Lin處獲得的(哈佛醫(yī)學(xué)院，劍橋，MA)，并作為實驗室培養(yǎng)物保持。
肺炎克雷伯氏菌ATCC25955是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，VA)購買的。
大腸桿菌DH5α是從Gibco/BRL購買的，并且用從肺炎克雷伯氏菌ATCC25955中分離的粘粒DNA轉(zhuǎn)化。該DNA含有編碼甘油或二醇脫水酶的基因。含有甘油脫水酶的粘粒被確定為pKP1和pKP2，而含有二醇脫水酶的粘粒被確定為pKP4。轉(zhuǎn)化過的DH5α細胞被確定為DH5α-pKP1、DH5α-pKP2、和DH5α-pKP4。
大腸桿菌ECL707(Sprenger等，遺傳微生物學(xué)雜志135，1255，1989)是從E.C.C.Lin(哈佛醫(yī)學(xué)院，劍橋，MA)處獲得的，并且同樣用來自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)化體被確定為含有甘油脫水酶基因的ECL707-pKP1和ECL707-pKP1，和含有二醇脫水酶基因的ECL707-pKP4。
在tpi基因上含有突變的大腸桿菌AA200(Anderson等，遺傳微生物學(xué)雜志62，329，1970)是從大腸桿菌遺傳資源中心購買的，耶魯大學(xué)(New Haven，CT)，并用克雷伯氏菌的粘粒DNA轉(zhuǎn)化，以便得到含有甘油脫水酶基因的AA200-pKP1和AA200-pKP2，以及含有二醇脫水酶基因的AA200-pKP4。
DH5α用5毫升LB培養(yǎng)基洗滌含有大約1000個用肺炎克雷伯氏菌DNA傳染過的大腸桿菌L1-BlueMR菌落的6個轉(zhuǎn)化平板，并離心。使細胞沉淀，并重新懸浮在5毫升LB培養(yǎng)基+甘油中。將一等份(50微升)接種到裝有S12合成培養(yǎng)基和0.2％甘油+400納克/毫升維生素B12+0.001％酵母提取物+50amp的15毫升試管中。用該培養(yǎng)基填充試管至頂部，并用石蠟?zāi)し饪?，?0℃下培養(yǎng)。48小時之后觀察到輕微的混濁度。分析過的在78小時和132小時能產(chǎn)生上述產(chǎn)物分布的試樣是1，3-丙二醇的陽性試樣，以后的時間點上含有較大量的1，3-丙二醇。
將測試為1，3-丙二醇產(chǎn)生陽性的細菌進行系列稀釋，并鋪平板到LB-50amp平板上，以便分離單菌落。分離了48個菌落，并再次檢查1，3-丙二醇的產(chǎn)生。從6個獨立的克隆中分離粘粒DNA，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5α中，再次檢查轉(zhuǎn)化體所產(chǎn)生的1，3-丙二醇。對兩種轉(zhuǎn)化體作進一步的鑒定，并命名為DH5α-pKP1和DH5α-pKP2。
將源于pKP1的12.1kb的EcoRI-SalI片段亞克隆到pIBI31(IBI生物系統(tǒng)，New Haven，CT)上，測序，并被命名為pK28-26(SEQ IDNO1)。測序發(fā)現(xiàn)了dha調(diào)節(jié)子編碼甘油脫水酶的相關(guān)開放讀框和調(diào)控所需基因的基因座。參見SEQ ID NO1，編碼二羥基丙酮激酶的dhaK1的一段開放讀框出現(xiàn)在1-399號堿基上(互補)；編碼甘油脫氫酶的開放讀框dhaD出現(xiàn)在1010-2107號堿基上；編碼抑制劑的開放讀框dhaR出現(xiàn)在2209-4134號堿基上；編碼一種未知功能的蛋白的開放讀框orfW出現(xiàn)在4112-4642號堿基上(互補)；編碼脫水酶再活化蛋白的開放讀框orfX出現(xiàn)在4643-4996號堿基上(互補)；編碼1，3丙二醇氧化還原酶的開放讀框dhaT出現(xiàn)在5017-6180號堿基上(互補)；編碼一種未知功能的蛋白的開放讀框orfY出現(xiàn)在6202-6630號堿基上(互補)；編碼α亞基甘油脫水酶的開放讀框dhaB1出現(xiàn)在7044-8711號堿基上；編碼β亞基甘油脫水酶的開放讀框dhaB2出現(xiàn)在8724-9308號堿基上；編碼γ亞基甘油脫水酶的開放讀框dhaB3出現(xiàn)在9311-9736號堿基上；編碼脫水酶再活化蛋白的開放讀框dhaBX出現(xiàn)在9749-11572號堿基上；以及編碼甘油攝取促進蛋白的開放讀框glpF的片段出現(xiàn)在11626-12145號堿基上。
將用源于肺炎克雷伯氏菌的包裝粘粒DNA轉(zhuǎn)染過的大腸桿菌XL1-Blue MR的單菌落接種到含有200微升S15培養(yǎng)基(硫酸銨，10mM；磷酸鉀緩沖液，pH7.0，1mM；MOPS/KOH緩沖液，pH7.0，50mM；氯化鎂2mM，氯化鈣，0.7mM；氯化錳，50μM；三氯化鐵，1μM；氯化鋅，1μM；硫酸銅，1.72μM；氯化鈷，2.53μM；鉬酸鈉，2.42μM；和鹽酸硫胺素，2μM)+0.2％甘油+400納克/毫升維生素B12+0.001％酵母提取物+50微克/毫升氨芐青霉素的微量滴定孔中。除了微量滴定孔之外，還要接種含有LB-50amp的主平板。96小時之后，取出100微升，并且在裝有0.2微米尼龍膜過濾器的Rainin微型離心管中離心。保留細菌，并對過濾液進行處理以便進行HPLC分析。在篩選大約240個菌落之后鑒定能產(chǎn)生1，3-丙二醇的陽性克隆。鑒定了3個陽性克隆，其中的2個在LB-50amp上生長，另一個沒有。從生長在LB-50amp上兩個陽性克隆中分離了一個單一菌落，并證實能產(chǎn)生1，3-丙二醇，將其命名為pKP4。從含有pKP4的大腸桿菌菌株中分離粘粒DNA，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α。證實了被稱為DH5α-pKP4的一個獨立轉(zhuǎn)化體能產(chǎn)生1，3-丙二醇。
ECL707用相當(dāng)于pKP1、pKP2、pKP4之一的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA或Supercos載體本身轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株ECL707，并分別命名為ECL707-pKP1，ECL707-pKP2，ECL707-pKP4，和ECL707-sc。ECL707的glpK、gld和ptsD是無效的，這些基因分別編碼ATP-決定型甘油激酶、NAD+-連接甘油脫氫酶和作為于烯醇磷酸丙酮酸決定型磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的二羥基丙酮的酶II。
將從LB-50amp平板上分離的每一種粘粒轉(zhuǎn)化的20個單菌落和Supercos載體本身(負(fù)對照)轉(zhuǎn)化的5個菌落轉(zhuǎn)移到LB-50amp主平板上。還測定了這些分離物將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的能力，以便確定其是否含有脫水酶活性。用消過毒的牙簽將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到含有200微升補充了0.2％的甘油或0.2％甘油+0.2％D-葡萄糖的培養(yǎng)基A的微量滴定板上。在30℃下培養(yǎng)48小時，通過0.45微米的尼龍濾膜過濾微量滴定板孔中的內(nèi)含物，并通過HPLC進行層析。該測試的結(jié)果在表2中給出。
表2由轉(zhuǎn)化過的ECL707將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇

*(陽性分離物的數(shù)量/測試過的分離物的數(shù)量)AA200用相當(dāng)于pKP1、pKP2、pKP4之一的粘粒肺炎克雷伯氏菌DNA或Supercos載體本身轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株AA200，并分別命名為AA200-pKP1，AA200-pKP2，AA200-pKP4，和AA200-sc。菌株AA200的磷酸丙糖異構(gòu)酶是無效的(tpi-)。
分離每一種粘粒轉(zhuǎn)化的20個單菌落和空載體轉(zhuǎn)化的5個菌落并測試其將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的能力，如在說明大腸桿菌菌株ECL707時所述。該測試的結(jié)果在表3中給出。
表3由轉(zhuǎn)化過的AA200將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇

*(陽性分離物的數(shù)量/測試過的分離物的數(shù)量)例2大腸桿菌FM5的甘油激酶突變體的工程改造，以便由葡萄糖生產(chǎn)甘油構(gòu)建用于在大腸桿菌FM5中進行甘油激酶基因取代的整合質(zhì)粒用PuregeneDNA分離試劑盒(Gentra系統(tǒng)，Minneapolis，MN)制備大腸桿菌FM5(ATCC53911)基因組DNA。使用引物SEQ ID NO2和SEQ ID NO3通過PCR(Mullis和Faloona，酶學(xué)方法155，335，1987)由FM5基因組DNA擴增含有部分glpF和glpK基因的1.0kb的DNA片段。用引物SEQ ID NO4和SEQ ID NO5通過PCR由PM5基因組DNA擴增含有部分glpK和glpX基因的1.1kb的DNA片段。將一個MunI位點插入引物SEQ ID NO4。引物SEQ ID NO4的5’末端是引物SEQ ID NO3的反向互補體，以便能夠隨后進行重疊延伸PCR。使用上述兩種PCR片段作模板和引物SEQ ID NO2和SEQ ID NO5通過PCR將通過重疊延伸技術(shù)剪接的基因(Horton等，生物技術(shù)8528，1990)用于制備2.1kb的片段。這種片段表示從1.5kb glpK基因的中央部分去掉了0.8kb。總體上講，該片段在MunI克隆位點(在部分glpK內(nèi)部)兩側(cè)具有1.0kb和1.1kb的旁側(cè)區(qū)，以便可以通過同源重組進行染色體基因置換。
將上述2.1kb PCR片段的末端補平(使用綠豆核酸酶)，并用GeroBlunt PCR克隆試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)克隆到pCR-Blunt載體上，以便得到含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.6kb的質(zhì)粒pRN100。將源于pLoxCat1(結(jié)果未公開)的含有其旁側(cè)為噬菌體PlloxP位點的氯霉素抗性基因(Snaith等，基因166，173，1995)的1.2kb HincII片段用于破壞質(zhì)粒pRN100上的grpK片段，將其連接在用MunI消化過的(和末端補平)質(zhì)粒pRN100上，得到6.9kb的質(zhì)粒pRN101-1。用引物SEQ ID NO6和SEQ ID NO7通過PCR擴增來自載體pGP704(Miller和Mekalanos，細菌學(xué)雜志170，2575-2583，1988)的含有R6K起始的376bp片段，將末端補平，并連接到源于pRN101-1的5.3kb Asp718-AatII片段(末端補平)上，含有卡那霉素和氯霉素抗性基因的5.7kb質(zhì)粒pRN102-1。用R6K起始取代pRN101-1上的ColE1起始區(qū)產(chǎn)生同樣包括缺失了大部分Zeocin抗性基因的pRN102-1。pRN102-1復(fù)制的宿主是大腸桿菌SY327(Miller和Mekalanos，細菌學(xué)雜志170，2575-2583，1988)，該細菌含有R6K起始起作用所必需pir基因。
氯霉素抗性基因被破壞了的甘油激酶突變體RJF10m的工程改造用非復(fù)制整合質(zhì)粒pRN102-1電轉(zhuǎn)化大腸桿菌FM5，并且在含有1mM甘油的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基上篩選氯霉素抗性(12.5微克/毫升)和卡那霉素敏感型(30微克/毫升)的轉(zhuǎn)化體對甘油的非利用。在通過Southern分析(Southern，分子生物學(xué)雜志98，503-517，1975)用完整的glpK基因檢測源于上述一種突變體RJF10m的基因組DNA的EcoRI消化物時，發(fā)現(xiàn)它是雙交換整合體(glpK基因取代)，因為觀察到了由于在氯霉素抗性基因內(nèi)存在另一個EcoRI位點而出現(xiàn)的7.9kb和2.0kb的帶。野生型對照產(chǎn)生單一預(yù)期的9.4kb的帶。對突變體RJF10m進行的13C NMR分析證實，它不能將13C標(biāo)記過的甘油和ATP轉(zhuǎn)化成甘油-3-磷酸。用引物組合SEQ ID NO8和SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQID NO11、以及SEQ ID NO8和SEQ ID NO11通過基因組PCR進一步分析該glpK突變體，所述PCR分別得到了預(yù)期的2.3kb、2.4kb和4.0kb PCR片段。在使用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO11時野生型對照產(chǎn)生了預(yù)期的3.5kb的帶。用質(zhì)粒pAH48電轉(zhuǎn)化glpK突變體RJF10m。根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定業(yè)已于1997年11月24日將glpK突變體大腸桿菌RJF10m交由ATCC保藏。
