專(zhuān)利名稱(chēng)：一種改進(jìn)的叢枝菌根孢子密度快速測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌根真菌學(xué)中孢子密度測(cè)定方法，具體涉及一種叢枝菌根真菌孢子密度快速測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
叢枝菌根真菌是自然界中普遍存在的一種土壤微生物(簡(jiǎn)稱(chēng)AM)。陸地90％以上的有花植物都能夠與它形成菌根共生體，菌根對(duì)煤礦區(qū)生態(tài)修復(fù)具有明顯的生態(tài)效應(yīng)。叢枝菌根真菌由菌根孢子(果)、叢枝體、泡囊、菌絲組成，都可以作為繁殖體。孢子不僅是作為叢枝菌根真菌營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存的器官，也是一種穩(wěn)定的繁殖體，它的形態(tài)特征目前仍是叢枝菌根真菌分類(lèi)學(xué)的重要依據(jù)。選用叢枝菌根真菌孢子作為接種源，不僅可以得到單一的菌根，而且也可以通過(guò)菌根真菌孢子的萌發(fā)來(lái)了解菌根真菌對(duì)外界條件的適應(yīng)程度。因此，適生的菌根真菌孢子的篩選和分離對(duì)于研究菌根真菌孢子在土壤中的分布、存在數(shù)量和種類(lèi)以及研究菌根在煤礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)的適應(yīng)性具有重要的意義。目前孢子收集的方法主要有濕篩傾析法、柱析法、漂浮法和離心法，但是常用的方法仍是濕篩傾析法和離心法。這些方法的共同點(diǎn)都是能夠?qū)⒕咦訌纳L(zhǎng)基質(zhì)中富積起來(lái)，但是孢子與基質(zhì)的小顆粒特別是沙粒顏色相近，不易于辨別。因此，菌根在礦區(qū)生態(tài)重建、土壤修復(fù)以及農(nóng)業(yè)生物肥力等方面越來(lái)越廣的應(yīng)用情況下，很難達(dá)到大批量樣品的菌根孢子密度快速測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明將提供一種能快速測(cè)定大批量樣品菌根孢子密度的方法，即對(duì)孢子密度常規(guī)測(cè)定方法濕篩傾析法作了改進(jìn)，本技術(shù)為快速測(cè)定大批量樣品孢子密度提供科學(xué)方法。
完成上述發(fā)明任務(wù)的方案是一種改進(jìn)的叢枝菌根孢子密度快速測(cè)定方法，包括以下步驟(1)稱(chēng)取一定重量的土壤標(biāo)本，放在容器內(nèi)用水浸泡20-30分鐘，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常規(guī)的土壤分散劑；(2)選用一套潔凈的、具有孔徑為0.5-0.034微米的土壤篩，按孔徑由大至小的順序從上到下依次疊放，最底層用一固體物墊著，使篩面稍微傾斜；(3)用玻璃棒攪動(dòng)浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物沉淀下去，然后將懸浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一層的土壤篩上，傾倒時(shí)，集中倒在篩面的一個(gè)點(diǎn)上，避免整個(gè)篩面都沾有土壤溶液；(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，以免在上層粗篩面的剩留物中殘留有叢枝菌根真菌孢子，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)清潔的培養(yǎng)皿里面；
(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)干凈的試管內(nèi)，滴加曲利本藍(lán)染色劑，放在90℃水浴鍋或烘箱中加熱半小時(shí)，進(jìn)行染色；(6)將染色后的濾液通過(guò)細(xì)篩，并沖洗篩上的濾物，洗去染色劑，將篩出物放在干凈的培養(yǎng)皿里，在沖洗下來(lái)的篩出物中，除許多細(xì)的沙礫和雜質(zhì)外，其余為不同直徑的叢枝菌根真菌的孢子；(7)將篩出物放在雙目實(shí)體解剖顯微鏡下觀察，可觀測(cè)到紫色孢子。