消除了對氯霉素抗性基因破壞的甘油激酶突變體RJF10的工程改造
在37℃下在YENB培養(yǎng)基(0.75％酵母提取物，0.8％營養(yǎng)液)中生長一夜之后，用質(zhì)粒pJW168(結(jié)果未發(fā)表)對懸浮在水中的大腸桿菌RJF10m進行電轉(zhuǎn)化，所述質(zhì)粒含有受IPTG誘導(dǎo)型1acUV5啟動子控制的噬菌體P1Cre重組酶基因，溫度敏感型pSC101復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因。在30℃下在SOS培養(yǎng)基中過度生長之后，在30℃下(pJW168復(fù)制的允許溫度)在補充了羧芐青霉素(50微克/毫升)和IPTG(1mM)的新鮮的LB瓊脂培養(yǎng)基上連續(xù)兩次過夜轉(zhuǎn)移合并的菌落，以便在Cre重組酶的作用下在loxP位點上進行的重組剪切染色體氯霉素抗性基因(HOess和Abremski等分子生物學(xué)雜志181，351-362，1985)。將所得到的菌落復(fù)制到補充了羧芐青霉素和IPTG的LB瓊脂培養(yǎng)基上和補充了氯霉素(12.5微克/毫升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，以便鑒定抗羧芐青霉素并且對氯霉素敏感的菌落，表明標(biāo)記基因已經(jīng)被除去。將上述一個菌落的在30℃下培養(yǎng)一夜的培養(yǎng)物用于接種10毫升LB培養(yǎng)基。在30℃下生長到OD(600納米)為0.6AU時，在37℃下將該培養(yǎng)物培養(yǎng)一夜。將若干稀釋液鋪平板在預(yù)熱的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并在42℃下將該平板培養(yǎng)過夜(PJW168不允許復(fù)制的溫度)。將所得到的菌落復(fù)制到補充了到LB瓊脂培養(yǎng)基和補充了羧芐青霉素(75微克/毫升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上，以便鑒定對羧芐青霉素敏感的菌落，表示了質(zhì)粒pJW168。用引物SEQ ID NO8和SEQ ID NO11通過基因組PCR對上述glpK突變體之一RJF10作進一步的分析，并得到了預(yù)期的3.0kb的帶，證實了標(biāo)記基因被切除。通過其不能在含有1mM甘油的M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長證實突變體RJF10不能利用甘油。用質(zhì)粒pAH48對jlpK突變體RJF10進行電轉(zhuǎn)化，以便由葡萄糖生產(chǎn)甘油。
例3構(gòu)建剔除了gldA基因的大腸桿菌菌株使用分別整合了末端Sphl和Xbal位點的引物SEQ ID NO12和SEQ ID NO13通過PCR從大腸桿菌中分離gldA基因(K.B.Mullis和F.A.Faloona，酶學(xué)方法155，335，350，1987)，并克隆到pUC18的Sphl和Xbal位點之間(T.Maniatis，1982，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，冷泉港，NY)，以便產(chǎn)生pKP8。裂解pKP8上gldA基因內(nèi)的獨特的SalI和NcoI位點，用Klenow將末端補平，并重新連接，導(dǎo)致缺少gldA的中央部分的109bp，并再生獨特的SalI位點，以便產(chǎn)生pKP9。用整合了末端SalI位點的引物SEQ ID NO14和SEQ IDNO15通過PCR從pET-28a(+)(Novagen，Madison，Wis)上分離1.4kb的DNA片段，該片段含有產(chǎn)生卡那霉素抗性(kan)的基因，并包括翻譯起始密碼子上游的大約400bp DNA和翻譯終止密碼子下游大約100bp DNA，并將其亞克隆到pKP9的獨特的SalI位點上，產(chǎn)生pKP13。用分別整合了末端SphI和Xbal位點的引物SEQ ID NO16和SEQ ID NO17通過PCR從pKP13上分離2.1kb的DNA片段，該片段始于gldA翻譯起始密碼子下游204bp，并終止于gldA翻譯終止密碼子上游178bp，將其亞克隆到pMAK705上Sphl和Xbal之間(Genencor國際，Palo Alto，CA)，以便產(chǎn)生pMP33。用pMP33轉(zhuǎn)化大腸桿菌FM5，并在30℃下在20微克/毫升kan上選擇，該溫度是允許pMAK705復(fù)制的溫度。在30℃下讓一個菌落在補充了20微克/毫升kan的液體培養(yǎng)基中增殖一夜。將大約32000細胞鋪平板到20微克/毫升kan上，并在44℃下培養(yǎng)16小時，該溫度是pMAK705復(fù)制的限制溫度。在44℃下生長的轉(zhuǎn)化體具有整合到其染色體上的質(zhì)粒，這種現(xiàn)象的發(fā)生頻率大約為0.0001。通過PCR和Southern印跡(E.M.Southern，分子生物學(xué)雜志98，503-517，1975)分析確定在所述轉(zhuǎn)化體中染色體整合事件的性質(zhì)。通過Western印跡分析(Towbin等，美國科學(xué)院院報76，4350，1979)確定在轉(zhuǎn)化體中是否產(chǎn)生了gldA的產(chǎn)物甘油脫氫酶蛋白。通過活性測定確定在轉(zhuǎn)化體中是否保留了甘油脫氫酶活性。用吩嗪甲磺酸酯作介體通過將甘油+NAD+向二羥基丙酮+NADH的轉(zhuǎn)化與四唑染料MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑]轉(zhuǎn)化成深色鉀*聯(lián)系起來測定天然凝膠上甘油脫氫酶帶的活性。甘油脫氫酶還需要30mM硫酸銨和100mM Tris，pH9的存在(Tang等，細菌學(xué)雜志，140，182，1997)，在8個分析過的轉(zhuǎn)化體中，有6個被確定為是剔除了gldA的。業(yè)已根據(jù)布達佩斯條約規(guī)定于1997年11月24日將大腸桿菌MSP33.6交由ATCC保藏。
例4構(gòu)建具有g(shù)lpK和gldA基因剔除的大腸桿菌菌株用分別整合了Sphl和Xbal位點的引物SEQ ID NO18和SEQ IDNO19通過PCR從大腸桿菌中分離1.6kb的DNA片段，該片段含有g(shù)ldA基因，并包括翻譯起始密碼子上游的228bp的DNA，和翻譯終止密碼子下游的220bp的DNA，并將其克隆到pUC18的Sphl和Xbal位點之間，產(chǎn)生pQN2。裂解pQN2的gldA基因上的獨特Sall和Ecol位點，用Klenow將其末端補平，并重新連接，導(dǎo)致缺失了gldA中部的109bp，并再生獨特的Sall位點，產(chǎn)生pQN4。Stul/Xhol片段形式從pLoxKan2(Genencor國際，PaloAlto，CA)上分離1.2kb的DNA片段，該片段含有產(chǎn)生卡那霉素抗性的基因(kan)以及旁側(cè)的loxP位點，用Klenow補平末端，并在用Klenow補平末端之后亞克隆到pQN4上的Sall位點上，產(chǎn)生pQN8。用分別整合了末端Sphl和Xbal位點的引物SEQ ID NO20和SEQ ID NO21通過PCR從pGP704(Miller和Mekalanos，細菌學(xué)雜志170，2575-2583，1988)上分離含有R6K復(fù)制起點的0.4kb的DNA片段，并連接到含有來自pQN8的gldAkan框的2.8kb Sphl和Xbal DNA片段上，產(chǎn)生pKP22。Xbal片段形式從pLoxKan2(Genencor國際，Palo Alto，CA)上分離1.0kb的DNA片段，該片段含有產(chǎn)生氯霉素抗性的基因(cam)以及旁側(cè)的loxP位點，并亞克隆到pKP22上的Xbal位點上，產(chǎn)生pKP23。用pKP23轉(zhuǎn)化glpK-的大腸桿菌菌株RJF10(參見例2)，并分離具有kanRcamS表型的轉(zhuǎn)化體，表明發(fā)生了雙交換整合，這一結(jié)果是通過Southern印跡分析證實的。甘油脫氫酶凝膠活性測定(如例3所述)表明，有活性的甘油脫氫酶不存在于這些轉(zhuǎn)化體中。如例2所示，用能產(chǎn)生Cre的質(zhì)粒pJW168從染色體上除去kan標(biāo)記，以便產(chǎn)生菌株klp23。若干具有kanS表型的分離物沒有表現(xiàn)出甘油脫氫酶活性，并且Sout hern印跡分析證實了kan標(biāo)記的消失。
例5構(gòu)建用于表達甘油3-磷酸脫氫酶(DAR1)和/或甘油3-磷酸酶(GPP2)的質(zhì)粒和菌株構(gòu)建甘油3-磷酸酶的表達框(gpp2)釀酒酵母染色體Vλ克隆6592(GenBank，保藏號U18813X11)是從ATCC獲得的?？寺?-磷酸酶基因(GPP2)，是通過用合成引物(SEQID NO22和SEQ ID NO23)克隆來自λ克隆的靶DNA而實現(xiàn)的，在5’末端整合了BamHI-RBS-Xbal位點，并在3’末端整合了Sall位點。將該產(chǎn)物亞克隆到pCR-Script(Stratagene，Madison，WI)上的Srfl位點上，產(chǎn)生含有GPP2的質(zhì)粒pAH15。質(zhì)粒pAH15含有處于無活性方向的GPP2基因，以便由pCR-ScriptSK+上的lac啟動子表達。將來自pAH15的含有GPP2基因的BamH I-Sall片段插入pBlueScriptIISK+上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAH19。pAH19含有正確方向的GPP2基因，以便由lac啟動子表達。將來自pAH19的含有GPP2基因的Xball-pSTl片段插入pPHOX2上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAH21。PAH21/DH5α是表達質(zhì)粒。
構(gòu)建甘油3-磷酸脫氫酶的表達框(DAR1)用合成引物(SEQ ID NO24和SEQ ID NO25)通過PCR克隆從釀酒酵母基因組DNA中分離DAR1。成功的PCR克隆將一個Ncol位點插入DAR1的5’末端，其中，Ncol內(nèi)部的ATG是DAR1的起始甲硫氨酸。在DAR1的3’末端緊隨翻譯終止子之后引入一個BamHI位點。用NcolBamHI消化該PCR片段，并克隆到表達質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)上的相同位點上，產(chǎn)生pDAR1A。
為了在DAR1的5’末端產(chǎn)生一個更好的核糖體結(jié)合位點，將通過退火合成引物(SEQ ID NO26和SEQ ID NO27)獲得的Spel-RBS-Ncol接頭插入pDAR1A的Ncol位點，產(chǎn)生pAH40。質(zhì)粒pAH40含有正確方向的新的RBS和DAR1基因，以便pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動子表達。將來自pDAR1A的Ncol-BamHI片段和第二套通過退火合成引物(SEQ ID NO28和SEQ ID NO29)獲得的Spel-RBS-Ncol接頭插入pBC-SK+(Stratagene，Madison，WI)的Spel-BamHI位點上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAH42。質(zhì)粒pAH42含有氯霉素抗性基因。
構(gòu)建dar1和gpp2的表達框DAR1和GPP2的表達框是用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法由上述獨立的DAR1和GPP2亞克隆組裝而成的。將來自pAH19的含有核糖體結(jié)合位點(RBS)和GPP2基因的BamHI-Pstl片段插入pAH40，產(chǎn)生pAH43。將來自pAH19的含有RBS和GPP2基因的BamHI-Pstl片段插入pAH42，產(chǎn)生pAH45。
按以下方式修飾GPP25’末端的核糖體結(jié)合位點。通過將合成的引物GATCCAGGAAACAGA(SEQ ID NO30)和CTAGTCTGTTTCCTG(SEQ IDNO31)與來自pAH19的含有GPP2基因的Xbal-Pstl片段退火獲得的Spel-RBS-Ncol接頭插入pAH40的BamHI-Pstl位點上，產(chǎn)生pAH48。質(zhì)粒pAH48含有DAR1基因，修飾過的RBS和正確方向的GPP2基因，以便由pTrc99A(Pharmacia，Piscataway，NJ)的trc啟動子表達。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α、MF5和KRP23。通過其DNA RFLP形式證實轉(zhuǎn)化體。
例6構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的具有源于肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子的基因的表達質(zhì)粒構(gòu)建表達載體pTacIQ通過將lacIq基因(Farabaugh，自然274，5673，765-769，1978)和tac啟動子(Amann等，基因25，167-178，1983)插pBR322(Sutcliffe，冷泉港定量生物學(xué)會議，43，77-90，1979)的EcoRI限制內(nèi)切酶位點上制備大腸桿菌表達載體pTacIQ。用多克隆位點和終止序列(SEQ ID NO32)取代pBR322上從EcoRI到SPHL的序列。
亞克隆甘油脫水酶基因(dhaB1、2、3、X)用在5’末端整合了EcoRI位點在3’末端整合了Xbal位點的引物(SEQ ID NO33和SEQ ID NO34)通過PCR擴增來自pHK28-26的dhaB3基因的開放讀框。將產(chǎn)物亞克隆到pLitmus29(新英格蘭生物實驗室公司，Beverly，MA)上，產(chǎn)生含有dhaB3的質(zhì)粒pdhaB3。
用限制酶Kpnl和EcoRI將源于pHK28-26的含有編碼dhaB調(diào)節(jié)子的dhaB1、dhaB2、dhaB3和dhaBX的完整編碼區(qū)的片段亞克隆到pBluescriptIKS+(Stratagene，La Jolla，CA)上，產(chǎn)生質(zhì)粒pM7。通過用Apal和Xbal消化質(zhì)粒pM7除去dhaBX基因，純化5.9kb片段，將其與源于質(zhì)粒的p dhaB3的325bp的Apal-Xbal片段連接，產(chǎn)生含有dhaB1、dhaB2和dhaB3的pM11。用在5’末端整合了HindIII位點和一個共有核糖體結(jié)合位點并在3’末端整合了Xbal位點的引物(SEQ ID NO35和SEQ ID NO36)通過PCR擴增來自pHK28-26的dhaB1基因的開放讀框。將該產(chǎn)物亞克隆到pLitmus28(新英格蘭生物實驗室公司，Beverly，MA)上，產(chǎn)生含有dhaB1的質(zhì)粒pDT1。
將來自pM11的含有部分dhaB1基因、dhaB2基因和dhaB3基因的Notl-Xbal片段插入pDT1上，產(chǎn)生dhaB表達質(zhì)粒pDT2。將來自pDT2的含有dhaB(1、2、3)基因的HindIII-Xbal片段插入pTacIQ上，產(chǎn)生pDT3。
亞克隆1，3-丙二醇脫氫酶基因(dhaT)將pHK28-26的含有1，3-丙二醇脫氫酶(dhaT)基因的Kpnl-Sacl片段亞克隆到pBluescriptIIKS+上，產(chǎn)生質(zhì)粒pAH1。用pAH1作模板DNA和在其5’末端整合了Xbal位點在其3’末端整合了BamHI位點的合成引物(SEQ ID NO37和SEQ ID NO38)通過PCR擴增dhaT基因。將該產(chǎn)物亞克隆到pCR-Script(Stratagene)的Srfl位點上，以便產(chǎn)生含有dhaT的質(zhì)粒pAH4和pAH5。質(zhì)粒pAH4含有正確方向的dhaT基因，以便由pCR-Script上的lac啟動子表達，而pAH5含有相反方向的dhaT基因。將來自pAH4的含有dhaT基因的Xbal-BamHI片段插入pTacIQ上，以便產(chǎn)生質(zhì)粒pAH8。將來自pAH8的含有RBS和dhaT基因的HindIII-BamHI片段插入pBluescriptIIKS+上，產(chǎn)生pAH11。
構(gòu)建dhaT和dhaB(1、2、3)的表達框用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法由上述單獨的dhaB(1、2、3)和dhaT亞克隆組裝dhaT和dhaB(1、2、3)的表達框。將含有來自pDT3的dhaB(1、2、3)基因的SpeI-SacI片段插入pAH11的SpeI-SacI位點上，產(chǎn)生pAH24。將SalI和XbaI接頭(SEQ ID NO39和SEQ ID NO40)插入用限制酶SalI-XbaI消化過的pAH5上，產(chǎn)生pDT16。所述接頭破壞了Xbal位點。然后將來自pDT16的1kb的SalI-MluI片段插入pAH24上，取代現(xiàn)有的SalI-MluI片段，產(chǎn)生pDT18。將來自pDT18的SalI-NotI片段和來自pM7的NotI-XbaI片段插入pCL1920(SEQ IDNO41)上構(gòu)建pDT21。通過PCR克隆來自酵母屬的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子序列(SEQ ID NO42)，并插入pLitmus28的EcoRI-HindIII位點上，構(gòu)建pDT5。通過將pDT5的EcoRI-PvuII片段插入pCL1920的EcoRI-PvuII位點上構(gòu)建pCL1925。通過將pDT21的HindIII-MluI片段和pDT21的MluI-XbaI片段克隆到pCL1925的HindIII-XbaI位點構(gòu)建pDT24。
構(gòu)建dhaT和dhaB(1、2、3、X)的表達框通過將pDT18的Sall-Ntol片段和pM7的Ntol-Xbal片段插入pCL1920上構(gòu)建pDT21(SEQ ID NO41)。通過PCR克隆來自酵母屬的葡萄糖異構(gòu)酶啟動子序列(SEQ ID NO42)，并插入pLitmus28的EcoRI-HindIII位點上，構(gòu)建pDT5。通過將pDT5的EcoRI-PvuII片段插入pCL1920的EcoRI-PvuII位點上構(gòu)建pCL1925。通過將pDT21的HindIII-MluI片段和pDT21的MluI-XbaI片段克隆到pCL1925的HindIII-XbaI位點構(gòu)建pDT24。
構(gòu)建dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW和dhaB(1、2、3、X)的表達框通過將pHK28-26的Sacl-EcoRI片段插入pCL1925的Sacl-EcoRI位點構(gòu)建pDT29。
構(gòu)建dhaR、orfY、orfX、orfW和dhaB(1、2、3、X)的表達框構(gòu)建質(zhì)粒pDT29的衍生物，其中，通過已知技術(shù)，如PCR介導(dǎo)的重疊延伸去掉了除了基因dhaT的頭5個和最后5個密碼子(加上終止密碼子)的所有密碼子。使用pDT29作模板，兩種一級PCR產(chǎn)物是用以下引物制備的SEQ ID NO43＝5′GAC GCA ACA GTA TTC CGT CGC3′；SEQ ID NO44＝5′ATG AGC TAT CGT ATG TTC CGC CAG GCA TTC TGAGTG TTA ACG3′；SEQ ID NO45＝5′GCC TGG CGG AAC ATA CGA TAG CTC ATA ATATAC3′；SEQ ID NO46＝5′CGG GGC GCT GGG CCA GTA CTG3′。
將SEQ ID NO45和SEQ ID NO46進行配對，以便制備931bp的產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有包括5’dhaB1(至獨特的Scal位點)所有的orfY、和dhaT的頭5個密碼子的核酸。將SEQ ID NO43和SEQ ID NO44進行配對，以便制備1348bp的產(chǎn)物，該產(chǎn)物含有包括dhaT的頭5個密碼子(加上終止密碼子)、所有orfX、所有orfW和5’dhaR(至獨特的Sapl位點)的核酸。SEQ ID NO44的5’末端的15個堿基構(gòu)成了一個尾巴，它是SEQ ID NO45的15個堿基部分的反向互補體。類似的，SEQ ID NO45的5’末端的11個堿基構(gòu)成了一個尾巴，它是SEQ IDNO44的41個堿基部分的反向互補體。因此，兩種一級PCR產(chǎn)物在退火之后連接在一起(通過26bp的尾巴重疊)，并通過PCR延伸，產(chǎn)生2253bp的第三種核酸產(chǎn)物。用Sapl和Scal消化第二種PCR產(chǎn)物，并連接到同樣用Sapl和Scal消化的pDT29上，制備質(zhì)粒pKP32，除了在dhaT內(nèi)部有較大的框內(nèi)缺失之外，它與pDT29相同。
例7用大腸桿菌菌株KLP23/pAH48/pDT29將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇，以及利用KLP23/pAH48/pKP32的改進方法預(yù)培養(yǎng)對KLP23/pAH48/pDT29和KLP23/pAH48/pKp32進行預(yù)培養(yǎng)，以便接種裝在發(fā)酵罐中的含有200毫克/升羧芐青霉素(或氨芐青霉素)和50毫克/升壯觀霉素的2YT培養(yǎng)基(10克/升酵母提取物，16克/升胰化蛋白胨，和10克/升氯化鈉)。KLP23/pAH48/pKP32與KLP23/pAH48/pDT29相同，所不同的是缺失了dhaT。
培養(yǎng)物來自冷凍的母液(用10％DMSO作防凍劑)，在2升三角燒瓶中的500毫升培養(yǎng)基中在35℃下生長，在搖床上以250rpm的速度搖動，直到OD550達到大約1.0AU，并將其用于接種發(fā)酵罐。
發(fā)酵培養(yǎng)基在發(fā)酵容器中對同時對以下成分進行消毒45克磷酸二氫鉀，12克檸檬酸，12克7水硫酸鎂，30克酵母提取物，2.0克檸檬酸鐵銨，5毫升Mazu DF204作為抗泡末劑，1.2克2水氯化鈣，和7.3毫升硫酸。用20％-28％的氫氧化銨將pH提高到6.8，然后添加以下成分1.2克羧芐青霉素或氨芐青霉素，0.30克壯觀霉素，60毫升微量元素溶液和葡萄糖(占添加量的60％-67％)。在培養(yǎng)之后，其體積為6升，葡萄糖的濃度為10克/升。微量元素的溶液含有(克/升)1水檸檬酸(4.0)，1水硫酸錳(3.0)，氯化鈉(1.0)，7水硫酸鐵(0.10)，6水氯化鈷(0.10)，7水硫酸鋅(0.10)，5水硫酸銅(0.010)，硼酸(0.010)和2水鉬酸鈉(0.010)。
發(fā)酵生長用上述培養(yǎng)基制備15升攪拌箱式發(fā)酵罐。將溫度控制在35℃，并用氨水(重量百分比為20-28％)將pH控制在6.8。設(shè)定空氣流速(將最低值設(shè)定為6-12標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘)和攪拌速度(將最低值設(shè)定為350-690rpm)的初始值，以便當(dāng)OUR達到大約140mM/升/小時時，啟動到溶解氧氣(DO)的控制。反壓力控制在0.5巴，DO控制在10％。除了有很小的誤差之外，葡萄糖保持在占飼養(yǎng)物量的60％或67％，在0-10克/升之間。按照下面的說明添加維生素B12和輔酶B12。
用KLP23/pAH48/pDT29發(fā)酵在表5中給出了用大腸桿菌菌株KLP23/pAH48/pDT29將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵方法的概述。從接種后3小時開始添加維生素B12(0.075克/升，500毫升)，添加速度為16毫升/小時。
所獲得的1，3-丙二醇的產(chǎn)量為24wt％(1，3-丙二醇克數(shù)/消耗的葡萄糖克數(shù))，效價為68克/升1，3-丙二醇。
表4用大腸桿菌菌株KLP23/pAH48/pDT29將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述

在發(fā)酵期間以2倍的濃度添加維生素B12或集中添加維生素B12獲得了類似的結(jié)果。所獲得的最高效價為77克/升。
使用KLP23/pAH48/pKP32的改進發(fā)酵在表4中給出了用大腸桿菌菌株KLP23/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述。從接種后3小時開始添加維生素B12(0.150克/升，500毫升)，添加速度為16毫升/小時。36小時之后，對大約2升發(fā)酵液進行凈化，以便可以連續(xù)添加葡萄糖飼養(yǎng)物。所獲得的1，3-丙二醇的產(chǎn)量為26wt％(1，3-丙二醇克數(shù)/消耗的葡萄糖克數(shù))，效價為112克/升1，3-丙二醇。
表5用大腸桿菌菌株KLP23/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述

在發(fā)酵期間以1/2的濃度添加維生素B12或集中添加維生素B12獲得了類似的結(jié)果。所獲得的最高效價為114克/升。
例8為了提高由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇的產(chǎn)量而對大腸桿菌KLP23的磷酸丙糖異構(gòu)酶突變體進行的工程改造構(gòu)建用于置換大腸桿菌KLP23中磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的質(zhì)粒用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra系統(tǒng)，Minneapolis，MN)制備大腸桿菌KLP23基因組DNA。用引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO48通過PCR(Mullis和Faloona，酶學(xué)方法，155，335-350，1987)由KLP23基因組DNA擴增cdh和翻譯磷酸丙糖異構(gòu)酶(tpiA)基因的3’末端的1.0kb DNA片段。用引物SEQ ID NO49和SEQ ID NO50通過PCR由KLP23基因組DNA擴增含有tpiA、yiiQ的5’末端和tiiR基因的5’末端的1.0kb DNA片段。在引物SEQ ID NO49上整合一個Scal位點。引物SEQ ID NO49的5’末端是引物SEQ ID NO48的反向互補體，以便隨后能夠進行重疊延伸PCR。將通過重疊延伸技術(shù)進行的基因剪接(Horton等，生物技術(shù)，8，528-535，1990)用于通過PCR制備2.0kb的片段，使用上述兩種PCR片段作模板和引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO50。該片段代表具有768bp tpiA結(jié)構(gòu)基因缺失了73％?？傮w上講，該片段在Scal克隆位點(在部分tpiA內(nèi)部)兩側(cè)具有1.0kb的旁側(cè)區(qū)，以便能夠通過同源重組進行染色體基因置換。