本發(fā)明充分挖掘了菌根真菌中繁殖體孢子(果)、菌絲用曲利本藍(lán)染色能夠染成紫色的特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)染色后的菌絲、菌根孢子的形態(tài)特性與篩出物的色彩差異明顯，在顯微鏡觀測(cè)下易于識(shí)別和辨認(rèn)，可以顯著地提高孢子密度測(cè)定的精度和速度。
常規(guī)的濕篩傾析法，在雙目實(shí)體解剖顯微鏡下觀察到菌根孢子和菌絲色澤與周?chē)纳沉；|(zhì)相近，為棕黃色，不易于辨別和測(cè)定，而利用染色法觀察到的孢子和菌絲呈紫色，與周?chē)沉Ｉ珴煞床钶^大，孢子從形態(tài)特性上觀測(cè)更加明顯，對(duì)叢枝菌根孢子的識(shí)別則是一目了然，染色法較常規(guī)的濕篩傾析法更易于識(shí)別和辨認(rèn)菌根孢子。以傳統(tǒng)的濕篩傾析法來(lái)統(tǒng)計(jì)待測(cè)樣品的孢子密度，10克沙土樣品孢子數(shù)平均為350個(gè)，而利用染色法來(lái)測(cè)定相同樣品的孢子數(shù)平均為380個(gè)，每個(gè)土壤樣品精度提高了8％，提高了孢子密度測(cè)定的精度。
利用常規(guī)的濕篩傾析法測(cè)定孢子密度，本試驗(yàn)條件下需要45-50分鐘時(shí)間來(lái)計(jì)數(shù)完成一個(gè)沙土樣品(10克土350個(gè)孢子)。而利用染色法則需要花費(fèi)25-30分鐘時(shí)間來(lái)計(jì)數(shù)完成1個(gè)樣品(10克土380個(gè)孢子)，測(cè)定速度上1個(gè)樣品縮短了一半時(shí)間(25-30分鐘)，而對(duì)本試驗(yàn)野外40個(gè)土樣，在測(cè)定速度上節(jié)約1000-1200分鐘，即20小時(shí)。40個(gè)樣品在染色過(guò)程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進(jìn)行染色30分鐘，耗時(shí)少，染色后能夠極大地提高孢子密度測(cè)定的速度。
利用該染色法，能夠觀測(cè)到明顯的菌絲和孢子形態(tài)，易于識(shí)別、辨認(rèn)和觀察，能夠極大地提高孢子密度測(cè)定的精度和速度，對(duì)菌根在礦區(qū)生態(tài)重建、土壤修復(fù)以及農(nóng)業(yè)生物肥力等野外大規(guī)模應(yīng)用后的菌根孢子密度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)提供了一種快速的科學(xué)測(cè)定方法，尤其對(duì)于初學(xué)菌根技術(shù)的人更是一種可行的快速測(cè)定方法。
具體實(shí)施方案實(shí)施例1(菌劑培養(yǎng)基質(zhì))培養(yǎng)基質(zhì)采自北京市北沙灘地建筑沙土，在裝盆前經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌(121℃，2h)，自然風(fēng)干，以供盆栽試驗(yàn)用。
供試菌種真菌菌種摩西球囊菌(G.mosseae)、地表球囊菌(G.versiforme)和(G.etunicatum)分別由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所微生物室提供。
供試作物玉米、高粱由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院中農(nóng)種子公司提供。播種前種子用10％H2O2浸泡10分鐘，去離子水反復(fù)清洗數(shù)遍瀝干備用。
試驗(yàn)用盆試驗(yàn)用盆采用20cm×20cm×15cm(高×盆口直徑×盆底直徑)規(guī)格的白色塑料盆。盆缽用自來(lái)水清洗瀝干后，75％酒精消毒，每盆裝風(fēng)干基質(zhì)2.5kg。
試驗(yàn)方案本研究設(shè)計(jì)4個(gè)處理菌根處理，即接種G.mosseae(處理1)、接種G.versiforme(處理2)、接種G.mosseae和G.versiforme混合菌劑(處理3)、接種G.mosseae、G.versiforme和G.etunicatum的混合菌劑(處理4)，2種供試植物，總共8個(gè)處理。其中處理1和處理2是4個(gè)重復(fù)，處理3、處理4是10個(gè)重復(fù)，總共56盆。