用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(Invitrogen，San Diego，CA)將上述平端2.0kb的PCR片段克隆到pCR-Blunt載體上，得到含有卡那霉素和Zeocin抗性基因的5.5kb的質(zhì)粒pRN106-2。通過將其連接在Scal消化過的質(zhì)粒pRN106-2上，用來自pLoxCat1(結(jié)果未公開)的含有其旁側(cè)為噬菌體P11oxP位點(Snaith等，基因166，173-174，1995)的氯霉素抗性基因1.2kb HincII片段，破壞質(zhì)粒pRN106-2上的tpiA片段，得到6.8kb的質(zhì)粒pRN107-1。
通過線性DNA轉(zhuǎn)化對磷酸丙糖異構(gòu)酶突變體RJ8m進行工程改造使用pRN107-1作模板和引物SEQ ID NO47和SEQ ID NO50對含有tpiA旁側(cè)區(qū)和loxP-CmR-loxP框的3.2kb片段進行PCR擴增和凝膠提取。用至多1微克這種3.2kb的線性DNA片段對大腸桿菌KLP23進行電轉(zhuǎn)化，在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基上對氯霉素抗性(12.5微克/毫升)和卡那霉素敏感(30微克/毫升)的轉(zhuǎn)化體作進一步的篩選，篩選其在1mM葡萄糖上對葡萄糖的利用較茶，能正常利用1mM葡萄糖酸，以及確保宿主KLP23在1mM甘油上的甘油非利用表型。在通過Southern分析(Southern，分子生物學(xué)雜志98，503-517，1975)用完整的tpiA基因檢測源于上述突變體RJ8m的基因組DNA的EcoRI消化物時發(fā)現(xiàn)，它是雙交換復(fù)合體(tpiA基因置換)，因為觀察到了由于在氯霉素抗性基因上存在另一個EcoRI位點而出現(xiàn)的兩個預(yù)期的6.6kb和3.0kb的帶。正如所預(yù)料的，宿主KLP23和野生型FM5分別控制所產(chǎn)生的單一的8.9kb和9.4kb的帶。用引物SEQ ID NO51和SEQ ID NO52通過基因組PCR對tpiA突變體作進一步的分析，它能產(chǎn)生預(yù)期的4.6kbPCR片段，而對于相同的引物對來說，KLP23和野生型FM5菌株都產(chǎn)生預(yù)期的3.9kb PCR片段。在用甘油醛3-磷酸作底物檢測來自tpiA突變體RJ8m和所述KLP23的無細胞提取物的tpiA活性時，在RJ8m上沒有觀察到活性。用質(zhì)粒pH48對tpiA突變體RJ8m進行電轉(zhuǎn)化，以便由葡萄糖產(chǎn)生甘油，同樣用質(zhì)粒pAH48和PDT29或pKP32進行轉(zhuǎn)化，以便由葡萄糖產(chǎn)生1，3-丙二醇。消除RJ8m上的氯霉素抗性標(biāo)記以便得到RJ8。
例9用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/PDT29將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇以及利用RJ8/pAH48/PKP32的改進的方法預(yù)培養(yǎng)對RJ8/pAH48/PDT29和RJ8/pAH48/PKP32進行預(yù)培養(yǎng)，以便按例7所述接種發(fā)酵罐。RJ8/pAH48/PKP32與RJ8/pAH48/PDT29相同，是不同的是缺失了dhaT。
發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基如例7所述。
發(fā)酵生長發(fā)酵生長如例7所述，所不同的是設(shè)定空氣流速(將最低值設(shè)定為5-6標(biāo)準(zhǔn)升/分鐘)和攪拌速度(將最低值設(shè)定為300-690rpm)的初始值，以便當(dāng)OUR值達到60-100mM/升/小時時開始對溶解氧氣(DO)的控制。按下文所述添加維生素B12或輔酶B12。
用RJ8/pAH48/PDT29進行發(fā)酵用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述在表6中示出。分別在2、8和24小時集中添加2、16和18毫克維生素B12。所獲得的1，3-丙二醇的產(chǎn)量為35wt％(1，3-丙二醇克數(shù)/消耗的葡萄糖克數(shù))，效價為50.1克/升1，3-丙二醇。
表6用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述

用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/pKP32的改進發(fā)酵用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述在表7中示出。分別在大約26和44小時集中添加48和16毫克維生素B12。所獲得的1，3-丙二醇的產(chǎn)量為34wt％(1，3-丙二醇克數(shù)/消耗的葡萄糖克數(shù))，效價為129克/升1，3-丙二醇。
表7用大腸桿菌菌株RJ8/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的代表性發(fā)酵概述

例10在改進的1，3-丙二醇方法中鑒定大腸桿菌非專一性催化活性(yqhD)在具有改進了的催化劑的1，3-丙二醇生產(chǎn)發(fā)酵液中證實非專一性催化活性通過測定完整細胞的1，3-丙二醇脫氫酶活性證實在發(fā)酵條件下，在添加維生素B12并產(chǎn)生3-羥基丙醛之后，而不是之前在大腸桿菌中存在非專一性催化活性。基本上按例7所述在10升的發(fā)酵罐中生長分別含有甘油生產(chǎn)質(zhì)粒pAH48和1，3-丙二醇生產(chǎn)質(zhì)粒pKP32的重組大腸桿菌菌株。當(dāng)發(fā)酵容器中OD550達到大約100時添加維生素B12藥團(48毫克)。在添加維生素B12之前和2小時之后馬上從該容器中采集細胞樣品。通過離心回收細胞，并用含有150微克/毫升氯霉素的PBS緩沖液重新懸浮至其原有體積，以便抑制新的蛋白合成。將合適體積的用氯霉素處理過的細胞添加到含有一種反應(yīng)混合物(PBS緩沖液，含有10克/升葡萄糖，10克/升甘油，1毫克/升輔酶B12，和150微克/毫升氯霉素)的250毫升的隔板燒瓶中，使最終體積為50毫升，OD550大約為10。對所述燒瓶遮光，在35℃下以250rpm的速度搖動。隨時間對試樣進行HPLC分析。在含有從添加維生素B12之前或之后的發(fā)酵罐中回收的細胞的燒瓶中觀察到了3-HPA依賴于時間的產(chǎn)生。相反，僅在裝有從添加維生素B12之后的發(fā)酵罐中回收的細胞的燒瓶中觀察到了較高含量的1，3-丙二醇。
檢測無細胞提取物中的非專一性催化活性通過天然凝膠活性菌株測定證實無細胞提取物中非專一性催化活性。在添加維生素B12之前和之后從分別采用了含有甘油生產(chǎn)和1，3-丙二醇生產(chǎn)質(zhì)粒pAH48和pKP32的重組大腸桿菌菌株的相應(yīng)的10升發(fā)酵物中回收細胞。用弗氏破碎器破碎細胞，以便制備無細胞提取物。將所述無細胞提取物、純的肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脫氫酶(dhaT)的制劑、和分子量標(biāo)準(zhǔn)物加樣到天然梯度聚丙烯酰胺凝膠上并展開。然后讓所述凝膠接觸底物1，3-丙二醇和NAD+或乙醇或NAD+。正如所預(yù)料的，在所述凝膠上，當(dāng)用1，3-丙二醇作底物時，觀察到了dhaT的活性菌株，它在所述天然凝膠上的遷移位置大致為340千道爾頓。該活性僅在添加了純的肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脫氫酶的泳道上出現(xiàn)。相反，當(dāng)用1，3-丙二醇作底物并添加維生素B12之后的無細胞提取物時，非專一性催化活性出現(xiàn)在大約90千道爾頓處。當(dāng)用乙醇作底物時，觀察不到所述dhaT帶和非專一性催化活性帶，但在添加維生素B12之前和之后出現(xiàn)了一個大約為120千道爾頓的獨立的帶。這種新的帶極有可能造成對乙醇底物具有專一性的醇脫氫酶，它通常存在于所有生物中。
這種天然凝膠測定在酶促測定步驟之前通過分子量將蛋白分離，這樣提供了在用具有低活性的結(jié)構(gòu)還原1，3-丙二醇時的更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，并且該活性很有可能與對乙醇底物有專一性的醇脫氫酶不同，已經(jīng)對大腸桿菌的醇脫氫酶作過充分的鑒定，并發(fā)現(xiàn)它存在于所有生物中。醇脫氫酶測定的原理是，醇脫氫酶能催化電子1，3-丙二醇(或其他醇)向NAD+轉(zhuǎn)移。然后由PMS偶連NADH和溴化四唑染料之間的電子轉(zhuǎn)移，它在凝膠中形成一種沉淀物。在所述底物中浸泡1夜之后，洗滌所述凝膠，以便除去試劑和可溶性染料。在所述凝膠上有活性脫氫酶的帶上形成一種不溶性蘭色染料。該測定的各個方面業(yè)已由Johnson和Lin披露(細菌學(xué)雜志169，2050，1987)。
純化并鑒定大腸桿菌中的非專一性催化活性用來自典型的1，3-丙二醇生產(chǎn)產(chǎn)物中收獲的細胞進行非專一性催化活性的大規(guī)模部分純化，如例7中使用KLP23/pAH48/pKP32的改進方法中所述。洗滌細胞沉淀(16克)并重新懸浮在20毫升50mM HEPES緩沖液，pH7.5，共進行3次。通過超聲波裂解懸浮液中的細胞。通過離心獲得無細胞提取物(10分鐘，20000xg，10℃)，并通過添加200毫克硫酸魚精蛋白同時在冰上攪拌將上清液進一步澄清。通過離心(20分鐘，20000xg，10℃)獲得上清液，并通過用HEPES緩沖液平衡的Superdex200制備級柱(6X60厘米)進行分離。收集分別為10毫升的級份，用10000MW截斷Centricon膜將每一份樣品濃縮25倍，然后將天然凝膠活性菌株進行測定。在107-112號級份中鑒定到了所述非專一性催化活性，高峰活性出現(xiàn)在108-109號級份中，將108和109號級份的較大的試劑樣(各7毫升)濃縮50倍，并加樣到有12個泳道的天然凝膠的所有泳道中。將所述凝膠一分為二，將一半用于對脫氫酶活性進行染色，其中，所出現(xiàn)的深蘭色帶表現(xiàn)非專一性催化活性。將未染色的凝膠與染過色的凝膠從頂部對齊，并切除未染色凝膠上相應(yīng)于非專一性催化活性的帶。將所述凝膠條粉碎，并提取可溶性蛋白將粉碎的顆粒浸泡在0.5毫升2D-加樣緩沖液中，加熱到95℃5分鐘，并離心以便除去凝膠顆粒。將上清液加樣到等電點聚焦(IEF)帶上，進行二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)，使用在Swiss2D數(shù)據(jù)庫(http:///www.expasy.ch/ch2d/；Tonella等，電泳191960-1971，1998)中所披露的用于大腸桿菌提取物的2D-PAGE的條件。通過電吸印將所述凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用膠體蘭色凝膠染料對所述膜上的蛋白進行染色。在圖6中示出了用于獲得非專一性催化活性性質(zhì)的染色的印跡。用氨基末端肽測序的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定斑點。只有一個斑點(斑點A)編碼氧化還原酶活性。通過用yqhD的氨基末端進行FASTA檢索，19輪斑點A(圖6)得到了百分之百的相同性，所述yqhD是具有推測的氧化還原酶活性的大腸桿菌開放讀框。在SEQ ID NO57中示出了由yqhD所編碼的蛋白的完整氨基酸序列；相應(yīng)的氨基酸序列在SEQ IDNO58中示出。YqhD基因與梭菌屬中的基因adhB具有40％的相同性，后者可能是NADH依賴型丁醇脫氫酶2。
破壞大腸桿菌KLP23中的yqhD基因生物化學(xué)測定和氨基末端氨基酸測序表明，所述非專一性催化活性可能是由大腸桿菌yqhD基因編碼的。這種具有未知功能的基因編碼一種假設(shè)的氧化還原酶，并含有兩種醇脫氫酶標(biāo)記，這種標(biāo)記還存在于由dhaT基因所編碼的弗氏檸檬酸桿菌和肺炎克雷伯氏菌1，3-丙二醇脫氫酶中。
為了破壞該基因，用Taq聚合酶和以下引物通過PCR由大腸桿菌KLP23(例4)基因組DNA擴增yqhD和830bp的5’旁側(cè)DNA序列和906bp的3’旁側(cè)DNA序列。