試驗(yàn)在7月5日播種，1個(gè)月后每盆定苗至2株，定時(shí)定量施加Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，維持基質(zhì)持水量在60％-80％之間，3個(gè)月后收獲?；|(zhì)風(fēng)干后用濕篩傾析法和濕篩傾析染色法測(cè)定叢枝菌根真菌孢子數(shù)。
以傳統(tǒng)的濕篩傾析法來(lái)統(tǒng)計(jì)孢子密度，10克沙土樣品孢子數(shù)平均為350個(gè)，需要45-50分鐘時(shí)間計(jì)數(shù)完成一個(gè)樣品(10克土350個(gè)孢子)；而利用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數(shù)平均為380個(gè)，需要花費(fèi)25-30分鐘時(shí)間計(jì)數(shù)完成1個(gè)樣品(10克土380個(gè)孢子)，從精度上每個(gè)土壤樣品平均提高了8％，從測(cè)定速度上1個(gè)樣品縮短了一半時(shí)間(25-30分鐘)，一共有76個(gè)樣品，總共可以省1900～2280分鐘，即節(jié)省33～38個(gè)小時(shí)，用濕篩傾析染色法測(cè)定孢子密度極大的提高了孢子密度測(cè)定的精度和速度，該方法適于大批量樣品的孢子密度測(cè)定。
實(shí)施例2(菌劑在寧夏煤矸石山生態(tài)重建中的野外應(yīng)用)試驗(yàn)用地寧夏大武口洗煤廠煤矸石山，該地位于寧夏回族自治區(qū)石嘴山市，屬于中溫帶干旱氣候區(qū)，降水稀少而集中，光照充足，蒸發(fā)強(qiáng)烈，空氣干燥，極不利于煤矸石山植被恢復(fù)。本試驗(yàn)地點(diǎn)選擇煤矸石山上，煤矸石山上鋪了0.8-1m厚的河沙作為生長(zhǎng)基質(zhì)。該沙土pH為8.12，電導(dǎo)率EC為6.67μS/cm，最大持水量為14.48％，有效磷2.9ppm，有效氮5.27ppm，有效鉀97ppm，屬于極貧瘠的沙土。
試驗(yàn)材料供試菌種為本實(shí)驗(yàn)室增殖培養(yǎng)的Glomus mosseae和Glomus etunicatum混合菌劑(簡(jiǎn)稱(chēng)G.spp)。供試植物是當(dāng)?shù)叵蠕h植株白蠟幼苗，裸根栽植，株高1米左右。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)和管理試驗(yàn)在2005年4月18日種植，設(shè)接種和不接種兩處理，接種192株，不接種204株，總共396株。每株穴播接種50g混合菌根菌劑。白蠟株距為1米，在接種和不接種之間有隔離帶，間距為2米，地邊周?chē)刑锕。偣布s500m2。栽植后主要是水分管理，首次澆水采用大水漫灌澆透，每周澆水2次，1個(gè)月后每周澆水1次，2個(gè)月后2周澆水1次，每次澆水都灌透，3個(gè)月后植株免水分管理自然生長(zhǎng)。
3、6和13個(gè)月后測(cè)定采集樣品的孢子密度，每次采集接菌、不接菌各10個(gè)樣品，三次采樣總共60樣品，采用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數(shù)，從測(cè)定速度上1個(gè)樣品縮短了一半時(shí)間(25-30分鐘)，一共有60個(gè)樣品，總共可以省1500～1800分鐘，即節(jié)省25～30個(gè)小時(shí)，60個(gè)樣品在染色過(guò)程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進(jìn)行染色30分鐘，用濕篩傾析染色法測(cè)定孢子密度極大地提高了孢子密度測(cè)定速度。
試驗(yàn)例3(菌劑在內(nèi)蒙神東生態(tài)恢復(fù)地野外應(yīng)用)與實(shí)施例2基本相同，但試驗(yàn)選擇地為神華集團(tuán)神東煤炭分公司大柳塔西山北區(qū)生態(tài)常綠林區(qū)供試土壤pH8，供試植物為新疆楊樹(shù)。供試菌種為本實(shí)驗(yàn)室增殖培養(yǎng)的Glomus mosseae和Glomus etunicatum混合菌劑(簡(jiǎn)稱(chēng)G.spp)，植株常規(guī)養(yǎng)護(hù)。
3和6個(gè)月后測(cè)定采集樣品的孢子密度，每次采集接菌、不接菌各10個(gè)樣品，三次采樣總共60樣品，采用濕篩傾析染色法則相同樣品孢子數(shù)，從測(cè)定速度上1個(gè)樣品縮短了一半時(shí)間(25-30分鐘)，一共有60個(gè)樣品，總共可以省1500～1800分鐘，即節(jié)省25～30個(gè)小時(shí)，60個(gè)樣品在染色過(guò)程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進(jìn)行染色30分鐘，用濕篩傾析染色法測(cè)定孢子密度極大地提高了孢子密度測(cè)定速度。
權(quán)利要求
1.一種叢枝菌根真菌孢子密度快速測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟(1)稱(chēng)取一定重量的土壤標(biāo)本，放在容器內(nèi)用水浸泡20-30分鐘，使土壤松散，如果土壤粘性很大，可加入常規(guī)的土壤分散劑；(2)選用一套潔凈的、具有孔徑為0.5-0.034微米的土壤篩，按孔徑由大至小的順序從上到下依次疊放，最底層用一固體物墊著，使篩面稍微傾斜；(3)用玻璃棒攪動(dòng)浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物沉淀下去，然后將懸浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一層的土壤篩上，傾倒時(shí)，集中倒在篩面的一個(gè)點(diǎn)上，避免整個(gè)篩面都沾有土壤溶液；(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，以免在上層粗篩面的剩留物中殘留有叢枝菌根真菌孢子，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)清潔的培養(yǎng)皿里面；(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)干凈的試管內(nèi)，滴加曲利本藍(lán)染色劑，放在90℃水浴鍋或烘箱中加熱半小時(shí)，進(jìn)行染色；(6)將染色后的濾液通過(guò)細(xì)篩，并沖洗篩上的濾物，洗去染色劑，將篩出物放在干凈的培養(yǎng)皿里，在沖洗下來(lái)的篩出物中，除許多細(xì)的沙礫和雜質(zhì)外，其余為不同直徑的叢枝菌根真菌的孢子；(7)將篩出物放在雙目實(shí)體解剖顯微鏡下觀察，可觀測(cè)到紫色孢子。
2.按照權(quán)利1要求所述的叢枝菌根真菌孢子密度快速測(cè)定方法，其特征在于，比常規(guī)的濕篩傾析法增加了染色這一步驟。
3.按照權(quán)利2要求所述的叢枝菌根真菌孢子密度快速測(cè)定方法，其特征在于，染色后孢子呈紫色，易于辨別形態(tài)特性。
全文摘要
菌根生物技術(shù)是目前應(yīng)用于煤礦區(qū)生態(tài)治理的一種新方法，菌根孢子密度是衡量菌根生態(tài)適應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)之一。孢子密度的測(cè)定采用的優(yōu)化方法是濕篩傾析染色法。優(yōu)化方案中采用曲利本藍(lán)對(duì)基質(zhì)中的孢子、菌絲進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)經(jīng)染色后基質(zhì)中的孢子及其菌絲呈紫色，在雙目顯微鏡下觀測(cè)孢子的數(shù)量和形態(tài)更容易識(shí)別，計(jì)數(shù)的精度和速度明顯提高，降低了孢子密度測(cè)定過(guò)程中的人為誤差。使用本發(fā)明的方法對(duì)孢子密度常規(guī)測(cè)定方法--濕篩傾析法作了改進(jìn)發(fā)明，以提高了試驗(yàn)測(cè)定的精度和速度，為檢驗(yàn)菌根技術(shù)在野外大規(guī)模的生態(tài)應(yīng)用效果提供了一種孢子密度快速測(cè)定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1979127SQ20061016532
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者畢銀麗, 吳王燕, 全文智 申請(qǐng)人:中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)