(SEQ ID NO59)5’-GCGGTACCGTTGCTCGACGCTCAGGTTTTCGG-3’(SEQ ID NO60)5’-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3’該反應(yīng)在94℃下進行1分鐘，50℃下1分鐘，72℃下3分鐘共35輪，然后在72℃下進行最終的延伸5分鐘。純化所得到的3.7kb的DNA片段，用SacL和Kpnl消化，并在16℃下用16小時將其連接到進行過相似消化的pBluescripII KS(+)(Strategene)上。將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Gibco/BRL)，并從在含有X-gal(40微克/毫升)和氨芐青霉素(100微克/毫升)的LB瓊脂(Difco)上出現(xiàn)白色菌落的轉(zhuǎn)化體中分離需要的質(zhì)粒pJSP29。用Af1II和NdeI消化質(zhì)粒pJSP29，以便釋放出包括363bp yqhD基因和46bp3’旁側(cè)DNA序列的409bp的DNA片段。純化其余的5350bp DNA片段，并連接到含有卡那霉素抗性基因的來自pLoxKan2(Genencor國際，PaloAlto，CA)的1374bp Af1II/NdeI DNA片段上，在16℃下反應(yīng)16小時。用連接的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并從含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選的轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒pJSP32-Blue。用KpnI和Sacl消化質(zhì)粒pJSP32-Blue，并純化3865bp的yqhD破壞框，并連接到作過類似消化的pGP704(Miller和Mekalanos，細菌學(xué)雜志1702575-2583，1988)上，在16℃下反應(yīng)16小時。將連接的DNA用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌SY327(Miller和Mekalanos，細菌學(xué)雜志1702575-2583，1988)，并從含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選的轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒pJSP32。將質(zhì)粒pJSP32轉(zhuǎn)入大腸桿菌KLP23，并在含有卡那霉素(50微克/毫升)的LB瓊脂上篩選轉(zhuǎn)化體。在篩選的200個卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體中，有2個表現(xiàn)出氨芐青霉素敏感表型，這是雙交換重組事件的預(yù)期現(xiàn)象，這會導(dǎo)致由yqhD破壞框取代yqhD基因。
用從以上兩種轉(zhuǎn)化體中分離的基因組DNA作模板和下列類型的引物對通過PCR證實yqhD基因的破壞Set#1(SEQ ID NO61)5′-GCGAGCTCGACGCTTGCCCTGATCGAGTTTTGC-3′(SEQ ID NO62)5′-CAGCTGGCAATTCCGGTTCG-3′Set#2(SEQ ID NO63)5′-CCCAGCTGGCAATTCCGGTTCGCTTGCTGT-3′(SEQ ID NO64)5′-GGCGACCCGACGCTCCAGACGGAAGCTGGT-3′Set#3(SEQ ID NO65)5′-CCGCAAGATTCACGGATGCATCGTGAAGGG-3′(SEQ ID NO66)5′-CGCCTTCTTGACGAGTTCTGAGCGGGA-3′Set#4(SEQ ID NO67)5′-GGAATTCATGAACAACTTTAATCTGCACAC-3′(SEQ ID NO68)5′-GTTTGAGGCGTAAAAAGCTTAGCGGGCGGC-3′所述反應(yīng)是用擴增高寶真聚合酶(Boehringer Manheim)或含有Taq聚合酶的Platinum PCR Supermix(Gibco/BRL)進行的，94℃1分鐘，50℃1分鐘，和72℃2分鐘，進行35輪，然后在72℃下進行最后的延伸5分鐘。通過1.0％(w/v)瓊脂糖上進行凝膠電泳，分析所得到的PCR產(chǎn)物。在表8中歸納的結(jié)果證實了在這兩種轉(zhuǎn)化體中yqhD基因的破壞。
表8

所述yqhD破壞缺失了yqhD的3’末端，包括46bp的3’旁側(cè)基因間DNA序列。該缺失去掉了相當(dāng)于121個氨基酸的363bp的3’yqhD編碼序列。在卡那霉素抗性框內(nèi)的殘余的yqhD編碼序列下游15bp處存在一個終止密碼子。
將pAH48和pKP32同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌KLP23(yqhD-)，并在含有氨芐青霉素(100微克/毫升)和壯觀霉素(50微克/毫升)的LB瓊脂上篩選含有這兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。測定代表性的轉(zhuǎn)化體在有或沒有維生素B12的情況下在10升發(fā)酵液中將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇的能力。
證實yqhD是在大腸桿菌KLP23/pAH48/pKP32中大量產(chǎn)生1，3-丙二醇所需要的大體上按例7所述進行生產(chǎn)1，3-丙二醇的發(fā)酵，使用大腸桿菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32，以便檢驗yqhDPY對1，3-丙二醇生產(chǎn)的影響。
在表9中示出了使用非專一性催化活性剔除的大腸桿菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32進行的代表性10升的發(fā)酵。所述生物穩(wěn)定地積累細胞物質(zhì)和甘油，直到添加維生素B12時OD550超過30A為止(10.4h)。在10.4小時時，以8毫克的藥團形式添加維生素B12，然后以1.32毫克/小時的速度連續(xù)添加。在添加B12之后的4小時內(nèi)，葡萄糖的消耗放緩，氧氣的利用速度下降，并且光學(xué)密度不再進一步提高。葡萄糖的發(fā)酵停止，而發(fā)酵罐中葡萄糖的濃度積累。所獲得的1，3-丙二醇的最高效價為0.41克/升。通過將所述細胞的稀釋系列鋪平板在含有氨芐青霉素和壯觀霉素的瓊脂平板上檢測其生活力。在30℃下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所述平板24小時。在來自大腸桿菌KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32的發(fā)酵液的平板上沒有有活力的菌落，表11。相反，來自沒有添加維生素B12的對照發(fā)酵罐的細胞懸浮液繼續(xù)增加細胞物質(zhì)和甘油，直到由于完全添加葡萄糖飼養(yǎng)液而使得10升的發(fā)酵罐變滿(表10)。在該發(fā)酵結(jié)束時通過細胞懸浮液的稀釋系列測定的瓊脂糖平板生活力表現(xiàn)出的有活力的細胞數(shù)與通過光學(xué)密度值估算的總細胞數(shù)吻合(表11)。
表9使用大腸桿菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32不能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇(1，3-PD)的代表性發(fā)酵概述

表10使用大腸桿菌菌株KLP2 3(yqhD-)/pAH48/pKP32將葡萄糖轉(zhuǎn)化成甘油的代表性發(fā)酵概述

表11在沒有和有維生素B12的條件下用大腸桿菌菌株KLP23(yqhD-)/pAH48/pKP32對葡萄糖進行發(fā)酵結(jié)束時有生活力的平板記數(shù)的代表性概述

序列表<110>納幕爾杜邦公司(E.I.du Pont de Nemours and Company)<120>用于生產(chǎn)高效價1，3-丙二醇的生物學(xué)方法<130>BC1020 PCT<140>
<141>
<150>60/149,534<151>1999-08-08<160>68<170>Microsoft Office 97<210>1<211>12145<212>DNA<213>肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)<400>1gtcgaccacc acggtggtga ctttaatgcc gctctcatgc agcagctcgg tggcggtctc 60aaaattcagg atgtcgccgg tatagttttt gataatcagc aagacgcctt cgccgccgtc 120aatttgcatc gcgcattcaa acattttgtc cggcgtcggc gaggtgaata tttcccccgg 180acaggcgccg gagagcatgc cctggccgat atagccgcag tgcatcggtt catgtccgct 240gccgccgccg gagagcaggg ccaccttgcc agccaccggc gcgtcggtgc gggtcacata 300cagcgggtcc tgatgcaggg tcagctgcgg atgggcttta gccagcccct gtaattgttc 360attcagtaca tcttcaacac ggttaatcag ctttttcatt attcagtgct ccgttggaga 420aggttcgatg ccgcctctct gctggcggag gcggtcatcg cgtaggggta tcgtctgacg 480gtggagcgtg cctggcgata tgatgattct ggctgagcgg acgaaaaaaa gaatgccccg 540acgatcgggt ttcattacga aacattgctt cctgattttg tttctttatg gaacgttttt 600gctgaggata tggtgaaaat gcgagctggc gcgctttttt tcttctgcca taagcggcgg 660tcaggatagc cggcgaagcg ggtgggaaaa aattttttgc tgattttctg ccgactgcgg 720gagaaaaggc ggtcaaacac ggaggattgt aagggcatta tgcggcaaag gagcggatcg 780ggatcgcaat cctgacagag actagggttt tttgttccaa tatggaacgt aaaaaattaa 840cctgtgtttc atatcagaac aaaaaggcga aagatttttt tgttccctgc cggccctaca 900gtgatcgcac tgctccggta cgctccgttc aggccgcgct tcactggccg gcgcggataa 960cgccagggct catcatgtct acatgcgcac ttatttgagg gtgaaaggaa tgctaaaagt 1020tattcaatct ccagccaaat atcttcaggg tcctgatgct gctgttctgt tcggtcaata 1080tgccaaaaac ctggcggaga gcttcttcgt catcgctgac gatttcgtaa tgaagctggc 1140gggagagaaa gtggtgaatg gcctgcagag ccacgatatt cgctgccatg cggaacggtt 1200taacggcgaa tgcagccatg cggaaatcaa ccgtctgatg gcgattttgc aaaaacaggg 1260ctgccgcggc gtggtcggga tcggcggtgg taaaaccctc gataccgcga aggcgatcgg 1320ttactaccag aagctgccgg tggtggtgat cccgaccatc gcctcgaccg atgcgccaac 1380cagcgcgctg tcggtgatct acaccgaagc gggcgagttt gaagagtatc tgatctatcc1440
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<223>引物<400>20cacgcatgca gttcaacctg ttgatagtac30<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>21gcgtctagat ccttttaaat taaaaatg 28<210>22<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>22gcgcggatcc aggagtctag aattatggga ttgactacta aacctctatc t51<210>23<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>23gatacgcccg ggttaccatt tcaacagatc gtcctt 36<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>24ttgataatat aaccatggct gctgctgctg atag 34<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>25gtatgatatg ttatcttgga tccaataaat ctaatcttc39<210>26<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>26
catgactagt aaggaggaca attc24<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>27catggaattg tcctccttac tagt24<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>28ctagtaagga ggacaattc 19<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>29catggaattg tcctcctta 19<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>30gatccaggaa acaga 15<210>31<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>31ctagtctgtt tcctg 15<210>32<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明終止序列<220>
<223>終止序列<400>32agcttaggag tctagaatat tgagctcgaa ttcccgggca tgcggtaccg gatccagaaa 60aaagcccgca cctgacagtg cgggcttttt tttt 94<210>33<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>33ggaattcaga tctcagcaat gagcgagaaa accatgc37<210>34<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>34gctctagatt agcttccttt acgcagc 27<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>35ggccaagctt aaggaggtta attaaatgaa aag33<210>36<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>36gctctagatt attcaatggt gtcggg26<210>37
<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>37gcgccgtcta gaattatgag ctatcgtatg tttgattatc tg 42<210>38<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>38tctgatacgg gatcctcaga atgcctggcg gaaaat36<210>39<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明 接頭<220>
<223>接頭<400>39tcgacgaat tcaggagga18<210>40<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明接頭
<220>
<223>接頭<400>40ctagtcctcc tgaattcg 18<210>41<211>4549<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明pCL1920<220>
<223>質(zhì)粒<400>41agctcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag60attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa120taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg180cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt240tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgag300ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg cgtaatcatg360gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc420cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc480gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat540cggccaacgc gaattcccga cagtaagacg ggtaagcctg ttgatgatac cgctgcctta600ctgggtgcat tagccagtct gaatgacctg tcacgggata atccgaagtg gtcagactgg660aaaatcagag ggcaggaact gctgaacagc aaaaagtcag atagcaccac atagcagacc720cgccataaaa cgccctgaga agcccgtgac gggcttttct tgtattatgg gtagtttcct780tgcatgaatc cataaaaggc gcctgtagtg ccatttaccc ccattcactg ccagagccgt840gagcgcagcg aactgaatgt cacgaaaaag acagcgactc aggtgcctga tggtcggaga900caaaaggaat attcagcgat ttgcccgagc ttgcgagggt gctacttaag cctttagggt960tttaaggtct gttttgtaga ggagcaaaca gcgtttgcga catccttttg taatactgcg1020gaactgacta aagtagtgag ttatacacag ggctgggatc tattcttttt atcttttttt1080attctttctt tattctataa attataacca cttgaatata aacaaaaaaa acacacaaag1140gtctagcgga atttacagag ggtctagcag aatttacaag ttttccagca aaggtctagc1200agaatttaca gatacccaca actcaaagga aaaggactag taattatcat tgactagccc1260atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt gagatgtatg tctgaattag1320ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga cttaacggag catgaaacca1380agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat tgaaaaccct acaaggaaag1440aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat gatgaacatc agtagggaaa1500atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat gacgagaact gtggaaatca1560ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac aaactatgcc aagttctcaa1620gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc ttatcttttc cagttaaaaa1680aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga aaacaaatac tctatgagga1740
tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac tcacaaggca aatatagaga1800ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa taactaccat gagtttaaaa1860ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt aaacacttac agcaatatga1920aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt gattttccaa gttgaactag1980atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca gataaaaatg aatggtgaca2040aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa cggactaaga aaaacactac2100acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga ggcaaaattt ttgagtgaca2160tgcaaagtaa gtatgatctc aatggttcgt tctcatggct cacgcaaaaa caacgaacca2220cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg ttcttatggc tcttgtatct2280atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa ctgttcaccg ttacatatca2340aagggaaaac tgtccatatg cacagatgaa aacggtgtaa aaaagataga tacatcagag2400cttttacgag tttttggtgc attcaaagct gttcaccatg aacagatcga caatgtaaca2460gatgaacagc atgtaacacc taatagaaca ggtgaaacca gtaaaacaaa gcaactagaa2520catgaaattg aacacctgag acaacttgtt acagctcaac agtcacacat agacagcctg2580aaacaggcga tgctgcttat cgaatcaaag ctgccgacaa cacgggagcc agtgacgcct2640cccgtgggga aaaaatcatg gcaattctgg aagaaatagc gctttcagcc ggcaaaccgg2700ctgaagccgg atctgcgatt ctgataacaa actagcaaca ccagaacagc ccgtttgcgg2760gcagcaaaac ccgtgggaat taattcccct gctcgcgcag gctgggtgcc aagctctcgg2820gtaacatcaa ggcccgatcc ttggagccct tgccctcccg cacgatgatc gtgccgtgat2880cgaaatccag atccttgacc cgcagttgca aaccctcact gatccgcatg cccgttccat2940acagaagctg ggcgaacaaa cgatgctcgc cttccagaaa accgaggatg cgaaccactt3000catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc gcgacggccg aggtcttccg atctcctgaa3060gccagggcag atccgtgcac agcaccttgc cgtagaagaa cagcaaggcc gccaatgcct3120gacgatgcgt ggagaccgaa accttgcgct cgttcgccag ccaggacaga aatgcctcga3180cttcgctgct gcccaaggtt gccgggtgac gcacaccgtg gaaacggatg aaggcacgaa3240cccagtggac ataagcctgt tcggttcgta agctgtaatg caagtagcgt atgcgctcac3300gcaactggtc cagaaccttg accgaacgca gcggtggtaa cggcgcagtg gcggttttca3360tggcttgtta tgactgtttt tttggggtac agtctatgcc tcgggcatcc aagcagcaag3420cgcgttacgc cgtgggtcga tgtttgatgt tatggagcag caacgatgtt acgcagcagg3480gcagtcgccc taaaacaaag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga3540ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg3600tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc3660tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt3720tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg3780ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag3840aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc3900tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg3960aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa4020cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt4080cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact4140gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct agacaggctt4200atcttggaca agaagaagat cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgtcc4260actacgtgaa aggcgagatc accaaggtag tcggcaaata atgtctaaca attcgttcaa4320gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag atgcactaag cacataattg4380ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt tttaagcgtg cataataagc4440cctacacaaa ttgggagata tatcatgaaa ggctggcttt ttcttgttat cgcaatagtt4500ggcgaagtaa tcgcaacatc cgcattaaaa tctagcgagg gctttacta4549
<210>42<211>199<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明葡萄糖異構(gòu)酶啟動子<220>
<223>啟動子<400>42gaattcacta gtcgatctgt gctgtttgcc acggtatgca gcaccagcgc gagattatgg60gctcgcacgc tcgactgtcg gacgggggca ctggaacgag aagtcaggcg agccgtcacg120cccttgacaa tgccacatcc tgagcaaata attcaaccac taaacaaatc aaccgcgttt180cccggaggta accaagctt 199<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>43gacgcaacag tattccgtcg c 21<210>44<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>44atgagctatc gtatgttccg ccaggcattc tgagtgttaa cg 42<210>45<211>33<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>45gcctggcgga acatacgata gctcataata tac33<210>46<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>46cggggcgctg ggccagtact g 21<210>47<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<220>
<223>引物<400>47tcaaacccgg tggtttctcg cgaccggg 28<210>48<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>48ctcagccgga tatcgacggc gcgctggt28<210>49<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>49accagcgcgc cgtcgatatc cggctgagta ctcaacacct gccagctctt tacgcaggtt 60<210>50<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>50cagcatgcct gcgaaccaca ggcctatc28<210>51<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>51
atgaacaagt ggggcgtagg gttaacat 28<210>52<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<220>
<223>引物<400>52ttaattactt gatttattgt cggcttta 28<210>53<211>1380<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>53ctttaatttt cttttatctt actctcctac ataagacatc aagaaacaat tgtatattgt60acaccccccc cctccacaaa cacaaatatt gataatataa agatgtctgc tgctgctgat120agattaaact taacttccgg ccacttgaat gctggtagaa agagaagttc ctcttctgtt180tctttgaagg ctgccgaaaa gcctttcaag gttactgtga ttggatctgg taactggggt240actactattg ccaaggtggt tgccgaaaat tgtaagggat acccagaagt tttcgctcca300atagtacaaa tgtgggtgtt cgaagaagag atcaatggtg aaaaattgac tgaaatcata360aatactagac atcaaaacgt gaaatacttg cctggcatca ctctacccga caatttggtt420gctaatccag acttgattga ttcagtcaag gatgtcgaca tcatcgtttt caacattcca480catcaatttt tgccccgtat ctgtagccaa ttgaaaggtc atgttgattc acacgtcaga540gctatctcct gtctaaaggg ttttgaagtt ggtgctaaag gtgtccaatt gctatcctct600tacatcactg aggaactagg tattcaatgt ggtgctctat ctggtgctaa cattgccacc660gaagtcgctc aagaacactg gtctgaaaca acagttgctt accacattcc aaaggatttc720agaggcgagg gcaaggacgt cgaccataag gttctaaagg ccttgttcca cagaccttac780ttccacgtta gtgtcatcga agatgttgct ggtatctcca tctgtggtgc tttgaagaac840gttgttgcct taggttgtgg tttcgtcgaa ggtctaggct ggggtaacaa cgcttctgct900gccatccaaa gagtcggttt gggtgagatc atcagattcg gtcaaatgtt tttcccagaa960tctagagaag aaacatacta ccaagagtct gctggtgttg ctgatttgat caccacctgc1020gctggtggta gaaacgtcaa ggttgctagg ctaatggcta cttctggtaa ggacgcctgg1080gaatgtgaaa aggagttgtt gaatggccaa tccgctcaag gtttaattac ctgcaaagaa1140gttcacgaat ggttggaaac atgtggctct gtcgaagact tcccattatt tgaagccgta1200taccaaatcg tttacaacaa ctacccaatg aagaacctgc cggacatgat tgaagaatta1260gatctacatg aagattagat ttattggaga aagataacat atcatacttc ccccactttt1320ttcgaggctc ttctatatca tattcataaa ttagcattat gtcatttctc ataactactt1380<210>54<211>391
<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>54Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn1 5 10 15Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu20 25 30Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr35 40 45Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe50 55 60Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu65 70 75 80Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu85 90 95Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile100 105 110Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln115 120 125Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gin Leu Lys Gly His Val Asp Ser His130 135 140Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly145 150 155 160Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr lle Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys165 170 175Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His180 185 190Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly195 200 205Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg210 215 220Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile225 230 235 240
Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu245 250 255Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly260 265 270Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg275 280 285Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr290 295 300Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr305 310 315 320Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln325 330 335Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu340 345 350Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln355 360 365Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu370 375 380Glu Leu Asp Leu His Glu Asp385 390<210>55<211>753<212>DNA<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>55atgggattga ctactaaacc tctatctttg aaagttaacg ccgctttgtt cgacgtcgac60ggtaccatta tcatctctca accagccatt gctgcattct ggagggattt cggtaaggac120aaaccttatt tcgatgctga acacgttatc caagtctcgc atggttggag aacgtttgat180gccattgcta agttcgctcc agactttgcc aatgaagagt atgttaacaa attagaagct240gaaattccgg tcaagtacgg tgaaaaatcc attgaagtcc caggtgcagt taagctgtgc300aacgctttga acgctctacc aaaagagaaa tgggctgtgg caacttccgg tacccgtgat360atggcacaaa aatggttcga gcatctggga atcaggagac caaagtactt cattaccgct420aatgatgtca aacagggtaa gcctcatcca gaaccatatc tgaagggcag gaatggctta480ggatatccga tcaatgagca agacccttcc aaatctaagg tagtagtatt tgaagacgct540ccagcaggta ttgccgccgg aaaagccgcc ggttgtaaga tcattggtat tgccactact600ttcgacttgg acttcctaaa ggaaaaaggc tgtgacatca ttgtcaaaaa ccacgaatcc660
atcagagttg gcggctacaa tgccgaaaca gacgaagttg aattcatttt tgacgactac720ttatatgcta aggacgatct gttgaaatgg taa 753<210>56<211>250<212>PRT<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<400>56Met Gly Leu Thr Thr Lys Pro Leu Ser Leu Lys Val Asn Ala Ala Leu1 5 10 15Phe Asp Val Asp Gly Thr Ile Ile Ile Ser Gln Pro Ala Ile Ala Ala20 25 30Phe Trp Arg Asp Phe Gly Lys Asp Lys Pro Tyr Phe Asp Ala Glu His35 40 45Val Ile Gln Val Ser His Gly Trp Arg Thr Phe Asp Ala Ile Ala Lys50 55 60Phe Ala Pro Asp Phe Ala Asn Glu Glu Tyr Val Asn Lys Leu Glu Ala65 70 75 80Glu Ile Pro Val Lys Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Glu Val Pro Gly Ala85 90 95Val Lys Leu Cys Asn Ala Leu Asn Ala Leu Pro Lys Glu Lys Trp Ala100 105 110Val Ala Thr Ser Gly Thr Arg Asp Met Ala Gln Lys Trp Phe Glu His115 120 125Leu Gly Ile Arg Arg Pro Lys Tyr Phe Ile Thr Ala Asn Asp Val Lys130 135 140Gln Gly Lys Pro His Pro Glu Pro Tyr Leu Lys Gly Arg Asn Gly Leu145 150 155 160Gly Tyr Pro Ile Asn Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Lys Val Val Val165 170 175Phe Glu Asp Ala Pro Ala Gly Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Gly Cys180 185 190Lys Ile Ile Gly Ile Ala Thr Thr Phe Asp Leu Asp Phe Leu Lys Glu195 200 205
Lys Gly Cys Asp Ile Ile Val Lys Asn His Glu Ser Ile Arg Val Gly210 215 220Gly Tyr Asn Ala Glu Thr Asp Glu Val Glu Phe Ile Phe Asp Asp Tyr225 230 235 240Leu Tyr Ala Lys Asp Asp Leu Leu Lys Trp245 250<210>57<211>387<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>57Met Asn Asn Phe Asn Leu His Thr Pro Thr Arg Ile Leu Phe Gly Lys1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Gly Leu Arg Glu Gln Ile Pro His Asp Ala Arg Val20 25 30Leu Ile Thr Tyr Gly Gly Gly Ser Val Lys Lys Thr Gly Val Leu Asp35 40 45Gln Val Leu Asp Ala Leu Lys Gly Met Asp Val Leu Glu Phe Gly Gly50 55 60Ile Glu Pro Asn Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Met Asn Ala Val Lys Leu65 70 75 80Val Arg Glu Gln Lys Val Thr Phe Leu Leu Ala Val Gly Gly Gly Ser85 90 95Val Leu Asp Gly Thr Lys Phe Ile Ala Ala Ala Ala Asn Tyr Pro Glu100 105 110Asn Ile Asp Pro Trp His Ile Leu Gln Thr Gly Gly Lys Glu Ile Lys115 120 125Ser Ala Ile Pro Met Gly Cys Val Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gly Ser130 135 140Glu Ser Asn Ala Gly Ala Val Ile Ser Arg Lys Thr Thr Gly Asp Lys145 150 155 160Gln Ala Phe His Ser Ala His Val Gln Pro Val Phe Ala Val Leu Asp165 170 175
Pro Val Tyr Thr Tyr Thr Leu Pro Pro Arg Gln Val Ala Asn Gly Val180 185 190Val Asp Ala Phe Val His Thr Val Glu Gln Tyr Val Thr Lys Pro Val195 200 205Asp Ala Lys Ile Gln Asp Arg Phe Ala Glu Gly Ile Leu Leu Thr Leu210 215 220Ile Glu Asp Gly Pro Lys Ala Leu Lys Glu Pro Glu Asn Tyr Asp Val225 230 235 240Arg Ala Ash Val Met Trp Ala Ala Thr Gln Ala Leu Asn Gly Leu Ile245 250 255Gly Ala Gly Val Pro Gln Asp Trp Ala Thr His Met Leu Gly His Glu260 265 270Leu Thr Ala Met His Gly Leu Asp His Ala Gln Thr Leu Ala Ile Val275 280 285Leu Pro Ala Leu Trp Ash Glu Lys Arg Asp Thr Lys Arg Ala Lys Leu290 295 300Leu Gln Tyr Ala Glu Arg Val Trp Asn Ile Thr Glu Gly Ser Asp Asp305 310 315 320Glu Arg Ille Asp Ala Ala Ile Ala Ala Thr Arg Asn Phe Phe Glu Gln325 330 335Leu Gly Val Pro Thr His Leu Ser Asp Tyr Gly Leu Asp Gly Ser Ser340 345 350Ile Pro Ala Leu Leu Lys Lys Leu Glu Glu His Gly Met Thr Gln Leu355 360 365Gly Glu Asn His Asp Ile Thr Leu Asp Val Ser Arg Arg Ile Tyr Glu370 375 380Ala Ala Arg385<210>58<211>1164<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)
<400>58atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct60ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc120gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg180gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg240gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc300accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg360caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca420gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag480caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc540tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg600gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt660ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg720cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta780ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat840cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag900cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat960gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg1020acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg1080gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc1140cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164<210>59<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>59gcggtaccgt tgctcgacgc tcaggttttc gg 32<210>60<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>60gcgagctcga cgcttgccct gatcgagttt tgc 33<210>61
<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>61gcgagctcga cgcttgccct gatcgagttt tgc 33<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列說明引物<400>68gtttgaggcg taaaaagctt agcgggcggc30
權(quán)利要求
1.載體pDT29，包括如SEQ ID NO1所示的一組基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ。
2.一種重組大腸桿菌菌株RJ8，包括(a)三個一組的內(nèi)源基因，每一個基因具有一個使該基因失活的突變，該基因組包括(i)編碼一種具有甘油激酶活性的多肽的基因；(ii)編碼一種具有甘油脫氫酶活性的多肽的基因；和(iii)編碼一種具有磷酸丙糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用單一微生物由可發(fā)酵的碳源生物學(xué)生產(chǎn)1，3－丙二醇的改進方法。在本發(fā)明的一個方面，一種用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化成1，3－丙二醇的改進方法是通過使用由肺炎克雷伯氏菌dha調(diào)節(jié)子基因dhaR、orfY、dhaT、orfX、orfW、dhaB1、dhaB2、dhaB3和orfZ轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌而實現(xiàn)的，以上所有基因的排列方式與野生型肺炎克雷伯氏菌中的遺傳組構(gòu)相同。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種與使用含有編碼G3PDH，G3P磷酸酶、脫水酶、脫水酶再活化因子和1，3－丙二醇氧化還原酶(dhaT)的重組大腸桿菌的相同的方法相比用于通過含有編碼G3PDH，G3P磷酸酶、脫水酶和脫水酶再活化因子基因的重組大腸桿菌由葡萄糖生產(chǎn)1，3－丙二醇的改進方法。明顯改善的方法取決于編碼一種非專一性催化活性的基因在大腸桿菌中的存在，該活性足于將3－羥基丙二醇轉(zhuǎn)化成1，3－丙二醇。
文檔編號C12N15/52GK101024843SQ200610168840
公開日2007年8月29日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月18日
發(fā)明者M·埃姆普塔格, S·海尼, L·拉芬德, J·普茨, G·懷特 申請人:納幕爾杜邦公司, 詹倫卡國際有限公司